一、蚕豆保卫细胞原生质体质膜ABA结合蛋白的理化特性（论文文献综述）
刘维妙[1]（2021）在《芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究》文中研究表明花粉发育和授粉受精过程是开花植物完成有性生殖的重要环节。花粉发育异常会影响其功能的正常完成,进而影响后代的繁衍。授粉受精过程的顺利进行离不开花粉管正常的萌发和伸长。花粉管的萌发通常起始于成熟花粉粒的内壁。在花粉管快速伸长的过程中尤其需要细胞壁的快速扩展,众多细胞壁合成和重塑蛋白都参与其中。植物扩展蛋白（expansins,EXP）是一类重要的细胞壁重塑蛋白,可以与细胞壁的多糖组分结合,通过破坏细胞壁组分之间的非共价键引起植物细胞壁的松弛,促进植物细胞的生长。扩展蛋白基因家族被细分为四个亚家族,分别是EXPA（expansin A subfamily,扩展蛋白A亚家族）、EXPB（expansin B subfamily,扩展蛋白B亚家族）、EXLA（expansin like A subfamily,扩展蛋白类A亚家族）和EXLB（expansin like B subfamily,扩展蛋白类B亚家族）。虽然近年来扩展蛋白基因的功能被广泛研究,但是有关扩展蛋白基因在植物生殖发育阶段的功能以及有关EXPA和EXPB亚家族基因协调作用都还鲜有报道。本文以白菜‘矮脚黄’（Brassica campestris ssp.chinensis,syn.B.rapa ssp.chinensis cv.Aijiaohuang）核雄性不育两用系ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’和黑芥（B.nigra cv.Z1411-02）以及甘蓝（B.oleracea cv.Jingfeng 1）为材料,对芸薹属三个二倍体基本种的扩展蛋白基因家族进行鉴定、进化和表达分析,明确三个基本种扩展蛋白基因家族的进化特征,为探究扩展蛋白基因在花粉和花粉管发育过程中的功能提供相关基础;由基因家族分析筛选到两个在白菜花粉发育后期和花粉管中高表达的基因BrEXPB4和BrEXPB9,通过人工microRNA技术研究BrEXPB4和BrEXPB9在白菜花粉和花粉管发育中的功能;采用CRISPR/Cas9技术和过表达技术对两者在模式植物拟南芥中的同源基因AtEXPB5进行生物学功能的分析,并对与其在花粉和花粉管发育阶段具有冗余功能的AtEXPA4进行验证;通过酵母单杂交和双荧光素酶实验对AtEXPB5和BrEXPB4/9可能参与的转录调控路径进行研究。取得的主要结果与结论如下:（1）通过三步分析法,鉴定了芸薹属三个基本种（白菜、甘蓝和黑芥）的扩展蛋白基因家族,并经与模式植物拟南芥的系统发育、基因结构和理化特性的比较分析对它们的扩张模式和进化细节进行了研究,发现经过独立的进化,扩展蛋白基因家族在这三个基本种中的相似性较多,而分歧较少。通过比较启动子和编码序列的差异,发现在拟南芥和三个基本种的直系同源物之间存在显着正相关性。随后的表达分析表明这三个物种的扩展蛋白基因家族中存在广泛的功能差异,特别是在生殖发育过程中筛选到两个在白菜花粉和花粉管发育阶段强烈表达的基因BrEXPB4和BrEXPB9。（2）通过烟草和洋葱瞬时表达体系进行亚细胞定位的结果表明,BrEXPB4和BrEXPB9都定位在细胞壁上,这与它们都具有信号肽结构的预测结果一致。通过荧光定量PCR和GUS基因报告系统进行的时空表达分析表明,BrEXPB4和BrEXPB9的表达模式也很相似,都是从单核花粉后期开始表达,并随着花粉的发育,表达量逐步升高,并且可以一直持续到花粉管中。（3）采用人工microRNA技术分别和同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9的表达,进而对它们的生物学功能进行鉴定。当它们被单独抑制时,对植株的生长发育并没有造成明显的影响。然而当它们的表达被同时抑制时,却造成约50%的花粉败育,并不能正常萌发。对败育花粉的细致观察显示,花粉的败育起始于单核花粉晚期,进一步使小孢子细胞质和花粉内壁降解,最终造成花粉败育和萌发异常。（4）通过亚细胞定位和时空表达分析,发现AtEXPB5定位在细胞壁上,并且其编码基因在成熟花粉粒和花粉管中强烈表达。然而,无论是敲除AtEXPB5还是过表达AtEXPB5都未对拟南芥的生长发育造成显着影响。结合前人相关电子表达谱的研究,发现仅有AtEXPA4在生殖发育阶段与AtEXPB5具有相似的表达模式。构建了AtEXPA4的敲除和过表达材料,并通过杂交获得AtEXPA4和AtEXPB5的双突变体,观察发现在双突变体中,花粉管伸长的速度显着减缓,并且无论是AtEXPB5还是AtEXPA4都可以恢复双突变体花粉管伸长减缓的表型,说明AtEXPA4和AtEXPB5冗余地参与了花粉管的发育。（5）通过亚细胞定位和时空表达分析,发现AtEXPA4定位在细胞壁上,其编码基因不仅在生殖发育阶段表达,也在拟南芥的根中优势表达。主根长度和根分生区的测量结果表明,AtEXPA4对于主根的生长具有促进作用。（6）通过酵母单杂交和双荧光素酶实验表明,AtEXPB5的表达可由AtTDF1和AtAMS共同激活,而这一调控途径在白菜中并不保守。这说明AtEXPB5和BrEXPB4/9的生物学功能产生分化,并且参与不同的转录调控路径。BrEXPB4/9及其同源基因AtEXPB5在表达模式、功能和调控网络上显示出巨大差异说明在进化过程中,同源基因物也会产生功能和调控的变化。
彭亚萍[2]（2021）在《盐生草盐胁迫响应基因HgS5功能研究》文中研究表明盐生草（Halogeton glomeratus）是藜科（Chenopodiaceae）、盐生草属（Halogeton）一年生草本植物,具有极强的抗旱耐盐性,是发掘抗旱、耐盐基因的重要野生资源。本研究以盐生草中盐胁迫响应基因HgS5为对象,对其功能进行了初步研究。主要结论如下:1.从盐生草中克隆到基因HgS5,并对其进行生物信息学分析,结果表明基因HgS5的cDNA编码序列大小为1110 bp,编码370个氨基酸;该基因编码蛋白不存在跨膜区,属于非跨膜蛋白;综合平均疏水性、脂肪系数及在线软件分析结果得出该基因编码蛋白为亲水性蛋白;预测其二级结构得出,无规卷曲占比最多为64.05%,最少的是β-转角,其比率为1.62%;编码蛋白存在丝氨酸和酪氨酸磷酸化位点;亚细胞定位结果显示编码蛋白主要位于细胞核内。2.利用HgS5的全长cDNA和表达载体pCambia2301成功构建了表达载体p Cambia2301-HgS5,经过农杆菌介导浸花法侵染拟南芥进行遗传转化;通过Kan抗性筛选和PCR阳性鉴定获得T2代阳性转化株。3.干旱处理下,T2代转基因拟南芥表现出明显的抗旱性,盐胁迫处理下,转基因拟南芥株系耐盐性不明显。低浓度PEG胁迫处理下（5%PEG和10%PEG）,转基因拟南芥和野生型拟南芥种子的发芽率差异不明显;较高浓度PEG胁迫处理下（15%PEG）,转基因拟南芥种子的发芽势显着高于野生型拟南芥种子（P<0.05）,高达98.89%,发芽率差异不显着;在高浓度PEG（20%PEG）胁迫处理下,转基因拟南芥种子发芽率比野生型拟南芥种子发芽率高22.13%,并达到差异显着水平（P<0.05）。随着干旱胁迫处理时间的延续,转基因拟南芥和野生型拟南芥植株中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的含量整体呈先增加后降低的趋势,轻度干旱胁迫下（0d-6d）,即土壤含水量为50%下降到30%时,植物体内氧化酶含量开始积累,转基因拟南芥植株中3种氧化酶含量低于野生型拟南芥;重度干旱胁迫下（6d-12d）,即土壤含水量为从30%下降到5%时,植物体内氧化酶含量呈不同程度的下降,这时转基因拟南芥植株中3种氧化酶含量高于野生型拟南芥。从以上试验数据可以初步确定基因HgS5具有提高转基因拟南芥抗旱性的功能。4.q RT-PCR结果分析显示,干旱胁迫处理下,基因HgS5在拟南芥根系中的表达量显着高于叶片（P<0.05）。5.构建HgS5基因的亚细胞定位载体PBI121-GFP-HgS5,通过农杆菌介导瞬时转化烟草,观察绿色荧光分布情况,初步得出该基因主要在细胞膜上表达。
陈荣珠[3]（2020）在《龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析》文中进行了进一步梳理龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国华南地区具有较高经济价值的热带亚热带果树。龙眼果实质量和产量与其胚胎发育息息相关。植物体细胞胚胎与合子胚在发育过程基本相似,可作为研究植物胚胎发生机制的优良替代体系。植物体胚发生过程不仅受特异基因的调控,还受表观遗传调控,尤其是DNA甲基化,一定水平的DNA甲基化对植物体胚的正常发育是必须的。mi RNA能够介导DNA的甲基化,该过程与mi RNA加工合成途径中的相关蛋白有关,AGO作为mi RNA加工合成途径中的关键蛋白,参与介导DNA的甲基化,因此,AGO基因可能参与调控植物的体胚发生过程,但是具体作用机制尚不清楚,目前,关于龙眼AGO表达调控和功能特异性研究仍有大量空白。因此,本研究首先从三代测序的龙眼基因组数据库中鉴定出AGO基因家族,对Dl AGOs家族的表达模式进行了分析,利用异位表达的方法对龙眼AGO基因及启动子功能进行研究。最后,进行了龙眼胚性愈伤组织去甲基化的转录组学分析。以此来探究AGO在龙眼体胚发生早期的甲基化调控机制。主要研究结果如下:1龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定、生物信息学分析及Dl AGO4、Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1 c DNA的克隆从龙眼基因组数据库中共鉴定出AGO家族10个成员,并根据注释到拟南芥或水稻中的成员进行命名。这些Dl AGOs基因分布于龙眼1、4、8、10、12、13、14和15号染色体,编码794-1064个氨基酸,含有AGO典型的保守结构域,且该家族的蛋白质均为亲水的碱性蛋白。系统进化树分析表明,不同物种的AGO可被分成4个分支,龙眼AGO与甜橙AGO亲缘关系最近。RT-PCR结合RACE法从龙眼EC中克隆获得了Dl AGO4、Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1基因的c DNA全长序列,其长度分别为3425 bp、3418 bp、3775 bp和3289 bp。Dl AGOs基因家族成员的氨基酸序列同源性较低,可能与其功能的多样性有直接的关系。2龙眼Dl AGOs启动子的克隆与生物信息学分析克隆获得了Dl AGOs基因5’端侧翼序列长度分别为1437 bp、1809bp、1514 bp、1807 bp、1707 bp、1722 bp、1784 bp、1746 bp、1794 bp和1512 bp。生物信息学分析表明,Dl AGO1、Dl AGO4和Dl AGO5-2启动子含有Cp G岛区域;Dl AGOs启动子序列除了含有大量的核心元件TATA-box和CAAT-box外,还含有多种光响应、激素应答、环境胁迫响应等元件,说明龙眼AGO基因在激素响应、光响应及抗逆等方面可能具有调控作用。3龙眼Dl AGOs家族的表达模式分析Dl AGOs不同成员在龙眼体胚发生早期阶段及合子胚发育阶段均有表达,尤其在胚胎发生的早中期具有较高的表达,不同成员具有一定功能的分工和互补,可能参与调控龙眼胚胎发生发育过程。Dl AGOs在龙眼不同组织部位中的时空表达具有特异性,可能参与龙眼种子、花、幼果和茎的发育调控。Dl AGOs基因在激素处理、不同光质处理、高温和低温处理、盐胁迫、渗透胁迫、干旱胁迫以及ABA处理下均有响应,说明它们广泛参与了激素应答、光响应及非生物胁迫应答,但是不同成员具有不同的表达模式,这也体现了AGO基因家族成员之间功能的多样性。4龙眼Dl AGOs启动子的功能验证构建龙眼Dl AGOs启动子表达载体瞬时转化烟草叶片和龙眼胚性愈伤组织EC,利用组织化学染色、GUS基因的瞬时表达及启动子激素应答分析。结果显示,Dl AGOs启动子均具有驱动GUS基因表达的活性,其中pro AGO5-1的驱动能力最强,ABA诱导Dl AGOs启动子的转录活性,部分启动子受Me JA、SA和GA3的诱导,推测龙眼Dl AGOs启动子为激素诱导型启动子。5 Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1的亚细胞定位研究构建融合表达载体,瞬时转化洋葱内表皮细胞,以GFP为报告基因,利用激光共聚焦显微镜观察表达情况,亚细胞定位结果表明,龙眼Dl AGO7主要定位于细胞核中,而Dl AGO10和Dl AGOMEL1主要定位于细胞质中。6 5-氮胞苷对龙眼体胚发生早期及Dl AGOs表达的影响2,4-D和5-azac均会影响植物体胚的发生,本研究用2,4-D（0.1、0.5、1.0 mg/L）与5-氮胞苷（5-azac:0、5、25、50、100 uM）配合处理龙眼胚性愈伤组织。显微观察发现,5 uM 5-azac与0.1 mg/L或0.5 mg/L 2,4-D配合使用,有利于球形胚产生;定量结果表明,Dl AGOs响应2,4-D和5-azac的处理,其中Dl AGO4在5 uM 5-azac处理下呈上调表达。在MS培养基中添加0、2.5、5 uM 5-azac处理龙眼EC 1、3、6、9和12 d,显微观察发现,培养第9 d,对照组未出现球形胚,而处理组中的龙眼胚性愈伤组织均发育至球形胚阶段;培养到第12 d,对照组和处理组均出现了球形胚;定量结果表明,低浓度5-azac处理9d促进Dl AGO4基因的表达。7 5-氮胞苷处理下龙眼体胚发生早期的转录组学分析用2.5 uM 5-azac处理龙眼EC 9 d,以不加5-azac为对照组,采用BGISEQ-500测序平台进行RNA高通量测序。测序结果表明,对照组与处理组相比总共有1,617个差异表达的基因,主要富集在植物病原互作、植物激素信号转导、植物MAPK信号通路、淀粉和糖代谢及丁酸盐代谢、C5-支化二元酸代谢、硫代谢、硒代化合物代谢等代谢通路。5-azac处理后,龙眼DNA甲基化水平降低,促进与龙眼体胚发生相关基因（FUS3、ABI3、FT1、GABA-T3、CAS、GLP等）和AGO4基因上调表达,从而促进龙眼早期体胚的发生。因此,5-azac处理促进龙眼Dl AGO4基因的表达,Dl AGO4与24-nt lmi RNA结合抑制DNA甲基化,促进龙眼体胚发生;5-azac抑制组蛋白乙酰化促进龙眼体胚发生;丁酸盐促进组蛋白丁酰化促进龙眼体胚发生,同时,丁酸盐代谢还参与植物抗逆。
李娜[4]（2019）在《小麦响应干旱胁迫的LEA蛋白组学分析及功能研究》文中研究表明干旱是影响小麦生长和产量的主要因素之一。植物的耐旱性与干旱诱导基因的表达呈正相关。干旱诱导基因在植物耐旱中发挥重要功能。胚胎发育晚期丰富（Late embryogenesis abundant,LEA）蛋白是一类高度亲水的蛋白质,在胚胎发育晚期可以在种子大量积累,或在干旱、高盐、低温等脱水胁迫条件下,在营养组织中大量积累。LEA蛋白可以在细胞缺水情况下保护蛋白质、核酸和膜脂质等。研究LEA蛋白的表达模式、结构和功能,为进一步揭示小麦抗旱分子机制和遗传育种提供理论依据。本研究利用Label-free定量蛋白质组学技术与方法,分析干旱胁迫下两种不同耐旱性小麦品种LEA蛋白表达模式,鉴定与小麦抗旱性相关的LEA蛋白,分析其理化性质和功能。根据蛋白质组学分析结果,我们在小麦中克隆了1个新的LEA5C基因TaLea14-A和2个类似于LEA蛋白的基因wsh1和wsh2。分析TaLea14-A和WSH1蛋白结构和二者在非生物胁迫中的功能。本文主要研究结论如下:1.对两种耐旱性能不同的小麦叶片进行了蛋白质组学分析,筛选到38个LEA蛋白和同源物,可分8个不同的亚类,即Dehydrin、LEA4、LEA1、LEA2、ABAWDS、LEA4-like、a novel class of LEA proteins和unclassified。结果表明,LEA蛋白和非LEA蛋白的表达类型、丰度与小麦的生长条件和基因类型有关。38个LEA蛋白中,有32个LEA蛋白在陕合6号小麦或两种小麦中均组成型地表达,说明这些LEA蛋白参与小麦幼苗正常生长发育。20个LEA蛋白干旱胁迫后丰度变化显着,与小麦耐旱性相关。2.采用qRT-PCR对13个代表性LEA基因进行了转录分析。干旱胁迫后,陕合6号小麦中所有LEA基因的转录水平与蛋白表达水平呈现相同的趋势。在郑引1号小麦中的情况有所不同,3个LEA基因转录和编码蛋白表达呈现不同的趋势,分别是O65216、M7ZBB0和M7YN16。3.从干旱胁迫的小麦叶片中克隆到LEA相关基因TaLea14-A和wsh1,分析表明,TaLea14-A属于LEA5C亚家族蛋白,含有1个WHY结构域,具有弱亲水性。WSH1蛋白与不含任何已知LEA蛋白家族结构域的LEA蛋白有很高的同源相似性,亲水性强,具有1个卷曲螺旋结构域,蛋白特性与LEA蛋白相似,是小麦中新的类似于LEA的蛋白。两种蛋白在水稻细胞原生质体中均定位于细胞核、细胞质和细胞膜中。4.实时定量分析表明,小麦TaLea14-A的表达明显受到外源ABA、干旱、高盐和低温胁迫诱导。wsh1基因的表达可被激素ABA、干旱和高盐胁迫诱导,但被低温胁迫抑制。5.FTIR光谱分析表明,TaLea14-A在水合状态下具有较多的β-折叠二级结构,另外还具有α-螺旋和无规则卷曲二级结构,干燥脱水没有诱导TaLea14-A蛋白的聚集,但β-折叠和β-转角含量明显增加。水合态WSH1主要具有α-螺旋结构,干燥后结构发生变化,形成了更多的α-螺旋结构,此外还有β-折叠和β转角结构。说明干燥脱水后,TaLea14-A和WSH1结构发生了变化。6.体外实验表明,TaLea14-A可以抑制LDH受冻融、高温和干燥诱导的失活。在冷冻、高温和干燥胁迫下,WSH1蛋白可以降低LDH酶活性,增加冷冻、高温和干燥胁迫对LDH的损伤。FTIR光谱数据证明,干燥后的LDH有少量分子间β-折叠聚集,说明干燥条件下聚集不是LDH酶失活的主要因素。表明TaLea14-A蛋白在干燥条件下,对LDH酶的保护机制除了抑制聚集外,可能还存在其它机制。7.TaLea14-A在大肠杆菌中的过表达提高了大肠杆菌对低温、高温、高盐、氧化胁迫以及PEG模拟的干旱胁迫的耐受性,促进了正常条件下大肠杆菌的生长。对转基因拟南芥研究表明,在干旱胁迫下,转基因拟南芥与野生型相比表现更强的耐旱性。像脯氨酸大量积累、抗氧化酶的活性增加等。体内原核表达证明,在干旱、高盐和氧化胁迫下,WSH1抑制了大肠杆菌的生长,与正常条件下相比,抑制作用更强。在低温和高温胁迫下,WSH1降低了大肠杆菌的存活能力。表明WSH1蛋白是具有抗菌活性的蛋白。
张云英[5]（2009）在《CO介导的H2O2参与ABA诱导气孔关闭和FC抑制ABA诱导气孔关闭的机制》文中认为研究证实过氧化氢（H2O2）、一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）均介导脱落酸（ABA）诱导的气孔关闭,也有资料显示壳梭孢素（fusicoccin,FC）有促进气孔开放的效应,但时止今日尚未清楚ABA诱导气孔关闭中CO与H2O2的关系,FC抑制ABA诱导的气孔关闭与保卫细胞H2O2、NO变化的关系也未见研究。本文以蚕豆为材料,借助表皮条试验和激光共聚焦扫描显微镜（LSCM）技术对上述问题进行了探索。所得结果主要如下:1.ABA、CO合成底物亚铁血红素（Ht）、CO水溶液和H2O2均表现促进气孔关闭的效应,CO产生酶亚铁血红素加氧酶-1（HO-1）专一性抑制剂锌原卟啉（ZnPPIX）、H2O2清除剂抗坏血酸（Vc）、过氧化氢酶（CAT）和H2O2产生酶NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘（DPI）均抑制ABA诱导气孔关闭,Ht诱导的气孔关闭也被Vc、CAT和DPI抑制,这些结果暗示ABA可能通过诱导保卫细胞CO合成增加H2O2产生,进而促进气孔关闭。内源H2O2检测结果表明,ABA和Ht确有诱导保卫细胞H2O2产生的作用,而且ABA促进保卫细胞H2O2产生的作用可被ZnPPIX明显抑制,此与前述表皮条试验的结果完全一致。2.与H2O2清除剂Vc、CAT和H2O2产生酶NADPH氧化酶抑制剂DPI一样,FC抑制ABA诱导气孔关闭并降低保卫细胞内源H2O2水平,表明FC通过降低保卫细胞H2O2水平抑制ABA诱导气孔关闭;与H2O2清除剂Vc、CAT类似,FC不仅阻止外源H2O2诱导气孔关闭、降低保卫细胞H2O2荧光,而且促进ABA诱导下已关闭气孔重新开放、降低ABA诱导下已产生的内源H2O2,但H2O2产生酶NADPH氧化酶抑制剂DPI却无上述效应,这些结果说明FC可能通过清除而非抑制合成降低保卫细胞H2O2水平,进而抑制ABA诱导气孔关闭。3.与NO专一性清除剂c-PTIO、NO合酶（NOS）抑制剂L-NAME一样,FC抑制ABA诱导气孔关闭并降低保卫细胞内源NO水平,表明FC通过降低保卫细胞NO水平抑制ABA诱导气孔关闭;与NO专一性清除剂c-PTIO类似,也能通过降低保卫细胞NO水平抑制ABA诱导的气孔关闭。与NO专一性清除剂c-PTIO相类似,FC不仅阻止外源NO供体硝普钠（SNP）诱导气孔关闭、降低保卫细胞NO荧光,而且促进ABA诱导下已关闭气孔重新开放、降低ABA诱导下已产生的内源NO,但NOS抑制剂L-NAME却无上述效应,这些结果说明FC可能通过清除而非抑制合成降低保卫细胞NO水平,进而抑制ABA诱导气孔关闭。
项燕[6]（2009）在《蚕豆叶片保卫细胞原生质体的提取及叶片cDNA文库的构建》文中认为气孔是植物与环境间进行水分和气体交换的门户,是由一对保卫细胞围绕而成的。干旱下,气孔的暂时关闭有利于植物减少水分蒸腾保持体内有限水分。气孔的关闭主要受保卫细胞的膨压影响。随着对保卫细胞研究的深入,提取保卫细胞原生质体几乎成为一种必需的手段。蚕豆因其生长周期短、叶片柔软易于撕取下表皮而成为研究保卫细胞的一种模式材料。本实验以蚕豆叶片为材料,将直接撕取表皮和从水中撕取表皮这两种方法从撕取的难易程度、表皮的伸展度、酶解过程、酶解的效果、酶解时间等方面进行了比较,确立了蚕豆叶片保卫细胞原生质体的提取方法:第一,从水中直接撕取叶片下表皮,得出从水中撕取表皮的方法远远优于直接撕取表皮法。而其他类似于蚕豆叶片这种柔软度的叶片在撕取表皮时,这种方法同样适用;第二,将撕取的下表皮在含有0.7% cellulysin的第一酶解液中酶解约45min,再将其转入含有1%纤维素酶RS、0.01%果胶酶的第二酶解液中酶解大约40min,过滤取滤液。第三,将滤液在200g下离心6min,共两次。再用密度梯度离心法于200g下离心13min,吸取中间层,于200g下离心6 min洗涤,即得到较为纯净的保卫细胞原生质体。在原生质体分离纯化方面将密度梯度离心与传统的低速离心相结合,尽管步骤增加,却大大降低了其中杂质的含量,获得了更为纯净的原生质体,为后续进一步研究保卫细胞原生质体打下良好的基础。cDNA文库是扩增未知基因的一种有效方法,为扩增和蚕豆叶片保卫细胞相关的基因,构建了蚕豆叶片cDNA文库。首先以蚕豆叶片为材料,利用天根公司的TRNzol–A+总RNA提取试剂提取蚕豆叶片的总RNA,电泳和比色结果表明所提取的总RNA具有较高的完整性和纯度。随后采用SMART cDNA合成技术合成cDNA第一链,经LD-PCR合成双链cDNA、蛋白酶K消化、SfiI酶切、CHROMA SPIN-400柱层析分级分离获得蚕豆叶片的cDNA,与PDNR-LIB载体连接,电转化进宿主菌DH5α,得到了蚕豆叶片cDNA的原始文库,滴度计算表明该文库达到后续试验要求。
王娟[7]（2009）在《乙烯对ABA和暗诱导气孔关闭的效应及其作用机制研究》文中提出研究发现植物激素乙烯有促进气孔关闭的作用,也有结果显示ABA和暗诱导气孔关闭可被乙烯抑制,可见乙烯对气孔运动的效应还是一个尚未清楚的问题。先前的研究证明ABA和暗均通过诱导H2O2、NO产生促进气孔关闭,暗示乙烯抑制ABA和暗诱导气孔关闭可能与降低H2O2、NO有关,但是否真如此仍需证明。本实验以蚕豆为实验材料,借助表皮条分析和激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）技术研究乙烯对ABA和暗诱导气孔关闭的效应及其作用机制。所得结果主要如下:1.与H2O2清除剂Vc和CAT、H2O2产生酶NADPH氧化酶抑制剂DPI、NO清除剂cPTIO和Hb、NO产生酶NOS抑制剂L-NAME一样,乙烯合成前体ACC、乙烯释放剂乙烯利显着抑制ABA和暗诱导气孔关闭。这些结果暗示,乙烯可能通过降低保卫细胞H2O2、NO抑制ABA和暗诱导气孔关闭。2.与Vc、CAT、DPI一样,ACC、乙烯利确实明显降低ABA和暗诱导保卫细胞H2O2水平;与cPTIO、Hb、L-NAME一样,ACC、乙烯利确实明显降低ABA和暗诱导保卫细胞NO水平。这些结果表明,乙烯确实通过降低保卫细胞H2O2、NO抑制ABA和暗诱导气孔关闭。3.与Vc、CAT、cPTIO、Hb一样,ACC、乙烯利显着促进ABA和暗诱导下已关闭气孔重新开放,而DPI、L-NAME则无上述效应。这些结果暗示,乙烯可能通过清除作用降低保卫细胞H2O2、NO进而促进ABA和暗诱导下已关闭气孔重新开放。4.与Vc、CAT一样,ACC、乙烯利确实明显降低ABA和暗诱导下保卫细胞已经积累的H2O2,DPI则无上述效应;与cPTIO、Hb、L-NAME一样,ACC、乙烯利确实明显降低ABA和暗诱导下保卫细胞已经积累的NO,L-NAME则无上述效应。这些结果表明,乙烯确实通过清除作用降低保卫细胞H2O2、NO进而促进ABA和暗诱导下已关闭气孔重新开放。5.与Vc、CAT一样,ACC、乙烯利显着抑制外源H2O2诱导气孔关闭,DPI则无上述效应;与cPTIO、Hb一样,ACC、乙烯利显着抑制外源NO供体SNP诱导气孔关闭,L-NAME则无上述效应。这些结果暗示,乙烯可能通过清除作用降低保卫细胞H2O2、NO进而抑制外源H2O2、NO供体SNP诱导气孔关闭。6.与Vc、CAT一样,ACC、乙烯利确实明显降低外源H2O2处理保卫细胞H2O2荧光,DPI则无上述效应;与cPTIO、Hb一样,ACC、乙烯利确实明显降低外源NO供体SNP处理保卫细胞NO荧光,L-NAME则无上述效应。这些结果表明,乙烯确实通过清除作用降低保卫细胞H2O2、NO进而抑制外源H2O2、NO供体SNP诱导气孔关闭。如将乙烯抑制ABA和暗诱导气孔关闭并降低ABA和暗诱导保卫细胞H2O2、NO的结果与其促进ABA和暗诱导下已关闭气孔重新开放并降低ABA和暗诱导下保卫细胞已经积累的H2O2、NO和抑制外源H2O2、NO诱导气孔关闭并降低外源H2O2、NO处理保卫细胞H2O2、NO荧光的结果联系起来考虑,可以得出乙烯通过清除作用降低保卫细胞H2O2、NO进而抑制ABA和暗诱导气孔关闭的结论。
孟朝妮[8]（2006）在《Auxins、CTKs对ABA诱导气孔关闭的效应及其作用机制研究》文中研究指明植物生长物质Auxins、CTKs和ABA对植物生长发育有重要调控作用。前人的研究表明，ABA通过提高保卫细胞H2O2、NO水平促进气孔关闭，Auxins、CTKs通过降低H2O2、NO水平促进气孔开放。但时至今日尚未见Auxins、CTKs和ABA相互作用进而调控气孔运动的报道，更未见调控气孔运动中前述生长物质相互作用机制的研究。本文以蚕豆（Vicia faba．L）下表皮为材料，借助表皮条分析、药理学实验及激光共聚焦显微镜技术，研究了Auxins（IAA、NAA）和CTKs (6-BA、KT对ABA诱导气孔关闭的效应及其作用机制，旨在完善保卫细胞信号转导网络，亦为丰富和发展气孔运动机制理论积累资料和奠定基础。 本文的主要结果如下： 1．Auxins（IAA、NAA）、CTKs（6-BA、KT）均以剂量依赖方式阻止ABA诱导气孔关闭。 2．IAA、NAA和6-BA、KT阻止ABA诱导气孔关闭的效应可被AsA（H2O2清除剂）、DPI（H2O2合成酶NADPH氧化酶抑制剂）、cPTIO（NO清除剂）、L-NAME（NO合成酶NOS抑制剂）所模拟，暗示IAA、NAA和6-BA、KT阻止ABA诱导气孔关闭的效应可能与保卫细胞H2O2、NO水平降低有关。 3．借助H2O2、NO的特异性荧光探针和LSCM技术发现，与AsA、DPI的作用相似，IAA、NAA和6-BA、KT确实阻止ABA诱导蚕豆保卫细胞H2O2水平升高；与cPTIO、L-NAME的作用相似，IAA、NAA和6-BA、KT确实阻止ABA诱导的蚕豆保卫细胞NO水平升高。这与AsA、DPI、cPTIO、L-NAME阻止ABA诱导气孔关闭的结果一致。这些结果表明IAA、NAA和6-BA、KT阻止ABA诱导气孔关闭的效应确实与保卫细胞H2O2、NO水平降低有关。 4．与AsA、cPTIO相似，6-BA、KT促进ABA诱导下已经关闭的气孔再次开放；与DPI、L-NAME相似，IAA、NAA未能促进ABA诱导下已经关闭的气孔再次开放。由此结果可见，6-BA、KT与H2O2、NO清除剂的效应一致，而IAA、NAA与H2O2、NO合成酶抑制剂的效应一致，这种一致暗示6-BA、KT可能通过清除已经由ABA诱导生成的H2O2、NO进而促进已经关闭的气孔再次开放，而IAA、NAA对已经由ABA诱导生成的H2O2、NO无清除效应，因而未使已经关闭的气孔再次开放。 5．借助H2O2、NO的特异性荧光探针和LSCM技术发现，ABA处理3h末保卫细胞H2O2、NO水平较高，此时加入6-BA、KT、AsA，H2O2水平在900s内即明显降低，1h时明显低于对照；此时加入6-BA、KT、cPTIO，NO水平在900s内亦明显降低，1h时亦明显低于对照。此结果表明，象AsA、cPTIO一样，6-BA、KT确有
邹克琴[9]（2005）在《苹果钙依赖蛋白激酶MdCPK1：分子克隆、表达、定位及被脱落酸的激活》文中指出在果实发育过程中,脱落酸是一种重要的调节因子。从脱落酸的产生到激发生理反应要经过一系列相互紧密联系的级联环节。蛋白激酶所催化的蛋白质磷酸化过程在细胞生命活动的许多过程都起着重要的调节作用,在细胞信号转导中处于核心地位。因此,揭示脱落酸信号转导过程中相关蛋白激酶的生理功能具有重要科学意义。 本实验室前期研究发现苹果果实中存在受脱落酸激活的钙依赖蛋白激酶,为研究钙依赖蛋白激酶在苹果果实发育中的功能,以新红星/海棠（Malus Domestica Bork cv. Starkrimson/Malus micromalus）果实中的RNA为模板,根据钙依赖蛋白激酶基因的保守序列,设计合成简并引物,通过RT-PCR方法克隆了715bp的中间保守序列,经过DNA序列测定和NCBI Blast分析,其与钙依赖蛋白激酶基因有很高的同源性。利用RACE的方法得到157bp的3’末端基因和208bp的5’末端基因,并且再次利用RT-PCR克隆了全长cDNA（GenBank登录号AY395701）,命名为MdCPK1。其全长1993bp,编码区长1632bp。经过软件分析,MdCPK1基因编码544个氨基酸,分子量是60kD,其氨基酸序列和烟草,番茄,胡萝卜,拟南芥分别有75.0996,74.55%,72.83%,71.12%的同源性,核苷酸序列分别有66.48%,71.57%,71.00%,68.00%的相似性。MdCPK1编码的蛋白具有N端可变区,激酶区,连接区和四个保守的钙结合区（即EF-hand）,具有典型的CDPK特征。利用生物信息学软件分析,MdCPK1在198—200位氨基酸和290—293位氨基酸具有两个跨膜区。以包含5’非翻译区和N端可变区的500bp片断为探针,用α-32PdCTP做探针,Southern Blot结果表明,MdCPK1相关基因在苹果基因组中可能有两个拷贝。 为了进一步研究MdCPK1的功能,通过RT-PCR方法,从果实总RNA中扩增1632bp的MdCPK1的完整的基因编码区和MdCPK1的N端可变区162bp片断。利用DNA重组技术,将其连接到原核表达载体pGEX-4T-1,构建了全长基因原核表达载体pGEX-MdCPKL和N端片断原核表达载体pGEX-MdCPKN。将原核表达载体转化大肠杆菌DH5 α菌株,经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,SDS-PAGE电泳发现,两个载体都分别正确表达出了86kD的GST-MdCPKL融合蛋白和32kD的GST-MdCPKN融合蛋白。可溶性分析表明,表达的GST-MdCPKN融合蛋白是可溶的,表达产物直接分泌到上清液中,表达量高达1.0g/L,但表达的GST-MdCPKL融合蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中。通过亲和层析,SDS-PAGE得到较纯的GST-MdCPKN融合蛋白和GST-MdCPKL融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫小鼠,根据酶联免疫（ELISA）分析,Protein dot blot和Western blotting分析,结果表明,所制得的这两种抗体有良好的特异性和较高的检测灵敏度。 为进一步研究MdCPK1的蛋白定位,利用DNA重组技术,将MdCPK1全长基因其连接到植物瞬时表达载体pEZS-NL上,构建了全长基因瞬时表达载体pMdCPKL-GFP。将表达载体分别用PEG融合法和基因枪轰击法转化拟南芥原生质细胞和洋葱表皮细胞,以增强型绿色荧光蛋白EGFP为报告基因,通过激光共聚焦扫描显微镜（Confocal）观察,结果表明,MdCPK1蛋白主要定位在细胞的膜体系上。分别提取苹果果实的微粒体蛋白和胞质可溶性蛋白,Western blot结果也表明,MdCPK1蛋白仅存在于果实微粒体膜蛋白组分中。
詹卫华[10]（2003）在《蚕豆保卫细胞中脱落酸诱导过氧化氢产生的亚细胞定位》文中提出H2O2作为第二信使参与了ABA的信号转导过程，但是，有关保卫细胞内ABA诱导H2O2产生的亚细胞定位至今未见报道，而这恰恰是理解气孔反应中氧化信号作用的关键问题。本实验以模式植物蚕豆（Vicia faba L）为材料，主要利用激光共聚焦显微技术（LSCM）和透射电子显微镜技术（TEM）对蚕豆保卫细胞内ABA诱导的H2O2的产生进行亚细胞定位。选择ABA处理的不同时间点检测气孔保卫细胞内H2O2产生的位点。其中ABA处理10min、15min、20min和30min时，累积位点主要是保卫细胞细胞壁的背壁，腹壁上有少量的电子密集沉积物产生；在ABA处理60min、90min和120min时，电子密集沉积物累积位点由保卫细胞的背壁转至腹壁及叶绿体的基质，线粒体和质膜基本没有。用H2O2处理蚕豆叶片，得出与ABA处理60min相同的结果。Diphenylene iodonium （DPI ）能显着抑制细胞壁上电子密集沉积物的累积，而catalase （CAT）减少细胞壁上的电子密集沉积物的累积。由细胞壁上电子密集沉积物的来源看，可能是质膜上NADPH氧化酶将O2 转变成O2。－， O2。－在细胞壁内或细胞壁上形成H2O2；亦可能是质膜上产生的H2O2扩散至细胞壁上。因此认为，细胞壁上的电子密集沉积物可能是质膜上H2O2产生后扩散至细胞壁上形成的。AsA除了能减少细胞壁上的电子密集沉积物累积外，还能减少叶绿体上电子密集沉积物的累积，这可能与ascorbic acid （AsA）参与了叶绿体内H2O2的清除系统有关。叶绿体内的抗坏血酸－谷胱甘肽循环能有效清除体内产生的H2O2。从以上的实验结果推知：ABA诱导蚕豆保卫细胞中H2O2的产生位点是质膜和叶绿体基质。另外，在亚细胞分析的实验过程中，以蚕豆叶片的表皮细胞和叶肉细胞（部分图片未列出）作为与保卫细胞内H2O2产生的对比，发现在ABA处理的短时间内（20 min），表皮细胞内有电子密集沉积物的累积，而叶肉细胞内则没有电子密集沉积物的累积。随处理时间的延长（到1 h左右），表皮细胞内电子密集沉积物累积的量逐渐降低，叶肉细胞内开始有微量的电子密集沉积物累积。DPI、AsA、CAT对叶肉细胞的处理结果与保卫细胞一致。以蚕豆叶片下表皮为材料，将H2O2的荧光探针2,7-二氯氢化荧光素二乙酸酯<WP=6>（2,7-dichlorofluorescin diacetate, H2DCFH）导入蚕豆气孔保卫细胞内，利用激光共聚焦显微镜技术，检测ABA诱导气孔关闭过程中H2O2的产生，结果表明，外源ABA能诱导蚕豆保卫细胞内H2O2的产生，其H2O2产生的主要位点是叶绿体部位和质膜。用AsA处理并结合张骁等（2001）人的光学显微镜结果（CAT和DPI处理）可知，CAT、DPI和AsA在一定程度上可减少ABA所诱导的保卫细胞内H2O2的产生。
二、蚕豆保卫细胞原生质体质膜ABA结合蛋白的理化特性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蚕豆保卫细胞原生质体质膜ABA结合蛋白的理化特性（论文提纲范文）
（1）芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物扩展蛋白基因家族的研究进展 |
| 1.1.1 扩展蛋白的结构特点和起源 |
| 1.1.1.1 扩展蛋白的结构特点 |
| 1.1.1.2 扩展蛋白基因的起源 |
| 1.1.2 不同植物扩展蛋白基因家族成员的比较 |
| 1.1.3 进化过程中扩展蛋白基因亚家族的基因结构和结构域较保守 |
| 1.1.4 扩展蛋白基因在染色体上广泛分布 |
| 1.1.5 染色体片段重复是扩展蛋白基因家族主要扩张模式 |
| 1.1.6 扩展蛋白基因在不同植物组织中的表达丰度不同 |
| 1.2 扩展蛋白在植物生长发育中的作用 |
| 1.2.1 扩展蛋白基因在植物营养生长中的功能 |
| 1.2.1.1 种子萌发 |
| 1.2.1.2 根的生长发育 |
| 1.2.1.3 叶片的生长发育 |
| 1.2.2 扩展蛋白基因在植物生殖生长中的功能和调控 |
| 1.2.2.1 花粉管发育 |
| 1.2.2.2 果实成熟软化 |
| 1.3 花粉内壁的发育和调控 |
| 1.3.1 花粉壁的形成 |
| 1.3.2 花粉内壁发育的调控 |
| 1.3.2.1 参与拟南芥花粉内壁发育的基因及其调控机制 |
| 1.3.2.2 参与水稻花粉内壁发育的基因及其调控机制 |
| 1.4 花粉管的发育和调控 |
| 1.4.1 花粉管壁的组成和发育 |
| 1.4.2 细胞壁组分对花粉管生长的影响 |
| 1.4.2.1 果胶合成 |
| 1.4.2.2 纤维素合成 |
| 1.4.3 花粉管生长过程中细胞壁的重塑 |
| 1.4.3.1 细胞壁扩展蛋白和糖苷酶水解蛋白 |
| 1.4.3.2 阿拉伯半乳糖蛋白 |
| 1.4.3.3 果胶甲酯酶和果胶乙酰化酶 |
| 1.4.4 花粉管细胞壁结构蛋白的信号通路 |
| 1.4.4.1 细胞壁结构蛋白LRXs |
| 1.4.4.2 快速碱化因子家族RALFs |
| 1.4.4.3 类受体激酶CrRLK1Ls——ANX1/2和BUPS1/2 |
| 2 芸薹属三个基本种扩展蛋白基因家族的鉴定和进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 2.1.2 扩展蛋白家族成员的鉴定和理化性质预测 |
| 2.1.3 扩展蛋白家族成员系统发育遗传树的构建与结构分析 |
| 2.1.4 扩展蛋白家族基因的染色体分布、共线性和保留率分析 |
| 2.1.5 扩展蛋白家族基因编码序列和启动子的进化分析 |
| 2.1.6 扩展蛋白家族基因的表达分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的鉴定 |
| 2.2.2 扩展蛋白基因的系统发育、基因结构和功能域分析 |
| 2.2.3 扩展蛋白基因的染色体分布、复制机制和保留比例 |
| 2.2.4 扩展蛋白基因的编码序列和启动子的进化分析 |
| 2.2.5 扩展蛋白家族成员的表达模式 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 全基因组三倍化后芸薹属三个基本种的扩展蛋白基因家族规模 |
| 2.3.2 芸薹属三个基本种中EXLB亚家族在进化上最为保守 |
| 2.3.3 启动子的变异与扩展蛋白基因的编码序列进化密切相关 |
| 2.3.4 扩展蛋白基因在白菜生殖发育中可能扮演重要的角色 |
| 3 白菜扩展蛋白基因BrEXPB4和BrEXPB9 的表达模式和功能鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 3.1.2 CTAB法提取基因组DNA |
| 3.1.3 总RNA 的提取(试剂盒法)与cDNA 的合成 |
| 3.1.4 BrEXPB4和BrEXPB9 的基因编码序列和启动子序列的扩增 |
| 3.1.5 氨基酸序列的特征分析 |
| 3.1.6 荧光定量PCR分析 |
| 3.1.7 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS融合表达载体的构建 |
| 3.1.8 BrEXPB4::eGFP和 BrEXPB9::eGFP融合表达载体的构建 |
| 3.1.9 人工microRNA(amiRNA)载体的构建 |
| 3.1.9.1 amiRNA序列的设计与合成 |
| 3.1.9.2 p35S::ami REXPB4/9、p35S::amiREXPB4和p35S::ami REXPB9 载体的构建 |
| 3.1.10 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS载体的遗传转化 |
| 3.1.10.1 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS载体浸花法转化野生型拟南芥 |
| 3.1.10.2 阳性转基因拟南芥植株的筛选 |
| 3.1.10.3 阳性植株组织的GUS染色观察 |
| 3.1.11 BrEXPB4和BrEXPB9 的亚细胞定位 |
| 3.1.11.1 利用烟草表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.11.2 利用洋葱表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.12 利用抽真空浸花法将amiRNA载体转化‘油青四九’菜心 |
| 3.1.13 菜心阳性转基因植株的筛选鉴定 |
| 3.1.13.1 转基因菜心基因组DNA的提取 |
| 3.1.13.2 利用PCR对转基因菜心植株进行初次筛选 |
| 3.1.13.3 利用qRT-PCR对转基因菜心植株进行再次筛选 |
| 3.1.14 阳性转基因菜心植株的表型观察 |
| 3.1.14.1 植株的形态学观察和角果长度的统计 |
| 3.1.14.2 花粉的细胞学染色观察 |
| 3.1.14.3 花粉的扫描电镜观察 |
| 3.1.14.4 花粉的半薄切片和透射电镜观察 |
| 3.1.14.5 花粉的体内萌发 |
| 3.1.14.6 花粉的体外萌发 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 成功扩增‘油青四九’菜心中BrEXPB4和BrEXPB9 的编码序列和启动子序列 |
| 3.2.2 BrEXPB4和BrEXPB9 主要在成熟花粉粒和花粉管中表达 |
| 3.2.2.1 BrEXPB4和BrEXPB9 主要在‘Bcajh97-01’的花序、三核花粉期以及授粉受精后优势表达 |
| 3.2.2.2 BrEXPB4和BrEXPB9 从单核晚期花粉中起始表达并持续到花粉管中 |
| 3.2.3 BrEXPB4和BrEXPB9 定位在细胞壁上 |
| 3.2.4 BrEXPB4和BrEXPB9 定位在细胞壁上 |
| 3.2.5 同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达造成花粉和花粉管的发育异常 |
| 3.2.5.1 利用amiRNA技术实现对菜心中BrEXPB4和BrEXPB9 的表达抑制 |
| 3.2.5.2 抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达不会影响菜心的营养生长和花器官形态 |
| 3.2.5.3 同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达导致花粉败育以及花粉萌发和伸长异常 |
| 3.2.5.4 BrEXPB4/9~(KD)的花粉败育发生在单核花粉晚期,导致花粉内容物含量降低并伴随异常的内壁沉积 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 BrEXPB4和BrEXPB9 具有相似的表达模式和亚细胞定位 |
| 3.3.2 BrEXPB4和BrEXPB9 冗余地参与白菜花粉发育和花粉管萌发 |
| 3.3.3 BrEXPB4和BrEXPB9 通过调控花粉内壁的沉积影响花粉管的萌发 |
| 4 拟南芥EXPA4和EXPB5 的表达模式和功能鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 4.1.2 CTAB法提取基因组DNA |
| 4.1.3 总RNA 的提取与cDNA 的合成 |
| 4.1.3.1 Trizol法提取总RNA |
| 4.1.3.2 cDNA的合成 |
| 4.1.4 AtEXPA4和AtEXPB5 的基因全长序列、编码序列和启动子序列的扩增 |
| 4.1.5 氨基酸序列的特征分析和启动子顺式作用元件分析 |
| 4.1.6 荧光定量PCR分析 |
| 4.1.7 proAtEXPA4::GUS和 proAtEXPB5::GUS融合表达载体的构建 |
| 4.1.8 AtEXPA4::eGFP和 AtEXPB5::eGFP融合表达载体的构建 |
| 4.1.9 AtEXPA4和AtEXPB5 敲除载体的构建 |
| 4.1.9.1 AtEXPA4和AtEXPB5 sgRNA的设计合成及中间载体的构建 |
| 4.1.9.2 构建以proYAO启动子驱动Cas9 表达的CRISPR/Cas9 载体 |
| 4.1.10 过表达载体proAtEXPA4::EXPA4和proAtEXPB5::EXPB5 的构建 |
| 4.1.11 利用浸花法将各载体转化野生型拟南芥以及T_1代抗性植株的筛选 |
| 4.1.11.1 通过浸花法对拟南芥进行遗传转化 |
| 4.1.11.2 T_1代抗性植株的筛选 |
| 4.1.12 proAtEXPA4::GUS和 proAtEXPB5::GUS植株的筛选和观察 |
| 4.1.13 AtEXPA4和AtEXPB5 的亚细胞定位 |
| 4.1.13.1 利用烟草表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 4.1.13.2 利用洋葱表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 4.1.14 敲除植株的筛选鉴定 |
| 4.1.14.1 通过PCR检测敲除植株的T-DNA插入情况 |
| 4.1.14.2 敲除植株的基因编辑检测 |
| 4.1.14.3 敲除纯合植株的筛选 |
| 4.1.15 双突变体atexpa4expb5 的获得和F_2代基因分离比的统计 |
| 4.1.16 利用PCR和 qRT-PCR对过表达植株进行筛选和鉴定 |
| 4.1.17 双突变体atexpa4expb5 的回补实验 |
| 4.1.17.1 过表达载体proAtEXPA4::EXPA4和proAtEXPB5::EXPB5对atexpa4expb5 的遗传转化 |
| 4.1.17.2 利用PCR和 qRT-PCR对回补植株进行筛选 |
| 4.1.18 敲除、过表达以及回补植株的表型观察 |
| 4.1.18.1 植株的形态学观察 |
| 4.1.18.2 花粉的细胞学染色观察 |
| 4.1.18.3 花粉的扫描电镜观察 |
| 4.1.18.4 花粉的体内萌发 |
| 4.1.18.5 主根长度和根尖分生区长度的测量与统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 AtEXPA4和AtEXPB5 的基因全长序列、编码序列和启动子序列 |
| 4.2.2 AtEXPA4和AtEXPB5 的表达分析 |
| 4.2.3 AtEXPA4和AtEXPB5 定位在细胞壁上 |
| 4.2.4 AtEXPA4和AtEXPB5 突变体、过表达以及回补植株的获得 |
| 4.2.4.1 atexpa4和atexpb5株系T-DNA插入和基因编辑类型的统计 |
| 4.2.4.2 AtEXPA4和AtEXPB5 敲除植株的脱靶检测 |
| 4.2.4.3 通过杂交获得AtEXPA4和AtEXPB5 双突变体atexpa4expab5 |
| 4.2.4.4 导入过表达载体使野生型拟南芥和atexpa4expab5 中相应基因的表达量升高 |
| 4.2.5 AtEXPA4和AtEXPB5 的同时突变使花粉管伸长速度减缓 |
| 4.2.5.1 AtEXPA4和AtEXPB5 的突变和过量表达对植株形态和花粉发育未观察到显着影响 |
| 4.2.5.2 双突变体atexpa4expab5 的花粉管伸长速度减缓 |
| 4.2.5.3 AtEXPA4和AtEXPB5 的突变对花粉的竞争力和配子传递无明显影响 |
| 4.2.6 AtEXPA4或AtEXPB5 都可以恢复atexpa4expab5 花粉管的伸长速度 |
| 4.2.7 AtEXPA4 促进主根的伸长 |
| 4.2.8 AtEXPA4和AtEXPB5 的启动子上顺式作用元件的分布情况 |
| 4.2.9 AtEXPA4和AtEXPB5 的启动子上顺式作用元件的分布情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 AtEXPA4和AtEXPB5 冗余地参与花粉管的发育 |
| 4.3.2 AtEXPA4 参与主根的生长发育 |
| 4.3.3 AtEXPA4和AtEXPB5 可能在MYB转录因子的调控下参与花粉管的发育 |
| 5 AtEXPA4和AtEXPB5 与其白菜中的同源基因的功能分化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 5.1.2 转录因子TDF1、AMS和 MYB结合位点的分析 |
| 5.1.3 酵母单杂交实验 |
| 5.1.3.1 TFs-AD和 proBrEXPB4A-E-AbAi、proBrEXPB9A-C-Ab Ai、pAtEXPB5A-Ab Ai载体的构建 |
| 5.1.3.2 线性化启动子载体并转化Y1H感受态细胞 |
| 5.1.3.3 检测转录因子对目的基因的调控作用 |
| 5.1.4 双荧光素酶实验 |
| 5.1.4.1 报告器载体proBrEXPB4-LUC、proBrEXPB9-LUC、pAtEXPB5A-LUC和效应器载体TFs-SK的构建 |
| 5.1.4.2 效应器和报告器质粒电击法转化农杆菌GV3101(MP90)感受态细胞 |
| 5.1.4.3 效应器和报告器载体瞬时转化烟草叶片并检测荧光强度 |
| 5.1.5 qRT-PCR分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 TDF1和AMS对白菜EXPB4/9 和拟南芥EXPB5 的转录激活分析 |
| 5.2.2 其他转录因子与BrEXPB4和BrEXPB9 的启动子结合分析 |
| 5.2.3 BrEXPA11/19/22 的表达模式及其在BrEXPB4/9~(KD)中的表达分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 AtEXPB5 与其在白菜中的同源基因BrEXPB4和BrEXPB9 产生功能分化 |
| 5.3.2 AtEXPB5和BrEXPB4/9 参与不同的调控路径 |
| 5.3.3 白菜扩展蛋白基因家族在进化过程中产生功能分化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的论文 |
（2）盐生草盐胁迫响应基因HgS5功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 植物响应干旱的研究进展 |
| 1.1 干旱对植物的影响 |
| 1.2 植物对干旱胁迫的响应 |
| 1.3 提高植物抗旱性的途径 |
| 2 植物响应盐胁迫的研究进展 |
| 2.1 盐害对植物的影响 |
| 2.2 植物应对盐胁迫的响应 |
| 3 抗旱耐盐基因挖掘的必要性 |
| 4 盐生植物盐生草概况 |
| 5 研究目的和意义 |
| 6 技术路线 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 载体与菌株 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 培养基配制 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 植物材料的种植与培养 |
| 2.3.2 HgS5 基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.3 HgS5 基因的遗传转化与亚细胞定位分析 |
| 2.3.4 HgS5基因功能验证和组织特异性分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 基因HgS5 的克隆 |
| 2 基因HgS5 的生物信息学分析 |
| 3 基因HgS5 的遗传转化 |
| 4 基因HgS5 的亚细胞定位分析 |
| 5 基因 HgS5 的功能研究 |
| 5.1 转基因拟南芥在干旱、盐胁迫下的表型鉴定 |
| 5.2 转基因拟南芥在干旱胁迫下的萌发分析 |
| 5.3 转基因拟南芥在干旱下的生理指标变化 |
| 6 基因HgS5的组织特异性表达分析 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（3）龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 植物AGO蛋白研究进展 |
| 1.1 植物AGO蛋白的结构研究 |
| 1.2 AGO蛋白参与植物micro RNA(mi RNA)的生物合成 |
| 1.3 植物AGO蛋白的功能研究 |
| 1.3.1 AGO蛋白参与植物生长发育 |
| 1.3.2 AGO蛋白参与植物生物和非生物胁迫 |
| 1.4 AGO蛋白的分类研究 |
| 2 植物体胚发生研究进展 |
| 2.1 植物激素对体胚发育的影响 |
| 2.2 植物体胚发生过程的基因表达调控 |
| 2.3 植物体胚发生过程的转录组学研究 |
| 3 龙眼体胚发生的研究进展 |
| 3.1 龙眼体胚发生与植株再生 |
| 3.2 龙眼体胚发生过程的生理生化研究 |
| 3.3 龙眼体胚发生相关基因的克隆及表达分析 |
| 4 植物DNA甲基化的研究进展 |
| 4.1 DNA甲基化概述及DNA甲基化的维持 |
| 4.2 植物中DNA甲基化的特征及分布 |
| 4.3 RNA介导的DNA甲基化途径 |
| 4.4 植物DNA甲基化的作用 |
| 4.4.1 DNA甲基化在植物胁迫中的作用 |
| 4.4.2 DNA甲基化与植物生长发育的关系 |
| 4.4.3 DNA甲基化对植物体胚发生的影响 |
| 5 植物启动子的研究进展 |
| 5.1 植物启动子克隆技术的研究 |
| 5.2 植物启动子功能分析方法 |
| 6 本研究的意义及主要内容 |
| 6.1 研究意义 |
| 6.2 本研究的主要内容 |
| 第二章 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定、生物信息学分析及DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 c DNA的克隆 |
| 第一节 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 龙眼AGO家族成员的鉴定 |
| 1.2.2 龙眼AGO蛋白理化特性分析 |
| 1.2.3 龙眼AGO蛋白磷酸化位点、糖基化位点预测 |
| 1.2.4 龙眼AGO蛋白二级、三级结构预测 |
| 1.2.5 龙眼AGO基因的染色体定位、蛋白保守基序及基因结构分析 |
| 1.2.6 AGO家族氨基酸序列系统进化树的构建 |
| 1.2.7 龙眼AGO蛋白结构域分析 |
| 1.2.8 龙眼AGO蛋白互作预测分析 |
| 1.2.9 调控DlAGOs的 miRNA预测 |
| 1.2.10 DlAGOs在龙眼体胚发生早期的FPKM值分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定 |
| 2.2 龙眼AGO蛋白特性分析 |
| 2.3 DlAGOs蛋白二级、三级结构预测分析 |
| 2.4 DlAGOs蛋白磷酸化位点、糖基化位点预测分析 |
| 2.5 龙眼AGO基因家族染色体定位及基因结构分析 |
| 2.6 龙眼AGO家族的系统进化树分析 |
| 2.7 龙眼AGO蛋白结构域分析 |
| 2.8 DlAGOs蛋白互作网络预测分析 |
| 2.9 调控DlAGOs的 mi RNA预测分析 |
| 2.10 DlAGOs在体胚发生早期的特异表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利用生物信息学推测DlAGOs在龙眼体胚中的可能作用机理 |
| 3.2 AGO蛋白生物学功能多样性的研究 |
| 第二节 龙眼EC中 DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL cDNA全长的克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 1.2.2 引物的设计 |
| 1.2.3 cDNA全长序列的扩增 |
| 1.2.4 目的基因PCR扩增产物的回收和测序 |
| 1.2.5 龙眼DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼EC总RNA的提取 |
| 2.2 龙眼EC中 DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 cDNA全长序列的克隆和分析 |
| 2.3 龙眼DlAGOs氨基酸序列及亲缘关系分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 龙眼胚性愈伤组织AGO基因克隆的意义 |
| 3.2 龙眼DlAGOs UTR对龙眼体胚发生过程可能起着调控作用 |
| 第三章 龙眼DlAGOs启动子的克隆和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 DNA的提取 |
| 1.2.2 龙眼EC中 DlAGOs启动子的克隆 |
| 1.2.3 DlAGOs启动子的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼DlAGOs启动子序列的克隆 |
| 2.2 龙眼DlAGOs启动子CpG岛的预测 |
| 2.3 龙眼DlAGOs启动子转录起始位点和核心启动子区域的预测 |
| 2.4 龙眼DlAGOs启动子功能元件分析 |
| 2.4.1 龙眼DlAGOs启动子序列含有激素响应元件 |
| 2.4.2 龙眼DlAGOs启动子序列中含有光反应元件 |
| 2.4.3 龙眼DlAGOs启动子含有逆境响应元件 |
| 2.4.4 龙眼DlAGOs启动子含有参与分生组织表达、胚乳表达和昼夜节律调控的响应元件 |
| 2.4.5 龙眼DlAGOs启动子序列含有大量功能未知的特异元件 |
| 3 讨论 |
| 3.1 龙眼DlAGOs可能参与激素信号转导 |
| 3.2 龙眼DlAGOs可能参与不同逆境及其它响应调控 |
| 3.3 龙眼DlAGOs启动子“CpG”岛的潜在功能 |
| 第四章 龙眼DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 龙眼材料 |
| 1.1.2 龙眼胚性愈伤组织EC的不同激素处理 |
| 1.1.3 龙眼胚性愈伤组织EC的不同非生物胁迫处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.2.2 DlAGOs家族实时荧光定量PCR引物的合成及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DlAGOs家族在龙眼体胚发生早期阶段的表达分析 |
| 2.2 DlAGOs家族在龙眼合子胚发育过程中的表达分析 |
| 2.3 DlAGOs家族在龙眼不同组织部位的特异性表达分析 |
| 2.4 不同激素处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.1 不同浓度2,4-D处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.2 不同浓度KT处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.3 茉莉酸甲酯(Me JA)处理下龙眼DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.4 水杨酸(SA)处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.5 非生物胁迫处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.1 不同光质处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.2 不同温度处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.3 盐胁迫处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.4 甘露醇处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.5 聚乙二醇-4000 处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.6 脱落酸处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DlAGOs在龙眼体胚与合子胚发育可能发挥相同的作用 |
| 3.2 DlAGOs可能参与调控龙眼胚胎发生发育过程 |
| 3.3 DlAGOs可能参与龙眼种子、叶片和花器官的发育 |
| 3.4 DlAGOs可能响应多种激素的应答 |
| 3.5 DlAGOs可能参与非生物胁迫应答机制 |
| 第五章 龙眼DlAGOs启动子的功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要载体和试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 龙眼DlAGOs启动子表达载体的构建 |
| 1.3.2 重组质粒转化农杆菌和PCR验证 |
| 1.3.3 DlAGOs启动子瞬时转化本氏烟烟草叶片 |
| 1.3.4 DlAGOs启动子瞬时转化烟草叶片的不同激素处理 |
| 1.3.5 GUS活性检测 |
| 1.3.6 DlAGOs启动子瞬时转化龙眼EC |
| 1.3.7 总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 1.3.8 GUS基因相对表达水平的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DlAGOs启动子表达载体的构建 |
| 2.2 瞬时转化烟草叶片的GUS组织化学染色 |
| 2.3 DlAGOs启动子转化烟草叶片驱动GUS基因表达的定量分析 |
| 2.4 不同激素处理下转化烟草叶片的GUS活性测定 |
| 2.5 DlAGOs启动子转化龙眼EC驱动GUS基因表达的定量分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 高等植物启动子的基本结构和作用 |
| 3.2 龙眼DlAGOs可能参与激素调控 |
| 3.3 龙眼遗传转化体系的研究 |
| 第六章 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 的亚细胞定位研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 菌种和载体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 瞬时表达载体构建引物的设计 |
| 1.4.2 目的片段的克隆 |
| 1.4.3 亚细胞定位表达载体的构建 |
| 1.4.4 重组质粒转化农杆菌 |
| 1.4.5 农杆菌侵染转化洋葱内表皮细胞 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼AGO蛋白信号肽和亚细胞定位预测分析 |
| 2.2 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 亚细胞定位融合表达载体的构建 |
| 2.3 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 的亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 3.1 亚细胞定位的研究进展 |
| 3.2 AGO蛋白在植物细胞中亚细胞定位的研究进展 |
| 第七章 5-氮胞苷对龙眼体胚发生早期及DlAGOs表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 不同浓度5-azac的配置 |
| 1.2.2 材料的处理 |
| 1.2.3 龙眼体胚发生早期阶段的形态观察 |
| 1.2.4 总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 5-azac与2,4-D处理对龙眼体胚发生早期和DlAGOs表达的影响 |
| 2.1.1 5-azac与2,4-D处理对龙眼体胚生长状态的影响 |
| 2.1.2 5-azac与2,4-D处理对龙眼早期体胚发生的影响 |
| 2.1.3 5-azac与2,4-D处理对DlAGOs表达的影响 |
| 2.2 低浓度5-azac对龙眼体胚发生的影响和DlAGOs的表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA甲基化水平对龙眼体胚发生的影响 |
| 3.2 2,4-D与5-azac处理对植物体胚发生的影响 |
| 3.3 龙眼AGO基因可能参与DNA甲基化机制 |
| 第八章 5-氮胞苷处理下龙眼体胚发生早期的转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 总RNA的提取、cDNA文库构建与高通量测序 |
| 1.3 测序数据的生物信息学分析 |
| 1.3.1 转录组分析 |
| 1.3.2 基因聚类分析 |
| 1.3.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序数据分析 |
| 2.2 基因表达量水平的分析和差异表达基因的筛选 |
| 2.3 转录因子及植物抗病基因结构域分析 |
| 2.4 差异表达基因的功能富集分析 |
| 2.4.1 差异表达基因GO富集分析 |
| 2.4.2 差异表达基因KEGG富集途径分析 |
| 2.5 5-azac处理下丁酸盐代谢途径相关基因差异表达分析 |
| 2.6 5-azac处理下硫代谢途径相关基因差异表达分析 |
| 2.7 5-azac处理下硒代化合物代谢途径相关基因的差异表达分析 |
| 2.8 5-azac处理下龙眼体胚发生早期差异表达基因的q PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DlAGO4基因在龙眼早期体胚发生的作用 |
| 3.2 DNA甲基化水平降低促进龙眼体胚发生相关基因的表达 |
| 3.3 丁酸盐代谢对植物体胚发育的影响 |
| 3.4 硫代谢对龙眼体胚发生早期的重要作用 |
| 第九章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）小麦响应干旱胁迫的LEA蛋白组学分析及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物对干旱胁迫的响应及抗旱调控 |
| 1.1.1 干旱胁迫感知和信号传导 |
| 1.1.2 植物对干旱胁迫的生理响应 |
| 1.1.3 植物对干旱胁迫的分子响应 |
| 1.1.4 植物适应干旱胁迫的机制 |
| 1.2 LEA蛋白研究进展 |
| 1.2.1 LEA蛋白的分布及分类 |
| 1.2.2 LEA蛋白的特性及功能 |
| 1.2.3 LEA蛋白与胁迫耐受性 |
| 1.3 LEA蛋白质组学研究进展 |
| 1.3.1 蛋白质组学分析与LEA蛋白鉴定 |
| 1.3.2 LEA蛋白质组学研究 |
| 1.4 选题的依据和意义 |
| 第二章 小麦响应干旱胁迫的LEA蛋白组学研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 生理指标测定 |
| 2.1.3 蛋白质沉淀方法比较 |
| 2.1.4 蛋白质提取 |
| 2.1.5 蛋白质的酶解 |
| 2.1.6 胰蛋白酶肽的LC-MS/MS分析 |
| 2.1.7 基于MaxQuant算法的数据库搜索和蛋白质鉴定 |
| 2.1.8 生物信息学和系统发育分析 |
| 2.1.9 RNA提取和实时荧光定量 |
| 2.1.10 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 干旱对小麦生理反应的影响 |
| 2.2.2 蛋白质沉淀方法的比较 |
| 2.2.3 经酸梯度处理的小麦叶片热稳定LEA蛋白电泳图谱 |
| 2.2.4 两种耐旱性不同的小麦幼苗叶片LEA蛋白的鉴定 |
| 2.2.5 小麦中LEA蛋白及LEA蛋白同源物的系统发育分析 |
| 2.2.6 具有热稳定性和酸溶性的非LEA蛋白的鉴定 |
| 2.2.7 热稳定的酸溶蛋白功能分布 |
| 2.2.8 两种耐旱性不同的小麦共有的差异表达蛋白质理化特性分析 |
| 2.2.9 LEA蛋白基因转录的RT-qPCR分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 小麦(Triticum aestivum)TaLea14-A基因的克隆及功能分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 小麦TaLea14-A基因的克隆 |
| 3.1.2 TaLea14-A基因及编码蛋白的生物信息学分析 |
| 3.1.3 不同胁迫下小麦TaLea14-A基因的表达分析 |
| 3.1.4 TaLea14-A蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.5 小麦TaLea14-A基因的原核表达及蛋白纯化 |
| 3.1.6 乳酸脱氢酶活性保护实验 |
| 3.1.7 傅里叶变换红外光谱(FTIR)法分析蛋白结构 |
| 3.1.8 非生物胁迫下小麦TaLea14-A蛋白对大肠杆菌的作用 |
| 3.1.9 小麦TaLea14-A基因转化拟南芥 |
| 3.1.10 转基因拟南芥对干旱胁迫的耐受性分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 小麦TaLea14-A基因的克隆 |
| 3.2.2 小麦TaLea14-A蛋白的特性及生物信息学分析 |
| 3.2.3 不同胁迫下小麦TaLea14-A基因的表达。 |
| 3.2.4 小麦TaLea14-A蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.5 小麦TaLea14-A基因原核表达及蛋白纯化 |
| 3.2.6 TaLea14-A蛋白对乳酸脱氢酶活性的保护 |
| 3.2.7 干燥脱水对TaLea14-A和乳酸脱氢酶结构的影响 |
| 3.2.8 非生物胁迫下小麦TaLea14-A蛋白在体内对大肠杆菌的保护 |
| 3.2.9 拟南芥转基因载体的构建、转化及转基因拟南芥鉴定 |
| 3.2.10 干旱胁迫下拟南芥表型的变化 |
| 3.2.11 干旱胁迫下TaLea14-A对拟南芥生理生化的影响 |
| 3.2.12 干旱胁迫下TaLea14-A对拟南芥活性氧积累的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 小麦(Triticum aestivum)wsh基因的克隆、编码蛋白结构及功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 小麦wsh基因的克隆 |
| 4.1.2 wsh1 基因及编码蛋白的生物信息学分析 |
| 4.1.3 不同胁迫下小麦wsh1 基因的表达分析 |
| 4.1.4 WSH1 蛋白的亚细胞定位 |
| 4.1.5 小麦wsh1 基因的原核表达及蛋白纯化 |
| 4.1.6 傅里叶变换红外光谱(FTIR)法分析蛋白结构 |
| 4.1.7 WSH1 对乳酸脱氢酶活性的影响 |
| 4.1.8 非生物胁迫下小麦WSH1 蛋白对大肠杆菌的作用 |
| 4.1.9 统计分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 小麦wsh基因的克隆 |
| 4.2.2 小麦wsh基因编码蛋白与LEA蛋白的进化关系分析 |
| 4.2.3 小麦WSH1 的蛋白特性及结构和亚细胞定位预测 |
| 4.2.4 不同胁迫下小麦wsh1 基因的表达 |
| 4.2.5 小麦WSH1 蛋白的亚细胞定位 |
| 4.2.6 小麦wsh1 基因原核表达及蛋白纯化 |
| 4.2.7 水合和干燥状态WSH1 的结构分析 |
| 4.2.8 WSH1 蛋白对乳酸脱氢酶活性的抑制 |
| 4.2.9 非生物胁迫下小麦WSH1 蛋白对大肠杆菌的作用 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）CO介导的H2O2参与ABA诱导气孔关闭和FC抑制ABA诱导气孔关闭的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 保卫细胞ABA信号转导 |
| 1.1.1 ABA的感知 |
| 1.1.2 ABA调节离子通道 |
| 1.1.3 ABA信号转导的途径 |
| 1.2 植物细胞H_2O_2及其在气孔运动中的作用 |
| 1.2.1 植物细胞H_2O_2的产生机制 |
| 1.2.2 植物细胞H_2O_2清除机制 |
| 1.2.3 H_2O_2参与调控保卫细胞气孔运动及其信号转导 |
| 1.3 植物细胞NO及其在气孔运动中的作用 |
| 1.3.1 植物体内NO的来源 |
| 1.3.2 NO参与调控保卫细胞气孔运动及其信号转导 |
| 1.4 植物中的CO及其作用 |
| 1.4.1 内源CO的产生及其作用机制 |
| 1.4.2. 植物中CO的生理学作用 |
| 1.5 壳梭孢素 |
| 1.5.1 FC作用机制研究 |
| 1.5.2 FC与气孔运动 |
| 1.6 选题的目的和意义 |
| 第2章 CO参与ABA诱导蚕豆保卫细胞H_2O_2产生和气孔关闭 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 化学试剂 |
| 2.2.3 CO气体饱和水溶液的制备 |
| 2.2.4 表皮条试验 |
| 2.2.5 H_2O_2荧光探针装载 |
| 2.2.6 激光共聚焦扫描显微镜检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 ABA、Ht、CO和H_2O_2对气孔开度的影响 |
| 2.3.2 ABA、ZnPPIX、Vc、CAT、DPI单独及复合处理对气孔开度的影响 |
| 2.3.3 Ht、Vc、CAT、DPI单独及复合处理对气孔开度的影响 |
| 2.3.4 ABA、ZnPPIX、Vc、CAT、DPI单独及复合处理对保卫细胞内H_2O_2产生的影响 |
| 2.3.5 Ht、Vc、CAT、DPI单独及复合处理对保卫细胞内源H_2O_2产生的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 FC抑制ABA诱导蚕豆气孔关闭与其降低保卫细胞H_2O_2水平有关 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 化学试剂 |
| 3.2.3 表皮条试验 |
| 3.2.4 H_2O_2荧光探针的装载 |
| 3.2.5 激光共聚焦扫描显微镜检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 FC、Vc、CAT、DPI对ABA诱导气孔关闭的影响 |
| 3.3.2 FC、Vc、CAT、DPI对ABA诱导保卫细胞H_2O_2水平的影响 |
| 3.3.3 FC、Vc、CAT、DPI对ABA诱导下已关闭气孔的效应 |
| 3.3.4 FC、Vc、CAT、DPI对ABA诱导下已产生H_2O_2的影响 |
| 3.3.5 FC、Vc、CAT、DPI对外源H_2O_2诱导气孔关闭的影响 |
| 3.3.6 FC、Vc、CAT、DPI对外源H_2O_2诱导保卫细胞DCF荧光的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 FC抑制ABA诱导蚕豆气孔关闭与其降低保卫细胞NO水平有关 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 化学试剂 |
| 4.2.3 表皮条试验 |
| 4.2.4 NO荧光探针的装载 |
| 4.2.5 激光共聚焦扫描显微镜检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 FC、c-PTIO、L-NAME对ABA诱导气孔关闭的影响 |
| 4.3.2 FC、c-PTIO、L-NAME对ABA诱导保卫细胞NO水平的影响 |
| 4.3.3 FC、c-PTIO、L-NAME对ABA诱导下已关闭气孔的效应 |
| 4.3.4 FC、c-PTIO、L-NAME对ABA诱导下已产生NO的影响 |
| 4.3.5 FC、c-PTIO、L-NAME对SNP诱导气孔关闭的影响 |
| 4.3.6 FC、c-PTIO、L-NAME对SNP诱导保卫细胞NO荧光的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 图版及图版说明 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（6）蚕豆叶片保卫细胞原生质体的提取及叶片cDNA文库的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 选题目的、依据及意义 |
| 1.2 国内外相关方面研究进展 |
| 1.2.1 保卫细胞的相关研究 |
| 1.2.2 原生质体提取原理及方法 |
| 1.2.3 cDNA 文库 |
| 1.2.4 利用SMART 技术构建全长cDNA 文库 |
| 第二章 蚕豆叶片保卫细胞原生质体的提取 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料及培养 |
| 2.2.2 试剂配制 |
| 2.2.3 蚕豆叶片保卫细胞原生质体的提取 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 表皮获得方法的改进 |
| 2.3.2 原生质体分离纯化的改进 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 蚕豆叶片cDNA 文库的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料的培养 |
| 3.2.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2.3 总RNA 的提取及检测 |
| 3.2.4 cDNA 文库的构建 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 总RNA 的提取 |
| 3.3.2 LD-PCR 扩增 |
| 3.3.3 电转化结果蓝白斑筛选 |
| 3.3.4 cDNA 文库的滴度 |
| 3.4 小结 |
| 3.4.1 总RNA 的提取 |
| 3.4.2 RNA 电泳检测 |
| 3.4.3 LD- PCR 扩增 |
| 3.4.4 CHROMA SPIN-400 Column 分级分离cDNA |
| 3.4.5 文库滴度的鉴定 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）乙烯对ABA和暗诱导气孔关闭的效应及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 ABA在气孔运动中的作用 |
| 1.1.1 ABA的感受和作用位点 |
| 1.1.2 ABA与离子通道 |
| 1.1.3 Ca~(2+)依赖与Ca~(2+)不依赖ABA信号转导 |
| 1.1.4 ABA与蛋白质可逆磷酸化 |
| 1.1.5 ABA与细胞骨架 |
| 1.2 光/暗对气孔运动的调控 |
| 1.3 气孔运动中H_2O_2上、下游信号 |
| 1.3.1 H_2O_2上游信号 |
| 1.3.2 H_2O_2下游信号 |
| 1.4 NO和气孔运动 |
| 1.4.1 NO与植物激素 |
| 1.4.2 NO与保卫细胞信号转导 |
| 1.5 乙烯和气孔运动 |
| 1.5.1 乙烯的生物合成 |
| 1.5.2 乙烯的作用 |
| 1.5.3 乙烯与其他植物激素在气孔运动方面的相互作用 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要化学试剂 |
| 2.2 植物材料及培养 |
| 2.3 表皮条试验 |
| 2.4 H_2O_2、NO荧光探针装载 |
| 2.5 内源H_2O_2、NO检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 乙烯对ABA和暗诱导气孔关闭的效应 |
| 3.1.1 乙烯对ABA诱导气孔关闭的效应 |
| 3.1.2 乙烯对暗诱导气孔关闭的效应 |
| 3.2 乙烯对ABA和暗诱导保卫细胞H_2O_2、NO的影响 |
| 3.2.1 乙烯对ABA诱导保卫细胞H_2O_2、NO水平的影响 |
| 3.2.2 乙烯对暗诱导保卫细胞H_2O_2、NO水平的效应 |
| 3.3 乙烯对H_2O_2和SNP诱导气孔关闭的效应 |
| 3.3.1 乙烯对H_2O_2诱导气孔关闭的效应 |
| 3.3.2 乙烯对SNP诱导气孔关闭的效应 |
| 3.4 乙烯对外源H_2O_2、SNP处理保卫细胞H_2O_2、NO水平的效应 |
| 3.4.1 乙烯对外源H_2O_2处理保卫细胞H_2O_2水平的效应 |
| 3.4.2 乙烯对外源SNP处理保卫细胞NO水平的效应 |
| 3.5 乙烯对ABA、暗诱导下已关闭气孔的效应 |
| 3.5.1 乙烯对ABA诱导下已关闭气孔的效应 |
| 3.5.2 乙烯对暗诱导下已关闭气孔的效应 |
| 3.6 乙烯对ABA、暗诱导下已关闭气孔保卫细胞H_2O_2、NO水平的效应 |
| 3.6.1 乙烯对ABA诱导下已关闭气孔保卫细胞H_2O_2、NO水平的效应 |
| 3.6.2 乙烯对暗诱导下已关闭气孔保卫细胞H_2O_2、NO水平的效应 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 图版及图版说明 |
| 致谢 |
| 硕士在读期间研究成果 |
（8）Auxins、CTKs对ABA诱导气孔关闭的效应及其作用机制研究（论文提纲范文）
| Ⅰ 文献综述 |
| 1 气孔保卫细胞ABA信号转导 |
| 1.1 ABA受体 |
| 1.2 保卫细胞ABA信号转导 |
| 1.2.1 Ca~(2+),IP_3和cADPR |
| 1.2.2 H~+信使 |
| 1.2.3 蛋白激酶／蛋白磷酸酶 |
| 1.2.4 H_2O_2和NO |
| 1.2.5 ABA对离子通道的调节 |
| 2 植物细胞H_2O_2与气孔运动 |
| 2.1 植物细胞H_2O_2的产生和清除机制 |
| 2.1.1 H_2O_2的产生 |
| 2.1.2 H_2O_2的清除 |
| 2.2 H_2O_2与气孔保卫细胞信号转导 |
| 2.2.1 H_2O_2参与保卫细胞气孔运动 |
| 2.2.2 气孔运动调控中H_2O_2的信号转导 |
| 3 植物细胞NO与气孔运动 |
| 3.1 NO生物学活性的发现 |
| 3.2 植物体内NO的来源 |
| 3.2.1 NOS途径 |
| 3.2.2 NR／NiR途径 |
| 3.2.3 非酶促途径 |
| 3.3 NO与植物激素 |
| 3.4 植物中NO信号传递途径 |
| 3.5 NO与气孔运动 |
| 3.5.1 NO参与调控保卫细胞气孔运动 |
| 3.5.2 保卫细胞NO信号转导 |
| 4 植物激素生长素与气孔运动 |
| 5 植物激素细胞分裂素与气孔运动 |
| 6 选题目的和意义 |
| Ⅱ 材料和方法 |
| 1 材料和化学试剂 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 主要化学试剂及仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 表皮条的剥离和分析 |
| 2.2 H_2O_2和NO荧光探针的装载 |
| 2.3 激光扫描共聚焦显微检测技术 |
| Ⅲ 结果与分析 |
| 1 Auxins、CTKs对ABA诱导气孔关闭和内源H_2O_2、NO的效应 |
| 1.1 Auxins、CTKs对ABA诱导气孔关闭的效应 |
| 1.1.1 ABA对气孔运动的效应 |
| 1.1.2 AsA、DPI及cPTIO、L-NAME对ABA诱导气孔关闭的效应 |
| 1.1.3 IAA、NAA对ABA诱导气孔关闭的效应 |
| 1.1.4 6-BA、KT对ABA诱导气孔关闭的效应 |
| 1.2 Auxins、CTKs对ABA诱导保卫细胞内源H_2O_2、NO水平的效应 |
| 1.2.1 Auxins、CTKs对ABA诱导保卫细胞内源H_2O_2水平的效应 |
| 1.2.2 Auxins、CTKs对ABA诱导保卫细胞内源NO水平的效应 |
| 2 Auxins、CTKs对ABA诱导下已关闭气孔再开放和H_2O_2、NO的效应 |
| 2.1 Auxins、CTKs对ABA诱导下已关闭气孔再开放的效应 |
| 2.1.1 IAA、NAA对ABA诱导下已关闭气孔再开放的效应 |
| 2.1.2 6-BA、KT对ABA诱导下已关闭气孔再开放的效应 |
| 2.2 Auxins、CTKs对ABA诱导下已产生的H_2O_2、NO的效应 |
| 2.2.1 AsA、DPI、Auxins、CTKs对ABA诱导下已产生的H_2O_2的效应 |
| 2.2.1.1 AsA、DPI对ABA诱导下已产生的H_2O_2的效应 |
| 2.2.1.2 IAA、NAA对ABA诱导下已产生的H_2O_2的效应 |
| 2.2.1.3 6-BA、KT对ABA诱导下已产生的H_2O_2的效应 |
| 2.2.2 cPTIO、L-NAME、Auxins、CTKs对ABA诱导下已产生的NO的效应 |
| 2.2.2.1 cPTIO、L-NAME对ABA诱导下已产生的NO的效应 |
| 2.2.2.2 IAA、NAA对ABA诱导下已产生的NO的效应 |
| 2.2.2.3 6-BA、KT对ABA诱导下已产生的NO的效应 |
| Ⅳ 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 图版及图版说明 |
| 致谢 |
| 硕士在读期间研究成果 |
（9）苹果钙依赖蛋白激酶MdCPK1：分子克隆、表达、定位及被脱落酸的激活（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.脱落酸信号转导研究进展 |
| 1.1 脱落酸的结合位点与受体 |
| 1.2 脱落酸与胞内信使 |
| 1.3 ABA的调控机制 |
| 1.4 脱落酸在果实发育中的生理作用 |
| 1.5 研究展望 |
| 2.植物蛋白激酶研究进展 |
| 2.1 植物蛋白激酶 |
| 2.2 植物蛋白激酶家族分类 |
| 2.3 植物体中蛋白质磷酸化及其调节机制 |
| 2.4 植物蛋白激酶的生理功能 |
| 2.5 研究展望 |
| 3.钙依赖蛋白激酶(CDPK)研究进展 |
| 3.1 CDPK序列结构和生化特性 |
| 3.2 CDPK活性的调控 |
| 3.3 CDPK底物以及专一性 |
| 3.4 研究展望 |
| 4.绿色荧光蛋白(GFP)的应用 |
| 5.本研究的目的和意义 |
| 6.本研究主要内容 |
| 第二章 苹果类钙依赖蛋白激酶全长基因的克隆及其序列分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1.材料 |
| 1.2 MdCPK1全长基因的克隆策略 |
| 1.3 引物的设计 |
| 1.4 苹果果实RNA的提取 |
| 1.5 总RNA及浓度的测定 |
| 1.6 cDNA第一链的合成 |
| 1.7 cDNA第二链的合成 |
| 1.8 MdCPK1保守序列的扩增 |
| 1.9 PCR产物的纯化与回收 |
| 1.10 目的片断和测序载体的连接 |
| 1.11 重组质粒的转化 |
| 1.12 重组质粒的鉴定 |
| 1.13 MdCPK1 5’端基因的克隆(5’—RACE) |
| 1.14 MdCPK1 3’端基因的克隆(3’—RACE) |
| 1.15 MdCPK1全长基因的扩增 |
| 1.16 苹果基因组DNA的提取 |
| 1.17 Southern blot |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 .RNA的质量检查结果 |
| 2.2 MdCPK1保守同源片段的获得 |
| 2.3 MdCPK1 5’端基因的克隆(5’—RACE) |
| 2.4 MdCPK1 3’端基因的克隆(3’—RACE) |
| 2.5 MdCPK1全长基因的克隆 |
| 2.6 MdCPK1的序列同源性分析 |
| 2.7MdCPK1蛋白的跨膜区分析 |
| 2.8 MdCPK1的系统进化树分析 |
| 2.9 MdCPK1的Southern Blot分析 |
| 3.小结 |
| 4.讨论 |
| 英文摘要 |
| 第三章 苹果类钙依赖蛋白激酶的原核表达及抗体制备 |
| 摘要 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 原核表达载体pGEX—MdCPK~L的构建 |
| 1.3 原核表达载体pGEX-MdCPK~N的构建 |
| 1.4 GST-MdCPK~L融合蛋白和GST-MdCPK~N融合蛋白的原核诱导表达 |
| 1.5 GST-MdCPK~L融合蛋白和GST-MdCPK~N融合蛋白的检测 |
| 1.6 细菌的裂解和包涵体的制备 |
| 1.7 融合蛋白的亲和纯化 |
| 1.8 抗原的制备 |
| 1.9.免疫小鼠 |
| 1.10 抗血清效价的测定(ELISA) |
| 1.11 抗体的纯化 |
| 1.12 Protein dot blot分析 |
| 1.13 SDS-PAGE和Western Blot |
| 2.结果与分析 |
| 2.1.原核表达载体pGEX-MdCPK~L的构建 |
| 2.2 GST-MdCPK~L融合蛋白的诱导表达 |
| 2.3.GST-MdCPK~L蛋白免疫小鼠的血清效价(ELISA)的测定结果 |
| 2.4.GST-MdCPK~L蛋白Protein Dot Blot |
| 2.5.原核表达载体pGEX-MdCPK~N的构建 |
| 2.6.GST-MdCPK~N融合蛋白的诱导表达 |
| 2.7.GST-MdCPK~N蛋白免疫小鼠的血清效价(ELISA)的测定结果 |
| 2.8.GST-MdCPK~N蛋白的Protein Dot Blot |
| 3.小结 |
| 4.讨论 |
| 英文摘要 |
| 第四章 苹果类钙依赖蛋白激酶的亚细胞定位 |
| 摘要 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1.材料 |
| 1.2 瞬时表达载体pMdCPK~L-GFP的构建 |
| 1.3.苹果果肉微粒体的制备 |
| 1.4.蛋白质含量的测定 |
| 1.5.SDS-PAGE和Western blot |
| 1.6 拟南芥原生质体的分离 |
| 1.7 荧光素醋酸盐(FDA)染色 |
| 1.8 PEG融合法转化原生质体 |
| 1.9 基因枪法转化基因到洋葱表皮细胞 |
| 1.10 显微镜观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1.瞬时表达载体pMdCPK—GFP的构建 |
| 2.2.拟南芥原生质体的分离 |
| 2.3.荧光素醋酸盐(FDA)染色结果 |
| 2.4.pMdCPK~L-GFP在洋葱表皮细胞的亚细胞定位结果 |
| 2.5.pMdCPK~L-GFP在拟南芥原生质体细胞的亚细胞定位结果 |
| 2.6 MdCPK1蛋白在苹果果实不同组分的表达 |
| 3 小结 |
| 4 讨论 |
| 英文摘要 |
| 第五章 苹果类钙依赖蛋白激酶在果实中特异表达并受到脱落酸的激活 |
| 摘要 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1.材料 |
| 1.2.ABA处理实验 |
| 1.3.苹果叶片RNA的提取 |
| 1.4 DNA的去除 |
| 1.5 RNA浓度的测定 |
| 1.6 RT-PCR反转录 |
| 1.7 苹果elongation factor genes(EF-1a)的扩增 |
| 1.8 苹果MdCPK1目的基因(510bp)的扩增 |
| 1.9 苹果果肉微粒体的制备 |
| 1.10.蛋白质含量的测定 |
| 1.11.SDS-PAGE和Western blot |
| 2.结果与分析 |
| 2.1.MdCPK1的组织特异性研究 |
| 2.2.外源ABA处理对MdCPK1蛋白表达量的影响 |
| 3.小结 |
| 4.讨论 |
| 英文摘要 |
| 第六章 结论与推论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）蚕豆保卫细胞中脱落酸诱导过氧化氢产生的亚细胞定位（论文提纲范文）
| 缩写表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 前言 |
| 1.1 ABA与气孔运动 |
| 1.2 植物细胞中H_2O_2的产生及作用机制 |
| 1.2.1 H_2O_2的产生和清除机制 |
| 1.2.2 H_2O_2的生理功能 |
| 1.2.3 H_2O_2与气孔运动 |
| 1.3 H_2O_2在ABA诱导气孔运动过程中的信号转导的研究 |
| 1.4 H_2O_2产生的亚细胞定位 |
| 1.4.1 测定植物体内H_2O_2产生的方法 |
| 1.4.1.1 激光共聚焦显微镜技术（LSCM) |
| 1.4.1.2 淀粉－碘化钾技术 |
| 1.4.1.3 DAB免疫组织化学技术 |
| 1.4.1.4 Ce-H_2O_2电子染色技术 |
| 1.4.2 H2O2产生的亚细胞定位 |
| 1.5 选题意义与依据 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 实验溶液 |
| 2.3 透射电镜（TEM）检测技术 |
| 2.4 激光共聚焦（LSCM）检测技术 |
| 2.5 化学试剂 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 保卫细胞内H_2O_2产生的TEM检测 |
| 3.1.1 自然状态下保卫细胞和叶肉细胞内Ce-H_2O_2的电子沉积物观察 |
| 3.1.2 H_2O_2处理叶片10min后保卫细胞内Ce-H_2O_2的电子沉积物观察 |
| 3.1.3 ABA处理叶片10min后保卫细胞Ce-H_2O_2的电子沉积物观察 |
| 3.1.4 ABA处理叶片15min后保卫细胞Ce-H_2O_2的电子沉积物观察 |
| 3.1.5 ABA处理叶片20min后保卫细胞Ce-H_2O_2的电子沉积物观察 |
| 3.1.6 ABA处理30min后保卫细胞和叶肉细胞内Ce-H_2O_2的电子沉积物观察 |
| 3.1.7 ABA处理叶片60min后保卫细胞和叶肉细胞内Ce-H_2O_2的电子沉积物观察 |
| 3.1.8 ABA处理叶片90min后保卫细胞Ce-H_2O_2的电子沉积物观察 |
| 3.1.9 ABA处理叶片120min后保卫细胞Ce-H_2O_2的电子沉积物观察 |
| 3.1.10 胞外CAT预处理对ABA诱导保卫细胞H_2O_2的产生的影响 |
| 3.1.11 胞外DPI对ABA诱导保卫细胞H_2O_2的产生的影响 |
| 3.1.12 胞外Vc对ABA诱导保卫细胞H_2O_2的产生的影响 |
| 3.2 保卫细胞内H_2O_2产生的荧光探针检测 |
| 3.2.1 表皮条气孔活性检测 |
| 3.2.2 保卫细胞内H_2O_2产生的荧光观察 |
| 3.2.3 胞外AsA对ABA诱导保卫细胞H_2O_2的产生的影响 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 保卫细胞内H_2O_2产生的电子密集沉积物检测 |
| 4.2 保卫细胞内H_2O_2产生的荧光探针检测 |
| 5. 结论 |
| 6. 参考文献 |
| 7. 致谢 |
四、蚕豆保卫细胞原生质体质膜ABA结合蛋白的理化特性（论文参考文献）
- [1]芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究[D]. 刘维妙. 浙江大学, 2021(01)
- [2]盐生草盐胁迫响应基因HgS5功能研究[D]. 彭亚萍. 甘肃农业大学, 2021(09)
- [3]龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析[D]. 陈荣珠. 福建农林大学, 2020
- [4]小麦响应干旱胁迫的LEA蛋白组学分析及功能研究[D]. 李娜. 西北农林科技大学, 2019(02)
- [5]CO介导的H2O2参与ABA诱导气孔关闭和FC抑制ABA诱导气孔关闭的机制[D]. 张云英. 陕西师范大学, 2009(07)
- [6]蚕豆叶片保卫细胞原生质体的提取及叶片cDNA文库的构建[D]. 项燕. 西北农林科技大学, 2009(S2)
- [7]乙烯对ABA和暗诱导气孔关闭的效应及其作用机制研究[D]. 王娟. 陕西师范大学, 2009(07)
- [8]Auxins、CTKs对ABA诱导气孔关闭的效应及其作用机制研究[D]. 孟朝妮. 陕西师范大学, 2006(10)
- [9]苹果钙依赖蛋白激酶MdCPK1：分子克隆、表达、定位及被脱落酸的激活[D]. 邹克琴. 中国农业大学, 2005(05)
- [10]蚕豆保卫细胞中脱落酸诱导过氧化氢产生的亚细胞定位[D]. 詹卫华. 河南大学, 2003(01)