一、人工肝实验研究 Ⅱ.人工肝治疗家犬急性肝衰竭的疗效（论文文献综述）
李柯,张广浩,张丞,杨嘉屹,吴昌哲,霍小林[1]（2022）在《体外3D规模化扩增肝细胞的培养体系及自动化、智能化生物反应器的评估》文中研究说明背景:如何在体外获得足够数量和质量的肝细胞,是生物人工肝临床应用亟待解决的核心问题。目的:对肝细胞体外3D规模化扩增培养体系的主要研究内容进行综述,总结了当前主要的肝种子细胞来源、3D培养方法、生物反应器系统以及培养过程关键指标实时在线监测的进展和局限,并对自动化、智能化生物反应器系统进一步发展进行展望。方法:由第一作者检索Web of Science核心数据库、ScienceDirect、EI、PubMed以及中国知网数据库,英文检索词为:"hepatocyte,3D culture,proliferate,bioreactorsystem,monitor andcontrol",中文检索词为:"肝细胞、3D培养、增殖、生物反应器系统、监测和控制"。文献检索时间范围为2005年1月至2021年3月,文献的类型包括研究原着、综述和荟萃分析,最终筛选出93篇文献进行综述。结果与结论:（1）目前肝种子细胞来源、3D培养方式、生物反应器系统构建以及关键生化指标实时在线监测方法等方面的研究均取得了一定进展,为进一步构建肝细胞体外3D规模化培养体系奠定了坚实的基础。（2）人肝癌细胞系、永生化肝细胞、干细胞分化及其他来源的肝细胞均能在体外培养增殖并进行肝功能表达,其中干细胞分化和直接重编程得到的肝细胞样细胞具有成熟肝脏细胞类似的细胞形态、功能和基因表达谱特征,在未来有更大的应用前景。（3）3D悬浮培养在培养密度、传质效率方面表现优异,且具有易于放大、接种和取用方便等优点,是肝细胞体外3D培养方式的主要发展方向。（4）现有的生物反应器系统虽然能实现肝细胞体外培养扩增,但自动化程度低,且缺乏对关键生化指标进行实时在线检测方法;此外,当前这几方面的研究相互融合程度低,也制约了肝细胞体外3D规模化培养体系的进展。（5）未来的研究重点是结合不同来源的肝种子细胞的生长特性,选择适合培养方式,以建立培养过程中的关键参数实时在线监测方法,从而构建高度自动化和智能化生物反应器系统,最终实现肝细胞体外规模化制备。
李建州[2]（2015）在《李氏人工肝（Li-ALS）与分子吸附再循环系统（MARS）治疗急性肝衰竭动物的对比研究》文中指出背景：非生物人工肝已经成为临床上治疗肝衰竭非常有效、实用的方法。但是,单一的治疗模式很难完全替代肝脏的功能。将不同的血液净化技术有机组合,从而最大程度清除有害物质,替代肝脏功能,是提高非生物人工肝疗效的关键,也是未来非生物人工肝的发展趋势。分子吸附再循环系统（molecular adsorbents recirculating system, MARS）是目前国外应用最广泛的非生物人工肝系统,但由于缺乏对肝脏合成功能的支持和费用昂贵,在我国临床难以推广应用。近期,本研究团队探索并构建了一套以小剂量血浆置换为基础,联合血浆吸附和血液滤过的多循环新型非生物人工肝支持系统,命名为李氏人工肝（Li’s artificial liver system, Li-ALS）。初步的动物实验证明,Li-ALS不仅能够有效清除肝衰竭动物体内的有毒物质和炎症细胞因子,而且能够补充凝血因子,纠正凝血障碍,全面的替代肝脏功能,显着延长了急性肝衰竭动物的生存时间。目的：通过中国实验小型猪的急性肝衰竭模型,对Li-ALS与MARS的疗效进行对比研究,进一步验证Li-ALS的有效性。方法：选取24只体重23～30千克的中国实验小型猪,在无麻醉条件下通过颈静脉双腔导管注射D-氨基半乳糖（1.3g/kg）建立猪急性肝衰竭模型。在D-氨基半乳糖注射36h后,实验动物随机分为急性肝衰竭对照组（n=8）、MARS治疗组（n=8）、Li-ALS治疗组（n=8）,并开始持续6小时的干预治疗。观察治疗前后所有实验动物临床表现、生存时间,检测不同时间点动物的凝血功能、生化指标、细胞因子,尸检并观察实验动物肝组织病理变化。结果：治疗过程中动物生命体征平稳,无明显不良反应。三组实验动物平均生存时间分别为61.6±2.1小时,73.5±2.2小时,89.1±3.8小时。Kaplan-Meier生存分析提示：MARS及Li-ALS治疗均能够显着延长急性肝衰竭动物的生存时间；Li-ALS治疗组动物的生存时间长于MARS治疗组。Li-ALS治疗能够明显缩短急性肝衰竭动物的凝血酶原时间,提高纤维蛋白原水平,纠正凝血功能障碍；MARS治疗对凝血功能没有改善。Li-ALS与MARS均能够显着改善急性肝衰竭动物的血清生化指标（胆汁酸、胆红素）,降低血氨水平,改善肝性脑病。Li-ALS能够能够有效的清除急性肝衰竭动物血清中的TNF-α、 TGF-β1、 Ang-Ⅱ等多种炎症因子,同时不影响血清中HGF水平,其清除能力强于MARS. Li-ALS治疗后急性肝衰竭动物的的肝脏组织炎症及坏死程度明显减轻,肝细胞再生明显增加。结论：1. Li-ALS和MARS治疗能够显着延长急性肝衰竭动物的生存时间,两者均为有效的治疗急性肝衰竭的人工肝支持手段。2. Li-ALS对急性肝衰竭动物的疗效优于MARS.
熊龙辉[3]（2014）在《新型生物人工肝系统安全性的评估》文中研究说明肝脏作为人体中最重要的器官之一,承担着合成、分泌、代谢、解毒等多种复杂的功能,各种原因一旦造成肝细胞的大量坏死,将出现肝衰竭,导致机体代谢紊乱和毒性物质的堆积,而这反过来又加重了肝细胞的损伤,影响肝细胞的再生,形成肝衰竭的恶性循环。肝衰竭患者病情危重,进展迅速,预后凶险,尽管近年来内科综合治疗措施取得了较大进展,患者病死率依然高达80%,每年死于终末期肝病的患者超过50万,是临床亟待解决的难题。目前,唯一有效的治疗是原位肝移植。但目前遇到极大的困难：由于供体十分缺乏,绝大部分患者难以获得移植机会,很多病人在等待中死亡。术后免疫排斥反应严重、费用高昂等因素严重制约着肝移植的发展。目前,我国每年肝移植手术约5000例左右,且自2007年开始有下降趋势。人工肝技术（血液净化）是肝衰竭治疗的有效新途径。人工肝是借助体外机械、化学或生物性装置,暂时及部分替代肝脏的功能,从而协助治疗肝功能不全、肝衰竭或相关疾病的方法。人工肝支持系统可以辅助清除患者体内毒素、减轻肝脏负担、稳定各项生理、生化指标,是患者恢复肝功能的重要环节。部分患者经人工肝治疗后肝功能可以恢复；部分患者病情危重,难以耐受肝移植手术,只能接受人工肝治疗；在等待肝移植过程中,人工肝可以改善患者状态,为寻找供肝争取时间。目前国内大约已有700多家医院开展了机械人工肝治疗,获得一定疗效,但机械性人工肝治疗对患者生存率并无明显影响。大量实验研究显示,生物人工肝治疗的效果显着优于机械人工肝以及内科治疗。生物人工肝需求群体巨大,其治疗作用无可替代。在国外,生物型人工肝支持系统装置已进行临床研究。但是,其治疗效果未达到预期的疗效,仍然没有现成的产品。目前急需要一种能够应用于临床的商品化的新型生物型人工肝支持系统,能够提高重型肝病患者的生存率与临床治疗效果、遏制病情进展,促进肝脏再生,能起到内外科桥梁作用,能为广大肝衰竭患者带来福音。本课题组研发出了新一代的人工肝支持系统商品化样机,其具有独特的特点：1.此系统能够同时进行肝肾功能支持（人工肝以及CRRT持续性肾脏替代治疗）；2.能够选择多种治疗模式进行血液净化治疗；3.高度智能化以及程序机能化,操作简单、方便,能提供数据的安全操作。本项目拟通过新型生物人工肝支持系统的体内外实验来评估新型生物人工肝支持系统大动物实验的安全性以及稳定性,探讨人工肝治疗的相关技术问题,为生物人工肝有效性评估打下基础,为动物麻醉,模型制作,治疗方式选择,参数设置等提供经验。目的：1.通过新型生物人工肝系统的体外循环实验来初步总结该支持系统的参数设定、治疗模式的选择、稳定性、污染性的评估,为体内循环的大动物实验提供经验及技术支持。2.通过新型生物人工肝系统的体内循环实验进一步探索生物人工肝治疗模式的参数设置、评估大动物人工肝治疗实验的安全性及其稳定性,为有效性的评估实验奠定基础,提供帮助。方法：1.新型生物人工肝系统安全性的评估：体外循环实验。（1）管路的设计制作：根据机器进行闭合式水循环过程中的血流动力学情况将BLS（Blood Line System）-101-SD的人工肝管路进行拼接改造,最终设计出合适的生物人工肝管路；（2）检测系统各个蠕动泵转运速率：实验中将装载各个泵的相应路管,分别以100ml/min、200ml/min的速率转动,动静脉管的接口两端都浸入盛有蒸馏水的桶中,使反渗水以封闭的方式在血路管中循环,同时排除管路中的空气,然后把静脉管接口移至1L的量杯中,泵运转5分钟后,观测量筒的容积,以此来判断蠕动泵转运速率是否符合设定的速率；（3）通过局部法（单位时间内通过的体积）和整体法（进出体积差）测定整套管路以及血浆分离器、血液灌流器、生物反应罐的容量（以了解预充量）；（4）进行密闭式水循环,检测各个报警装置是否正常工作,检测有无气泡产生,有无漏气、漏血等；摸索出最适合人工肝治疗的参数设置,各个泵速最佳组合模式；并评估长时间治疗模式下的耐力性及其污染性。2.新型生物人工肝系统安全性的评估：体内循环实验。（1）生物人工肝实验猪模型制备：实验前适应性喂养1周,术前禁食水12h,自由饮水。氯胺酮肌肉注射诱导麻醉结合股静脉持续泵入丙泊酚维持麻醉,术中间断追加力月西（咪达唑仑注射液）镇静,待麻醉满意后,常规消毒铺单,并心电监护,观察实验过程中心电图、心率、呼吸频率、血氧饱和度。分别于股动脉及颈内静脉置管以备实验用。（2）实验猪肝肾支持系统上机：实验猪上机前所有管路以及滤器先用肝素盐水循环20mins,再用706代血浆预充管路,给予静脉注射地塞米松5mg,非那根（盐酸异丙嗪注射液）25mg肌肉注射,经双腔管按0.5mg·kg-1给予首剂肝素,启动肝素泵,按0.05mg·kg-1·h-1追加肝素,每小时监测活化部分凝血酶时间（APTT）,根据活化部分凝血酶时间值调整肝素泵的速率,治疗结束前1h停止追加肝素。血泵流量调节为50ml/min-60ml/min,分浆泵流量调节为度15ml/min,倒向泵LDP1、LDP2流量调节为18ml/min、反应器往返周期0.4rain。连接压力监测器,检查各个报警装置。每头模型猪接受总共8小时的治疗,前2h模拟混合模式（血液吸附灌流联合生物人工肝治疗）,后6h模拟单纯生物治疗模式（撤掉灌流器）,每隔1小时记录1次静脉压、跨膜压、入浆壶压,动态监测猪的动脉血压、血氧饱和度、心率、呼吸、心电图。治疗过程中,每隔2小时候输入0.9%生理盐水200ml进行冲管,以防止堵塞滤器和管路,密切注意猪的胸廓起伏、生命体征的变化。治疗结束后,继续观察实验猪饮食、饮水、生命体征变化。同时从实验开始第0、4h、8h股静脉采血行血培养、内毒素测定（南方医科大学珠江医院检验科）。（3）统计学分析：数据以均数±标准差表示,样本均数间比较采用单向方差分析（One-Way ANOVA）,系统稳定性采用质量控制图（control chart）进行分析,所有数据经SPSS13.0for Windows统计软件进行处理,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.体外循环实验：运用BLS（Blood Line System）-101-SD管路顺利的完成了三种治疗模式的管路制作；蠕动泵转速正常；灌流器预充量约300m1,生物反应罐预充量约为500m1,整条生物以及非生物部分管路约为300ml。经过局部与整体的实验,可以得出整个珠江Ⅰ号预充量约为1100m1。其中生物反罐500m1,灌流器预充量约300ra1,整条生物以及非生物部分管路约为300ml；在密闭式水循环全过程中,均未见明显大的气泡,未见管路爆破,未见漏水等情况,密闭式循环安全；血流不足检测器,漏血检测器,气泡检测器均运行良好,经过相应的处理后,可解决机器报警问题；在机器连续运行120个小时过程中,机器未出现故障,各个压力值稳定,密闭式循环安全,机器耐受性良好,内毒素测定：10管样本的内毒素测定结果均<5.0EU/ml;血培养结果：动、静脉端需氧、厌氧菌培养14天无细菌生长。2.体内循环实验：将6只猪在实验过程中以及实验结束后均存活良好。实验过程中未出现低血压、高血压、抽搐、透析综合症、发热、出血等不良反应。治疗7天后未见发热、切口感染、出血等并发症。生物人工肝机器运行过程中无故障,无管路爆破、漏血,血浆分离器未见破膜等情况,实验第0h、4h、8h抽血所测得的内毒素结果均小于0.5EU/ml,血培养结果显示培养15天未见细菌生长。西藏猪实验过程中的心电图无明显异常,各时间点平均动脉压、呼吸频率均数间无显着性差异（P>0.05）,第2h心率与0h相比有显着性差异P<0.01（P=0.005）,第2h心率的均数落在质控图下限外,血氧饱和度、呼吸频率、平均动脉压样本均数各时间点均在控制线内,均能维持相对稳定状态,第5小时出现心率加快,血氧饱和度降低,平均动脉压下降的情况。入浆壶压经Welch法校正后以及静脉压、跨膜压均满足方差齐性,经过方差分析发现不同时间点之间存在显着差异（F值分别为2.415,2.357,6.163,P<0.05）,将第1-8小时的值与第0小时的值（对照组）进行比较后发现,静脉压、跨膜压、入浆壶压在第5小时与第0小时相比,明显增高（P<0.05）,而其余各时间点与第0小时之间无显着性差异（P>0.05）；除了第5小时的均数点落在控制线以外,其余各点均在控制线内。结论：通过体外实验对实验参数及相关技术的探索,体内实验的进一步验证,说明在新型人工肝系统治疗过程中,猪的生命体征处于稳定状态,血流动力学相对稳定,猪的呼吸以及循环功能未受到不良影响,人工肝机器的各个压力监测值趋于稳定,动物的生命安全得以保证,在此基础上,我们可以进一步评价猪的肝衰竭模型的有效性。本实验对生物人工肝大动物体外循环、肾脏透析、肝衰竭模型的疗效评价等实验及远期临床应用可提供一定的经验及技术支持。
黄建伟[4]（2010）在《四氯化碳构建犬急性肝衰竭模型及血液净化效果探索》文中指出目的：近年来,人工肝在急性肝衰竭治疗方面取得了较大进展,是血液净化领域迅速发展的一项新技术,然而急性肝衰竭患者病情进展较快、临床病情复杂、影响因素众多,难以客观评价人工肝在急性肝衰竭治疗方面的实际作用。为此,我们尝试建立四氯化碳诱导的犬急性肝衰竭动物模型,探讨非生物型人工肝技术血液灌流联合血液滤过疗法对犬急性肝衰竭动物模型的实际支持力度,并对其有效性进行评估。材料和方法：健康比格犬10只,雌雄各半,年龄在10-12月龄,体重在12-15kg（13.3±1.18 kg）,随机分为对照组（n=5）和对照组（n=5）,第一次静脉注射30%乙酰胺基酚（0.5ml/kg）,腹部皮下注射40%四氯化碳（0.5ml/kg）,第12h重复给药,给药途径相同,给药剂量为第一次给药剂量的1/2,建立犬急性肝衰竭模型,治疗组动物在给药后24小时予以血液灌流联合血液滤过治疗,对照组未进行任何干预措施。动态监测两组动物一般状况、血常规（RBC、WBC、PLT）、生化指标（ALT、AST、TBIL、CHE、Cr、BUN、TP、ALB、NH3、电解质）、对照组未行人工肝干预。对照组和治疗组分别于0h、6h各时间点观察动物一般状况并采血,观察比较两组动物生存时间、一般状况、肝功能指标、组织病理变化。结果：Beagle犬建模后24h内死亡率为0。ALT、AST逐渐增加,在第24h出现高峰,Tbil水平则在第6h出现高峰,肉眼见肝脏充血肿大,暗红色与白色相间,光镜和电子显微镜示线粒体肿胀,粗面内质网明显脱粒,细胞核萎缩等。经血液灌流联合血液滤过治疗后动物一般状况改善;治疗组的生化指标于治疗后同一时间点与对照组相比,均有不同程度改善。结论：四氯化碳诱导Beagle犬ALF模型是可行的。尽管该模型同其他化学药物肝衰竭模型一样具有重复性差的弱点,但该模型与临床上多见肝炎病毒及药物中毒所致的ALF病理生理过程相似,且易于进行连续性监测和体外血液循环治疗,故有望成为人工肝研究新的更理想的实验动物模型。人工肝四氯化碳诱导Beagle犬ALF模型疗效显着。
喻成波[5]（2009）在《微囊漏斗形流化床式生物反应器创建及体外初步评价研究》文中认为研究背景重型肝炎病情危重，预后，凶险，其治疗是临床上一大难题。生物型人工肝（bioartificial liver,BAL）理论上讲可以代偿肝脏的全部功能，构建BAL已经成为人工肝研究领域治疗重型肝炎的热点。生物反应器是生物人工肝的核心装置。目前应用最多的是中空纤维生物反应器，但是难以放大且半透膜致使物质弥散障碍等都限制了其应用。微囊肝细胞培养的流化床反应器是必然的选择。BAL欲得到临床应用，必须容易“放大”，约需1010数量级的肝细胞数。传统体外培养方法难以达到，另外还必须解决免疫排斥问题。生物微胶囊具有选择性物质通透性，允许营养成分及小分子物质自由通过，并且有免疫隔离效果。目前微囊技术已广泛用于生物人工肝研究。目前转瓶大规模微囊肝细胞培养国内外均未见报道，而适合微囊肝细胞的反应器为流化床式生物反应器，流化床的流化作用能使体外循环液充分接触微囊化肝细胞进行物质交换和物质代谢。传统的固化床液体流动时具有剪切力大，物质交换效率低，易于形成无效腔和死腔等缺点。并且其结构多为圆柱体状，液体流化时的不均一性，存在边际效应，导致无效腔形成。我们设计并研制了一种基于改善流化床反应器径向传递性能及混合效果和便于规模化应用的一套漏斗形新型结构流化床反应器。本研究旨在建立微囊永生化肝细胞大规模高活性培养体系；构建新型漏斗形流化床式反应器及对其结构参数的研究；使用体外培养基循环以及重型肝炎血浆模型对此构建的生物反应器进行体外评价，为今后进一步实验提供理论基础。第一部分微囊化永生化肝细胞的大规模转瓶培养及评价目的：本研究旨在建立一种大规模海藻酸／壳聚糖（AC）微囊化肝细胞的转瓶培养体系，并对大规模微囊化肝细胞进行功能评价研究。方法：AC微囊的表征测定（机械强度、物质渗透性免疫隔离作用）、一步法大规模包裹制备微囊永生化肝细胞，微囊肝细胞与裸细胞转瓶培养20天，动态评价微囊肝细胞增殖能力及物质代谢功能。结果：AC微囊能承受高速振荡剪切力的作用而保持形态完整；不仅能对小分子物质如白蛋白自由通过，而且阻止免疫球蛋白的释放。与裸细胞培养比较，大规模转瓶培养AC微囊肝细胞能改善细胞的生长代谢及功能（白蛋白合成、氨代谢以及利多卡因清除能力）。结论：建立了一种大规模AC微囊化肝细胞的转瓶培养体系；一步法大规模制作的AC微囊性能可靠；转瓶培养微囊化肝细胞功能在2周左右达到最佳状态，此培养模式的建立有应用生物人工肝支持系统的广阔前景。第二部分新型漏斗形流化床式反应器初步研制及结构参数研究目的：本研究旨在设计一种符合流体力学的漏斗形生物反应器，通过微囊置于反应器中在模拟体外循外灌流状态下摸索反应器的适宜流化参数。材料与方法：自行设计一定高度和锥度的漏斗形流化床式生物反应器，计算反应器结构参数；观测微囊在流化床流化状态的变化情况。排液体积法测定循环液气含率，测定流化床表观速率、最佳流化高度、观察微囊流化8小时后的完整性。结果：自行设计的漏斗形反应器容积约550ml，高度25cm，锥度92达到最佳流化状态大致分四个过程：固化床、起始流化床、循环床、完全循环流化床。流化床的气含率随着微囊的固含率增加，气含率随之增加，300g／L微囊固含率时气含率达到最大，而后固化率增加气含率缓慢下降。最佳流化高度为23 cm时，泵速为85ml／min，微囊的流化速率为1．19cm／s。流化8小时，微囊完整性在97％以上。结论：流化床式反应器作为承载微囊化人工肝适宜的生物反应器，流化床的流化参数直接影响到流化效果，对这些参数的探索对今后微囊流化床生物反应器的应用于生物人工肝研究具有指导意义。第三部分新型微囊漏斗形流化床式反应器体外初步评价目的：应用培养基循环验证流化床反应器流化作用对肝细胞功能代谢的影响；应用废弃重型肝炎血浆模型对新构建的生物反应器进行评价，观察流化床微囊化肝细胞对重肝血浆的代谢作用以及二者的相互影响。为下一步动物实验奠定基础。材料与方法：正确建立体外循环，将培养2周的微囊化肝细胞分为两组（培养基体外培养组和流化床组），实验组微囊肝细胞置于流化床式生物反应器中，DMEM高糖完全培养基1000ml体外循环12小时，动态检测上清中的ALT、LDH以及白蛋白的水平；重型肝炎血浆置换术后的被置换血浆，作为微囊生物人工肝治疗的血浆模型。将总量约5×109活率在90％以上的微囊肝细胞置于流化床反应器，稀释50％的血浆体外循环6小时，实验前后测定血浆中ALT、TBi、DBi、ALB变化以及微囊肝细胞的活性以及电镜观察肝细胞的微观结构变化情况。结果：体外培养基循环12小时的评价中ALT、LDH水平均有上升，静止培养组ALT上升更为明显，两组相比有显着性差异（H4，p＜0．01；H6，p＜0．05；H12，p＜0．01）。两组白蛋白的合成均有不同程度增多，流化床组升高更为明显（H6，p＜0．01；H12，p＜0．05），与此同时，静止培养组和流化床组从6小时后白蛋白合成量较前比较明显增多，差异有统计学意义（p＜0．05或者p＜0．01）。微囊流化床组实验前肝细胞活率平均为93．5±3．2％，循环12小时后肝细胞活率为90．6±6．5％（P＞0．05）。而培养基静止培养组实验前肝细胞活率平均为93．9±4．4％，实验结束后微囊肝细胞活率略有下降，平均为87．8±3．8％，但没有统计学意义。废弃血浆体外循环功能评价显示：微囊流化床流化6小时后ALT水平无明显上升，静止培养组ALT有明显的升高，两组相比有显着性差异（H6，p＜0．05），而静止培养组中ALT水平较实验前有明显上升（p＜0．05）。体外静止培养组治疗前后总胆红素及直接胆红素无明显下降；而漏斗形流化床组则6小时体外循环后相比静止培养组有明显的下降（p＜0．05）。此外，漏斗形流化床组在治疗前后胆红素也有一定程度下降（p＜0．05），具有统计学意义。两组中白蛋白无明显变化。微囊流化床组循环6小时后肝细胞活率有明显下降（p＜0．05）；静止培养组实验结束后微囊肝细胞活率明显下降，有显着性差异（p＜0．01）。两组在实验结束后活率比较，静止培养组肝细胞活率下降明显，具有显着性差异（p＜0．05）。废弃血浆静止培养的微囊化肝细胞实验结束后肝细胞有明显的损害，出现了空泡性结构。而反应器流化组在实验结束后肝细胞细胞器清晰可见，生长状态尚可，无明显的空泡形成。结论：新构建的漏斗形流化床式生物反应器能使微囊化肝细胞在体外有效地保持活性和功能。载有以大规模微囊化肝细胞接种的漏斗型流化床式生物反应器为基础的的生物人工肝对重肝血浆中的胆红素等有害物质有效清除作用，同时流化床的流化作用对肝细胞有保护作用。建立了评价反应器的体外完整的评价体系，为今后进一步动物实验打好基础。
乔玲,李亚明,张晶,虞岱斌,陈煜,段钟平[6]（2007）在《药物性急性肝衰竭动物模型的建立》文中指出目的建立用于人工肝实验研究的急性肝衰竭大动物模型。方法应用中国实验小型猪13头随机分为3组,低剂量组（n=3）给予1.0g/kg的D-氨基半乳糖;中剂量组（n=6）给予1.2g/kg的药物;大剂量组（n=4）给药剂量为1.5g/kg。观察比较每组动物的一般状况、生存时间、生理生化指标、颅内压、组织病理等方面的变化,从中得出建立急性肝衰竭动物模型的较稳定方法。结果低剂量组动物在给药后均出现一过性的肝功能损害,未出现肝昏迷表现,在给药后3～4d肝功能开始恢复,约1周后指标基本恢复正常,所有动物均存活;高剂量组的动物肝损害出现时间早,损伤剧烈,存活时间短（24.8±5.3h）,均死于严重的肝衰竭。中等剂量组的动物在给药后12h各项指标开始变化明显,在给药48h时损伤达高峰,存活时间为67.9±9.4h,最终死于严重的肝衰竭。结论应用药物方法能建立急性肝衰竭动物模型,其中D-氨基半乳糖1.2g/kg的给药剂量建立的模型稳定性好,且能较好模拟临床急性肝衰竭发生、发展的病理、生理过程,可作为人工肝治疗的实验平台。
章益民[7]（2007）在《HepLL细胞海藻酸—壳聚糖微囊包裹和冻存研究》文中提出前言获得足够数量具有高度活性及良好功能的肝细胞是生物人工肝（Bioartificial liver，BAL）发挥功能和肝细胞移植（Hepatocyte transplantation，HCT）获得成功的关键。众所周知，正常人肝细胞来源有限，且在宿主体内增殖较弱；而胎肝细胞、肿瘤源性肝细胞由于致瘤性风险和伦理学原因，也难以在临床推广应用。为此本实验室已经通过SV40LTag转染正常成人原位肝移植的供肝细胞，建立了一株永生化人源性肝细胞HepLL，在体外可以无限传代。一系列鉴定结果表明它具有和人原代培养肝细胞类似的形态学特征，保持了大部分正常肝细胞的生物学活性。将该永生化HepLL肝细胞进行BALB／C裸鼠移植的实验结果表明，脾内移植的HepLL细胞参与和促进了部分肝切除裸鼠的肝脏再生。前期的工作证实HepLL细胞可在体内外发挥良好的特异性肝细胞功能，有应用于生物人工肝和肝细胞移植的前景；但必须解决体外大规模培养和保存运输等问题。普通的单层贴壁培养为二维平面培养，限制了大规模的扩增和长时间细胞功能的发挥，且其冻存和收获用于生物人工肝和肝细胞移植较为复杂困难。微囊培养为三维空间培养，是进行大规模扩增的良好手段，也是建立生物人工肝和肝细胞移植所需肝细胞库的潜在培养方法，同时为大规模冻存和运输提供了便捷的手段。因此，本实验进行了HepLL细胞海藻酸—壳聚糖（AC）微囊包裹和短期培养的研究，并对AC微囊化HepLL细胞的冻存保护液配方进行了初步的探索。方法1．一步法和两步法海藻酸—壳聚糖（AC）微囊包裹HepLL细胞，MTT法检测包裹后7天两者的活力，以确定适合HepLL细胞AC包裹的方法。2．以单层贴壁的HepLL细胞为对照组，每天以MTT、Ki-67免疫组化染色检测一步法AC微囊包裹HepLL细胞活力和增殖活性，激光共聚焦显微镜、HE染色观察其形态学特征至第10天；以两天为间隔检测其白蛋白、尿素合成、安定转化等肝细胞特异性功能至第10天，评价AC微囊包裹HepLL细胞能否在微囊内发挥良好的生物学活性。3．分别用含海藻糖的冻存保护液和不含海藻糖的冻存保护液冻存一步法AC微囊包裹后6天的HepLL细胞，-80℃冻存14天后复苏，MTT法检测其复苏后当天、第7天的增殖活性，检测复苏后第7天白蛋白合成能力和安定转化能力，以探索AC微囊化HepLL细胞冻存液的较佳配方。结果1．一步法海藻酸—壳聚糖（AC）包裹后7天的HepLL细胞比两步法包裹的活力更强；2．一步法AC微囊包裹的HepLL细胞在微囊内能存活并均匀分布，至第10天细胞增殖标记Ki-67表达仍较强：和单层贴壁的细胞相比一步法AC微囊包裹的HepLL细胞包裹后8天至10天，其活力、合成能力、和生物转化能力更强；3．复苏后当天、第7天，海藻糖组微囊化HepLL细胞活力比对照组微囊化HepLL细胞更强，复苏后第7天其白蛋白合成能力比对照组强。结论以上结果显示一步法AC微囊包裹的HepLL细胞能在微囊内存活、增殖，和单层贴壁的相比，较长时间培养活力更高、功能更强，是潜在的应用于生物人工肝和肝细胞移植的良好细胞培养方式；应用了海藻糖的冻存保护液能较有效地保护冻存微囊化HepLL细胞的功能。本研究为进一步建立体外HepLL细胞大规模培养、冻存、运输体系和生物人工肝、肝细胞移植用肝细胞库提供了实验基础。
杨忠霞[8]（2007）在《血浆置换联合血液滤过干预猪急性肝衰竭的实验研究》文中研究表明目的建立急性肝衰竭大动物模型，评价非生物型组合人工肝血浆置换联合血液滤过的干预效果，并探讨其作用机制。方法将中国实验小型猪11头随机分为对照组（n=5）与治疗组（n=6），静脉注射D-氨基半乳糖（1.2g／kg体重）诱导建立急性肝衰竭大动物模型。治疗组动物在给药后24小时、48小时分别进行血浆置换联合血液滤过治疗，对照组未进行任何干预措施。动态观察比较两组动物一般状况、生化指标（AST、TBIL、Cr、NH3）、PTA、血清细胞因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平变化及肝组织病理变化，并比较两组动物生存时间及每一时间点动物的生存率。结果经人工肝治疗动物一般状况改善；治疗组治疗后生化指标、PTA、炎性细胞因子同一时间点与对照组相比差异具有统计学意义（p＜0.05～p＜0.01），且治疗后较治疗前均有不同程度改善（p＜0.05～p＜0.01）；人工肝治疗后肝脏组织损伤减轻，其损伤程度与血清细胞因子的水平相关；治疗组动物生存时间较对照组明显延长，两组分别为（101.50±13.31）h和（61.20±11.63）h（p＜0.01）；生存率分析显示治疗组生存率曲线高于对照组，两组生存率的差别有统计学意义（p＜0.01）。结论连续两次血浆置换联合血液滤过的组合型非生物人工肝干预，通过部分清除炎症介质，减轻急性肝衰竭动物模型肝组织的损伤程度，显着延长动物生存时间，改善生化及凝血，提高生存率，对急性肝衰竭的治疗效果肯定，可作为临床治疗急性肝衰竭的有效辅助措施。
张磐[9]（2007）在《胎球蛋白A在急性肝衰竭中的保护作用研究》文中提出目的：（1）探讨慢性重型肝炎患者的血清胎球蛋白A（fetuin—A）水平与肝损害程度、预后及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor—α，TNF-α）的关系。（2）体外观察在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下，胎球蛋白A对人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）分泌TNF-α和IL-6的影响。（3）建立一种简便、有效、稳定的暴发性肝衰竭（fulminant hepatic failure，FHF）动物模型，观察该模型动物不同时间点胎球蛋白A的表达情况；并用胎球蛋白A对FHF模型小鼠进行干预，观察胎球蛋白A对实验动物肝功能、肝脏组织学改变、肝细胞凋亡率和病死率的影响，并进一步探讨可能的机制。方法：（1）设立健康对照组、慢性肝炎组和慢性重型肝炎组，慢重肝组中分设恢复组和未恢复组，检测血清胎球蛋白A、TNF—α、凝血酶原活动度、白蛋白和总胆红素。（2）常规分离培养人外周血单个核细胞，2％台盼蓝进行细胞活力检测后，分组观察胎球蛋白A干预对上清液中TNF-α和IL-6的表达量变化（ELISA法）。（3）采用析因试验法，以小鼠24 h病死率为评价指标，以实验鼠的血清肝功能和肝组织病理学改变为验证指标，建立规范化小鼠FHF模型。（4）利用RT-PCR、Western Blot和免疫组化技术，分别从mRNA水平和蛋白质水平研究FHF模型小鼠胎球蛋白A的表达变化。（5）分组观察胎球蛋白A的干预对模型小鼠的24h病死率、肝功能、肝组织病理改变（HE染色）、肝细胞凋亡率（原位末端标记法，TUNEL）改变和血清中TNF-α和IL-6的水平（ELISA法）的影响。结果：（1）血清胎球蛋白A水平在慢性重型肝炎患者（114.02±89.11μg／ml）较健康对照者（317.75±107.83μg／ml）和慢性肝炎患者（253.14±206.45μg／ml）明显降低（P＜0.01）；在慢性重型肝炎患者未恢复组（82.53±47.90μg／ml）较恢复组（203.05±112.94μg／ml）明显降低（P＜0.01）；与凝血酶原活动度（Rho=0.493，P＜0.01）和血清白蛋白水平显着正相关（Rho=0.420，P＜0.01），与血清总胆红素水平显着负相关（Rho=—0.463，P＜0.01）；与血清TNF—α水平显着负相关（Rho=—0.378，P＜0.01）。（2）胎球蛋白A与精胺的联合应用显着抑制了LPS刺激下人PBMC分泌TNF-α（24.89±7.71 pg／ml）和IL-6（112.91±37.80 pg／ml）的水平（P＜0.01）。（3）采用析因实验法筛选出D-GalN 800 mg／kg+LPS 0.04 mg／kg和D-GalN 600 mg／kg+LPS 0.5 mg／kg均为合适建模剂量组合，并通过验证实验确证。（4）在FHF小鼠模型中，随着肝损伤的加重，胎球蛋白A的表达逐渐减少，胎球蛋白AmRNA的表达量下降早于蛋白。免疫组化的结果显示胎球蛋白A主要在肝细胞的胞浆中表达，部分在胞膜表达。（5）胎球蛋白A干预明显降低FHF小鼠的病死率（由83％降至25％，P＜0.05），明显降低血清ALT的水平（由291370.76±29241.68nkat／L降至31585.15±4086.35 nkat／L，P＜0.05），降低血清和肝组织中TNF—α和IL-6的水平（P＜0.05），减轻肝组织炎症坏死程度，减轻肝细胞凋亡的程度（凋亡指数由FHF模型组的23.10±7.39降至2.20±2.97，P＜0.05）。结论：（1）慢性重型肝炎患者的血清胎球蛋白A水平与肝脏损害严重程度、血清TNF-α水平及预后密切相关。（2）胎球蛋白A和精胺合用可以有效抑制LPS刺激下人PBMC释放TNF-α和IL-6。（3）以析因实验法建立一种规范、重复性好、费效比低的FHF模型；在该模型中，随着肝损伤的加重，胎球蛋白A的表达逐渐减少；胎球蛋白A的干预可以改善由D-Galn和LPS诱导的暴发性肝衰竭，其可能的机制之一是通过抑制TNF-α和IL-6等炎症介质的表达。
赵甫涛,葛娅[10]（2007）在《我国人工肝的发展及其在重型肝炎治疗中的应用》文中研究指明
二、人工肝实验研究 Ⅱ.人工肝治疗家犬急性肝衰竭的疗效（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人工肝实验研究 Ⅱ.人工肝治疗家犬急性肝衰竭的疗效（论文提纲范文）
（1）体外3D规模化扩增肝细胞的培养体系及自动化、智能化生物反应器的评估（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1资料和方法Data and methods |
| 1.1资料来源 |
| 1.1.1检索人及检索时间 |
| 1.1.2检索文献时限 |
| 1.1.3检索数据库 |
| 1.1.4检索词 |
| 1.1.5检索文献类型 |
| 1.1.6手工检索情况 |
| 1.1.7检索策略 |
| 1.1.8检索文献量 |
| 1.2入组标准 |
| 1.2.1纳入标准 |
| 1.2.2排除标准 |
| 1.3质量评估及数据提取 |
| 2结果Results |
| 2.1肝细胞来源 |
| 2.1.1人肝癌细胞系 |
| 2.1.2永生化肝细胞 |
| 2.1.3干细胞 |
| 2.1.4其他来源肝细胞 |
| 2.2肝细胞培养方式 |
| 2.2.1 3D支架结构培养 |
| 2.2.2 3D悬浮培养 |
| 2.3生物反应器系统 |
| 2.4培养过程实时在线监测与调控 |
| 2.4.1 p H值与溶解氧浓度的监测与控制 |
| 2.4.2肝细胞浓度在线监测 |
| 2.4.3关键生化指标在线检测方法 |
| 3总结与展望Summary and prospects |
| 3.1当前研究中存在的问题 |
| 3.2文章区别于他人他篇的特点 |
| 3.3综述的局限性 |
| 3.4综述的重要义 |
（2）李氏人工肝（Li-ALS）与分子吸附再循环系统（MARS）治疗急性肝衰竭动物的对比研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 目录 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. 急性肝衰竭模型的建立 |
| 2. 人工肝治疗对急性肝衰竭动物的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 实用新型说明书 |
| 附图 |
| 作者简历及在读期间研究成果 |
（3）新型生物人工肝系统安全性的评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 新型生物人工肝系统安全性的评估：体外循环实验 |
| 1 材料与仪器 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 新型生物人工肝系统安全性的评估：体内循环实验 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 结果与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间的成果 |
| 致谢 |
（4）四氯化碳构建犬急性肝衰竭模型及血液净化效果探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 1 前言 |
| 1.1 急性肝功能衰竭治疗现状 |
| 1.2 人工肝治疗急性肝功能衰竭原理 |
| 1.3 人工肝动物模型建立研究背景 |
| 1.4 研究目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 急性肝功能衰竭广州本地犬模型的建立 |
| 2.2 Beagel犬急性肝衰竭模型的建立 |
| 2.3 人工肝急性肝功能衰竭Beagle犬模型 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 急性肝功能衰竭广州本地犬模型的建立 |
| 3.1.1 肝功能改变 |
| 3.1.2 肝脏病理改变 |
| 3.2 急性肝功能衰竭Beagle犬模型的建立 |
| 3.2.1 肝功能改变 |
| 3.2.2 肝脏病理改变 |
| 3.3 人工肝急性肝功能衰竭Beagle犬模型 |
| 3.3.1 人工肝治疗前后肝功能改变 |
| 3.3.2 人工肝治疗前后血常规改变 |
| 4 讨论 |
| 4.1 人工肝治疗急性肝功能衰竭意义 |
| 4.2 建立血液灌流联合血液滤过药物性犬急性肝功能衰竭 |
| 4.3 问题与展望 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩写词表 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（5）微囊漏斗形流化床式生物反应器创建及体外初步评价研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 前言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:微囊化永生化肝细胞的大规模转瓶培养及评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分:新型漏斗形流化床式反应器初步研制及结构参数研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分:新型微囊漏斗形流化床式反应器体外初步评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 个人简历 |
| 在学期间的发表文章 |
| 专利情况 |
（7）HepLL细胞海藻酸—壳聚糖微囊包裹和冻存研究（论文提纲范文）
| 一、论文摘要 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 二、正文 |
| 第一部分 AC法包裹HepLL细胞和短期培养 |
| 第一节 一步法和两步法AC微囊包裹HepLL细胞 |
| 第二节 一步法AC微囊包裹HepLL细胞和短期培养 |
| 第二部分 海藻糖作为AC微囊化HepLL冻存保护剂的初步研究 |
| 参考文献 |
| 三、综述 |
| 微囊化肝细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 四、英文缩写一览表 |
| 五、在读期间发表的论文、获得的专利和奖项 |
| 六、致谢 |
（8）血浆置换联合血液滤过干预猪急性肝衰竭的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 研究背景 |
| 立题依据 |
| 研究内容 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在校期间研究成果 |
| 缩略语 |
| 致谢 |
| 附图 |
（9）胎球蛋白A在急性肝衰竭中的保护作用研究（论文提纲范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、英汉缩略语名词对照表 |
| 四、论文正文 |
| 前言 |
| 第一章 慢性重型肝炎患者血清胎球蛋白A的临床意义 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 胎球蛋白A对脂多糖刺激下人PBMC的TNF-α,IL-6分泌的抑制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 析因试验法建立规范化小鼠暴发性肝衰竭模型 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 胎球蛋白A在急性肝衰竭小鼠模型中的表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 胎球蛋白A在急性肝衰竭小鼠模型中的保护作用及机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 五、综述 |
| 综述一:实验性肝损伤动物模型的制备和机制研究 |
| 综述二:胎球蛋白A的研究现况及其临床意义 |
| 六、致谢 |
| 七、攻读学位期间主要的研究成果 |
四、人工肝实验研究 Ⅱ.人工肝治疗家犬急性肝衰竭的疗效（论文参考文献）
- [1]体外3D规模化扩增肝细胞的培养体系及自动化、智能化生物反应器的评估[J]. 李柯,张广浩,张丞,杨嘉屹,吴昌哲,霍小林. 中国组织工程研究, 2022(19)
- [2]李氏人工肝（Li-ALS）与分子吸附再循环系统（MARS）治疗急性肝衰竭动物的对比研究[D]. 李建州. 浙江大学, 2015(10)
- [3]新型生物人工肝系统安全性的评估[D]. 熊龙辉. 南方医科大学, 2014(12)
- [4]四氯化碳构建犬急性肝衰竭模型及血液净化效果探索[D]. 黄建伟. 暨南大学, 2010(02)
- [5]微囊漏斗形流化床式生物反应器创建及体外初步评价研究[D]. 喻成波. 浙江大学, 2009(11)
- [6]药物性急性肝衰竭动物模型的建立[J]. 乔玲,李亚明,张晶,虞岱斌,陈煜,段钟平. 传染病信息, 2007(05)
- [7]HepLL细胞海藻酸—壳聚糖微囊包裹和冻存研究[D]. 章益民. 浙江大学, 2007(02)
- [8]血浆置换联合血液滤过干预猪急性肝衰竭的实验研究[D]. 杨忠霞. 兰州大学, 2007(04)
- [9]胎球蛋白A在急性肝衰竭中的保护作用研究[D]. 张磐. 中南大学, 2007(02)
- [10]我国人工肝的发展及其在重型肝炎治疗中的应用[J]. 赵甫涛,葛娅. 华南国防医学杂志, 2007(01)