一、应用单克隆抗体对白血病细胞表面标记的观察（论文文献综述）
耿陈露[1]（2021）在《来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究》文中研究指明T细胞是抗肿瘤免疫反应的重要组成部分,是肿瘤免疫治疗的主要作用对象。充分激活T细胞需要TCR（T cell receptor）识别MHC（Major histocompatibility complex）呈递的抗原多肽产生抗原信号,还需要一系列共刺激信号。T细胞表面的CD28共刺激受体与B7配体相互作用,激活下游共刺激信号,促进T细胞的激活和效应细胞功能,这对充分激活T细胞抗肿瘤免疫反应至关重要。但在人体衰老过程和部分实体瘤中,CD8+T细胞表面的CD28蛋白表达会逐渐缺失,CD28的缺失会导致T细胞免疫反应不足以及PD-1/PD-L1（Programmed death-1/programmed death-ligand 1）免疫检查点抑制剂失效。来那度胺（lenalidomide）是一种免疫调节药物（Immunomodulatory drugs,IMi Ds）,可以在缺少CD28和B7相互作用的情况下共刺激T细胞,但来那度胺能否在实体瘤中通过共刺激CD28-T细胞弥补CD28缺失导致的T细胞免疫反应不足以及PD-1/PD-L1抗体治疗失效并没有得到阐述。我们构建了CrbnI391V基因敲入小鼠模型,在小鼠中模拟来那度胺对人源T细胞的共刺激作用,用于探讨来那度胺的共刺激作用对实体瘤免疫治疗的意义。我们的研究结果表明,在CD28缺失的CrbnI391V小鼠中,来那度胺共刺激CD28-CD8+T细胞,增强T细胞免疫反应,可以抑制肿瘤生长并弥补CD28缺失导致的PD-1抗体治疗失效。在结直肠癌病人的肿瘤样本中,来那度胺可以共刺激CD28-CD8+T细胞,并增强这群T细胞对PD-1抗体的响应。在分子机制层面,已知来那度胺可以在T细胞中靶向CRL4CRBN E3泛素连接酶导致转录因子IKZF1（Ikaros）和IKZF3（Aiolos）泛素化降解,上调白细胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）。我们进一步揭示来那度胺可以在CD8+T细胞中上调一些Notch靶基因的表达,而来那度胺在Cd28-/-CrbnI391V小鼠中恢复PD-1抗体的肿瘤抑制效果需要IL-2和Notch信号的参与。这些结果提示,来那度胺有望在肿瘤中浸润有大量CD28-CD8+T细胞的实体瘤病人中增强PD-1抗体的疗效,这一发现对实体瘤的免疫治疗具有一定的临床指导意义。我们尝试进一步挖掘来那度胺的共刺激作用在实体瘤中的治疗潜力。为此,我们通过体内CRISPR文库筛选系统性地寻找能够增强结肠癌细胞对来那度胺治疗敏感性的基因突变,并发现Ptpn2、Jak1和Eef2等基因突变使得小鼠结肠癌细胞对来那度胺的治疗更加敏感。这为充分发挥来那度胺在结肠癌中的免疫治疗潜力提供了潜在的生物标志物和联合治疗靶点。最后,我们利用Cd28-/-CrbnI391V小鼠CD8+T细胞筛选了一些来那度胺类似物,并发现了两个全新的化合物可以高效地共刺激CD8+T细胞,将来可用于进一步肿瘤免疫治疗的研究。创新点:1.明确来那度胺可以在体内和体外共刺激CD28-CD8+T细胞,有望弥补CD28缺失导致的T细胞免疫反应不足。2.发现来那度胺有可能弥补CD28缺失导致的PD-1抗体治疗失效。3.发现来那度胺可以在CD8+T细胞中上调一些Notch靶基因的表达,并确定了这是来那度胺共刺激CD8+T细胞的分子机制之一。4.通过CRISPR文库筛选发现Ptpn2、Jak1和Eef2等基因突变使得小鼠结肠癌细胞对来那度胺治疗更加敏感。
方佳成[2]（2021）在《泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用》文中研究说明癌症已经成为危害人类健康的主要疾病,据世卫组织国际癌症研究机构数据显示,2020年,全球男性和女性将合计出现约1930万和1000万的新发病例和癌症死亡病例,其中的1800万例和930万例将来自实体瘤。然而,对肿瘤治疗的系统评估数据显示,欧洲药物管理局在2009-2013年度批准的大多数抗癌药物未能对患者的整体生命质量产生重大改善。因此,需要继续提高抗肿瘤药物的临床疗效。抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T细胞疗法是发展迅速的肿瘤靶向治疗技术,它们通过特异性识别在恶性细胞和正常组织细胞之间差异过表达的靶标抗原,达到辨识肿瘤和消融肿瘤的目的。ADC和CAR-T实现安全性与有效性的关键,在于其所识别的靶标抗原是否具备足够的肿瘤特异性。因而,鉴别出理想的靶标抗原至关重要。理想的靶标抗原由恶性细胞特异性表达,然而肿瘤特异性抗原屈指可数。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上表达升高,在正常细胞上限制性表达,这一特性使得它们亦能够作为有效定位恶性肿瘤的靶标分子。目的:以发现理想的肿瘤相关抗原为出发点,着力于打造肿瘤相关抗原发现新平台,构建全面的泛实体瘤肿瘤相关抗原图谱,为癌症研究人员和广泛的科学与医药界科研工作者提供研究便利。方法:1.使用经统一处理的TCGA和GTEx的RNA序列数据,对19种类型实体瘤中的20242个HUGO基因进行差异分析;通过将阈值设置为Benjamini-Hochberg adjusted p值为0.01,log2Fold Change为1.0,保留那些在肿瘤细胞群中显着差异表达的HUGO基因;结合蛋白质亚细胞定位信息,排除不具备胞外结构域的蛋白;使用集成了GTEx,HPA和FANTOM5的m RNA表达信息和HPA和HPM的蛋白质丰度信息的数据集,获取在正常组织中受限表达的蛋白分子;使用公开的Blood Spot平台,发现那些在骨髓Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs和Lin-CD34+CD38-CD90-45RA-MPPs中限制性表达的蛋白分子。2.将RNA测序的读段计数数据转换为TPM格式,并将每个基因在其配对适应症和正常组织中的TPM值作为差异表达分析的输入数据。采用非参数Mann-Whitney U检验分析,计算并绘制每个候选靶标分子在特定适应症中的表达相比其在各个人体正常组织中的表达的差异表达谱。3.提取并整理TCGA中泛癌表型数据中的癌组织学分级,病理分级和TNM分期信息;通过挖掘MC3（“多中心多癌种突变识别”）TCGA MAF（“突变注释格式”）数据,确定靶标基因的非沉默体细胞突变（SNP和INDEL）。结合m RNA表达数据,汇编用于评价靶标基因的异质表达模式的综合数据集。4.从TCGA下载并提取靶标基因组变异数据,从Onco KB收集致癌或功能性基因组变异信息,注释并统计靶标基因的变异类型及发生频率,确定在临床上有应用价值的携带特异性驱动变异的功能性靶标。5.通过杂交瘤技术制备CDH17特异性单克隆抗体,进而运用流式细胞术、过表达共定位分析、结合亲和力检测、抗体测序和可变区序列进化关系分析等,多重表征抗体的各项指标。通过偶联mc-Val Cit PABC-MMAE,制备CDH17靶向型ADC。结合体外杀伤实验与细胞内化评估,完成效应分子的初筛验证。6.通过构建KM12SM和COLO205结肠癌细胞系CDX动物模型,综合评估chi2E21-MMAE和chi2F12-MMAE的体内抗肿瘤活性。通过制备和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子,并对给药的荷瘤小鼠的心/肺/肝/肾/结肠/直肠/脾脏进行HE染色,评估CDH17靶向型ADC对小鼠的组织毒性。7.通过慢病毒载体感染CD3+T细胞,制备LYPD3靶向型CAR-T细胞。通过对CAR-T细胞进行分化检测,确定其向效应细胞持续分化的能力。通过体外细胞杀伤实验和细胞因子分泌检测,研究LYPD3靶向型CAR-T细胞对肿瘤细胞的的特异性杀伤作用。通过对荷瘤小鼠循环血中的CAR-T细胞进行计数和检测肿瘤组织中的T细胞浸润水平,揭示LYPD3靶向型CAR-T细胞在小鼠体内发挥持久抗肿瘤作用的机制。结果:1.开发专门的算法和汇编整合有泛实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组信息的综合数据集。2.系统地识别肿瘤相关抗原。通过我们的肿瘤相关抗原发现平台,筛选得到75个潜在的肿瘤相关抗原分子。特别是BACE2、CDH17、CELSR1、CELSR2、COL17A1、COL23A1、CRIM1、DSC3、GPR87、LYPD3、MUC17、NOX1、PTPRN2、SCTR、TRPM8、VCAM1等分子值得做进一步的临床前研究。3.基于CDH17蛋白定向开发的ADC分子可以在体内显着消融KM12SM和COLO205异种移植瘤,并对高表达CDH17蛋白的结肠癌病人来源的异种移植瘤表现出一定的肿瘤抑制效果。chi2F12-MMAE在体外对高药敏度的COLO205显示高水平的细胞毒性（IC50=60.9p M）,chi2E21-MMAE和chi1A13-MMAE对COLO205的抑瘤水平相当（IC50:925.8 p M vs.998.3 p M）。两次单药静脉注射（Q2W）chi2E21-MMAE或chi2F12-MMAE,均能以剂量依赖性的方式抑制KM12SM在小鼠体内的生长,但无法完全清除肿瘤。在COLO205 CDX模型中,按同样的给药方式静注chi2F12-MMAE,1.5 mg/kg剂量的第一针治疗可以起到平缓异种移植肿瘤增长的效果,且两周后的第二针治疗亦能继续起到溶瘤效果;3 mg/kg的中剂量治疗组有部分小鼠的肿瘤在后期出现反弹;6 mg/kg的高剂量治疗可以根治异种移植瘤。4.CDH17靶向型ADC在小鼠体内具有相对可控的组织毒性。制备了能和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子677-MMAE,观察到在677-MMAE给药组小鼠的结直肠的局部组织中有炎症反应,聚集了大量的淋巴细胞;但在其它组织中没有出现炎症反应。此外,在观察期内,小鼠对chi2E21-MMAE、chi2F12-MMAE或677-MMAE的体内耐受良好,用药期间未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。5.LYPD3靶向型CAR-T细胞能够在小鼠体内对PC9异种移植肿瘤发挥持久的抗肿瘤作用。且小鼠对LYPD3-CAR-T的耐受良好,在观察期内未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。进一步调查发现,LYPD3-CAR-T细胞不仅在小鼠外周血中大量存在,还在高响应LYPD3-CAR-T治疗的PC9异种移植瘤组织中大量浸润。此外,LYPD3-CAR-T治疗组的小鼠脾脏内出现大量CD3+T细胞,但在对照组中却没有。CAR-T细胞的记忆表型对于激发持久的免疫应答至关重要。数据显示,LYPD3-CAR-T细胞在输注前,其中的Tn/Tscm细胞和Tcm细胞比例分别高达52.4%和21.7%,具有良好的向效应细胞分化的潜能。结论:通过开发肿瘤相关抗原识别算法和整合来自19种实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组数据,完成了泛实体瘤相关抗原的探索。通过考察CDH17靶向型ADC和LYPD3靶向型CAR-T细胞在模型小鼠中的抗肿瘤活性,例证了CDH17和LYPD3蛋白分别作为ADC和CAR-T靶标开发的可行性。
王丽霞[3]（2021）在《CD109在初发AML中的表达及临床特征分析》文中研究表明目的:研究膜蛋白CD109在初发急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia,AML）不同亚型（急性早幼粒细胞白血病除外）中的表达及其与患者临床特征的相关性,并利用多参数流式细胞术（multiparameter flow cytometry,MFC）从AML患者原代细胞及急性髓系白血病细胞系KG-1a两方面研究CD109在干祖细胞不同细胞群体中的表达分布情况。方法:收集2019年1月至2021年1月山西医科大学第二医院血液科确诊的86例初发AML患者初诊时骨髓标本,利用荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RT-q PCR）检测CD109 m RNA的表达水平,并分析CD109与初发AML患者临床特征的相关性。利用多参数流式细胞术（multiparameter flow cytometry,MFC）检测CD109在AML患者的骨髓标本及人急性白血病髓细胞系KG1-a中的不同细胞群不同免疫标记物或组合（Panels）的阳性表达率（Gate%）和平均荧光强度（MFI）。结果:1.通过RT-q PCR法检测CD109基因在AML患者组与正常对照组中的表达水平,发现与正常对照组相比,CD109在M0、M4组有表达升高（p<0.05,p<0.01）,M1组表达有升高的趋势,但是没有达到统计学差异（p=0.1052）。根据CD34表达情况将AML患者分为CD34阳性和CD34阴性组,结果表明,CD109在CD34阳性组中的表达明显高于CD34阴性组和正常对照组（p<0.05）,而CD34阴性组与正常对照组之间无统计学差异（p>0.05）。2.在CD34阳性的患者中,CD109的表达在FLT3-ITD突变型组明显高于野生型组（P<0.01）。按核型危险度分层将急性髓细胞白血病分为3组:预后良好组,预后中危组和预后不良组,结果发现在CD34阳性组中,CD109的表达在预后不良组明显高于预后良好组和预后中危组（p<0.05）。在CD34阴性组中,CD109的表达在预后中危组中的表达明显高于预后良好组（p<0.05）。在AML患者中,CD109的表达在AML-ETO融合基因阴性组中明显高于阳性组（p<0.05）。3.依据CD109在AML患者中m RNA表达水平的中位数（RQ=2.976）,将CD34阳性AML患者分为CD109高表达组和CD109低表达组,分析CD109基因的表达水平与初发AML患者的各种临床特征的相关性,我们的分析结果是CD109低表达组与高表达组分别在NCCN危险分层、核型分类、FLT3-ITD基因突变的分布上有统计学差异（p<0.05）。4.通过流式细胞术检测CD109在AML患者中的阳性表达率（gate%）和中位荧光强度（MFI）,结果发现与CD34阴性组相比,CD109在CD34阳性组中原始细胞的表达率明显高于CD34阴性组（p<0.05）;在CD34阳性患者中,CD109在原始细胞中CD34阳性细胞群中的表达明显高于CD34阴性细胞群（p<0.001）。在AML患者中,CD109的表达还与CD34抗原的表达呈正相关（p<0.05）。在CD90阳性AML患者中,CD109在CD34+CD38-CD90+、CD34+CD38-CD90-、CD34+CD38+、CD34+CD38+CD117+原始细胞群中的阳性表达率（gate%）和平均荧光强度（MFI）中的结果显示CD109在CD34+CD38+中的阳性表达率的中位数最高,在CD34+CD38-CD90+的中位荧光强度的中位数最高。5.CD109在髓系白血病细胞系中的表达:RQ-PCR结果表明与阴性对照细胞系（K562）相比,CD109在KG1-a中的表达最高,Kasumi细胞次之。因此,选择KG1-a细胞系进一步检测了CD109在KG1-a中的CD34+CD38-CD90+、CD34+CD38-CD90-、CD34+CD38+、CD34+CD38+CD123+、CD34+CD38+CD117+中的阳性表达率和中位荧光强度,发现CD109在CD34+CD38+CD123+中的阳性表达率和表达强度最高,CD34+CD38+次之。结论:1.CD109在初发AML患者中的表达存在异质性。CD109在FAB分型中的M0、M1、M4表达增高,在CD34阳性AML患者中表达增高。在CD34阳性AML中,CD109的表达与FLT3-ITD基因突变,核型预后分组有关。在AML患者中,CD109的表达还与AML-ETO融合基因有关。2.在CD34阳性的患者中,CD109低表达组与高表达组在NCCN危险分层、核型分类、FLT3-ITD基因突变的分布有关。在AML患者中,CD109的表达还与CD34抗原的表达呈正相关。3.CD109在AML患者骨髓中的原始细胞中的CD34+CD38-CD90+这一群细胞中的荧光强度表达最高,是否可以作为AML白血病干细胞的分子标志还有待研究。
崔文平[4]（2021）在《松花粉多糖活性组分及其靶向纳米药物抗ALV-J活性研究》文中研究说明ALV-J作为一种典型的反转录病毒,近些年来在鸡群中多次爆发,给养殖业造成了巨大损失。目前防控ALV-J的种鸡群净化措施存在投入大,周期长等缺点,迫切需要寻求新的方法进行有效防控。前期研究显示松花粉多糖在抗ALV-J试验中具有一定活性,但由于尚未进行深入研究,松花粉多糖抑制ALV-J复制的物质基础尚不清楚,无法解释其抗ALV-J的机制,也难以对其活性和质量进行评价控制。同时,作为一种大分子多糖,在动物体内往往存在难以透过胃肠道黏膜吸收,易被免疫系统识别,导致代谢失活的缺点。因此,研究松花粉多糖抑制ALV-J复制的物质基础,阐释其构效关系,并进一步构建合适的药物递送系统,提高其体内生物利用度和抗ALV-J活性,为ALV-J防治提供新的方法,具有重要的科学意义和研究价值。一、松花粉多糖抗ALV-J活性单体分离鉴定及构效关系研究单因素试验筛选优化提取工艺,通过总多糖提取产率确定最佳提取条件:提取温度90℃,提取溶液p H 9.0,液固比30:1,获得总多糖的最终提取率为6.5±0.19%。通过DEAE离子交换柱和sephadex G-200分子排阻色谱柱分离多糖,得到三个单体组分（PPP-1、PPP-2和PPP-3）。CCK-8试验显示各组分在800μg/m L以下无明显细胞毒性,体外抗病毒试验表明三个组分抗ALV-J活性顺序为PPP-2>PPP-3>>PPP-1。为进一步研究三个组分抗ALV-J活性的构效关系,对其分子量、单糖组成及三螺旋构象进一步分析。结果表明三个组分分子量分别为463.70、99.41和26.97 k Da,差异显着;PPP-2和PPP-3的单糖组成接近,葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量高于PPP-1,而葡萄糖含量显着偏低;刚果红试验显示只有PPP-2具有三螺旋结构,破坏PPP-2三螺旋结构后其活性明显下降。结合文献报道,初步推测松花粉多糖抗ALV-J活性构效关系如下:单糖组成是影响松花粉多糖活性的主要因素,含有酸性单糖的单体组分显示出较好的抗ALV-J活性,空间构象也是影响其活性的重要因素,三螺旋结构的保持可以提高PPP-2抗ALV-J效果,同时分子量也可能对其活性具有一定影响。本部分实验研究了松花粉多糖抑制ALV-J复制的物质基础,阐释其构效关系,为进一步研究松花粉多糖抗ALV-J活性提供了物质基础。二、松花粉多糖壳聚糖纳米药物制备及其抗ALV-J活性研究为改善松花粉多糖在体内易代谢失活的缺点,实验借助松花粉多糖和壳聚糖间的静电作用,以及壳聚糖纳米粒自组装原理,制备了松花粉多糖壳聚糖纳米药物（CS-PPPs NPs）来延长松花粉多糖在鸡体内作用时间,提高抗ALV-J活性。通过包封率、载药量及粒径对CS-PPPs NPs的制备条件进行筛选,得出最优制备工艺:壳聚糖浓度为2 mg/m L、多聚磷酸钠与壳聚糖的比例为1:8,多糖占壳聚糖的浓度10.00%,所制备的CS-PPPs NPs包封率可达91.2%,载药量达8.2%,平均粒径264 nm,PDI=0.21。体外释放实验显示所制备CS-PPPs NPs在96 h累计释放率为90%,具有较好的缓释效果;细胞实验表明,纳米粒可以携带药物进入细胞并可以缓慢释放,低于400μg/m L时,对DF-1细胞没有明显毒性作用;体外抗ALV-J活性结果表明,CS-PPPs NPs通过缓释作用延长了作用时间,提高了抗病毒效果。进一步开展实验结果表明,空白壳聚糖纳米粒没有明显的抗病毒效果,松花粉多糖溶液在短期内有较好的抗ALV-J复制的效果,但在长期实验中,PPPs组因代谢排泄效果明显下降。CS-PPPs NPs在体内显示出较好的缓释作用,在长期抗ALV-J复制中具有较好的效果,可以长时间保护鸡体,提高鸡只的免疫力和生长速度。三、基于抗体靶向的壳聚糖纳米药物递送系统增强松花粉多糖抗ALV-J活性研究为提高药物在动物体内抗病毒活性,同时减小对动物本身的毒性,本实验以松花粉多糖（PPPs）作为模型药物,以JE9抗体作为抗ALV-J指示剂,构建了新型靶向抗ALV-J纳米药物递送系统（Ab-CS-PPPs DDS）。实验通过EDC和NHS催化合成连接抗体的纳米药物（Ab-CS-PPPs NPs）,通过红外光谱、透射电镜和粒度分析仪进行表征,结果显示JE9抗体成功与壳聚糖连接,纳米药物连接抗体后,粒径、包封率、载药量及体外释放度均无显着变化。使用FITC荧光探针,考察其在细胞和动物体内对病毒的靶向性,结果显示,感染ALV-J的细胞对Ab-CS-PPPs NPs摄取更快,持续时间更长。体内实验显示,Ab-CS-PPPs NPs在感染ALV-J鸡的肝脏、肾脏、胸腺、脾脏及法氏囊上具有明显的富集性。体内外抗ALV-J实验均显示,偶联抗体后,纳米药物抑制ALV-J复制的效果提高,说明纳米递送系统对ALV-J具有较好的分布和抑制靶向性。毒理研究表明低于400μg/m L时,对DF-1细胞没有明显毒性作用;体内代谢显示偶联抗体后,纳米药物仍然具有良好的缓释作用,体外抗病毒实验结果表明,在100μg/m L的浓度下,Ab-CS-PPPs NPs可以持续抑制ALV-J的复制,在体外显示出良好的抗病毒效果。最后建立后天感染ALV-J雏鸡模型,肌肉注射CS-PPPs NPs及Ab-CS-PPPs NPs,定期观察各组鸡的临床表现及剖检病理变化,对相关指标检测表明在病毒感染的早期,Ab-CS-PPPs NPs可以持续缓慢的释放,维持稳定的药物浓度,通过药物干预可以显着降低组织的病毒载量并对感染ALV-J雏鸡的生长发育有一定的促进作用。总之,该研究通过对松花粉多糖中的单体多糖及单糖组成进行分离鉴定,研究了其抗ALV-J的活性成分,对其构效关系进行了初步分析;借助静电作用和自组装原理制备了包封率和载药量较高、具有缓释长效作用的松花粉多糖壳聚糖纳米药物;同时以松花粉多糖作为抗病毒模型药物,构建了基于抗体靶向的纳米药物递送系统,进一步提高了松花粉多糖抗ALV-J活性,为ALV-J的防治提供了新的思路和方法,同时为其它靶向抗病毒药物的研制及评价提供了参考。
王呈呈[5]（2021）在《K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用》文中提出K亚群禽白血病病毒（ALV-K）是近些年新发现的一种外源性禽白血病病毒亚群,该亚群主要存在于中国地方鸡群,病毒增殖慢,感染范围广,是我国地方鸡群主要防控对象之一。相对其它亚群禽白血病病毒,该亚群病毒研究起步晚、感染特性和致病机制所知少、缺乏特异性诊断试剂和方法,极大限制了对该病毒深入研究和临床防控检测。本研究旨在根据ALV-K毒株的囊膜表面蛋白基因特性,利用分子生物学、细胞生物学和兽医免疫学等技术方法获得针对该病毒亚群的特异性蛋白抗原和抗体,并建立基于这些抗原抗体介导的特异性检测方法,为该亚群病毒深入研究和临床防控检测提供物质基础和方法依据。本研究首先根据Gen Bank上发表的ALV-K囊膜表面蛋白gp85基因序列,利用生物信息软件筛选出与其他亚群同源性较低的特异性抗原基因片段,设计引物,以ALV-K-JS11C1毒株的基因为模板扩增该基因片段,利用原核表达技术,获得特异性蛋白抗原;其次,对该蛋白抗原进行纯化、鉴定、包被,优化反应条件,建立检测该亚群病毒抗体的ELISA方法,对该方法的特异性、灵敏度、重复性、符合率、保存期等进行评价;第三,利用该蛋白抗原免疫接种兔,制备多克隆抗体,检测其抗体效价和对病毒或抗原的识别特性;第四,利用该蛋白抗原免疫接种Bal b/c小鼠,制备分泌抗体的脾细胞,与SP2/0细胞杂交融合,获得分泌抗体的杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞的染色体数目、分泌抗体类型和识别特性进行检测。结果显示,获得特异性的抗原基因片段大小为310bp,与目前发表的ALV-K亚群同源性为92.9%～100%,而与其他亚群同源性为37%～79.7%;系统进化树显示该基因片段与ALV-K亚群毒株基因亲缘关系很近,与其他亚群较远;蛋白结构抗原性较高。经基因克隆、诱导表达,获得大小为30k Da的目的蛋白条带。对该蛋白进行纯化和包被建立ELISA,并对抗原包被浓度、抗体稀释度、反应条件等进行优化,确定抗原包被浓度为0.75μg/m L、血清抗体稀释度为1:800、二抗稀释浓度为1:5000、一抗孵育时间为45min、二抗孵育时间为60min、显色时间10min为最佳条件;ELISA检测阴性血清临界值为0.705,能区分ALV-K与其它ALV-A/B/J亚群的鸡血清抗体;该方法灵敏度较全长蛋白提高近20倍;板内重复性变异系数在0.90%～7.33%之间,板间重复性显示变异系数在0.84%～5.44%;与商品化ALV p27抗体检测试剂盒符合率可达93.48%;试剂盒至少在5个月内有效。利用该重组蛋白免疫兔可获得效价为8.1×105～5.12×107的血清抗体,所获得的抗体可用于免疫印迹分析（Western blotting）识别ALV-K gp85蛋白和间接免疫荧光分析（IFA）识别细胞中的ALV-K病毒。通过细胞融合和多次亚克隆筛选获得两株分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为ALV-K30B、ALV-K23H,其分泌的抗体亚类分别为Ig G2b、Ig G1,制备的腹水抗体效价可达214和212,所产生的抗体可用于Western blotting特异性识别ALV-K gp85蛋白和IFA识别细胞中的ALV-K亚群毒株,而不识别ALV-A/J亚群毒株。以上结果表明,获取的ALV-K gp85特异性基因片段经诱导表达,可获得成功用于特异性检测鸡血清ALV-K抗体的ELISA包被抗原,也可成功用于制备高效价的多克隆抗体和单克隆抗体。所建立的血清抗体检测ELISA具有良好的特异性、敏感性、稳定性和符合率;所制备的特异性抗体可用于ALV-K病毒及其gp85蛋白的特异性检测。
朱西[6]（2021）在《靶向细胞间粘附分子抗体药物偶联物抗肿瘤作用及机制研究》文中研究表明抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugates,ADCs）通过化学接头将高效的细胞毒性分子与靶向肿瘤细胞表面特定抗原的单克隆抗体偶联,形成了一种新型的靶向药物递送策略。基于抗原抗体的特异性结合特征,ADCs能够选择性地向肿瘤细胞递送毒剂而不伤害正常细胞,极大程度地解决了化疗药物全身暴露及剂量限制性毒性问题,克服了传统细胞毒抗肿瘤药物治疗的主要临床障碍,具有传统化疗药物无法实现的特异性和疗效。以往,ADCs的开发大多围绕抗原分化特征明确的血液系统肿瘤及人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）阳性的实体瘤展开;随着对肿瘤生物学的深入了解以及病理分析技术的迅速发展,越来越多的具有高度差异性表达特征的细胞表面抗原被鉴定出来,ADCs的研发布局逐渐多元化起来。细胞间粘附分子Claudin 18.2和Nectin-4都是构成细胞间连接的重要跨膜蛋白,同时也是目前极具潜力的ADCs靶标。本论文构建了多种稳定表达人Claudin18.2以及人Nectin-4的肿瘤细胞模型,并以此为基础研究了分别靶向Claudin 18.2和Nectin-4的ADCs LZ1904和LMA282的抗肿瘤作用及机制。Claudin是构成紧密连接（Tight Junctions,TJs）的重要跨膜蛋白家族,具有不同的组织特异性表达模式。作为其中一员,Claudin 18.2仅在已分化的胃细胞中广泛表达,并在细胞恶性转化过程中得以保留。同时,研究发现,Claudin 18.2还在其他多种上皮来源的肿瘤中频繁异位激活。这种在正常细胞与肿瘤细胞间显着差异化表达特点促使Claudin 18.2成为极具潜力的肿瘤靶向治疗靶点。作为最早报道也是目前进展最快的以Claudin 18.2为靶点的药物,单克隆抗体IMAB362无论是作为单药还是与化疗药物联用,在临床上均显示出强大的抗肿瘤活性。因此,开发Claudin 18.2靶向药物具有巨大的临床意义。LZ1904是由靶向Claudin 18.2的单克隆抗体LZ1903与拓扑异构酶Ⅰ抑制剂9106-IM-2通过可裂解的连接子偶联而成的新型ADC。研究发现,LZ1904能够选择性地与Claudin 18.2阳性细胞结合,并被细胞内吞转运到溶酶体内,阻滞细胞周期在G2/M期、诱导细胞凋亡,对Claudin 18.2阳性胃癌、胰腺癌细胞具有显着的选择性增殖抑制作用。与此同时,LZ1904还能够通过旁观者效应杀伤邻近的Claudin 18.2阴性的肿瘤细胞,以及通过抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）直接杀伤Claudin 18.2阳性肿瘤细胞。总体而言,LZ1904在体外评价中显示出显着的选择性抗肿瘤作用,值得进一步体内抗肿瘤疗效评价。Nectin是属于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,Ig SF）的细胞间粘附分子,是构成黏着连接（Adherens Junctions,AJs）的重要跨膜蛋白。与Nectin其他家族成员在正常成年人各组织中广泛表达不同,Nectin-4的表达通常局限于胎盘,且在成年人健康组织中表达受限。但是,研究发现,Nectin-4在多种人类癌症中异常过表达,尤其是在膀胱癌、乳腺癌、肺癌中,阳性患者比例均超过50%。同时,作为介导麻疹病毒入侵细胞的受体,Nectin-4本身具有显着的介导内吞能力。鉴于以上两点特征,Nectin-4是极具潜力的ADC靶标。事实上,以Nectin-4为靶点的ADC PADCEV?已于2019年成功获批上市,应用于尿路上皮癌（urothelial carcinoma,UC）的治疗,进一步证明了针对Nectin-4进行药物研发的可行性及巨大的临床潜力。LMA282是以Nectin-4为靶点开发的ADC,由特异性靶向人Nectin-4的单克隆抗体LM282和微管抑制剂MMAE偶联而成。结果显示,LMA282选择性地结合Nectin-4阳性细胞,并被内吞转运到溶酶体内,抑制细胞微管聚集、阻滞细胞周期在G2/M期、诱导细胞凋亡,最终实现对Nectin-4阳性细胞显着的选择性增殖抑制作用。同时,在人膀胱癌、乳腺癌、肺癌小鼠移植瘤模型中,LMA282显示出与PADCEV?相当甚至更优异的体内抗肿瘤作用。这些结果提示,LMA282在多种潜在适应症上具有显着的抗肿瘤活性,为进入临床应用提供了支撑。综上所述,LZ1904与LMA282在多种适应症中显示出了显着的选择性抗肿瘤作用,是很有前景的新型ADCs,具有极大的临床应用潜力。此外,本论文还对PARP抑制剂TSL-1502的抗肿瘤作用及机制进行了研究。PARP酶在DNA损伤应答反应中具有重要作用,抑制其活性会在同源重组（Homologous recombination,HR）缺陷型细胞中产生协同致死效应。目前,已有6款PARP抑制剂获批应用于多种HR缺陷型癌症治疗。但是,这些PARP抑制剂会造成严重的血液系统毒性,极大程度地限制其临床应用。TSL-1502是一种高效的新型PARP抑制剂葡糖醛酸前药,可经肿瘤组织中富含的β-葡萄糖醛酸苷酶水解释放活性母体药物TSL-1502M。结果显示,TSL-1502M能够有效抑制PARP1/2酶活性,促进HR缺陷型肿瘤细胞中双链断裂（Double Strand Breaks,DSBs）积累,诱导细胞G2/M期阻滞及细胞凋亡,抑制细胞增殖,且活性显着优于Olaparib。与此同时,虽然TSL-1502本身并没有对PARP酶直接的抑制活性,但是TSL-1502能够选择性地在肿瘤组织处释放活性代谢物TSL-1502M,在HR缺陷型移植瘤模型中显示出比Olaparib更显着的抗肿瘤作用。总体而言,TSL-1502是一款极具创新及临床应用潜力的新型PARP抑制剂。基于其显着的抗肿瘤活性和选择性释放特性,TSL-1502已在国内开展Ⅰ期临床试验。
李小丰[7]（2021）在《PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究》文中进行了进一步梳理背景:目前,肺恶性肿瘤仍是威胁人类健康的最大敌人之一,中国癌症发病和死亡统计显示,2015年我国肺癌的新发病例数为78.7万,死亡人数为63.1万,均列癌症首位。根据临床和病理特点的不同,肺癌分为小细胞肺癌（占13%）和非小细胞肺癌（占87%）,其5年总生存率仅为18.2%。传统的治疗方法包括手术、化疗、放疗等,但对于晚期肺癌患者均疗效不佳。近年来,随着分子靶向治疗的兴起,非小细胞肺癌的无进展生存期和总生存期都得到了显着改善。具有敏感基因突变的肺癌患者,分子靶向治疗是最有效的治疗方式之一,而对于没有敏感突变或在靶向治疗过程中发生靶基因耐药突变的患者而言,发现新的肿瘤生物学标志物和新的治疗靶点显得尤为重要。鱼精蛋白-1（PRM1）是肿瘤-睾丸抗原（CTA）的一种,CTA在正常情况下只在睾丸组织中表达,而其它组织不表达或极低表达,但当机体出现肿瘤时则可以在某些肿瘤组织中高表达,肿瘤-睾丸抗原也因此得名。既往对于PRM1的研究主要集中在男性生殖领域。近年来,随着CTA在肿瘤领域研究的深入,关于PRM1在恶性肿瘤中的作用也逐渐被重视,研究发现PRM1是结肠癌相关的肿瘤-睾丸抗原基因,利用RT-PCR技术分析PRM1在结肠癌和癌旁组织的表达水平,发现肠癌组织中PRM1-m RNA水平明显高于癌旁和正常组织。也有研究发现PRM1在慢性淋巴细胞白血病患者中高表达,PRM1也被认为是慢性淋巴性白血病的CTA基因。另有研究表明,PRM1在恶性肿瘤中的异常表达,可能与肿瘤的生长侵袭相关。在动物实验中,给裸鼠皮下注射PRM1蛋白可明显提高小鼠肠道肿瘤的发生率。目前为止,尚无关于PRM1在非小细胞肺癌中表达情况的报道,课题组的前期工作已证实,与正常组织比较,PRM1在非小细胞肺癌组织中的表达明显升高。同时,PRM1对非小细胞肺癌细胞具有促进增殖作用。本研究中,我们检测了PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达情况,分析了PRM1蛋白水平与临床特征的相关性;并评估了PRM1在非小细胞肺癌中的诊断价值;通过过表达和敲低PRM1基因观察其对细胞增殖、凋亡及周期的影响;建立非小细胞肺癌裸鼠转移瘤模型,检测转移瘤裸鼠外周血PRM1蛋白的表达水平,观察外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。旨在评估PRM1作为新的生物学标志物对非小细胞肺癌的诊断价值,研究PRM1对非小细胞肺癌细胞的促增殖作用,并对其机制作初步探讨。方法:1、收集110例非小细胞肺癌肿瘤组织、配对正常组织、术前血清和健康者血清标本,应用RT-PCR法、免疫组织化学染色法和ELISA法检测其中PRM1基因和蛋白水平,应用卡方检验统计分析患者肿瘤组织和外周血中PRM1蛋白水平与临床特点的相关性。2、评估PRM1的诊断价值,应用SPSS软件统计分析外周血中PRM1蛋白水平对非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌的诊断价值,并与临床常用的肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1进行比较,评估PRM1诊断价值的优劣性。3、观察细胞内PRM1表达水平对细胞增殖的影响,通过质粒构建技术及si RNA转染技术,过表达和敲低A549、NCI-H460细胞的PRM1基因,应用RTPCR和ELISA法检测细胞PRM1基因和蛋白表达水平,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。4、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对细胞增殖的影响,将人源重组PRM1蛋白和PRM1抗体加入到A549、NCI-H460细胞培养液中,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况。5、观察细胞在不同营养状态下PRM1的表达情况,将A549、NCI-H460细胞培养于含不同浓度血清的培养液中,应用RT-PCR法和ELISA法检测细胞的PRM1基因及蛋白水平。6、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对动物转移瘤生长的影响,制备裸鼠转移瘤模型,将非小细胞肺癌细胞A549皮下注射到裸鼠背部偏右侧,肿瘤形成后,（1）应用ELISA法检测转移瘤裸鼠和健康裸鼠外周血PRM1蛋白水平,并分析其差异性;（2）分别经尾静脉注射人源重组PRM1蛋白、PRM1抗体及两者混合剂,每3日测量并计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。（3）第33天于麻醉下处死裸鼠,取出肿瘤组织,测量重量并计算肿瘤体积,分析外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。结果:1、非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1的m RNA和蛋白水平较配对正常组织明显升高。统计分析显示:随着肿瘤组织中PRM1蛋白水平的增加,肿瘤T分期越晚,淋巴结转移阳性率越高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润无相关性;2、非小细胞肺癌患者外周血中PRM1蛋白水平较健康者显着升高。统计分析显示,淋巴结转移阳性和临床分期较晚的患者外周血中的PRM1蛋白水平更高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润不相关。3、PPM1对于非小细胞具有较高的诊断价值。SPSS软件统计分析显示:（1）外周血中PRM1蛋白水平在非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌中均具有较高的诊断价值。（2）在肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在肺鳞癌中,PRM1的诊断价值明显强于SCC且与CYFRA21-1相当;（3）含有PRM1的肿瘤标志物组合的诊断价值明显高于传统组合;（4）在早期的肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在早期肺鳞癌中,PRM1诊断价值高于SCC且不劣于CYFRA21-1。提示PRM1具有较高的非小细胞肺癌诊断价值。4、非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的PRM1 m RNA水平较人正常肺上皮细胞株BEAS-2B明显升高;同样,A549、NCI-H460细胞内和培养液中的PRM1蛋白水平较BEAS-2B细胞均显着升高。5、成功构建PRM1过表达和敲低的A549、NCI-H460细胞株模型,与对照组比较,过表达PRM1促进A549和NCI-H460细胞的增殖,而敲低PRM1则抑制细胞的增殖。6、外源性PRM1重组蛋白能够促进非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞的增殖,而PRM1抗体则抑制细胞增殖。7、不同营养状态下PRM1的表达存在差异。实验结果显示,随着细胞培养液中血清浓度的降低,A549和NCI-H460细胞PRM1表达水平显着增加。8、细胞周期检测结果提示,过表达PRM1使细胞周期中G0/G1期比例降低,S期细胞比例增加,肿瘤细胞增殖活跃;而敲低PRM1则使细胞周期发生G0-G1期阻滞,S期细胞比例降低,肿瘤细胞增殖受抑;细胞凋亡结果显示,敲低PRM1对A549和NCI-H460细胞的凋亡水平无显着影响。9、动物实验结果:（1）与健康对照组比较,转移瘤裸鼠外周血中PRM1蛋白水平明显升高,也证实了动物实验和体外细胞实验结果与人体组织实验结果一致。（2）外源性PRM1重组蛋白具有促进裸鼠转移瘤生长的作用,而PRM1抗体则抑制转移瘤生长。实验结果提示,与对照组比较,经尾静脉给予外源性PRM1重组蛋白的裸鼠肿瘤生长速度快,肿瘤体积大,而给予PRM1抗体的裸鼠肿瘤生长速度较慢,且肿瘤体积较小。结论:1、PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的特异性高表达,及其对非小细胞肺癌特别是早期患者的诊断价值,使其具备了成为非小细胞肺癌血清学肿瘤标志物的潜质。2、过表达和敲低PRM1基因双向验证了其对非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的促增殖作用,这种作用与增加细胞周期中S期细胞比例相关,而非抑制细胞的凋亡。3、细胞内外PRM1蛋白水平的增加均可促进细胞的增殖,提示PRM1促增殖作用可能存在多条途径,为进一步研究PRM1的作用机制提供线索。4、营养供应差时细胞PRM1的表达水平反而增加,这种负反馈调节作用在一定程度上解释非小细胞肺癌在血供不良的情况下仍快速生长的原因。5、外源性PRM1重组蛋白和抗体对裸鼠转移瘤生长的影响,进一步在生物体内验证了PRM1促进肿瘤生长的作用,同时,PRM1抗体的抑瘤作用也为其成为肿瘤治疗靶点提供直接的理论支持。
高楠[8]（2021）在《SHIV感染恒河猴体内产生针对HIV-1广谱中和抗体机制的研究》文中研究表明获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）又称艾滋病,是严重威胁人类公共健康的传染病之一。这种疾病由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）感染所引发。目前已有的治疗方案虽然可以有效地延长患者寿命,但由于无法完全清除HIV-1感染者体内的病毒潜伏库而不能彻底治愈艾滋病,治疗还会对患者产生一定的副作用并且由治疗引发的耐药性问题也亟待解决。因此,研发出有效的艾滋病疫苗是控制艾滋病传播的重要干预手段。广谱中和抗体（Broadly neutralizing antibodies,bn Abs）是人体经过长期感染HIV而逐渐产生的体液免疫应答,这是一类对大部分HIV-1流行株均具有较强中和能力的抗体,为HIV的治疗和预防策略提供了新的方向。因此能否诱导机体产生bn Abs也成为衡量一个疫苗有效性的重要标准。然而在HIV-1感染的人群中只有约20%患者体内能够产生这类bn Abs,并且通过对bn Abs在人体中进化过程的研究可以发现,这类抗体要经历2-4年的成熟进化才能够形成。人猴嵌合免疫缺陷病毒（Simian/human immunodeficiency virus,SHIV）感染的非人灵长类动物模型（Non-human primate,NHP）作为唯一可以用来评价HIV-1疫苗有效性的动物模型,但其能否和人类一样具有产生bn Abs的能力,且产生机制是否相同目前还不清楚。因此,建立合理的SHIV-NHP模型研究其体内bn Abs的产生及进化机制对于未来HIV-1疫苗的评价具有十分重要的意义。在先前的研究中,很少在SHIV感染的NHP体内检测到广谱中和抗体的产生,但在几项关于SHIV-NHP模型的报道中,极个别的恒河猴在感染SHIV后血浆中产生了具有交叉活性的中和抗体,但并未分离到单克隆bn Abs。这很大程度上是由于bn Abs的产生通常需要2-4年时间,而一般的猴体实验项目所持续的时间不超过2年,抗体没有足够的时间进化成熟为bn Abs。正是由于缺少合适的长期感染模型,因此目前还无法对恒河猴体内产生的中和抗体的性质及成熟过程进行细致深入的研究。因此在本篇论文的研究中,我们利用两种SHIVs分别建立感染模型,并持续跟踪6-7年。通过长期的SHIV感染在恒河猴体内诱导产生广谱中和活性,利用不同敏感度的HIV-1流行株对血浆中和活性进行分析,并分析血浆中和抗体的作用表位。在确定产生广谱中和活性的恒河猴体内分离出单克隆bn Ab,评价其中和广谱性,强度以及表位等特性。再通过分析猴体单克隆抗体（monoclonal antibodies,m Abs）的谱系以及猴体内病毒包膜蛋白的突变情况追溯bn Ab的进化过程以及与SHIV共同进化的过程,从而分析NHP体内与人体内产生广谱中和抗体的相关性,为更好地应用恒河猴模型来评价HIV-1疫苗提供理论和实验依据。首先我们选择了两种感染力较强的SHIVs(SHIV1157ipd3N4和SHIVSF162P3)通过高剂量静脉单次或者低剂量直肠多次的方式感染中国恒河猴,最终在31只恒河猴体内成功建立了感染。通过对猴体内病毒载量的检测可以发现,急性感染期猴体内的病毒载量很高,进入慢性感染期后猴体内有持续的病毒存在。我们对2只SHIV1157ipd3N4感染的恒河猴（G1015R和G1020R）持续监测至感染后6年,发现在感染后期病毒载量有持续升高的趋势,这为bn Abs的产生提供了持续的抗原刺激。随后我们对保留有不同纵向时间点血浆样本的6只恒河猴的进行了中和活性的评价,发现感染早期中和抗体的交叉活性很低,随着感染时间的延长,中和广谱度逐渐升高,感染超过6年的G1015R和G1020R可以中和超过65%的tier 2病毒。并且通过对比不同SHIVs感染恒河猴产生中和抗体的广谱度发现,SHIV1157ipd3N4诱导产生广谱中和活性的能力要强于SHIVSF162P3和SHIVCHN19P4,且直肠攻毒途径更易诱导bn Abs。中和表位特异性分析表明,V2,V3或CD4bs区域中已知bn Abs的抗性突变会降低G1015R和G1020R血浆中和抗体对病毒的敏感性,说明G1015R和G1020R产生的中和活性针对Env的V2,V3以及CD4bs区,这和人体产生的bn Abs具有相似的性质。为了进一步分析恒河猴体内产生的bn Abs,我们通过流式细胞术对猴体内的单克隆抗体进行分离。我们选择了G1015R感染后350周的外周血淋巴细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）样品,分选了针对V2区表位特异性的单个记忆B细胞,并进行抗体可变区基因的扩增,共获得了44对重轻链配对的Ig G基因,通过ELISA筛选其中对同源病毒具有结合活性的抗体,再经过大量表达纯化后进行中和抗体广谱度和强度的评价。我们共分离到12个具有中和活性的抗体,其中6个抗体具有中和多种tier 2病毒的能力。J038是其中中和能力最强的m Ab,可以中和54%的208个全球流行株,这也是目前报道的分离自SHIV感染的NHP体内广谱度最高的抗体。通过对抗体谱系进行分析可以发现6个具有交叉中和活性的抗体均来源于相同谱系（VH4-2*01 F/VK1-20*01 F）。对J038谱系抗体的识别表位进行分析,发现其识别Env主要依赖于N156位和N160聚糖以及V2环上的氨基酸残基。通过对J038 Fab-C1080 Env共结晶的晶体结构进行结合位点分析,可以发现J038所具备的18个氨基酸的HCDR3区并未插入Env V2顶端的内部,而是和V2环反向平行形成了氢键。但J038和聚糖的相互作用占据了抗体-抗原近一半的结合界面,这和分离自人体的V2特异性bn Abs的特征一致。随后,我们对J038谱系抗体的进化过程进行了追溯。通过进化树分析我们推测了J038谱系的共同祖先（Unmutated common ancestor,UCA）和各阶段的中间过渡抗体（Intermediates antibodies,IAs）,UCA和早期的IAs可以中和自体病毒但并不能中和异源病毒,表明J038谱系的广谱中和能力是通过感染过程中逐渐积累突变进化获得的。对各阶段过渡体的结合位点进行同源建模分析可以发现J038谱系抗体在进化的过程中逐渐积累了对包膜蛋白V2区N156和N160位聚糖的结合界面也验证了J038谱系广谱中和抗体的进化过程。通过比对G1015R各时期血浆中病毒env序列可以发现,J038谱系所识别的V2区已经逐渐积累了稳定的突变,其中I165L,K171R和V172A会造成病毒对J038谱系抗体的中和敏感度下降,表明在G1015R恒河猴体内病毒由于中和抗体的选择压力已经产生了逃逸突变。尽管在猴体内抗体选择压力下所产生的逃逸突变和人体内所检测到的突变不完全相同,但猴体内bn Abs和人体内bn Abs的进化过程具有很多相似之处。综上所述,本文成功建立了最长时间的SHIV-NHP感染模型,在其体内诱导产生了广谱中和活性,通过分离单克隆bn Abs获得了目前分离自SHIV感染恒河猴体内中和广谱度最高的的J038谱系抗体,通过对NHP体内产生的bn Abs的性质和进化过程进行了深入的研究发现J038识别与人源V2特异性广谱中和抗体相同的表位,在进化过程中通过积累对聚糖的结合增强广谱性。并且J038谱系的产生也对猴体的病毒产生了免疫选择压力且病毒在此压力下也积累了逃逸突变。通过这项研究对NHP体内是否能产生和人体类似bn Abs及其产生机制进行了合理的分析和阐释。通过本篇论文的研究,可以为更好地应用SHIV-NHP模型评价HIV-1疫苗提供一定的理论和实验依据。
孙琳[9]（2021）在《1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究》文中研究表明研究目的:1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus,T1DM）是一种由遗传因素和环境因素共同诱导,细胞免疫及体液免疫共同介导胰岛β细胞损伤的自身免疫性疾病,在儿童和青少年中更为常见。近年来,流行病学研究表明,我国T1DM发病率明显增加,而患者进行性的胰岛功能下降导致其需要终身应用胰岛素治疗,鉴于其逐年增长的发病率和随之出现的多系统并发症,T1DM已成为重大的公共卫生挑战。目前,T1DM的发病机制尚未完全明确,T细胞相关的研究一直是1型糖尿病的研究热点,而近年来除了CD4+T细胞,越来越多的研究表明CD8+T细胞在1型糖尿病的发病进程中有着重要作用。淋巴细胞活化信号分子家族（signaling lymphocyte activated molecular family,SLAMF）被报道在多种免疫异常疾病中表达异常,并显着影响包括CD8+T细胞在内的免疫细胞分化及功能。然而对T1DM免疫细胞表面SLAMF分子的表达情况未被报道,且对于T1DM中SLAMF分子如何通过影响CD8+T细胞功能仍不明确。为探讨这一问题,本课题通过对T1DM患者及非肥胖的糖尿病小鼠模型（non-obese diabetic,NOD）免疫细胞分化情况及SLAMF分子表达情况进行分析,并进行mRNA测序及相关的体外细胞实验,以期探讨T1DM免疫系统异常分化及SLAMF分子表达对T1DM免疫微环境下CD8+T细胞功能和命运的影响。研究方法:（1）对T1DM患者及健康对照组（health control,HC）的一般临床资料进行统计,利用流式细胞分析法对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中T细胞及其亚群、NK细胞及其亚群、B细胞等免疫细胞比例进行分析,并检测T细胞、B细胞和NK细胞表面SLAM分子家族的表达情况;（2）利用流式细胞分析法对T1DM患者外周血中T细胞SLAMF4分子表达及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌情况进行检测,分析SLAMF4分子与细胞活化状态和细胞因子分泌能力之间的相关性;分析SLAMF4分子表达与1型糖尿病一般临床资料的相关性;（3）对自发性1型糖尿病小鼠模型NOD小鼠进行体重、随机血糖监测及小鼠尾静脉采血,对小鼠胰腺组织留取病理,进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosi,HE）染色,观察其组织细胞形态、炎细胞浸润情况;用流式细胞分析法检测小鼠外周血免疫细胞分化及外周血、胰腺引流淋巴结CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（4）采用流式细胞分选技术得到纯化的T1DM患者的SLAMF4+CD8+T细胞和SLAMF4-CD8+T细胞,并进行mRNA转录组测序,分析差异表达基因的分布及临床意义;（5）应用免疫磁珠分选技术分选脐带血细胞中CD8+T细胞,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体刺激下进行培养,检测作用不同时间CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（6）采用磁珠分选联合流式细胞分选技术正常健康人SLAMF4阳性CD8 T细胞和SLAMF4阴性CD 8 T细胞分别进行分选,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体的刺激下进行体外扩增,用CFSE标记细胞,检测细胞增殖情况,并于Day6检测两种细胞的凋亡情况。研究结果:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞比例与HCs比较存在异常,表现为CD4+T细胞和B细胞比例增多,Treg细胞的比例降低,总NK细胞及其CD56dim亚群的NK细胞比例减低,CD56bright亚群的NK细胞比例升高。与HCs相比,T1DM患者外周血PBMC中SLAMF4阳性的总T细胞百分比降低,且SLAMF4阳性的CD8+T细胞明显降低;SLAMF3分子表达在B淋巴细胞比例有所降低,SLAMF5在NK细胞表面表达升高,差异均有统计学意义。（2）T1DM患者T细胞表面SLAMF4分子表达与细胞活化的状态有关,且与SLAMF4阴性CD8+T细胞相比,SLAMF4阳性CD8+T细胞具备更强的分泌促炎因子IFN-γ和TNF-a的能力;在与T1DM相关的一般临床指标的分析中,发现SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比与糖化血红蛋白水平及T1DM病程呈负相关。（3）与同周龄的Balb/c小鼠相比,NOD小鼠CD4+T细胞及CD4+CD25+的调节性T细胞百分比明显降低,随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下降,且明显低于对照Balb/c小鼠。（4）mRNA转录组测序结果表明,1型糖尿病中SLAMF4作用后的CD8+T细胞表现出多个信号通路的异常改变,包括T细胞受体信号相关的信号通路、细胞因子分泌及细胞凋亡通路,差异表达的基因中也有多个与凋亡相关的基因,说明SLAFM4在1型糖尿病中调控CD8+T细胞的活性与命运。（5）通过体外培养人脐带血CD8+T淋巴细胞发现,一定程度的抗原刺激可促进SLAMF4在脐带血na?ve CD8+T细胞表面上调表达,随着免疫活化的时间延长,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下调。（6）通过SLAMF4阳性CD8+T细胞和SLAMF4阴性CD8+T细胞经CFSE标记后体外培养,发现SLAMF4阴性CD8+T细胞对抗CD3/CD28单克隆抗体的TCR刺激更敏感、更易扩增,增殖能力强,而SLAMF4阳性CD8+T细胞更容易凋亡。研究结论:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞分化比例与HCs相比存在异常,且外周血T细胞及B细胞表面多种SLAM分子表达水平发生变化,结合课题组前期结果,这在T1DM及T2DM之间存在一定共性和不同之处。（2）与HCs相比,T1DM患者SLAMF4阳性CD8 T细胞百分比显着下降,且SLAMF4分子表达与细胞活化的状态及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌有关。在T1DM患者中,SLAMF4+CD8+T细胞百分比与患者的糖化血红蛋白水平和1型糖尿病病程呈负相关。（3）在动物模型中我们发现NOD小鼠也存在外周血T细胞异常分化状态。且随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T百分比逐渐下降,明显低于对照Balb/c小鼠。（4）SLAMF4分子表达与1型糖尿病患者CD8+T细胞功能调控及凋亡显着相关,SLAMF4阳性的CD8+T细胞增殖能力较差且更容易凋亡,故体内持续抗原刺激会导致表达SLAMF4的CD8+T细胞的百分比降低,使其发挥类似调定点作用。综上所述,本课题首次分析了T1DM疾病模型中的SLAMF分子家族的表达谱,为SLAMF分子与T1DM免疫细胞的调控提供了实验证据,证实了在1型糖尿病免疫微环境中SLAMF4表达对CD8+T细胞的功能影响和命运的调控及SLAMF4阳性CD8+T细胞比例变化的具体机制,提示SLAMF4分子可能为T1DM的早期诊断,临床分期或免疫干预提供新靶点。
贺显晶[10]（2021）在《43K OMP在牛坏死杆菌黏附宿主细胞中的作用》文中提出牛坏死杆菌是一种能引起牛肝脓肿、腐蹄病和坏死性喉炎的革兰阴性厌氧杆菌,在奶牛乳房炎和子宫内膜炎中也发挥重要作用,常引起感染组织或细胞的坏死性化脓性病变。近年来,牛坏死杆菌在牛临床感染中具有普遍性的趋势,深入开展其致病机制研究具有理论和现实意义。43K OMP作为牛坏死杆菌的重要外膜蛋白,在牛坏死杆菌黏附感染细胞中可能发挥作用,但相关研究尚属空白。因此,本研究拟明确43K OMP在牛坏死杆菌黏附牛子宫内膜细胞、牛乳腺上皮细胞等宿主细胞中的作用,筛选及鉴定43K OMP黏附宿主细胞的互作蛋白,初步探究牛坏死杆菌黏附宿主细胞后43K OMP介导的炎症反应,阐明43K OMP在牛坏死杆菌黏附过程中的作用,为揭示牛坏死杆菌致病机制和抗菌药物的开发提供理论基础。为明确43K OMP在牛坏死杆菌黏附宿主细胞中的作用,本研究以牛子宫内膜细胞、牛乳腺上皮细胞、鼠乳腺上皮细胞和鼠肝细胞作为细胞模型,利用蛋白黏附实验、抗体抑制实验和蛋白竞争实验明确43K OMP对牛坏死杆菌黏附宿主细胞的影响;将43K OMP基因克隆至p ET-32a载体中,转化入E.coli BL21后进行原核表达,通过黏附实验、抗体抑制实验、蛋白竞争实验和蛋白酶水解实验,分析43K OMP的黏附特性在牛坏死杆菌黏附中的作用。结果显示,43K OMP能黏附于BEECs、MAC-T和MMECs细胞表面;牛坏死杆菌与43K OMP抗体预孵育后,黏附于宿主细胞的牛坏死杆菌数量显着降低（P<0.05）;天然43K OMP与细胞预孵育后,牛坏死杆菌黏附数量明显下降（P<0.05）;经IPTG诱导后黏附宿主细胞的重组菌数量明显升高（P<0.05）;重组菌与43K OMP抗体预孵育后,黏附宿主细胞的重组菌数量显着降低（P<0.05）;天然43K OMP与宿主细胞预孵育后,重组菌黏附数量显着降低（P<0.05）;经不同浓度蛋白酶K（0、25、50、100μg/m L）处理重组菌后,重组菌黏附细胞的数量显着降低（P<0.05）,且与蛋白酶K浓度呈现剂量依赖关系。为明确43K OMP基因与牛坏死杆菌黏附的关系,本研究先后扩增同源重组片段和甲砜霉素抗性片段,连接后克隆入自杀质粒p CVD442中,通过电转化将打靶质粒转入E.coliβ2155获得供体菌。供体菌和A25菌株接合后利用甲砜霉素抗性进行初步筛选,并结合PCR技术和基因测序技术鉴定基因缺失菌是否构建成功。利用基因缺失菌进行黏附实验,验证43K OMP基因缺失对牛坏死杆菌黏附宿主细胞的影响。结果显示,融合的打靶片段大小为1423 bp,测序结果显示打靶质粒构建成功;PCR鉴定和测序结果表明,插入位置的5′端和3?端PCR扩增片段大小为1159 bp和808 bp,构建的质粒稳定插入43K OMP内部使其完整性打断,基因缺失菌A25Δ43K OMP构建成功;与A25菌株相比,基因缺失菌A25Δ43K OMP黏附宿主细胞能力极显着下降（P<0.01）,黏附率降低了90.4%～94.9%。为筛选及鉴定43K OMP与宿主细胞作用的互作蛋白,本研究将重组43K OMP与MAC-T细胞裂解液共孵育,利用Co-IP技术和质谱技术,筛选可能与43K OMP互作的靶标蛋白,并对差异蛋白亚细胞定位和分子功能进行分析,应用Co-IP技术验证靶标蛋白与43K OMP的相互作用。结果显示,差异条带质谱共获得了127个蛋白,280个肽段,筛选出39个可疑差异靶标蛋白,结合亚细胞定位和细菌黏附功能初步筛选出胶原蛋白、纤连蛋白和肌球蛋白等3个靶标蛋白,经Co-IP验证发现43K OMP与细胞外基质蛋白纤连蛋白具有直接相互作用。为初步探究牛坏死杆菌黏附宿主细胞后43K OMP在宿主细胞炎症反应中的作用,本研究运用定量蛋白质组学筛选分析43K OMP刺激MAC-T细胞后与细菌感染相关的通路和差异表达蛋白变化;43K OMP刺激鼠巨噬细胞RAW264.7,通过q RT-PCR检测细胞炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的变化,运用ELISA方法检测细胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的变化,利用Western blot检测细胞IκBα、P65和IL-6等相关蛋白表达水平的变化。结果显示,与对照组相比,43K OMP处理MAC-T细胞后共筛选出224个差异蛋白,包括118个上调蛋白,106个下调蛋白,差异蛋白主要富集于NF-κB通路、细菌入侵、细胞黏附分子等通路,且差异蛋白主要参与细菌黏附、炎症反应等生物学过程;43K OMP刺激RAW264.7细胞后,细胞IL-1βm RNA、IL-6 m RNA和TNF-αm RNA相对表达水平极显着升高（P<0.01）,IL-4 m RNA相对表达水平极显着降低（P<0.01）;细胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量显着升高（P<0.05）;RAW264.7细胞经43K OMP刺激后,细胞IκBα蛋白表达水平显着下降（P<0.05）,p65的S536位点的磷酸化水平极显着升高（P<0.01）。本研究结果表明:43K OMP能介导牛坏死杆菌黏附牛子宫内膜细胞、牛乳腺上皮细胞、鼠肝细胞和鼠乳腺上皮细胞,43K OMP基因缺失降低了牛坏死杆菌黏附宿主细胞的能力,43K OMP通过与纤连蛋白作用介导牛坏死杆菌黏附宿主细胞。同时,43K OMP通过激活NF-κB经典通路,诱导炎症细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌,介导牛坏死杆菌黏附宿主细胞后引起的炎症反应。以上结果揭示了43K OMP在牛坏死杆菌黏附宿主细胞中发挥关键性作用,为深入研究牛坏死杆菌病的致病机制提供了理论基础,更为牛坏死杆菌抗菌药物及疫苗研发提供新思路。
二、应用单克隆抗体对白血病细胞表面标记的观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用单克隆抗体对白血病细胞表面标记的观察（论文提纲范文）
（1）来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 Abbreviations |
| 1 引言 |
| 1.1 肿瘤免疫循环与免疫治疗 |
| 1.1.1 肿瘤免疫循环是肿瘤免疫治疗的基础 |
| 1.1.2 肿瘤免疫循环失调限制免疫治疗效果 |
| 1.2 CD28调控抗肿瘤免疫反应和PD-1/PD-L1抗体治疗效果 |
| 1.2.1 CD28共刺激信号促进CD8~+T细胞的激活和效应细胞功能 |
| 1.2.2 CD28共刺激受体的缺失削弱抗肿瘤免疫反应 |
| 1.2.3 CD28共刺激受体的缺失导致PD-1/PD-L1抗体治疗失效 |
| 1.3 来那度胺的发现与发展 |
| 1.3.1 来那度胺的发现过程 |
| 1.3.2 来那度胺具有广谱的抗肿瘤潜力 |
| 1.4 来那度胺对T细胞的共刺激作用 |
| 1.4.1 来那度胺直接杀伤MM和MDS细胞的分子机制 |
| 1.4.2 来那度胺的抗血管生成作用 |
| 1.4.3 来那度胺增强NK细胞免疫反应 |
| 1.4.4 来那度胺具有共刺激T细胞的作用 |
| 1.4.5 来那度胺共刺激T细胞具有免疫治疗潜力 |
| 1.5 CRBN的I391V突变使得小鼠细胞响应来那度胺 |
| 1.6 来那度胺通过降解IKZF1和IKZF3共刺激T细胞 |
| 1.6.1 来那度胺通过降解IKZF1和IKZF3上调IL-2表达 |
| 1.6.2 IKZF1和IKZF3调控T细胞激活 |
| 1.7 本课题拟解决的科学问题 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 质粒和感受态细胞 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 常用的溶液配制 |
| 2.1.7 小鼠基因型鉴定引物以及Q-PCR引物 |
| 2.1.8 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Crbn~(I391V)小鼠的构建 |
| 2.2.2 MC38-OVA和B16F10-OVA细胞的构建 |
| 2.2.3 细胞培养常用技术 |
| 2.2.4 小鼠T细胞分离和激活实验 |
| 2.2.5 小鼠T细胞杀伤实验 |
| 2.2.6 在小鼠CD8~+T细胞中敲除Ikzf1和Ikzf3 |
| 2.2.7 小鼠肿瘤模型构建与给药处理 |
| 2.2.8 通过流式细胞术分析脾脏细胞中以及肿瘤中浸润的淋巴细胞 |
| 2.2.9 蛋白质免疫印记(Western Blot) |
| 2.2.10 蛋白热位移实验 |
| 2.2.11 RNA测序以及数据分析 |
| 2.2.12 实时荧光定量PCR(Q-PCR) |
| 2.2.13 酶联免疫吸附测定法(ELISA) |
| 2.2.14 CRISPR文库筛选 |
| 2.2.15 统计分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 来那度胺在体外共刺激Crbn~(I391V)小鼠T细胞 |
| 3.1.1 Crbn~(I391V)小鼠的构建 |
| 3.1.2 来那度胺促进Crbn~(I391V)小鼠T细胞激活与增殖 |
| 3.1.3 来那度胺增强Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力 |
| 3.2 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内增强抗肿瘤免疫反应 |
| 3.2.1 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内抑制MC38-OVA肿瘤生长 |
| 3.2.2 来那度胺抑制MC38-OVA肿瘤生长是由CD8~+T细胞介导的 |
| 3.2.3 来那度胺在Crbn~(I391V)小鼠体内促进T细胞激活、增殖和分化 |
| 3.3 来那度胺共刺激CD28~-CD8~+T细胞 |
| 3.3.1 来那度胺在CD8~+T细胞中引起的转录组变化与CD28 共刺激信号类似. |
| 3.3.2 来那度胺共刺激缺少CD28受体的Crbn~(I391V)小鼠T细胞 |
| 3.3.3 来那度胺共刺激结直肠癌病人来源的CD28~-CD8~+T细胞 |
| 3.4 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内增强抗肿瘤免疫反应 |
| 3.4.1 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内抑制MC38-OVA肿瘤生长 |
| 3.4.2 来那度胺部分弥补CD28 缺失造成的T细胞激活、增殖和分化的缺陷 |
| 3.5 来那度胺逆转CD28缺陷导致的PD-1抗体治疗失效 |
| 3.5.1 来那度胺在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内恢复PD-1抗体的疗效 |
| 3.5.2 来那度胺联合PD-1抗体促进结直肠癌病人来源的CD28~-CD8~+T细胞增殖 |
| 3.6 来那度胺通过上调IL-2分泌和调控细胞内在信号共刺激CD8~+T细胞 |
| 3.6.1 免疫调节药物共刺激CD8~+T细胞与其降解IKZF1和IKZF3的效率相关 |
| 3.6.2 敲除Ikzf1或Ikzf3促进小鼠CD8~+T细胞激活 |
| 3.6.3 来那度胺上调Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞中的IL-2信号 |
| 3.6.4 来那度胺部分通过上调IL-2 分泌共刺激CD8~+T细胞 |
| 3.7 来那度胺上调CD8~+T细胞中部分Notch靶基因的表达 |
| 3.7.1 来那度胺通过不依赖于IL-2的方式上调部分Notch靶基因的表达 |
| 3.7.2 在Jurkat T细胞中敲除IKZF1或IKZF3上调部分Notch靶基因的表达 |
| 3.8 上调Notch靶基因表达是来那度胺共刺激CD8~+T细胞的关键分子机制之一 |
| 3.9 阻断IL-2和Notch信号抑制来那度胺与PD-1抗体联合治疗效果 |
| 3.9.1 IL-2 抗体联合Notch抑制剂阻断来那度胺与PD-1抗体在Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠体内的联合治疗效果 |
| 3.9.2 IL-2 抗体联合Notch抑制剂减弱来那度胺联合PD-1抗体促进T细胞激活和分化的能力 |
| 3.10 通过CRISPR文库筛选寻找增强MC38-OVA肿瘤对来那度胺敏感性的基因突变 |
| 3.10.1 CRISPR文库筛选的实验流程和筛选过程中的肿瘤生长变化 |
| 3.10.2 对CRISPR文库筛选的NGS数据进行MAGe CK分析 |
| 3.11 利用Cd28~(-/-)Crbn~(I391V)小鼠CD8~+T细胞筛选具有共刺激T细胞潜力的化合物 |
| 4 结论与意义 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 答辩决议书 |
（2）泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗体偶联药物的知识现状 |
| 引言 |
| 1.1.1 ADC发展简史 |
| 1.1.2 获得监管批准的上市ADC |
| 1.1.3 临床试验中的在研ADC及其靶标图谱 |
| 1.1.4 抗体骨架和靶标的选择 |
| 1.1.5 连接子类型和偶联技术 |
| 1.1.6 有效载荷 |
| 1.1.7 ADC在体内的工作原理 |
| 1.1.8 ADC对难治性癌症的治疗 |
| 1.1.9 ADC的毒性问题 |
| 1.1.10 ADC耐药机制 |
| 1.1.11 未来展望 |
| 1.2 嵌合抗原受体T细胞的知识现状 |
| 引言 |
| 1.2.1 CAR-T发展简史 |
| 1.2.2 CAR-T细胞的工作原理 |
| 1.2.3 CAR和T细胞受体的结构 |
| 1.2.4 获得监管批准的CAR-T |
| 1.2.5 CAR-T细胞疗法的毒性 |
| 1.2.6 未来挑战、机会和应用 |
| 1.3 本课题的研究目标 |
| 第二章 基于多组学构建泛实体瘤相关抗原图谱 |
| 引言 |
| 2.1 数据采集与分析方法 |
| 2.1.1 正常组织转录组和蛋白组的数据采集 |
| 2.1.2 蛋白质亚细胞定位数据的采集与编译 |
| 2.1.3 人体组织器官的重排与映射 |
| 2.1.4 正常组织的表达及其分级 |
| 2.1.5 基因在肿瘤及其癌旁组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.6 基因在肿瘤与其他正常组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.7 肿瘤组织转录组、基因组和表型数据的编译 |
| 2.1.8 功能相关突变的注释 |
| 2.1.9 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.1.10 肿瘤相关抗原与癌细胞功能状态的相关性分析 |
| 2.1.11 基因集富集得分分析 |
| 2.1.12 临床试验的检索策略 |
| 2.1.13 统计分析 |
| 2.2 分析结果 |
| 2.2.1 组装综合数据集并通过算法识别肿瘤相关抗原 |
| 2.2.2 肿瘤相关抗原的表达谱与差异表达谱 |
| 2.2.3 肿瘤相关抗原的异质表达谱 |
| 2.2.4 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.2.5 癌症驱动基因变异全景 |
| 2.2.6 候选肿瘤相关抗原的组合评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 靶向CDH17 的新型ADC的制备及抗结直肠癌活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 TCGA与 GTEx中 CDH17的m RNA数据的获取与分析 |
| 3.3.2 免疫原的设计与制备 |
| 3.3.3 制备靶向CDH17 的单克隆抗体的免疫方案 |
| 3.3.4 抗体可变区基因测序 |
| 3.3.5 鼠-人嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 3.3.6 抗体结合亲和力的测定 |
| 3.3.7 CDH17 靶向抗体偶联vc MMAE |
| 3.3.8 细胞内吞实验 |
| 3.3.9 细胞膜蛋白的提取 |
| 3.3.10 免疫沉淀 |
| 3.3.11 免疫沉淀产物的银染 |
| 3.3.12 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.13 免疫组化 |
| 3.3.14 免疫荧光 |
| 3.3.15 流式细胞实验 |
| 3.3.16 体外细胞毒性实验 |
| 3.3.17 体内抑瘤活性实验 |
| 3.3.18 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CDH17 在消化道肿瘤和正常组织中的表达 |
| 3.4.2 CDH17 靶向抗体的多重表征 |
| 3.4.3 CDH17 靶向ADC的制备与表征 |
| 3.4.4 CDH17 靶向ADC在体外的抗肿瘤活性 |
| 3.4.5 CDH17 靶向ADC在 KM12SM结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.6 CDH17 靶向ADC在 COLO205 结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.7 荷瘤小鼠对CDH17 靶向ADC的耐受性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 靶向LYPD3的CAR-T细胞的抗肺腺癌活性研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 试剂耗材及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 TCGA与 GTEx中 LYPD3 m RNA数据的获取与分析 |
| 4.3.2 抗体人源化 |
| 4.3.3 慢病毒包装 |
| 4.3.4 CD3+T细胞的复苏与激活 |
| 4.3.5 CD3+T细胞慢病毒感染 |
| 4.3.6 CAR-T细胞分化与耗竭的检测 |
| 4.3.7 CAR-T体外细胞杀伤 |
| 4.3.8 CAR-T体内活性实验 |
| 4.3.9 细胞因子的检测 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 LYPD3 蛋白在肿瘤和正常组织中的表达 |
| 4.4.2 LYPD3 靶向的CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性 |
| 4.4.3 LYPD3 靶向的CAR-T细胞在PC9 肺腺癌异种移植模型中抗肿瘤活性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）CD109在初发AML中的表达及临床特征分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验方法和具体实验步骤 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 通过RT-qPCR法检测CD109基因在初发AML患者中的表达水平 |
| 2.2 通过FCM检测CD109膜蛋白在初发AML患者中的表达分析 |
| 2.3 CD109在髓系白血病细胞系中的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 CD109与急性髓系白血病的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）松花粉多糖活性组分及其靶向纳米药物抗ALV-J活性研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 J亚群禽白血病病毒(ALV-J)研究进展 |
| 1.1 ALV-J流行病学特点 |
| 1.2 ALV的理化特征与基因结构特点 |
| 1.2.1 形态学特征 |
| 1.2.2 ALV的理化特性 |
| 1.2.3 ALV基因结构 |
| 1.3 ALV的复制 |
| 1.4 ALV-J的致瘤特点 |
| 1.5 ALV-J致病性及危害 |
| 1.6 ALV-J的检测和诊断 |
| 1.6.1 血清学检测 |
| 1.6.2 免疫荧光技术(IFA) |
| 1.6.3 免疫组化技术 |
| 1.6.4 病毒基因检测 |
| 1.7 ALV-J的防控 |
| 1.7.1 免疫接种 |
| 1.7.2 药物治疗 |
| 1.7.3 种群净化措施 |
| 2 松花粉概述 |
| 3 多糖 |
| 3.1 多糖提取方法 |
| 3.1.1 经典法 |
| 3.1.2 超声波法 |
| 3.1.3 酶法 |
| 3.1.4 其他方法 |
| 3.2 多糖分离纯化 |
| 3.2.1 分级沉淀 |
| 3.2.2 柱分离 |
| 3.2.3 膜分离 |
| 3.3 多糖的生理功能 |
| 3.3.1 抗肿瘤作用 |
| 3.3.2 免疫增强作用 |
| 3.3.3 抗病毒作用 |
| 3.3.4 其他功能 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 松花粉多糖抗ALV-J活性单体分离鉴定及构效关系研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与病毒 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 马尾松花粉粗多糖提取 |
| 2.1.1 花粉除脂 |
| 2.1.2 多糖提取纯化 |
| 2.1.3 苯酚-硫酸法测定多糖含量 |
| 2.2 单体多糖分离纯化 |
| 2.3 单体多糖活性体外评价 |
| 2.3.1 细胞复苏及培养 |
| 2.3.2 细胞毒性试验 |
| 2.3.3 体外抗病毒活性 |
| 2.3.3.1 病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.3.3.2 ELISA法检测细胞上清p27 抗原 |
| 2.3.3.3 qPCR方法检测病毒拷贝量 |
| 2.4 多糖及单体组分表征 |
| 2.4.1 单体多糖分子量测定 |
| 2.4.2 单体多糖红外光谱表征 |
| 2.4.3 单体多糖单糖组成测定 |
| 2.4.4 单体多糖三螺旋结构测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 脱蛋白纯化表征 |
| 3.2 总多糖提取条件筛选 |
| 3.3 单体多糖的分离纯化 |
| 3.4 不同pH条件下单体多糖提取效率比较 |
| 3.5 细胞毒性试验 |
| 3.6 多糖组分体外抗病毒活性评价 |
| 3.6.1 多糖组分对p27 抗原表达的影响 |
| 3.6.2 qPCR方法检测多糖组分病毒拷贝量 |
| 3.7 单体多糖分子量及其分布 |
| 3.8 单体多糖红外光谱分析 |
| 3.9 单糖组成的测定 |
| 3.10 单糖组成相对含量 |
| 3.11 三螺旋结构的测定 |
| 3.12 NaOH处理PPP-2 抗病毒活性研究 |
| 4 讨论 |
| 第三章 松花粉多糖壳聚糖纳米药物制备及抗ALV-J活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒与动物 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 松花粉多糖壳聚糖纳米药物(CS-PPPs NPs)制备 |
| 2.1.1 壳聚糖空白纳米药物(CS NPs)制备 |
| 2.1.2 载药纳米药物(CS-PPPs NPs)制备 |
| 2.2 CS-PPPs NPs体外表征 |
| 2.2.1 透射电镜表征 |
| 2.2.2 粒径及分布表征 |
| 2.2.3 包封率测定 |
| 2.2.4 载药量测定 |
| 2.2.5 体外释放试验 |
| 2.3 CS-PPPs纳米药物体外评价 |
| 2.3.1 细胞毒性试验 |
| 2.3.2 细胞荧光标记试验 |
| 2.3.3 体外抗病毒活性试验 |
| 2.4 纳米药物体内评价 |
| 2.4.1 纳米药物体内代谢行为研究 |
| 2.4.2 ALV-J体内感染模型建立及分组 |
| 2.4.3 泄殖腔排毒监测 |
| 2.4.4 大体剖检 |
| 2.4.5 组织病理观察 |
| 2.4.6 mRNA水平检测血浆病毒载量 |
| 2.4.7 免疫器官指数 |
| 2.4.8 白细胞检测 |
| 2.4.9 外周血淋巴细胞转换率(LTR)测定 |
| 2.4.10 血清中IL-2和IFN-γ分泌量测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 流出曲线图 |
| 3.2 制备工艺筛选 |
| 3.2.1 壳聚糖浓度筛选 |
| 3.2.2 TPP比例筛选 |
| 3.2.3 多糖占壳聚糖浓度筛选 |
| 3.3 体外释放试验 |
| 3.4 纳米药物体外评价 |
| 3.4.1 纳米药物细胞毒性试验 |
| 3.4.2 体外荧光标记 |
| 3.4.3 体外抗病毒活性试验 |
| 3.5 纳米药物体内试验 |
| 3.5.1 纳米药物体内代谢行为研究 |
| 3.5.2 临床症状 |
| 3.5.3 泄殖腔排毒监测 |
| 3.5.4 大体剖检 |
| 3.5.5 组织病理观察 |
| 3.5.6 纳米药物对ALV-J在鸡体复制的影响 |
| 3.5.7 免疫器官指数 |
| 3.5.8 白细胞检测 |
| 3.5.9 纳米药物对感染ALV-J鸡外周血淋巴细胞转换率测定 |
| 3.5.10 纳米药物对感染ALV-J鸡外周血中细胞因子浓度影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 基于抗体靶向的壳聚糖纳米药物递送系统增强松花粉多糖抗ALV-J活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒与动物 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 基于抗体靶向的松花粉多糖壳聚糖纳米药物(Ab-CS-PPPs NPs)制备 |
| 2.1.1 壳聚糖抗体(Ab-CS)复合物的制备 |
| 2.1.2 Ab-CS-PPPs NPs制备 |
| 2.2 Ab-CS-PPPs NPs理化表征 |
| 2.2.1 红外光谱表征 |
| 2.2.2 透射电镜(TEM)表征 |
| 2.2.3 粒径及分布表征 |
| 2.2.4 包封率及载药量测定 |
| 2.2.5 体外释放试验 |
| 2.3 Ab-CS-PPPs NPs体内外ALV-J靶向试验 |
| 2.3.1 Ab-CS-PPPs NPs细胞靶向研究 |
| 2.3.2 Ab-CS-PPPs NPs体内靶向组织分布研究 |
| 2.3.3 Ab-CS-PPPs NPs体内靶器官抑制ALV-J复制研究 |
| 2.4 Ab-CS-PPPs NPs毒理及代谢研究 |
| 2.4.1 细胞毒性研究 |
| 2.4.2 Ab-CS-PPPs NPs体内代谢研究 |
| 2.5 Ab-CS-PPPs NPs体内外抗病毒活性研究 |
| 2.5.1 Ab-CS-PPPs NPs体外抗病毒活性表征 |
| 2.5.2 ALV-J体内感染模型建立及分组 |
| 2.5.3 泄殖腔排毒监测 |
| 2.5.4 大体剖检及组织病理观察 |
| 2.5.5 血浆病毒载量检测 |
| 2.6 Ab-CS-PPPs NPs缓解ALV-J免疫抑制研究 |
| 2.6.1 免疫器官指数 |
| 2.6.2 白细胞及外周血淋巴细胞转换率(LTR)测定 |
| 2.6.3 血清中IL-2和IFN-γ分泌量测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Ab-CS-PPPs NPs理化表征 |
| 3.1.1 Ab-CS复合物制备及红外表征 |
| 3.1.2 Ab-CS-PPPs NPs粒径、包封率及载药量表征 |
| 3.1.3 Ab-CS-PPPs NPs形态及粒径表征 |
| 3.1.4 体外释放试验 |
| 3.2 Ab-CS-PPPs NPs体内外ALV-J靶向试验 |
| 3.2.1 Ab-CS-PPPs NPs细胞靶向研究 |
| 3.2.2 Ab-CS-PPPs NPs体内靶向组织分布研究 |
| 3.2.3 Ab-CS-PPPs NPs体内靶器官抑制ALV-J复制研究 |
| 3.3 Ab-CS-PPPs NPs毒理及代谢研究 |
| 3.3.1 Ab-CS-PPPs NPs细胞毒性试验 |
| 3.3.2 Ab-CS-PPPs NPs体内代谢行为研究 |
| 3.4 Ab-CS-PPPs NPs体内外抗病毒活性研究 |
| 3.4.1 体外抗病毒活性 |
| 3.4.2 临床症状 |
| 3.4.3 泄殖腔排毒监测 |
| 3.4.4 大体剖检 |
| 3.4.5 组织病理观察 |
| 3.4.6 血浆病毒载量 |
| 3.5 Ab-CS-PPPs NPs缓解ALV-J免疫抑制研究 |
| 3.5.1 免疫器官指数 |
| 3.5.2 白细胞检测 |
| 3.5.3 抗体纳米药物对感染ALV-J鸡外周血LTR测定 |
| 3.5.4 纳米药物对感染ALV-J鸡外周血中细胞因子浓度测定 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 禽白血病 |
| 1.1.1 ALV病原学 |
| 1.1.2 ALV流行病学 |
| 1.1.3 ALV致病性 |
| 1.1.4 ALV防控现状与存在问题 |
| 1.2 K亚群禽白血病病毒(ALV-K) |
| 1.2.1 ALV-K的发现 |
| 1.2.2 ALV-K基因结构及特点 |
| 1.2.3 ALV-K致病性及危害 |
| 1.2.4 ALV-K在我国鸡群感染现状 |
| 1.3 ALV抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.1 ALV-A/B/J抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.2 ALV-K抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.3 ALV-K抗体检测ELISA存在的问题 |
| 1.4 ALV单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.1 ALV-A/B/J单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.2 ALV-K单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.3 ALV-K单克隆抗体研究存在的问题 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 病毒、细胞、抗体和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 ALV-K gp85 目的基因分析 |
| 2.2.2 K亚群gp85 蛋白原核表达体系的建立 |
| 2.2.3 间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 2.2.4 ALV-K gp85 蛋白的多克隆抗体制备 |
| 2.2.5 ALV-K gp85 蛋白的单克隆抗体制备 |
| 2.3 数据处理与统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 ALV-K gp85 目的基因分析 |
| 3.1.1 基因序列分析 |
| 3.1.2 目的蛋白分析 |
| 3.2 ALV-K gp85 特异基因的原核表达 |
| 3.2.1 ALV-K gp85 特异基因克隆PCR产物的鉴定 |
| 3.2.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.3 gp85 特异性蛋白的制备及鉴定 |
| 3.3 ALV-K间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 3.3.1 间接ELISA条件的优化 |
| 3.3.2 特异性试验 |
| 3.3.3 敏感性试验 |
| 3.3.4 重复性试验 |
| 3.3.5 符合率试验 |
| 3.3.6 保存期试验 |
| 3.4 ALV-K gp85 蛋白的多克隆抗体制备 |
| 3.4.1 多克隆抗体效价测定 |
| 3.4.2 多克隆抗体的纯化及检测鉴定 |
| 3.4.3 多克隆抗体的识别检测 |
| 3.5 ALV-K gp85 蛋白的单克隆抗体制备 |
| 3.5.1 ALV-K gp85 蛋白免疫小鼠效价测定 |
| 3.5.2 杂交瘤细胞融合观察 |
| 3.5.3 杂交瘤细胞抗体分泌鉴定 |
| 3.5.4 腹水制备鉴定及应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ALV-K gp85 重组蛋白的制备 |
| 4.2 ALV-K间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 4.3 ALV-K多克隆抗体的制备 |
| 4.4 ALV-K单克隆抗体的制备 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得学术成果 |
（6）靶向细胞间粘附分子抗体药物偶联物抗肿瘤作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 靶向细胞间粘附分子抗体药物偶联物抗肿瘤作用及机制研究 |
| 第1 章 引言 |
| 第2章 靶向Claudin18.2 ADC LZ1904 抗肿瘤作用及机制研究 |
| 第1节 稳定表达人Claudin18.2 细胞株构建及验证 |
| 第2节 LZ1904 的体外抗肿瘤作用及机制 |
| 第3章 靶向Nectin-4 ADC LMA282 抗肿瘤作用及机制研究 |
| 第1节 稳定表达人Nectin-4 细胞株构建及验证 |
| 第2节 LMA282 的体外抗肿瘤作用及机制 |
| 第3节 LMA282 体内抗肿瘤活性评价 |
| 第4章 总结与讨论 |
| 第二部分 PARP抑制剂TSL-1502 抗肿瘤作用及机制研究 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 TSL-1502 抗肿瘤作用及机制研究 |
| 第3章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略词表 |
| 附录2 图表目录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（7）PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的研究进展 |
| 1.1.1 肺癌的分类 |
| 1.1.2 非小细胞肺癌的诊断 |
| 1.1.3 非小细胞肺癌的治疗 |
| 1.2 肿瘤-睾丸抗原(CTA)的研究进展 |
| 1.2.1 CTA分类及特征 |
| 1.2.2 CTA表达调控 |
| 1.2.3 CTA作用和功能 |
| 1.2.4 配子发生与恶性生殖 |
| 1.2.5 CTA在恶性肿瘤中的诊断价值 |
| 1.2.6 肿瘤疫苗和免疫治疗 |
| 1.3 人鱼精蛋白1(PRM1) |
| 1.3.1 PRM1 的作用 |
| 1.3.2 PRM1 与恶性肿瘤 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验设备和试剂 |
| 2.1.1 实验设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验细胞和动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床样本的收集 |
| 2.2.2 RT-PCTR法检测样本mRNA水平 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.5 细胞株复苏与培养 |
| 2.2.6 非小细胞肺癌细胞株活力检测 |
| 2.2.7 非小细胞肺癌细胞在不同血清浓度下孵育 |
| 2.2.8 质粒转染和RNA干扰 |
| 2.2.9 人源重组PRM1 蛋白孵育实验 |
| 2.2.10 CCK8 法检测细胞增殖 |
| 2.2.11 EdU法检测细胞增殖实验 |
| 2.2.12 动物实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 PRM1 在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达 |
| 3.1.1 非小细胞肺癌肿瘤组织与配对正常组织PRM1-mRNA水平的差异 |
| 3.1.2 非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1 蛋白水平及临床相关性 |
| 3.1.3 非小细胞肺癌患者外周血中PRM1 蛋白水平及与临床特征的相关性 |
| 3.2 PRM1 诊断价值的评估 |
| 3.2.1 外周血PRM1 蛋白水平对非小细胞肺癌的诊断价值 |
| 3.2.2 PRM1 在肺腺癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.3 PRM1 在肺鳞癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.4 PRM1 在组合标志物中诊断价值的评估 |
| 3.2.5 PRM1 对不同分期的非小细胞肺癌的诊断价值评估 |
| 3.2.6 PRM1 在Ⅰ-Ⅱ期肺鳞癌和肺腺癌中的诊断价值 |
| 3.3 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用的研究-细胞学实验 |
| 3.3.1 PRM1 在非小细胞肺癌细胞株中的表达 |
| 3.3.2 PRM1 基因过表达和敲低对非小细胞肺癌细胞株增殖的影响 |
| 3.3.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 细胞营养状态对PRM1 表达水平的影响 |
| 3.3.5 PRM1对A549、NCI-H460 细胞的细胞周期和凋亡的影响 |
| 3.4 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用研究-动物学实验 |
| 3.4.1 构建A549 细胞裸鼠转移瘤模型 |
| 3.4.2 非小细胞肺癌细胞A549 转移瘤裸鼠血清中PRM1 表达水平 |
| 3.4.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤生长曲线的影响 |
| 3.4.4 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤体积和重量的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）SHIV感染恒河猴体内产生针对HIV-1广谱中和抗体机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 艾滋病 |
| 1.1.1 艾滋病简介 |
| 1.1.2 艾滋病治疗方案研究进展 |
| 1.1.3 艾滋病疫苗研究进展 |
| 1.1.4 艾滋病疫苗的研究模型 |
| 1.2 抗HIV-1 广谱中和抗体 |
| 1.2.1 广谱中和抗体功能及表位 |
| 1.2.2 抗HIV-1 广谱中和抗体产生及进化机制研究 |
| 1.2.3 广谱中和抗体在艾滋病预防和治疗中的应用 |
| 1.3 抗HIV-1 广谱中和抗体的分离与评价技术 |
| 1.3.1 单克隆广谱中和抗体的分离 |
| 1.3.2 单克隆广谱中和抗体评价体系 |
| 1.4 立题依据及实验设计 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 实验设计 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 质粒与基因合成 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 恒河猴饲养及伦理审查 |
| 2.2.3 病毒载量检测 |
| 2.2.4 假病毒制备及TCID50 检测 |
| 2.2.5 免疫印迹法 |
| 2.2.6 中和实验 |
| 2.2.7 单点突变PCR |
| 2.2.8 单细胞流式分选 |
| 2.2.9 抗体可变区扩增 |
| 2.2.10 单克隆抗体表达 |
| 2.2.11 亲和层析纯化蛋白 |
| 2.2.12 酶联免疫吸附反应 |
| 2.2.13 生物膜干涉实验 |
| 2.2.14 单基因组扩增 |
| 2.2.15 抗体进化分析 |
| 2.2.16 抗原抗体结晶复合物结构分析 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 3.1 SHIV长期感染恒河猴模型的建立 |
| 3.1.1 SHIV攻毒策略 |
| 3.1.2 恒河猴体内病毒载量检测 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 SHIV感染恒河猴血浆中和抗体评价 |
| 3.2.1 血浆内抗体中和广谱度及强度评价 |
| 3.2.2 不同SHIVs感染恒河猴产生中和抗体广谱度对比 |
| 3.2.3 血浆内抗体中和表位评价 |
| 3.2.4 表位特异性中和抗体产生过程 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 SHIV感染恒河猴体内广谱中和抗体基因分离 |
| 3.3.1 表位特异性记忆B细胞分选 |
| 3.3.2 抗体可变区基因扩增 |
| 3.3.3 抗体可变区基因谱系分析 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 单克隆抗体表达与纯化 |
| 3.4.1 建立单克隆抗体线性表达体系 |
| 3.4.2 小量表达抗体检测抗原结合活性 |
| 3.4.3 完整抗体表达质粒构建及大量表达单克隆抗体 |
| 3.4.4 小结 |
| 3.5 单克隆抗体中和能力评价 |
| 3.5.1 Small global panel评价抗体中和能力 |
| 3.5.2 Large global panel评价抗体中和能力 |
| 3.5.3 小结 |
| 3.6 中和抗体谱系分析 |
| 3.6.1 抗体可变区谱系来源分析 |
| 3.6.2 抗体进化及脱靶抗体分析 |
| 3.6.3 小结 |
| 3.7 J038 谱系抗体中和表位分析 |
| 3.7.1 J038 谱系抗体表位内氨基酸依赖性分析 |
| 3.7.2 J038 谱系抗体结合抗原形式分析 |
| 3.7.3 小结 |
| 3.8 抗原-抗体复合物晶体结构分析 |
| 3.8.1 Cryo-EM揭示J038 结合Env的 V2 区域 |
| 3.8.2 Env-J038 结合V2 区氨基酸位点分析 |
| 3.8.3 Env-J038 结合V2 区糖基化位点分析 |
| 3.8.4 小结 |
| 3.9 J038 谱系抗体进化过程分析 |
| 3.9.1 推测抗体共同祖先及中间过渡体 |
| 3.9.2 共同祖先及中间过渡体抗原亲和力检测 |
| 3.9.3 共同祖先及中间过渡体中和能力检测 |
| 3.9.4 共同祖先及中间过渡体与Env相互作用界面分析 |
| 3.9.5 小结 |
| 3.10 中和抗体与病毒共进化分析 |
| 3.10.1 SHIV感染恒河猴体内病毒变异程度分析 |
| 3.10.2 病毒包膜蛋白突变对血浆中间抗体的影响 |
| 3.10.3 病毒包膜蛋白V2 区突变对单克隆中和抗体的影响 |
| 3.10.4 小结 |
| 3.11 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 课题的假设与提出 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 1型糖尿病免疫系统异常概述 |
| 2.1.1 适应性免疫系统与1型糖尿病 |
| 2.1.2 先天性免疫系统与1型糖尿病 |
| 2.1.3 免疫治疗在1型糖尿病中的应用 |
| 2.2 SLAM分子家族在免疫系统异常疾病中的表达 |
| 2.2.1 SLAM分子家族概述 |
| 2.2.2 SLAM分子家族在多种疾病中异常表达 |
| 2.3 SLAMF4(CD244)研究现状综述 |
| 2.3.1 SLAMF4(CD244)的结构与功能 |
| 2.3.2 SLAMF4(CD244)的异常表达与疾病 |
| 2.3.3 SLAMF4(CD244)的应用前景与展望 |
| 第3章 T1DM患者免疫系统变化及SLAM分子家族表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 人外周血来源 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 3.3.2 生化的测定 |
| 3.3.3 密度梯度离心法分离PBMC |
| 3.3.4 细胞外标志物染色 |
| 3.3.5 细胞内Foxp3 染色 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 T1DM患者及HCs基线指标及生化检测结果 |
| 3.4.2 T1DM患者及HCs外周血PBMC中T细胞表达 |
| 3.4.3 T1DM患者及HCs外周血PBMC中B细胞表达 |
| 3.4.4 T1DM患者及HCs外周血PBMC中NK细胞表达 |
| 3.4.5 T1DM患者及HCs外周血PBMC中髓系细胞表达 |
| 3.4.6 各免疫细胞表面SLAM分子家族表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 T1DM患者T细胞表面SLAMF4 分子表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 人外周血来源 |
| 4.2.2 材料和试剂 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.3.2 生化及一般临床资料的测定 |
| 4.3.3 密度梯度离心法分离PBMC |
| 4.3.4 细胞外标志物染色 |
| 4.3.5 细胞内IFN-γ/TNF-a染色 |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 T1DM患者及HCs外周血T细胞SLAMF4分子表达 |
| 4.4.2 T1DM患者及HCs外周血T细胞亚群SLAMF4分子表达 |
| 4.4.3 SLAMF4分子表达与细胞活化的状态有关 |
| 4.4.4 T1DM患者外周血SLAMF4分子表达与一般临床资料相关性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 NOD小鼠免疫细胞分化及SLAMF4分子表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和动物 |
| 5.2.1 材料和试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.2.4 垫料与饲料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 NOD小鼠体重及一般情况 |
| 5.3.2 NOD小鼠血糖的测量 |
| 5.3.3 检测小鼠外周血免疫细胞分化及血清分离 |
| 5.3.4 胰腺淋巴结单细胞悬液制备 |
| 5.3.5 小鼠尾静脉采血及血清分离 |
| 5.3.6 密度梯度离心法分离小鼠外周血单个核细胞 |
| 5.3.7 细胞外标志物染色 |
| 5.3.8 苏木精-伊红(hematoxylin and eosin stain,HE)染色 |
| 5.3.9 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 NOD小鼠1型糖尿病发病情况 |
| 5.4.2 NOD小鼠外周血T细胞亚群分布异常 |
| 5.4.3 NOD小鼠T细胞表面SLAMF4分子异常表达 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 SLAMF4调控CD8~+T细胞的增殖与凋亡 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 人脐带血来源 |
| 6.2.2 正常人外周血来源 |
| 6.2.3 T1DM患者外周血来源 |
| 6.2.4 材料与试剂 |
| 6.2.5 仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞 |
| 6.3.2 磁珠分选脐带血CD8~+T细胞 |
| 6.3.3 体外培养脐带血来源的CD8~+T细胞 |
| 6.3.4 流式分选T1DM患者SLAMF4~+及SLAMF4~-CD8+T细胞转录组测序 |
| 6.3.5 磁珠分选正常人外周血来源的CD8~+T细胞 |
| 6.3.6 流式分选正常人SLAMF4~+CD8+T细胞及SLAMF4~-CD8+T细胞 |
| 6.3.7 细胞凋亡检测 |
| 6.3.8 细胞增殖检测 |
| 6.3.9 统计分析 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 体外培养脐带血来源CD8~+T细胞SLAMF4表达情况 |
| 6.4.2 T1DM患者SLAMF4~+及SLAMF4~-CD8+T细胞的RNA测序 |
| 6.4.3 SLAMF4与CD8+T细胞凋亡 |
| 6.4.4 SLAMF4与CD8+T细胞增殖 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第7章 T1DM免疫损伤机理及SLAMF分子异常表达的思考 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）43K OMP在牛坏死杆菌黏附宿主细胞中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛坏死杆菌的研究概况 |
| 1.1.1 牛坏死杆菌的生物学特性 |
| 1.1.2 牛坏死杆菌的致病机理 |
| 1.1.3 牛坏死杆菌病的危害 |
| 1.2 牛坏死杆菌功能蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 白细胞毒素 |
| 1.2.2 溶血素 |
| 1.2.3 内毒素 |
| 1.2.4 外膜蛋白 |
| 1.3 43K OMP在牛坏死杆菌致病中的潜在作用 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 43K OMP介导牛坏死杆菌与宿主细胞黏附作用的确证 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 上皮细胞的鉴定 |
| 2.2.2 牛坏死杆菌A25 菌株的鉴定 |
| 2.2.3 天然43K OMP的提取及重组蛋白的纯化 |
| 2.2.4 牛坏死杆菌43K OMP对宿主细胞的黏附作用 |
| 2.2.5 抗体对牛坏死杆菌黏附宿主细胞的影响 |
| 2.2.6 天然43K OMP对牛坏死杆菌黏附宿主细胞的影响 |
| 2.2.7 牛坏死杆菌43K OMP黏附特性的分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 43K OMP基因缺失对牛坏死杆菌黏附力的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 打靶片段的融合PCR结果 |
| 3.2.2 基因缺失菌的筛选及鉴定结果 |
| 3.2.3 43K OMP基因缺失对牛坏死杆菌黏附宿主细胞的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 43K OMP与宿主细胞互作蛋白的筛选及鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 43K OMP与MAC-T细胞的Co-IP |
| 4.2.2 43K OMP与互作蛋白的质谱分析 |
| 4.2.3 43K OMP与纤连蛋白的Co-IP结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 43K OMP介导宿主细胞炎症反应的初步探究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 43K OMP的细胞毒性试验结果 |
| 5.2.2 43K OMP作用MAC-T细胞的蛋白质组学分析 |
| 5.2.3 43K OMP对 RAW264.7 细胞的炎症因子m RNA相对表达水平的影响 |
| 5.2.4 43K OMP对 RAW264.7 细胞上清中细胞因子分泌的影响 |
| 5.2.5 43K OMP对 NF-κB通路相关蛋白表达水平的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
四、应用单克隆抗体对白血病细胞表面标记的观察（论文参考文献）
- [1]来那度胺增强T细胞抗肿瘤活性的功能与机制研究[D]. 耿陈露. 浙江大学, 2021(01)
- [2]泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用[D]. 方佳成. 西北大学, 2021(12)
- [3]CD109在初发AML中的表达及临床特征分析[D]. 王丽霞. 山西医科大学, 2021(01)
- [4]松花粉多糖活性组分及其靶向纳米药物抗ALV-J活性研究[D]. 崔文平. 山东农业大学, 2021
- [5]K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用[D]. 王呈呈. 山东农业大学, 2021
- [6]靶向细胞间粘附分子抗体药物偶联物抗肿瘤作用及机制研究[D]. 朱西. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2021(08)
- [7]PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究[D]. 李小丰. 吉林大学, 2021(01)
- [8]SHIV感染恒河猴体内产生针对HIV-1广谱中和抗体机制的研究[D]. 高楠. 吉林大学, 2021(01)
- [9]1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究[D]. 孙琳. 吉林大学, 2021(01)
- [10]43K OMP在牛坏死杆菌黏附宿主细胞中的作用[D]. 贺显晶. 黑龙江八一农垦大学, 2021
标签：抗体; 肿瘤; 急性淋巴细胞性白血病; 抗原抗体反应; 单克隆抗体技术;