一、一种重组人腺病毒抗狂犬病疫苗（论文文献综述）
刘乐[1]（2021）在《嵌合非洲猪瘟病毒免疫相关基因的重组狂犬病毒的拯救及鉴定》文中研究指明非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起猪的一种急性、烈性、出血性传染病,最急性和急性感染率和死亡率可高达100%。我国自2018年报告第一起ASF疫情以来,疫情已接连流行至全国大部分省区,给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。由于ASFV基因组庞大而复杂,且病毒具有非常复杂的免疫保护和免疫逃逸机制,使得至今尚无有效的商业化疫苗和治疗药物。狂犬病是感染了狂犬病毒所引起的一种人畜共患病,一旦出现临床症状,死亡率高达100%。本研究首先通过原核表达系统表达了ASFV CD2v蛋白（该蛋白由EP402R基因编码）,免疫日本大耳白兔制备了针对该蛋白的多克隆抗体。所制备的多克隆抗体经ELISA、蛋白免疫印迹等方法鉴定发现其具有良好的反应特异性。本研究主要利用狂犬病毒反向遗传操作系统,构建能够分别表达ASFV CD2v、p54、p30蛋白的重组狂犬病病毒。首先以狂犬病毒SAD弱毒株的全长c DNA作为骨架,在病毒的N、P基因之间插入ASFV EP402R基因、p54基因和p30基因,分别构建三个重组狂犬病毒全长c DNA质粒。然后将全长质粒与狂犬病毒的辅助质粒N、P、L、G以及T7质粒通过脂质体共转染BHK-21细胞系进行重组病毒的拯救。用FITC标记的狂犬病毒N蛋白单克隆抗体进行免疫荧光试验和针对狂犬病毒N基因的q PCR进行重组病毒的鉴定。成功拯救出的重组病毒在BHK-21细胞上大量繁殖,再通过病毒毒价测定,绘制重组病毒的生长曲线,确定三种重组病毒的最佳收毒时间。最后通过激光共聚焦鉴定ASFV CD2v、p54和p30蛋白和狂犬病毒N蛋白的表达;将重组病毒在BHK-21细胞系上连续传代10次后,通过RT-PCR方法检测重组病毒的外源基因EP402R、p54和p30基因,表明重组病毒具有良好的遗传稳定性。本研究成功拯救出了嵌合ASFV EP402R、p54和p30基因的三株重组狂犬病毒,为基于狂犬病毒为骨架的ASFV基因工程亚单位疫苗的研制提供了新思路。
柴本杰,黄菲,裴捷,周明,田大勇,傅振芳,赵凌[2]（2021）在《狂犬病新型基因工程疫苗研究进展》文中指出狂犬病是由狂犬病病毒感染中枢神经系统引起的一种古老的人兽共患传染病,人和动物感染后一旦出现临床症状,死亡率几乎100%,至今仍无有效的治疗方法。当前,接种疫苗是预防狂犬病最为有效的途径。因此,狂犬病疫苗研发一直是狂犬病研究领域的热点之一,进而不断涌现出新型疫苗。本文对近期狂犬病新型灭活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、口服疫苗等基因工程疫苗研究进展进行系统梳理,以期把握狂犬病疫苗研究现状,为研发更为有效的狂犬病新型疫苗提供新思路。
燕丽娜[3]（2020）在《共表达RABV G蛋白与CDV H蛋白的重组人5型腺病毒的构建与免疫研究》文中认为狂犬病病毒（RABV）和犬瘟热病毒（CDV）是犬等食肉动物危害最大的病原体。狂犬病是由RABV引起的噬神经的高病死率的病毒病。目前,狂犬病仍在150个国家流行。每年大约5.9万人死于狂犬病感染,其中亚洲和非洲的病例占95%。在中国,人类狂犬病病例的95%是由感染RABV的犬咬伤引起的,尤其是在经济欠发达的农村地区。我国已经制定了到2030年消灭由犬传播的人类狂犬病的目标。按照2011年发表的数据,中国狂犬病疫苗的投入主要用于人在被犬咬伤后被迫接种疫苗和抗血清的费用,耗资达100亿元,这个数量超出全球生产所有狂犬病疫苗的80%。中国每年为狂犬病付出的代价是世界第一,而每年狂犬病发病人数却居世界前列。世界卫生组织（WHO）调查显示,为70%的犬连续7年接种疫苗能阻断狂犬病的传播[1-2]。因此,中国急需高效、廉价的狂犬病疫苗,提高犬的免疫覆盖率,从源头阻断病毒传播。犬瘟热是由CDV引起的高致病性、高传染性的疾病,表现为严重的免疫抑制和多系统临床症状,包括呼吸系统、胃肠系统、中枢神经系统等。犬瘟热感染的宿主广泛,包括犬科、猫科、浣熊科、熊猫科、灵猫科、鼬科、臭鼬科及海豹科等动物,甚至在非人类灵长类动物也有犬瘟热感染的报道。有研究指出犬瘟热与人类疾病有关。研究者在Paget畸形骨炎患者骨骼中检出CDV,检出率达100%,表明Paget畸形骨炎与CD感染显着相关[3],Paget畸形骨炎在欧美国家发病率达5%。动物感染CDV后病死率达30%～80%,其中雪貂最为敏感,病死率几乎达100%。犬瘟热的传染性强,通过直接接触传播,也可以通过空气飞沫传播。犬瘟热是危害养犬业最严重的的病毒性传染病,严重影响着狐狸、貂等动物毛皮养殖业发展。犬在犬瘟热传播中占主要地位,感染CDV的犬是狐狸、貂等动物感染CDV的主要传染源。犬瘟热疫苗是犬、狐狸、貂等必须免疫的疫苗,而我国目前所用的犬瘟热疫苗大多是进口疫苗,价格昂贵,因此有必要研制安全、有效、廉价的犬瘟热疫苗。RABV和CDV感染的共同宿主多,包括与人密切接触的家养动物犬及观赏动物虎、豹、狮、熊猫、非人类灵长类动物等。犬在狂犬病和犬瘟热疾病传播中有重要的作用。狂犬病和犬瘟热可以通过疫苗接种达到一级预防,减轻疾病负担。有必要研制一种二联疫苗,同时保护机体免受两种病毒感染。目前在中国,应用上市的狂犬病疫苗是细胞培养灭活疫苗,而批准使用的犬瘟热疫苗是减毒活疫苗,针对两种疾病的联合疫苗仍然缺乏。人5型腺病毒载体在基因治疗和病毒病防治方面应用广泛,作为病毒载体有诸多优势。首先,腺病毒载体安全性高,缺失E1复制必须区,使病毒只能在E1区互补的细胞系中复制;其次,其能容纳较长的外源基因,同时表达多个基因;另外,应用293细胞培养腺病毒工艺成熟,易于培养,滴度高,能引起较高的免疫反应。2017年,国家食品药品监督管理局（FDA）批准了表达埃博拉病毒糖蛋白的重组人5型腺病毒疫苗的新药上市。2020年,以人5型腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗已进入临床试验Ⅱ期。因此,本研究以缺陷型人5型腺病毒为载体,表达RABV糖蛋白（G）及CDV血凝素蛋白（H）,获得重组腺病毒rAd5-G-H,通过体外实验、动物免疫及动物攻毒保护实验,分析rAd5-G-H对机体的保护效果,评价其作为二联疫苗的潜力。研究目的1.以复制缺陷人5型腺病毒为载体,构建一种共表达RABV G蛋白和CDV H蛋白的重组腺病毒rAd5-G-H,作为狂犬病和犬瘟热的候选二联疫苗。2.体外细胞实验验证rAd5-G-H在细胞水平是否表达RABV G蛋白和CDV H蛋白。3.通过小鼠和狐狸动物模型评价rAd5-G-H的毒力、免疫原性和保护性,为新型狂犬病和犬瘟热二联疫苗研制提供科学依据。研究方法1.重组腺病毒rAd5-G-H的构建与鉴定。将RABV G基因和CDV H基因重组至复制缺陷人5型腺病毒构建重组腺病毒rAd5-G-H。通过基因组PCR、电镜观察、间接免疫实验等方法鉴定rAd5-G-H的滴度、形态与目的基因的表达。2.rAd5-G-H毒力鉴定。6～8周龄雌性BALB/c小鼠后肢肌肉注射rAd5-G-H,连续21天监测小鼠体重、毛色、饮食情况,评价疫苗的毒力,为初步评价疫苗安全性提供依据。3.rAd5-G-H体内诱导中和抗体能力检测。6～8周龄雌性BALB/c小鼠后肢肌肉注射rAd5-G-H,分别在免疫后第1、2、4和8周采血,分离血清。利用荧光抗体病毒中和试验（FAVN）测定RABV中和抗体（VNA）效价,用50%荧光减少中和实验（FRNT）测定CDV VNA。6周龄雌性银狐肌肉注射rAd5-G-H,用同样的方法测定免疫后第0、2、3和4周血清中RABV和CDV VNA,在狐狸体内评价rAd5-G-H的免疫原性。4.rAd5-G-H诱导小鼠募集活化DC细胞及B细胞能力检测。在免疫后3、6和9天分离小鼠腹股沟淋巴结淋巴细胞,并且在免疫后7天和14天采集小鼠外周血。通过流式细胞术检测rAd5-G-H诱导小鼠募集和/或活化DC细胞和B细胞的情况。5.rAd5-G-H诱导小鼠脾细胞分泌IFN-γ和IL-4细胞因子能力的检测。在免疫后4周分离小鼠脾脏淋巴细胞,使用ELISpot试剂盒检测在特异性刺激物RABV蛋白颗粒和原核表达的CDV H蛋白存在时,rAd5-G-H诱导小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4细胞因子的能力。用ELISA法测定免疫小鼠血清中特异性IgG2a和IgG1抗体水平。6.rAd5-G-H对RABV和CDV感染的保护能力检测。6～8周龄雌性BALB/c小鼠后肢肌肉注射rAd5-G-H后4周,一侧后肢肌肉注射RABV HNPB3株。6周龄雌性银狐肌肉注射rAd5-G-H后4周,异侧后肢肌肉注射CDV QL。在攻毒后21天,观察小鼠和狐狸毛色、行为及死亡情况,评价重组腺病毒对小鼠和狐狸的保护率。研究结果1.重组腺病毒rAd5-G-H获得成功拯救,并且在细胞水平上验证了该重组腺病毒可以同时表达RABV G和CDV H蛋白。通过负染电子显微镜观察,重组腺病毒rAd5-G-H与腺病毒载体对照病毒表面光滑,形态都呈典型的二十面体结构,大小约为70～100nm。2.与空白组和病毒对照组相比,rAd5-G-H组小鼠体重变化轻微,未出现异常行为和疾病症状。3.rAd5-G-H引起免疫小鼠和狐狸产生强烈的RABV和CDV VNA,重组腺病毒的免疫原性良好。4.流式细胞术结果显示,与空白组和病毒对照组相比,rAd5-G-H能诱导小鼠募集和/或活化DC细胞和B细胞。5.ELISpot实验表明,在RABV蛋白颗粒和原核表达的CDV H蛋白刺激后,rAd5-G-H免疫组的小鼠脾脏中淋巴细胞可分泌明显增多的IFN-γ Th1型细胞因子和IL-4 Th2型细胞因子。ELISA结果表明,rAd5-G-H可刺激小鼠产生高水平RABV和CDV特异性IgG2a和IgG1抗体水平。6.攻毒实验表明,rAd5-G-H能够完全保护免疫小鼠抵御RABV的致死性攻击,并能完全保护狐狸抵御CDV的致死性攻击。结论本研究制备了缺陷型人5型腺病毒rAd5-G-H,能刺激机体产生特异性体液免疫及Th1型和Th2型细胞免疫应答,能够保护小鼠抵抗RABV的致死性攻击,保护狐狸抵抗CDV的致死性攻击,是狂犬病和犬瘟热二联疫苗的理想候选疫苗。
童剑军[4]（2020）在《狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建》文中研究指明狂犬病是由狂犬病毒引起的高度致死性和接触性人兽共患病,几乎所有哺乳动物均可感染,一旦发病就意味着死亡。我国是狂犬病高发国家之一,加之疆土幅员辽阔,狼、狐狸等野生动物携带狂犬病毒的可能性较大,因此牧区牛羊受野生动物攻击而感染狂犬病的情况时有发生,如山西、内蒙、新疆塔城等地均有牛羊被其咬伤导致其感染狂犬病的报道。羊痘病毒作为痘病毒科的成员,是大型的线形DNA病毒,可容纳大量外源基因而不影响病毒的正常生长繁殖,因此常被作为载体生产活载体多价疫苗。为有效预防羊狂犬病,本研究以山羊痘病毒疫苗株为病毒活载体,以其腺甘酸酶基因（TK）为复制非必需区,以VV7.5基因或GTPV-A8R基因为启动子,绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因,利用基因工程技术设计构建10株能重组狂犬病毒保护性抗原（G蛋白）的表达载体;制备培养羔羊睾丸原代细胞,通过脂质体转染法将构建成功的重组表达载体导入预先感染羊痘病毒疫苗株的羔羊睾丸细胞中,经同源重组获得能够表达狂犬病毒G蛋白的重组羊痘病毒,然后运用低熔点琼脂糖固定、挑取荧光斑点和倍比稀释传代的方式进行纯化,经4-6代传代纯化即可获得较纯的重组病毒,通过GFP基因表达率、细胞病变及PCR方法确定重组病毒是否纯化,并运用Western-blot方式初步评价G蛋白在重组病毒中的表达效果。用ELISA方法检测培养物中G蛋白的表达情况。将纯化的重组疫苗株免疫健康绵羊,定时采血分离血清,通过ELISA方法初步评价狂犬病毒G蛋白产生的抗体水平,并用羊痘病毒疫苗株对对照。本试验成功构建8株重组病毒转移载体PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PG M-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFPRVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP。制备羔羊睾丸原代细胞,其生长稳定性较好且接种羊痘病毒后细胞病变明显,可以满足后期实验需要。经细胞转染、基因重组、重组病毒筛选纯化,得到PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PG M-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP 3株重组病毒,经We stern-blot鉴定,最终获得能正确表达狂犬病毒G蛋白的重组疫苗两株:PGM-T K13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5;出现的荧光斑点,发生重组但尚未纯化的病毒1株:PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP。G蛋白抗原ELIS A检测发现G蛋白较大量的分泌性表达到细胞培养液中。免疫绵羊后血清抗体的ELISA检测结果显示:两株重组疫苗株均能在绵羊体内表达G蛋白并成功诱导机体产生抗体,与羊痘病毒疫苗株差异极显着;而G蛋白膜外区重组疫苗株的抗体水平高于G蛋白全长重组疫苗株,且差异显着。狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的成功构建为狂犬病毒活载体疫苗研发奠定了基础,也为羊狂犬病防控提供了新思路和技术路线。
孙燕[5]（2019）在《新型人用狂犬病疫苗研究进展》文中指出虽然狂犬病可通过接种狂犬病疫苗来预防,但全球每年仍有超过55 000人因狂犬病死亡。采用现行狂犬病疫苗的多剂接种方案,暴露前疫苗接种对大多数国家来说不具有成本效益,因此有必要开发新型狂犬病疫苗。理想的狂犬病疫苗应与现行的多剂疫苗同样安全,而且单剂接种后就能达到保护性免疫。此综述讨论了处于临床前试验和正在进行临床试验的新型狂犬病疫苗,及其替代现有狂犬病疫苗的潜力。
刘畅[6]（2019）在《截短钙网蛋白融合FMDV VP1及PCV2 Cap蛋白表达形成多聚体的免疫原性分析》文中认为口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是一种高度接触性的偶蹄动物的传染病;其病原体为口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）,结构蛋白VP1为最重要的抗原性蛋白。猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease,PCVD）是猪的重要传染病之一,引发该病的病原体为猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）,Cap蛋白是病毒的核衣壳蛋白。钙网蛋白（Calreticulin,CRT）是一种长度为46 kDa的内质网Ca2+结合蛋白,全长或截短的CRT具有有效促进蛋白折叠和聚合的作用。CRT融合外源蛋白也能维持聚合物的结构和良好的免疫原性。目前,接种疫苗仍旧是预防FMDV以及PCV2感染的最有效途径。为了制备安全有效的O型FMDV和PCV2的亚单位疫苗,分别利用O型FMDV的VP1蛋白以及PCV2的Cap蛋白融合不同长度的截短CRT原核表达形成高分子的多聚体,并分别以小鼠以及豚鼠为动物模型,检测了疫苗的免疫潜力。主要结果如下:1.采用全长的VP1蛋白分别在N端及C端融合不同长度的截短CRT（120-250 aa/120-308 aa）,成功构建了4种不同形式的VP1-CRT融合蛋白（rV4C,rC4V,rV5F和rF5V）。采用了伴侣蛋白Tf16共表达的方法实现了VP1-CRT融合蛋白的可溶性表达。采用凝胶过滤的方法成功实现了VP1-CRT融合蛋白的纯化,并验证其能够形成多聚体形式。采用动态光散射（Dynamic Light Scattering,DLS）等方法检测表明VP1-CRT融合蛋白全部能够形成直径为100 nm左右的大颗粒蛋白。间接ELISA方法分析VP1-CRT融合蛋白的全部能够特异性识别O型FMDV阳性血清,O型FMDV单克隆抗体2D2以及FMDV多肽（VP1 141-160 aa）单抗3D-A11,反应原性良好。2.纯化后的VP1-CRT融合蛋白配合佐剂制成疫苗,初步免疫小鼠,间接ELISA以及双抗夹心ELISA方法检测小鼠免疫后血清中产生了高水平的能够识别VP1蛋白的抗体以及结合FMDV的抗体。免疫豚鼠结果表明所有VP1-CRT融合蛋白可以刺激豚鼠产生高水平的体液免疫应答,rC4V组豚鼠产生的抗体水平与灭活疫苗组无差异。同时检测了豚鼠淋巴细胞分泌IFN-γ,IL-10,IL-18,TNF-α,GM-CSF细胞因子的含量和淋巴细胞的增殖情况,结果表明免疫后的豚鼠产生了一定水平的细胞免疫应答。从7种不同种类的佐剂中优化合适佐剂与重组蛋白配伍,最终鉴定佐剂MontanideTM ISA 50V2和rC4V是最优组合配比疫苗。3.以rC4V为检测抗原,建立了间接rC4V-ELISA检测方法,敏感性和特异性可以分别达到84.2%以及100%。检测了376份临床血清,rC4V-ELISA与LPB-ELISA试剂盒的符合率达到84.4%,该方法具有检测FMDV抗体的潜力,能够用以监测疾病感染及免疫后的抗体水平。4.采用全长的Cap蛋白分别在N端及C端融合不同长度的截短CRT（120-250 aa/120-308 aa）,成功构建了4种不同形式的Cap-CRT融合蛋白（rP4C,rC4P,rP5F和rF5P）。常规优化可溶表达条件成功实现了为了rF5P的可溶性表达。通过Ni-NAT亲和层析纯化的方法获得90%以上纯度的重组蛋白,凝胶过滤的方法分析rF5P也能够形成多聚体形式。DLS等方法检测结果表明rF5P形成的大颗粒直径为100 nm。对前期临床送检的病料中分离的PCV2流行毒株DF-1进行连续培养,病毒滴度可达107.5TCID50/mL,为下一步疫苗研究奠定基础。纯化后的rF5P配合佐剂制成疫苗免疫小鼠,ELISA和IPMA检测小鼠免疫后产生了高水平的体液免疫水平,抗体效价可持续至免疫后56天与商品化疫苗无差异。同时检测了小鼠淋巴细胞分泌细胞因子含量和淋巴细胞的增殖情况,结果表明免疫后的小鼠也能够产生了一定水平的细胞免疫反应。小鼠攻毒DF-1后,RT-PCR检测心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织中的病毒含量,结果表明rF5P疫苗有效地降低了小鼠对DF-1毒株的感染率,可以作为预防PCV2的候选疫苗。
张莹辉,姚文生,康凯,薛麒,李启红,陈小云,杜吉革,朱真,印春生[7]（2020）在《狂犬病病毒糖蛋白重组表达及其基因工程疫苗研究进展》文中提出狂犬病病毒糖蛋白（RVGP）是唯一暴露于病毒颗粒表面的抗原,能够诱导宿主产生中和抗体,也是唯一存在于所有新型狂犬病疫苗中的病毒成分。本文综述了国内外学者利用原核系统,以及包括酵母系统、植物系统、昆虫细胞系统在内的真核系统和哺乳动物细胞系统、病毒载体系统来表达具有免疫原性的重组狂犬病病毒糖蛋白（rRVGP）,并对其与天然RVGP在结构和激发机体免疫反应方面的相似性进行的相关研究,为狂犬病基因工程新型疫苗提供研究思路。
谢青梅,封柯宇,沈勇[8]（2019）在《动物病毒重组活载体疫苗研究进展》文中进行了进一步梳理病毒活载体疫苗作为一种新型疫苗,与传统疫苗相比,具有极大的优势与应用前景,是当今与未来疫苗研制与开发的重要方向之一。目前在人类医学和兽医领域,病毒活载体疫苗均取得了大量的研究成果。本文综述了主要的兽用病毒疫苗载体及重组活载体疫苗的最新研究进展,并分析了其发展趋势,为进一步研制新型重组病毒疫苗提供参考。
王明月[9]（2019）在《狂犬病病毒糖蛋白83和367位点突变株的拯救与鉴定》文中研究说明狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起的人和多种动物中枢神经系统感染的急性传染病,临床发病后死亡率几乎达到100%。通过实验室先前的研究发现,狂犬病毒糖蛋白（G）的第83、367位氨基酸对细胞适应性及致病力至关重要。本研究以狂犬病毒SAD株为母本质粒,运用重叠延伸PCR和点突变试剂盒构建K83R-rSAD、P367S-rSAD和K83R-P367S-rSAD三个重组病毒全长质粒。成功拯救出包括SAD亲本株及以上三个重组病毒,将重组病毒在细胞上连续传代5代,测定F6代病毒的多步生长曲线,在第72 h和第96 h时病毒滴度达到最高,K83R-rSAD为108.5FFU、P367S-rSAD为107.5FFU、K83R-P367S-rSAD为108.5FFU、SAD为107.0FFU,结果表明狂犬病毒糖蛋白第83位氨基酸突变后,狂犬病毒的滴度显着升高。对重组病毒G基因测序结果表明K83R、P367S在连续五代内稳定遗传。Western Blot检测结果表明G83突变后,G蛋白表达量明显升高。将上述四株病毒以脑部注射的方式接种于昆明白乳鼠,乳鼠全部死亡。分离鼠脑病毒后,以肌肉注射的方式免疫C57BL/6小鼠,小鼠发病并有死亡现象。免疫SAD亲本毒的小鼠全部死亡,免疫重组病毒K83R-rSAD、P367S-rSAD和K83R-P367S-rSAD后小鼠的存活率分别为72%、42.6%和63.6%,结果表明狂犬病毒G83和G367突变后能够降低对C57BL/6小鼠的致病性。综上所述狂犬病毒糖蛋白83和367位氨基酸的改变能够降低对小鼠的致病性,同时第83位氨基酸改变后狂犬病毒糖蛋白表达量升高。本研究成功拯救出致病力更弱的重组狂犬病病毒,为今后研制狂犬病毒弱毒疫苗了奠定基础。
刘川玉[10]（2019）在《表达MERS-CoV S1蛋白重组狂犬病病毒的纯化与实验免疫研究》文中认为中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome,MERS）是由中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）所引起的一种高度传染性人兽共患病。自2012年首例MERS患者病例被确诊以来,因其在全球范围内传播范围广、致死率高而受到世界卫生组织（World Health Organization,WHO）的广泛关注。2015年我国报道出现的首例输入性MERS患者,这无疑为我国的MERS防控增加了挑战,也敲响了警钟。流行病学调查表明,单峰驼是MERS-CoV的重要中间宿主,人可通过与病畜直接或间接接触感染MERS-CoV。因此,加强针对MERS的新型疫苗研究,对单峰驼等动物宿主进行免疫源头免疫是MERS防控的关键。近年来,随着疫苗监管部门对疫苗质量、安全性要求的逐步升级,经简单粗放生产的疫苗已不能满足市场需求,必须提高疫苗纯度,加强对疫苗的纯化工艺探索研究。密度梯度离心法、沉淀法是病毒分离纯化工艺的经典方法,缺点是杂质去除效果有限,疫苗纯度低,安全性差,副作用大,无法线性放大应用于规模化生产。而一些新的分离纯化技术如膜过滤、层析等因自动化程度高、操作简便、回收率高而受到广泛关注。基于此,本研究旨在建立表达MERS-CoV S1蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-MERSS1的悬浮培养工艺,同时研究其浓缩纯化方法,并且通过动物试验评价纯化病毒的免疫效果,为MERS新型疫苗的研究奠定基础。1、rSRV9-MERSS1重组病毒悬浮培养的初步研究通过比较不同感染复数（Multiplicity of infection,MOI）下接毒后,BHK 21细胞的生长曲线和病毒滴度变化来确定最佳的MOI。同时对病毒的收获时间、收获次数等参数进行优化来确定病毒的悬浮培养条件。结果显示:当MOI=0.05时,以2×106个/mL的细胞密度作为工作细胞密度,接毒后48 h病毒滴度可达2×108 TCID50/mL。离心收取细胞上清,用相同体积的新鲜培养液均匀重悬细胞沉淀,继续培养48 h,病毒滴度可达2×109 TCID50/mL。2、rSRV9-MERSS1重组病毒的浓缩纯化方法研究将收获的病毒培养液灭活后,分别通过三种方法（醋酸锌沉淀+Sepharose 4FF凝胶过滤层析、500 KD中空纤维超滤柱+Sepharose 4FF凝胶过滤层析、500 KD中空纤维超滤柱+CellufineTMM Sulfate亲和层析）进行纯化,通过比较最终筛选出一种温和、目的蛋白回收率高、纯度高的纯化方法。结果显示:500 KD中空纤维超滤柱+Sepharose4FF凝胶过滤层析回收的抗原含量最高,50 mL重组病毒原液经纯化后可得到1.82 mg蛋白,杂蛋白去除率可高达97.02%;电镜下观察可见到纯化的病毒粒子具有较好的形态。结合生产成本等方面综合考虑,最终确定选用此种方法进行病毒的浓缩纯化。3、rSRV9-MERSS1纯化病毒的实验免疫研究通过500 KD中空纤维超滤柱+Sepharose 4FF凝胶过滤层析法来制备纯化的病毒。同时将不同剂量（2μg、10μg、50μg）的纯化病毒及未纯化病毒免疫小鼠,通过测定抗MERS-CoV IgG抗体效价消长规律、抗MERS-CoV中和抗体水平等综合评价纯化病毒的免疫原性及免疫效果。结果显示:在抗MERS-CoV IgG抗体效价及抗MERS-CoV中和抗体水平上,不同剂量组呈现剂量依赖性效应,且抗体水平随着免疫次数的增加而升高;纯化的病毒具有良好的免疫原性,且可诱导小鼠产生良好的体液免疫应答。与未纯化病毒相比,纯化病毒可诱导小鼠较早产生高水平的体液免疫应答。
二、一种重组人腺病毒抗狂犬病疫苗（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种重组人腺病毒抗狂犬病疫苗（论文提纲范文）
（1）嵌合非洲猪瘟病毒免疫相关基因的重组狂犬病毒的拯救及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 非洲猪瘟概述 |
| 1.1.1 非洲猪瘟 |
| 1.1.2 非洲猪瘟流行病学 |
| 1.1.3 非洲猪瘟临床症状与诊断 |
| 1.1.4 非洲猪瘟病毒基因组和几种重要的免疫相关蛋白 |
| 1.1.5 非洲猪瘟疫苗研究进展 |
| 1.2 狂犬病毒与反向遗传操作系统 |
| 1.2.1 狂犬病毒 |
| 1.2.2 RNA病毒反向遗传系统 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 非洲猪瘟病毒EP402R基因的原核表达及其多克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂、载体和菌株 |
| 2.1.2 EP402R基因的优化及其重组表达质粒的构建 |
| 2.1.3 CD2v蛋白的原核诱导表达 |
| 2.1.4 包涵体蛋白纯化 |
| 2.1.5 免疫动物以及ELISA鉴定血清抗体效价 |
| 2.1.6 抗体纯化 |
| 2.1.7 Western blotting检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 成功构建重组质粒 |
| 2.2.2 重组蛋白成功诱导表达 |
| 2.2.3 ELISA检测多克隆抗体效价 |
| 2.2.4 抗体纯化结果 |
| 2.2.5 Western blotting检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 重组狂犬病毒 rBNSP-ASFV-EP402R 的拯救及其生物学特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 RABV SAD株全长c DNA、辅助质粒、细胞 |
| 3.1.3 ASFV EP402R基因的合成 |
| 3.1.4 嵌合ASFV EP402R基因的重组狂犬病毒全长cDNA的构建 |
| 3.1.5 重组病毒的拯救 |
| 3.1.6 免疫荧光鉴定 |
| 3.1.7 实时荧光定量qPCR鉴定 |
| 3.1.8 重组病毒滴度测定和生长曲线的测定 |
| 3.1.9 激光共聚焦鉴定 |
| 3.1.10 外源基因遗传稳定性检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 ASFV EP402R基因合成结果 |
| 3.2.2 重组病毒全长cDNA的构建结果 |
| 3.2.3 免疫荧光鉴定结果 |
| 3.2.4 实时荧光qPCR鉴定结果 |
| 3.2.5 重组病毒生长曲线的绘制 |
| 3.2.6 激光共聚焦鉴定结果 |
| 3.2.7 外源基因遗传稳定性检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 重组狂犬病毒RBNSP-ASFV-P54 的拯救及其生物学特性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 RABV SAD株全长cDNA、辅助质粒、细胞 |
| 4.1.3 ASFV p54 基因的合成 |
| 4.1.4 嵌合ASFV p54 基因的重组狂犬病毒全长cDNA的构建 |
| 4.1.5 重组病毒的拯救 |
| 4.1.6 免疫荧光鉴定 |
| 4.1.7 实时荧光定量qPCR鉴定 |
| 4.1.8 重组病毒滴度测定和生长曲线的测定 |
| 4.1.9 激光共聚焦鉴定 |
| 4.1.10 外源基因遗传稳定性检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 ASFV p54 基因合成结果 |
| 4.2.2 重组病毒全长cDNA的构建结果 |
| 4.2.3 免疫荧光鉴定结果 |
| 4.2.4 实时荧光qPCR鉴定结果 |
| 4.2.5 重组病毒生长曲线的绘制 |
| 4.2.6 激光共聚焦鉴定结果 |
| 4.2.7 外源基因遗传稳定性检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 重组狂犬病毒RBNSP-ASFV-P30 的拯救及其生物学特性研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 RABV SAD株全长cDNA、辅助质粒、细胞 |
| 5.1.3 ASFV p30 基因的合成 |
| 5.1.4 嵌合ASFV p30 基因的重组狂犬病毒全长cDNA的构建 |
| 5.1.5 重组病毒的拯救 |
| 5.1.6 免疫荧光鉴定 |
| 5.1.7 实时荧光定量qPCR鉴定 |
| 5.1.8 重组病毒滴度测定和生长曲线的测定 |
| 5.1.9 激光共聚焦鉴定 |
| 5.1.10 外源基因遗传稳定性检测 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 ASFV p30 基因合成结果 |
| 5.2.2 重组病毒全长cDNA的构建结果 |
| 5.2.3 免疫荧光鉴定结果 |
| 5.2.4 实时荧光qPCR鉴定结果 |
| 5.2.5 重组病毒生长曲线的绘制 |
| 5.2.6 激光共聚焦鉴定结果 |
| 5.2.7 外源基因遗传稳定性检测结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）狂犬病新型基因工程疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 狂犬病新型灭活疫苗 |
| 2 狂犬病新型弱毒疫苗 |
| 3 狂犬病新型活载体疫苗 |
| 4 狂犬病新型核酸疫苗 |
| 5 狂犬病新型亚单位疫苗和病毒样颗粒疫苗 |
| 6 狂犬病口服疫苗 |
| 7 展 望 |
（3）共表达RABV G蛋白与CDV H蛋白的重组人5型腺病毒的构建与免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新与不足 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表（Abbreviations） |
| 第1章 引言 |
| 1.1 狂犬病研究概况 |
| 1.1.1 狂犬病流行特点及临床症状 |
| 1.1.2 狂犬病病原 |
| 1.1.3 狂犬病防制策略 |
| 1.1.4 狂犬病疫苗研究现状 |
| 1.1.5 狂犬病毒糖蛋白疫苗研究进展 |
| 1.2 羊痘 |
| 1.2.1 羊痘病毒 |
| 1.2.2 羊痘病毒基因组结构特征 |
| 1.2.3 羊痘病毒的应用研究 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第2章 狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗转移载体的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、载体、基因片段 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 主要溶液的配制 |
| 2.2.3 重组病毒构建模型设计 |
| 2.2.4 分段扩增 |
| 2.2.5 融合扩增 |
| 2.2.6 PCR产物的回收及鉴定 |
| 2.2.7 载体单酶切并去磷酸化 |
| 2.2.8 连接 |
| 2.2.9 转化 |
| 2.2.10 菌液PCR鉴定 |
| 2.2.11 质粒提取及鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组病毒的纯化及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株与细胞 |
| 3.1.2 抗体 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 其他材料 |
| 3.1.5 主要仪器及设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 相关试剂配制 |
| 3.2.2 转移载体重组及重组病毒纯化 |
| 3.2.3 G蛋白Western-blot检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组病毒的纯化 |
| 3.3.2 重组病毒纯化的PCR鉴定 |
| 3.3.3 G蛋白表达检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗免疫效果评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验材料与试剂 |
| 4.1.2 主要仪器及设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组羊痘疫苗株抗原检测样品的制备 |
| 4.2.2 重组羊痘疫苗株注射液的制备 |
| 4.2.3 免疫接种试验 |
| 4.2.4 G 蛋白及其中和抗体检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）截短钙网蛋白融合FMDV VP1及PCV2 Cap蛋白表达形成多聚体的免疫原性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 FMDV的研究进展 |
| 1.1 FMD简介 |
| 1.2 FMDV的病原学 |
| 1.3 FMD的防控 |
| 第2章 PCV2的研究进展 |
| 2.1 PCV2简介 |
| 2.2 PCV2病原学 |
| 2.3 PCV2 的防控 |
| 第3章 CRT的研究进展 |
| 3.1 CRT简介 |
| 3.2 截短CRT的功能研究 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 FMDV VP1-CRT融合蛋白制备和反应原性分析 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 重组VP1-CRT融合蛋白对小鼠及豚鼠的免疫效果评价 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 VP1-CRT融合蛋白(rC4V)抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.1 试剂及血清 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 PCV2 Cap-CRT融合蛋白的制备和免疫原性分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）狂犬病病毒糖蛋白重组表达及其基因工程疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 狂犬病病毒(RV)及其G蛋白(RVGP) |
| 2 rRVGP在不同细胞系统中的表达研究进展 |
| 2.1 原核系统 |
| 2.2 真核系统 |
| 2.2.1 酵母系统 |
| 2.2.2 植物系统 |
| 2.2.3 昆虫细胞系统 |
| 2.3 哺乳动物细胞系统 |
| 2.4 病毒载体系统 |
| 3 rRVGP作为疫苗使用的问题及意义 |
| 4 展 望 |
（8）动物病毒重组活载体疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 痘病毒活载体疫苗 |
| 2 疱疹病毒活载体疫苗 |
| 3 腺病毒活载体疫苗 |
| 4 新城疫病毒活载体疫苗 |
| 5 其他动物病毒载体疫苗 |
| 6 展望 |
（9）狂犬病病毒糖蛋白83和367位点突变株的拯救与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 狂犬病概述 |
| 1.1 狂犬病的流行与危害 |
| 1.2 狂犬病的诊断与防控 |
| 2 狂犬病病毒 |
| 2.1 狂犬病病毒基因组结构及功能 |
| 2.2 狂犬病病毒各结构蛋白的功能 |
| 2.3 狂犬病病毒的分型 |
| 2.4 狂犬病病毒的理化性质 |
| 3 狂犬病病毒致病机理 |
| 4 狂犬病病毒糖蛋白(G)免疫原性的研究 |
| 5 狂犬病疫苗的发展与种类 |
| 5.1 狂犬病疫苗的发展 |
| 5.2 狂犬病疫苗的种类 |
| 6 狂犬病病毒反向遗传学技术的发展与应用 |
| 6.1 反向遗传学技术介绍 |
| 6.2 狂犬病病毒反向遗传学的发展与应用 |
| 7 Overlap PCR的原理与应用 |
| 7.1 Overlap PCR原理 |
| 7.2 Overlap PCR的运用 |
| 8 结语 |
| 第二章 狂犬病病毒糖蛋白83和367 位点突变株的拯救与鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂与耗材 |
| 1.1.2 质粒、试验动物、病毒与细胞 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 狂犬病病毒SAD株全长质粒的扩增及G基因测序鉴定 |
| 1.2.2 试验用引物设计 |
| 1.2.3 狂犬病病毒G83和G367 突变毒株全长c DNA的构建 |
| 1.2.4 重组狂犬病病毒突变株及亲本株的拯救与鉴定 |
| 1.2.5 重组狂犬病病毒的传代 |
| 1.2.6 重组狂犬病病毒滴度的测定 |
| 1.2.7 重组狂犬病病毒的遗传稳定性分析及毒力研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 本研究的试验设计 |
| 2.2 狂犬病病毒SAD株全长质粒的鉴定 |
| 2.3 狂犬病病毒重组全长质粒的构建与鉴定 |
| 2.3.1 重叠延伸PCR构建狂犬病病毒重组全长质粒的构建与鉴定 |
| 2.3.2 点突变试剂盒构建狂犬病病毒重组全长质粒的鉴定 |
| 2.4 辅助质粒的鉴定 |
| 2.5 重组狂犬病病毒的鉴定 |
| 2.6 重组狂犬病病毒的遗传稳定性 |
| 2.7 重组狂犬病病毒的多步生长曲线 |
| 2.8 重组狂犬病病毒G蛋白表达量 |
| 2.9 重组狂犬病病毒对乳鼠致病性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 用于拯救野生型狂犬病病毒反向遗传学系统的研究 |
| 3.2 狂犬病病毒G蛋白表达水平与狂犬病病毒致病相关性的研究 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）表达MERS-CoV S1蛋白重组狂犬病病毒的纯化与实验免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 中东呼吸综合征概述 |
| 1.2 中东呼吸综合征疫苗研究现状 |
| 1.3 疫苗纯化工艺研究现状 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 rSRV9-MERSS1悬浮培养的初步研究 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 rSRV9-MERSS1的浓缩纯化方法研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 rSRV9-MERSS1纯化病毒的实验免疫研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、一种重组人腺病毒抗狂犬病疫苗（论文参考文献）
- [1]嵌合非洲猪瘟病毒免疫相关基因的重组狂犬病毒的拯救及鉴定[D]. 刘乐. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]狂犬病新型基因工程疫苗研究进展[J]. 柴本杰,黄菲,裴捷,周明,田大勇,傅振芳,赵凌. 华中农业大学学报, 2021(03)
- [3]共表达RABV G蛋白与CDV H蛋白的重组人5型腺病毒的构建与免疫研究[D]. 燕丽娜. 山东大学, 2020(02)
- [4]狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建[D]. 童剑军. 塔里木大学, 2020(10)
- [5]新型人用狂犬病疫苗研究进展[J]. 孙燕. 国际生物制品学杂志, 2019(06)
- [6]截短钙网蛋白融合FMDV VP1及PCV2 Cap蛋白表达形成多聚体的免疫原性分析[D]. 刘畅. 吉林大学, 2019(02)
- [7]狂犬病病毒糖蛋白重组表达及其基因工程疫苗研究进展[J]. 张莹辉,姚文生,康凯,薛麒,李启红,陈小云,杜吉革,朱真,印春生. 中国人兽共患病学报, 2020(01)
- [8]动物病毒重组活载体疫苗研究进展[J]. 谢青梅,封柯宇,沈勇. 华南农业大学学报, 2019(05)
- [9]狂犬病病毒糖蛋白83和367位点突变株的拯救与鉴定[D]. 王明月. 内蒙古大学, 2019(09)
- [10]表达MERS-CoV S1蛋白重组狂犬病病毒的纯化与实验免疫研究[D]. 刘川玉. 吉林农业大学, 2019(01)