一、应用改建的人5型腺病毒载体表达成人腹泻轮状病毒第5基因编码的内壳蛋白（论文文献综述）
彭瑚,洪涛,王长安,张炳华,屈建国[1]（1996）在《应用改建的人5型腺病毒载体表达成人腹泻轮状病毒第5基因编码的内壳蛋白》文中进行了进一步梳理应用前期工作克隆的腺病毒晚期表达盒对引进的5型腺病毒（Adenovirus type 5,Ad5）载体进行改建,首先将成人腹泻轮状病毒（Adult Diarrhea rotavirus,ADRV）第5基因克隆入表达盒中,而后将该表达盒插入到Ad5载体的E3区,最后重组质粒与Ad5 DNA EcoR I大片段共转染A549细胞,经打点杂交和Southern转印筛选出重组病毒空斑。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测重组病毒感染细胞上清和沉淀的抗原滴度分别为1:8,1:64。Western转印显示在分子量44 000处有一条转印带。ADRV第5基因在改建的Ad5载体上的表达为口服腺病毒基因工程疫苗的研究积累了实验经验,为ADRV诊断试剂的研制提供了便利条件。
王敏[2]（2008）在《基因优化的表达人轮状病毒重组腺病毒免疫效果研究》文中进行了进一步梳理A组轮状病毒（Group A Rotavirus,ARV）是引起全世界婴幼儿严重腹泻的最重要病原,在发展中国家,每年至少约600,000儿童死于轮状病毒感染。鉴于轮状病毒危害严重且缺乏有效治疗手段,世界卫生组织一直将发展轮状病毒疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。由于腺病毒能感染呼吸道和肠道,在诱导全身免疫的同时产生局部粘膜免疫,安全可靠,可以通过口服或滴鼻给药,适于婴幼儿使用,因此,腺病毒载体轮状病毒基因工程疫苗具有良好的前景。我们实验室前期利用腺病毒载体表达轮状病毒保护性抗原,对轮状病毒基因工程疫苗进行了系统研究。我们课题组前期研究表明:用Ad5表达的轮状病毒的VP6和VP7基因,采用滴鼻或灌胃的给药方式,可以在小鼠实验模型上取得良好的细胞免疫和体液免疫效果,并对轮状病毒攻击鼠有一定的保护作用。但是,由于腺病毒对轮状病毒的野生型基因表达量比较低,因此,增强轮状病毒抗原的表达,优化免疫效果,降低重组腺病毒的用量,提高疫苗的安全性等诸多问题就成了发展该疫苗的重要课题。本文通过密码子优化,人工合成了轮状病毒的VP6,VP7基因,通过对蛋白表达量及免疫效果的比较,鉴定了密码优化确实提高了VP6,VP7蛋白的表达量,从而减少了病毒的用量。本研究还检测了口服腺病毒免疫后,不同时间点病毒在小鼠体内的分布,为该疫苗的进一步研究提供了实验资料。1.利用密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒基因的表达量ARV基因的密码子使用与人类密码子相差很远,其AT含量很高。大量研究证明,通过基因密码改造可以有效提高基因的表达量。我们对RV VP6、G1VP7、G2VP7和G3VP7 4个基因依据人的偏爱密码子进行了密码优化,人工合成了优化基因,利用腺病毒Ad5载体（AdEasy系统）在人胚肾细胞293中进行了表达。结果显示,经过密码子优化后,与野生型病毒基因相比,4个基因的蛋白表达量均有显着提高。同时,我们对这4种重组腺病毒进行了连续20代的传代培养,在连续传代过程中,插入的轮状病毒基因一直稳定存在和表达。重组腺病毒rvAdG2VP7（o）在连续传代15代后,重组腺病毒rvAdG1VP7（o）和rvAdG2VP7（o）在连续传代20代后检测到复制型腺病毒（Replication-Competent AdenovirusRCA）的存在。说明重组腺病毒在293细胞中连续传代具有良好的遗传稳定性,传代10代以内一般检测不到RCA,可望满足腺病毒载体疫苗的研发需要。2.密码子优化增强了轮状病毒VP6基因重组腺病毒的免疫效果在证实了通过密码子优化可以提高蛋白表达量后,我们以VP6基因为例,以表达野生型RVVP6基因的重组病毒rvAdVP6为对照,在小鼠模型上通过等量病毒（108TCID50/只/次）3次滴鼻免疫,观察了基因优化重组腺病毒rvAdVP6（o）的免疫效果。结果显示:（1）三次免疫rvAdVP6（o）产生的抗VP6血清IgG抗体水平均明显高于rvAdVP6,说明优化后的重组病毒产生了更强的体液免疫反应;（2）两种重组腺病毒均可诱导粘膜免疫,在肺灌洗液、肺匀浆液、肠匀浆液和粪便中均能检测出较高水平的特异性IgG和IgA,其中,rvAdVP6（o）肺灌洗液、肺匀浆液和粪便中的IgG和IgA水平均显着高于rvAdVP6;rvAdVP6（o）肠匀浆液IgG水平显着高于rvAdVP6,说明优化后的病毒产生了更强的粘膜免疫效果;（3）用ELISpot检测脾细胞培养上清中的γ干扰素（IFN-γ）,结果显示,rvAdVP6（o）产生的斑点数多于rvAdVP6产生的斑点数,说明优化后的病毒产生了更强的细胞免疫效果;（4）RV攻击后检测小鼠的排毒量,发现rvAdVP6（o）免疫组的RV排毒减少率明显高于rvAdVP6,说明优化后的病毒对小鼠的保护性也增强了。综上所述,在等量重组腺病毒免疫的情况下,优化后的VP6重组病毒在体液免疫、粘膜免疫、细胞免疫和攻毒保护方面,均优于优化前,可望在以后的疫苗应用中,达到减少病毒用量的目的。3.重组腺病毒口服免疫后在小鼠体内的生物分布为了探讨重组腺病毒作为口服疫苗的可行性,研究了经灌胃免疫后重组腺病毒在各组织器官中的分布以及抗原表达情况。将小鼠分为两组:rvAdVP6（o）免疫组和PBS对照组,每组70只小鼠,免疫后在7个时间点（4h、12h、1d、4d、7d、14d和28d）分别取5只小鼠,采集14种组织标本,用免疫组织化学方法检测腺病毒载体和轮状病毒VP6抗原,用荧光定量PCR检测腺病毒载体和轮状病毒VP6基因的存在。结果显示:用重组腺病毒灌胃免疫小鼠后,在4h～28d内,在肝、肾、脾、心脏、肺、大肠、小肠、胃、食管、舌、脑、气管、派氏结和卵巢14种组织标本中,均无明显的病理变化;免疫组织化学检测结果显示,只在4h时在大肠和小肠中检测到腺病毒和轮状病毒VP6抗原;荧光定量PCR在4h时在大肠、小肠、胃、食管和派氏结中检测到腺病毒载体和轮状病毒VP6基因;12h时后在大肠、小肠、胃和食管中仍能检测到腺病毒载体和轮状病毒VP6基因,但其拷贝数明显降低;1d后只在大肠和食管中检测到少量的腺病毒载体和轮状病毒VP6基因;在4d、7d后,食管、胃和大肠仍能检测到腺病毒载体基因的存在,其他组织中均检测不到;至14d时,只有在食管中仍能检测到腺病毒载体基因的存在,在其他组织中均检测不到。说明灌胃免疫后,腺病毒载体和VP6基因在小鼠体内可以表达,并在多种组织器官中存在。综上所述,本研究构建了4株表达轮状病毒密码子优化基因的VP6和VP7的重组腺病毒,与野生型基因相比,其在蛋白表达水平和免疫效果上均明显得到提高,在此基础上检测了灌胃免疫后,其在小鼠体内的分布情况,这些研究均未见报道。这些结果的获得,为研制我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗进一步奠定了基础。
张彩红[3]（2005）在《轮状病毒基因工程疫苗免疫效果的研究》文中研究表明轮状病毒（Rotavirus,RV）是引起全世界婴幼儿和幼龄动物严重腹泻的最重要、最常见的病原。在发展中国家,每年因RV 感染发生中度和严重腹泻以及死亡的儿童高达1887 万人;在发达国家,因RV 感染造成的经济损失是一个不容忽视的问题。据估计美国每年就此一项的医药损失高达2 亿6 千万美元。鉴于RV 危害严重且无有效的治疗手段,世界卫生组织（WHO）将RV 疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。目前正在研制的候选RV 疫苗包括重组或减毒疫苗、灭活疫苗、病毒样颗粒（VLPs）疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和转基因植物疫苗等,动物实验表明这些疫苗的免疫保护效果差异较大,因此对于新型RV 疫苗的研究仍在探索之中。A 组RV 血清型众多,疫苗研究实践表明,包含中和性抗原的多价疫苗的效果要好于单价疫苗。为了探索以非复制型腺病毒为表达载体的多价RV 基因工程疫苗的可行性,我们在前期获得了表达我国A 组RV G1 型、G2 型和G3 型流行毒株VP7 基因的非复制型重组腺病毒rvAdG1VP7、rvAdG2VP7 和rvAdG3VP7,并对其免疫效果进行了研究,均获得了良好的免疫效果。RV VP6 蛋白是其主要的组特异性抗原,有较强的抗原性和免疫原性,可诱导保护性免疫。研究表明,VP6 蛋白的IgA 单克隆抗体对RV 感染具有免疫保护作用,肌注免疫VP6 DNA疫苗可产生较好的异源保护作用,以VP6 蛋白和黏膜佐剂免疫小鼠可诱导产生对鼠RV EDIM 株的完全保护作用。为了获得更有效的RV基因工程疫苗,我们在前期构建了表达我国A 组RV VP6 基因的非复制型重组腺病毒rvAdVP6。本论文在上述工作的基础上,对轮状病毒重组腺病毒疫苗rvAdVP6 的免疫效果进行了研究。获得了以下结果: 1.将非复制型重组腺病毒疫苗rvAdVP6 经滴鼻和灌胃两种途径免疫Balb/c 小鼠两次,对免疫后小鼠的血清IgG抗体水平和相关的细胞因子水平进行了检测。结果表明,用rvAdVP6经滴鼻和灌胃两种途径免疫Balb/c小鼠后均可诱导机体产生较强的RV特异性全面免疫应答,包括体液免疫和细胞免疫,但主导免疫反应与免疫途径有关。与相应的对照组相比,灌胃免疫组小鼠产生的IL-4 水平明显高于滴鼻组,而滴鼻免疫组小鼠产生的IFN-? 水平明显高于灌胃组,由此可推测rvAdVP6 滴鼻免疫组小鼠可能产生以Th1型免疫反应为主的全面免疫应答,而rvAdVP6 灌胃免疫组小鼠可能产生以Th2 型免疫
刘甜恬[4]（2018）在《人3、7和55型腺病毒三价疫苗候选株及纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒的研究》文中指出【目的】人类腺病毒（HAdV）3、7和55型可引起急性呼吸道疾病流行和暴发。1、研究并探讨一株抗人3、7和55型腺病毒三价疫苗候选株,为腺病毒疫苗研究奠定基础。2.鉴定中和抗原对监测疫情和疫苗开发至关重要,以人三型腺病毒为基础,构建7型腺病毒纤毛头和六邻体蛋白嵌合型重组腺病毒,研究产生主要中和抗体的抗原。3、构建人5型腺病毒纤毛蛋白嵌合型重组人三型腺病毒,研究其对类动物细胞的感染性。【方法】一、通过同源重组,将含有HAdV-55六邻体的片段pSKE3LR-h55中的HAdV-55六邻体（h55）重组到含有HAdV-3和HAdV-7六邻体的质粒p BRAd-MHE3中,得到的三价腺病毒质粒命名为p BRAd-MHE3-h55。在二价疫苗rAdMHE3的E3区表达HAdV-55的六邻体,包装出重组抗人3、7和55型腺病毒三价疫苗候选株rAdMHE3-h55。测定重组腺病毒的生长曲线用来分析其生长特性,使用小鼠血清对重组病毒进行的体外中和试验。使用rAdMHE3-h55免疫小鼠,分别用HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55滴鼻攻毒,取肺组织进行Q-PCR检测、HE染色,检测重组腺病毒对小鼠的保护力。通过PCR扩增人7型腺病毒的纤毛头基因,与人3型腺病毒载体进行同源重组,包装出含Ad3E骨架和HAdV-7纤毛头的重组衣壳嵌合人腺病毒rAd3E-Fk7。通过PCR获得的人7型腺病毒的六邻体基因替换p Ad3E-Fk7的3型六邻体,包装出含有Ad3E骨架和HAdV-7六邻体和纤毛头的重组衣壳嵌合人腺病毒rAd3E-H7Fk7。测定重组腺病毒的生长曲线用来分析其生长特性,使用小鼠和人血清对嵌合腺病毒进行的体外中和试验。使用纯化的病毒HAdV-3、HAdV-7和rAd3E-H7Fk7免疫小鼠获得血清进行体外中和实验,在人血清中对重组腺病毒进行中和试验。三、通过PCR扩增人5型腺病毒的纤毛头基因,与人3型腺病毒载体进行同源重组,包装出包含Ad3E骨架和HAdV-5纤毛头的重组衣壳嵌合人腺病毒rAd3E-Fk5。测定重组腺病毒的生长曲线用来分析其生长特性。重组人腺病毒rAd3E-Fk5感染小鼠原代肾上皮细胞、金仓鼠原代肾上皮细胞以及测定rAd3E-Fk5在金仓鼠原代细胞内晚期基因的表达。【结果】一、成功包装出了重组抗人3、7和55型腺病毒三价疫苗候选株rAdMHE3-h55。重组三价病毒rAdMHE3-h55表达HAdV-55的六邻体蛋白并且具有与其对应的野生型HAdV-3有相似的复制动力学。小鼠抗-rAdMHE3-h55对HAdV-3、HAdV-7、HAdV-55和rAdMHE3-h55产生强应答,而小鼠抗-HAdV-55仅针对HAdV-55和rAdMHE3-h55的产生应答。这些发现证实,重组腺病毒rAdMHE3-h55能够在小鼠中诱导免疫应答,并且产生针对HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55的抗体。用rAdMHE3-h55接种可BALB/c小鼠,使用HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55对其进行滴鼻感染,发现第五天,免疫后的小鼠对三种病毒都能有效的清除。我们的体外和体内研究表明,rAdMHE3-h55不仅能够诱导针对HAdV3、HAdV7和HAdV55的中和抗体,而且使用HAdV-3、HAdV-7或HAdV-55对小鼠进行滴鼻攻毒,rAdMHE3-h55免疫对小鼠能明显产生保护作用。二、成功构建了重组腺病毒rAd3E-Fk7和rAd3E-H7Fk7。重组腺病毒rAd3E-Fk7、rAd3E-H7Fk7与野生型腺病毒具有相同的复制曲线。用嵌合腺病毒进行体外中和实验表明,六邻体和纤毛头蛋白能诱导产生针对HAdV-3和HAdV-7的中和抗体。对人血清进行体外中和实验,显示六邻体和纤毛头蛋白能产生HAdV-3或HAdV-7的中和抗体。总之,HAdV-3和HAdV-7中的六邻体蛋白和纤毛头蛋白都可能是诱导中和抗体应答。研究结果对腺病毒疫苗和药物开发有重要意义。三、成功构建了重组人五型腺病毒纤毛头蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-Fk5。结果显示rAd3E-Fk5病毒在金仓鼠原代细胞内有显着增殖。而rAd3E病毒在金仓鼠原代细胞内没有显着增殖。人3型腺病毒rAd3E对小鼠肾原代细胞感染能力低,而纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-Fk5的感染力高,与对照人5型腺病毒rAd5E感染力相近。rAd3E-Fk5在金仓鼠原代细胞内有晚期基因的表达。可以用于人3型腺病毒疫苗评价、抗病毒药物评价、致病机制的小鼠、金仓鼠动物模型中。【结论】一、重组腺病毒rAdMHE3-h55能够在小鼠中诱导免疫应答,并且产生针对HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55的抗体。对重组腺病毒疫苗的开发有重要意义。二、HAdV-3和HAdV-7中的六邻体蛋白和纤毛头蛋白都可能是诱导中和抗体应答。因此可能对腺病毒疫苗和药物开发很重要。三、纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-Fk5在体外可以感染小鼠肾原代上皮细胞、金仓鼠肾原代细胞,其感染效率与HAdV-5相近,相比其母毒株rAd3E其感染效率要高得多,rAd3E-Fk5在金仓鼠细胞内有显着复制,可以用于人3型腺病毒疫苗评价、抗病毒药物评价、致病机制等动物模型中。
陈漉[5]（2009）在《特异性抗肿瘤重组腺病毒抑癌作用研究》文中提出为更好的研究重组腺病毒抗肿瘤制剂在临床应用过程中存在的安全性和有效性,本研究利用分子生物学、病毒学和免疫学等技术和手段,通过同源重组方法构建了分别含有特异性抑癌基因HN、Apoptin的特异性抗肿瘤重组腺病毒;同时构建了对照重组腺病毒,Ad-EGFP。通过一系列实验研究证明,所获得重组腺病毒性状稳定,形态完整。通过MTT染色、AO/EB染色、流式细胞术等方法检测了重组腺病毒感染对HepG-2人肝癌细胞的抑制作用。证明了,Ad-Apoptin和Ad-HN重组腺病毒可不同程度地抑制体外培养的HepG-2肿瘤细胞。利用Annexin V染色、DAPI染色、Caspase活性检测等方法探讨了所构建重组腺病毒致HepG-2细胞死亡的方式。证实了,Ad-Apoptin、Ad-HN重组腺病毒主要以诱导凋亡的方式抑制体外培养的HepG-2肿瘤细胞。通过在C57BL/6小鼠荷小鼠肝癌（H22）肿瘤模型上的体内实体肿瘤抑制试验,发现Ad-Apoptin、Ad-HN均可不同程度地抑制实体肿瘤的生长,提高荷瘤动物模型生存率,延长荷瘤动物模型生存期。另外,Ad-HN还可以刺激机体产生抗肿瘤免疫效应。上述研究为揭示HN、Apoptin的抑瘤和免疫调控机理提供了有价值的参考数据。
师东方[6]（2002）在《猪轮状病毒和传染性胃肠炎病毒核酸免疫的研究》文中研究表明本实验在MA104细胞上培养增殖了猪轮状病毒（RV）地方分离株JL94，并提取了病毒的双股RNA。以该RNA为模板，Li-9、Li-11为一对上、下游引物，Li-12、Li-13为另一对上、下游引物，通过RT-PCR分别扩增出了大小为1000bp、1300bp的两个片段。 将该片段插入T载体中构建了重组质粒pMD18-T-JL94/VP7和pMD18-T-JL94/VP6，经酶切初步鉴定和序列检测证明扩增的片段是JL94/VP7（1062bp），JL94/VP6（1356bp）全长基因，并与国外参考毒株OSU株、Gottfried株进行了核苷酸和氨基酸序列的比较。JL94/VP7与OSU株VP7核苷酸同源性为99.9％，氨基酸同源性为99.9％，与Gottfried株VP7核苷酸同源性为74.1％，氨基酸同源性为75.4％。JL94/VP6与OSU株VP6核苷酸同源性为86.85％，氨基酸同源性为97.48％，与Gotffried株VP6核苷酸序列同源性为82.41％，氨基酸序列同源性为93.20％。 以pMD18-T-JL94/VP7为模板，Li-14、Li-11，为上、下游引物扩增带有Kozak序列的VP7基因并克隆到T载体上构建了重组质粒pMD18-T-VP7。将真核表达载体pcDNA3.1（+）与pMD18-T-VP7分别用HindⅢ、BamHⅠ双酶切，胶回收纯化后连接。经酶切鉴定和序列检测，证明VP7基因按设计要求已插入表达载体中，构建了重组真核表达载体pcDNA-VP7。 以重组质粒PHD为模板，Li-15、Li-2为上、下游引物扩增出上游带有BamHⅠ酶切位点的传染性胃肠炎病毒（TGEV）TH-98/N基因。将N基因胶回收纯化后与真核表达载体pcDNA3.1（+）分别用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，胶回收纯化后连接。经酶切鉴定和序列检测，证明N基因按设计要求已插入表达载体中，构建了重组真核表达载体pcDNA-N。 将昆明鼠随机分为A、B、C、D四组，分别肌肉注射pcDNA-VP7、pcDNA-N、pcDNA-VP7+pcDNA-N和pcDNA3.1（+），每只鼠100μg/100μ1，共免疫3次，每次间隔2周。首次免疫第0d、14d、21d、28d、35d、39d、47d、54d采血分离血清用ELISA法检测抗体动态变化，同时检测外周血CD4+、CD8+T细胞动态变化。 A组小鼠血清在首免后第14d即可检出阳性抗体。以后在第28d、35d、39d、54d分别检出了阳性抗体（P/N≥2.0），第35d抗体水平最高。C组小鼠血清在首免后第14d也可检出阳性抗体。以后在第28d、39d、54d均检出阳性抗体（P/N≥2.0）。B组小鼠在首次免疫后第39d检测到针对TGEVN蛋白的阳性抗体（P/N≥2.0），其它时间均未检出阳性抗体。 A组与D组小鼠外周血CD4+T细胞数量在首免后第14d、47d、54d有显着差异（P＜0.05），A组小鼠外周血CD4+T细胞数量明显高于D组。B组与D组小鼠外周血CD4+T细胞数量在首免后第28d、47d分别出现显着差异（P＜0.05）。B组小鼠外周血CD4+T细胞数量明显高于D组。C组与D组小员外周血CD4+T细胞数量在首免后28d与对照组比较，差异显着（P＜0.05），C组小员外周血CD4+T细胞数量明显高于D组。 A组与D组小鼠外周血CD8+T细胞数量在首免后第14d出现显着差异（P＜0.05），博士学位论文 猪轮状病毒和传染性胃肠炎病毒核酸免疫的研究 2002年 12月A组小鼠外周血CDS”T细胞数量明显高于D组。B组与D组小鼠外周血CDS”T细胞数量在首免后第14d出现显着差异(P＜0．0引，B组小鼠外周血CD矿T细胞数量明显高于D组。C组与D组小鼠外周血CDS“T细胞数量在第35d出现显着差异（P＜0．05），C组小鼠外周血CDS＋ T细胞数量明显高于D组。 本实验首次在国内克隆了猪轮状病毒地方分离株JL94的VP6、VP7全基因并与国外参考毒株进行了序列比较分析，丰富了猪RV感染的分子流行病学资料，也为研制猪轮状病毒基因工程疫苗提供了候选基因；首次在国内构建了猪轮状病毒地方分离株JL94／VP7基因和传染性胃肠炎地方分离株h－98／N基因的重组真核表达载体p。＊＊＊－VP 7和WDN AN：首次在国内应用重组真核表达载体WDN＊－W 7和WDN＊N兔疫昆明鼠，结果证明上述重组真核表达载体能够诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫应答。 该研究为今后对猪 RV和 TGEV进一步的分于生物学研究奠定了基础，为猪RV和丁＊EV核酸疫苗的深入研究提供了科学的实验依据、理论资料以及技术和物质储备。
曾艳[7]（2008）在《猪轮状病毒NSP4基因原核与真核表达载体的构建及其表达研究》文中提出轮状病毒（rotavirus RV）是仔猪腹泻的重要原因,仔猪感染RV后迅速发生腹泻,严重者常因脱水而死亡,给畜牧业造成严重的危害。RV血清型众多,血清的免疫交叉保护性低,研究新型疫苗已经成为防制RV腹泻的研究热点。最近的研究显示轮状病毒非结构蛋白NSP4与RV免疫相关,有可能成为轮状病毒疫苗研制的候选基因。本研究则从猪轮状病毒NSP4着手对其特性进行初步研究,主要内容如下:1.猪轮状病毒NSP4基因的克隆及鉴定根据基因库中已发表的猪轮状病毒OSU株NSP4基因设计含XhoI和EcoRI酶切位点的上、下游引物,并利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从病毒基因组中获得NSP4基因的开放阅读框（ORF）547bp,构建了克隆载体pMD-19T-NSP4。序列分析显示,经过细胞培养的OSU株产生了很大的变异,它与报道的OSU株核苷酸序列同源性为81%,氨基酸同源性为83%,主要变异区段集中在C末端。该毒株更趋向于人轮状病毒,它与人轮状病毒G10株核苷酸同源性为93%,与氨基酸序列同源性为95%。2.NSP4基因片段原核表达载体的构建及其表达研究实验设计了一对引物扩增了去掉前端疏水区的300bp左右的NSP4基因片段,并将其克隆入pMD-19Tsemple载体。然后通过XhoI和EcoRI酶切位点转移到pet32a（+）载体上获得能表达NSP4蛋白C端片段（86-174aa）的原核表达载体pet32a-NSP4c。利用原核表达并纯化的NSP4c蛋白和免疫小鼠获得的阳性抗体构建了检测NSP4抗体的间接ELISA方法。3.NSP4基因真核表达载体的构建及其表达研究将NSP4基因片段通过XhoI和EcoRI酶切位点转移到pEGFP-N1载体上构建真核表达重组质粒pEGFP-N1-NSP4。随后采用脂质体转染法将pEGFP-N1-NSP4转染至COS7细胞。该载体含有绿色荧光蛋白,因此直接用荧光倒置显微镜检测了NSP4基因的表达情况。将昆明小鼠分成随机3组。第一、二组为空白对照和空载体对照,分别注射生理盐水（100μl/只）,pEGFP-N1（100μg/只）。第三组为实验组,注射pEGFP-N1-NSP4（100μg/只）。每两周免疫一次,共免疫三次。分别在免疫的第0d、14d、21d、28d、35d和42d采血制备血清,用ELISA检测抗体水平。第21d即可检测出抗NSP4阳性抗体,第28d、35d阳性抗体水平增加,第42d抗体水平下降。实验结果表明,重组真核表达载体pEGFP-N1-NSP4进行动物免疫时在细胞内得到了表达,并且表达产物能诱导体液免疫反应产生抗体。该试验为NSP4结构和功能的研究以及轮状病毒DNA疫苗的研究提供了材料和技术基础。
马磊[8]（2013）在《携大熊猫轮状病毒CH-1株VP4-VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建与免疫原性研究》文中研究指明大熊猫轮状病毒（Giant Panda Rotavirus, GPRV）因引起幼龄大熊猫（5-11月龄）传染性和顽固性腹泻,导致多器官衰竭而死亡,其发病率可达100%,对大熊猫的种群扩大造成巨大威胁。目前主要是依靠加强饲养管理预防轮状病毒感染,但由于环境等因素的影响效果不是很理想,为此免疫预防成了防制该病的主要措施和研究热点。本试验对以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的大熊猫轮状病毒VP4和VP7双基因疫苗的构建及对小鼠免疫试验进行研究。1.大熊猫轮状病毒VP4和VP7基因的克隆及鉴定根据GenBank中大熊猫轮状病毒CH-1株VP4和VP7基因序列,分别设计引物,经RT-PCR成功得到GPRV-VP4（2331bp）和GPRV-VP7（981bp）基因的核苷酸序列,分别进行克隆后,测序鉴定得到正确的GPRV-VP4和GPRV-VP7基因核苷酸序列。2.大熊猫轮状病毒VP4和VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建选择真核表达质粒pVAX1,将正确的GPRV-VP4和GPRV-VP7基因分别插入表达载体pVAX1中构建含有VP4和VP7基因的单基因表达载体pVAX1-GPR V-VP4、pVAX1-GPRV-VP7和双基因表达载体pVAX1-GPRV-VP4-VP7,并将重组质粒转化减毒沙门氏菌S.L7207得到重组菌株S.L7207/pVAX1-GPRV-VP4、S. L7207/pVAX1-GPRV-VP7和S.L7207/pVAX1-GPRV-VP4-VP7。经PCR、酶切和测序鉴定,表明重组菌构建成功；分别提取重组菌质粒转染IPEC-J2细胞,经间接免疫荧光试验和RT-PCR检测并测序鉴定后,表明重组质粒均能在IPEC-J2细胞中表达。3.携带GPRV-VP4-VP7基因的DNA疫苗的免疫学性质对重组菌株S.L7207/pVAX1-VP4-VP7进行体外稳定性检测,并以不同剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性、目的基因在体内的转录和体内稳定性,进行小鼠血清抗体检测和细胞因子检测,并用MTT法检测脾淋巴细胞的增殖等特性鉴定。结果表明,重组菌在Kan抗性下稳定性好,以安全剂量1×108CFU口服接种小鼠后,重组菌携带的S.L7207/pVAX1-VP4-VP7接种小鼠后3d在肠道部位有VP4和VP7基因的转录,并且重组菌在小鼠体内15d内比较稳定；重组菌S.L7207/pVAX1-VP4-VP7免疫组产生抗体与对照组相比差异显着（P<0.05）,重组菌刺激脾淋巴细胞增殖与对照组差异显着（P<0.05）,结合血清细胞因子检测结果说明重组菌株具有良好的免疫原性。综合试验结果表明,本试验构建的以减毒沙门氏菌为载体的疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,可为大熊猫轮状病毒疫苗研究奠定基础。
二、应用改建的人5型腺病毒载体表达成人腹泻轮状病毒第5基因编码的内壳蛋白（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用改建的人5型腺病毒载体表达成人腹泻轮状病毒第5基因编码的内壳蛋白（论文提纲范文）
（2）基因优化的表达人轮状病毒重组腺病毒免疫效果研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 利用密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒基因的表达量 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 密码子优化可增强轮状病毒VP6基因重组腺病毒的免疫效果 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 重组腺病毒口服免疫后在小鼠体内的生物分布 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附录 密码优化的基因序列 |
| 攻读博士学位期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（3）轮状病毒基因工程疫苗免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 轮状病毒疫苗设计策略与提高疫苗免疫效果新方法研究进展 |
| 1.1 轮状病毒疫苗设计的新思路与策略 |
| 1.1.1 理想疫苗的要求 |
| 1.1.2 新型疫苗技术与免疫策略 |
| 1.1.3 T细胞两条通路的激活与新型疫苗设计 |
| 1.1.4 DNA芯片技术与新型疫苗设计 |
| 1.1.5 目前的疫苗种类 |
| 1.2 轮状病毒疫苗研发重点与增强疫苗免疫效果的途径 |
| 1.2.1 新型免疫方式的研发 |
| 1.2.2 新型传送方式的研发 |
| 1.2.3 核酸疫苗的研发 |
| 1.2.4 基因工程疫苗的研发 |
| 1.2.5 新型疫苗载体释放系统的选择 |
| 1.2.6 新型疫苗佐剂的选择 |
| 1.2.6.1 APC佐剂 |
| 1.2.6.2 T细胞佐剂 |
| 1.2.6.3 黏膜佐剂 |
| 1.2.6.4 结合物型佐剂 |
| 1.2.7 疫苗抗原的选择 |
| 1.2.8 免疫接种途径、启动子和制剂剂型的选择 |
| 1.2.8.1 免疫接种途径的选择 |
| 1.2.8.2 启动子的选择 |
| 1.2.8.3 制剂剂型的选择 |
| 1.2.9 建立能客观评价疫苗免疫效果的理想动物模型 |
| 试验研究 |
| 第二章 表达人A组轮状病毒VP6基因的重组腺病毒疫苗免疫效果的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 细胞和病毒 |
| 2.1.1.2 免疫学试剂 |
| 2.1.1.3 主要仪器 |
| 2.1.1.4 其他主要器材和试剂 |
| 2.1.1.5 主要试剂溶液的配方 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 腺病毒的制备和滴度测定 |
| 2.1.2.2 轮状病毒扩增及滴度测定 |
| 2.1.2.3 动物免疫 |
| 2.1.2.4 小鼠血清中RV特异性IgG抗体的测定 |
| 2.1.2.5 小鼠脾淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ含量的测定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 重组腺病毒滴度的测定 |
| 2.2.2 轮状病毒的滴度测定 |
| 2.2.3 重组腺病毒rvAdVP6免疫小鼠后可诱导产生RV特异性IgG |
| 2.2.4 重组腺病毒rvAdVP6免疫小鼠后诱导机体产生全面的免疫应答但主导免疫反应与免疫途径有关 |
| 2.2.4.1 小鼠脾淋巴细胞分泌IL-4的测定 |
| 2.2.4.2 小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的测定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 A组轮状病毒VP6基因优化改造的方法研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.1.2 主要仪器 |
| 3.1.1.3 主要试剂 |
| 3.1.1.4 主要试剂溶液配方 |
| 3.1.1.5 合成引物 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 逐步拼接法合成RVVP6基因 |
| 3.1.2.2 两步法合成RVVP6基因 |
| 3.1.2.3 优化改造前后RVVP6基因的序列对比分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 逐步拼接法合成RVVP6基因 |
| 3.2.1.1 获得优化的RVVP6基因重组cDNA序列 |
| 3.2.1.2 RVVP6基因的优化合成策略 |
| 3.2.1.3 获得RVVP6基因S1片段和S2片段 |
| 3.2.1.4 获得优化的RVVP6基因 |
| 3.2.2 两步法合成RVVP6基因 |
| 3.2.3 RVVP6基因优化改造前后的序列对比分析 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）人3、7和55型腺病毒三价疫苗候选株及纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 腺病毒的感染和流行性 |
| 1.1 腺病毒的感染和流行 |
| 1.2 人类腺病毒（HAdV）引起呼吸道感染 |
| 2 腺病毒的分类和型别 |
| 3 腺病毒的主要结构 |
| 4 腺病毒中和抗原及表位 |
| 5 腺病毒的受体 |
| 6 人类腺病毒感染动物模型 |
| 6.1 腺病毒感染小鼠模型 |
| 6.2 受体DSG2转基因小鼠 |
| 6.3 人B种腺病毒感染候选模型动物 |
| 6.4 棉鼠、血貂、叙利亚仓鼠 |
| 6.5 猪 |
| 6.6 猴 |
| 6.7 树鼩 |
| 7 腺病毒的疫苗 |
| 7.1 人腺病毒疫苗 |
| 7.2 新型腺病毒疫苗 |
| 8 本论文的研究背景及目的 |
| 第一部分 一株抗人3、7和55型腺病毒重组三价疫苗候选株的研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 重组三价病毒rAdMHE3-h55表达HAdV-55的六邻体蛋白并且具有与其野生型HAdV-3相似的复制动力学 |
| 2.2 用rAdMHE3-h55免疫的小鼠产生识别HAdV-3,HAdV-7和HAdV-55的六邻体蛋白的抗体 |
| 2.3 抗rAdMHE3-h55血清能体外中和HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55 |
| 2.4 用rAdMHE3-h55免疫小鼠,可抵抗BALB/c小鼠中的HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55感染 |
| 2.5 组织病理学分析 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 使用衣壳嵌合病毒鉴定腺病毒中和抗原 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 病毒拯救和准备 |
| 1.4 重组病毒的生长特征 |
| 1.5 免疫印迹 |
| 1.6 小鼠免疫 |
| 1.7 中和试验 |
| 1.8 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 产生携带H7和Fk7的嵌合HAdV-3病毒rAd3E-Fk7、rAd3E-H7Fk |
| 2.2 重组腺病毒的生长特性 |
| 2.3 rAd3E-Fk7和rAd3E-H7Fk7的体外交叉中和实验 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 人5型腺病毒knob置换型人3型腺病毒的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 成功构建纤毛蛋白嵌合型重组人B型腺病毒rAd3E-Fk |
| 2.2 重组人腺病毒rAd3E-Fk5感染小鼠原代肾上皮细胞 |
| 2.3 重组人腺病毒rAd3E-Fk5感染感染金仓鼠细胞 |
| 2.4 rAd3E-Fk5在金仓鼠原代细胞内的复制 |
| 2.5 rAd3E-Fk5在金仓鼠原代细胞内晚期基因的表达 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 科研情况 |
| 博士期间发表的论文 |
| 专利申请 |
| 博士期间参与科研项目 |
| 致谢 |
（5）特异性抗肿瘤重组腺病毒抑癌作用研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第1篇 文献综述 |
| 第1章 腺病毒载体的研究进展 |
| 1.1 腺病毒载体的一般特性 |
| 1.2 腺病毒载体的发展过程 |
| 1.3 腺病毒载体的发展趋势 |
| 1.4 腺病毒载体的应用 |
| 1.5 展望 |
| 第2章 消化道肿瘤的基因治疗 |
| 2.1 消化道肿瘤的基因治疗 |
| 2.2 肿瘤基因治疗存在的问题和前景 |
| 第2篇 研究内容 |
| 第1章 特异性抗肿瘤重组腺病毒的构建及鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 AD-HN对人肝癌细胞HEPG-2的作用研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 AD-APOPTIN对人肝癌细胞HEPG-2的作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 特异性抗肿瘤重组腺病毒的体内抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
（6）猪轮状病毒和传染性胃肠炎病毒核酸免疫的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 综述 |
| 综述一 猪轮状病毒感染及其病原分子生物学研究进展 |
| 综述二 猪传染性胃肠炎及其病原分子生物学研究进展 |
| 综述三 核酸免疫的研究进展 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要实验材料 |
| 1.1 病毒与细胞 |
| 1.2 主要试剂与药品 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 质粒与感受态菌株 |
| 1.5 实验动物 |
| 1.6 主要实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 病毒的培养增殖 |
| 2.2 RNA提取 |
| 2.3 RT-PCR |
| 2.4 重组质粒pMD18-T-JL94/VP7、VP6的构建 |
| 2.5 重组质粒pMD18-T-JL94/VP7的鉴定 |
| 2.6 重组质粒pMD18-T-JL94/VP6的鉴定 |
| 2.7 重组质粒pMD18-T-VP7的构建 |
| 2.8 重组真核表达载体pcDNA-vp7的构建 |
| 2.9 重组真核表达载体pcDNA-N的构建 |
| 2.10 实验动物免疫及血液样品采集 |
| 2.11 抗体检测 |
| 2.12 CD4~+、CD8~+T细胞检测 |
| 实验结果 |
| 1. 重组质粒pMD18-T-JL94/VP7的鉴定 |
| 1.1 PCR产物电泳 |
| 1.2 重组质粒pMD18-T-JL94/VP7的鉴定 |
| 2. 重组质粒pMD18-T-JL94/VP6的鉴定 |
| 2.1 PCR产物电泳 |
| 2.2 重组质粒pMD18-T-JL94/VP6的鉴定 |
| 3. 重组质粒pMD18-T-VP7的鉴定 |
| 3.1 PCR产物电泳 |
| 3.2 重组质粒pMD18-T-VP7的酶切鉴定 |
| 4. 重组真核表达载体pcDNA-vp7的鉴定 |
| 4.1 酶切鉴定 |
| 4.2 序列检测 |
| 5. 重组真核表达载体pcDNA-N的鉴定 |
| 5.1 PCR产物鉴定 |
| 5.2 真核表达载体pcDNA-N的鉴定 |
| 6. 重组真核表达质粒浓度检测 |
| 7. 抗体检测 |
| 7.1 pcDNA-VP7免疫后的抗体检测 |
| 7.2 pcDNA-N免疫后的抗体检测 |
| 8. CD4~+、CD8~+T细胞的检测 |
| 8.1 pcDNA-VP7免疫后的CD4~+T细胞检测 |
| 8.2 pcDNA-N免疫后的CD4~+T细胞检测 |
| 8.3 pcDNA-VP7免疫后的CD8~+T细胞检测 |
| 8.4 pcDNA-N免疫后的CD8~+T细胞检测 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）猪轮状病毒NSP4基因原核与真核表达载体的构建及其表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.轮状病毒病概述 |
| 2.轮状病毒概述 |
| 3.轮状病毒疫苗研究 |
| 3.1 传统疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗 |
| 3.3 DNA疫苗 |
| 3.4 猪轮状病毒疫苗研究 |
| 4.轮状病毒的检测 |
| 5.轮状病毒蛋白的研究 |
| 5.1 结构蛋白 |
| 5.2 非结构蛋白 |
| 6.目的意义 |
| 1.材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 NSP4基因的克隆及鉴定 |
| 2.1.1 PRV病毒的增殖 |
| 2.1.2 引物设计 |
| 2.1.3 NSP4基因的扩增及回收 |
| 2.1.4 NSP4的克隆及鉴定 |
| 2.2 NSP4基因原核表达载体的构建及其表达研究 |
| 2.2.1 NSP4c的克隆与鉴定 |
| 2.2.2 重组质粒pet32a-NSP4c的构建及其鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒pet32a-NSP4c的诱导表达 |
| 2.2.4 NSP4c蛋白的纯化 |
| 2.2.5 间接ELISA的构建 |
| 2.3 NSP4基因真核表达载体的构建及其表达研究 |
| 2.3.1 目的基因的酶切及纯化 |
| 2.3.2 连接与转化 |
| 2.3.3 重组阳性转化子的鉴定 |
| 2.3.4 NSP4基因在COS7细胞中的表达 |
| 2.3.5 pEGFP-N1-NSP4质粒的大量制备与提纯 |
| 2.3.6 pEGFP-N1-NSP4免疫抗体检测 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 NSP4基因的克隆及鉴定 |
| 3.1.1 RT-PCR结果 |
| 3.1.2 重组质粒pMD-19T-NSP4的鉴定 |
| 3.1.3 NSP4基因序列测定与分析 |
| 3.2 NSP4c基因原核表达载体的构建及其表达研究 |
| 3.2.1 NSP4c PCR结果 |
| 3.2.2 重组质粒pMD-19T-NSP4c的鉴定 |
| 3.2.3 重组质粒pet32a-NSP4c的鉴定 |
| 3.2.4 重组质粒pet32a-NSP4c的诱导表达 |
| 3.2.5 NSP4c融合蛋白的纯化 |
| 3.3 NSP4基因真核表达载体的构建及其表达研究 |
| 3.3.1 重组质粒pEGFP-N1-NSP4的鉴定 |
| 3.3.2 NSP4基因在COS7细胞中的表达鉴定 |
| 3.3.3 pEGFP-N1-NSP4免疫抗体检测 |
| 4.讨论 |
| 4.1 NSP4基因的克隆 |
| 4.1.1 NSP4基因的RT-PCR |
| 4.1.2 NSP4基因的克隆及序列分析 |
| 4.2 NSP4c基因的原核表达 |
| 4.3 NSP4基因的真核表达 |
| 4.3.1 真核表达载体的构建 |
| 4.3.2 pEGFP-N1-NSP4免疫原性分析 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 实验试剂的配置 |
（8）携大熊猫轮状病毒CH-1株VP4-VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建与免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 轮状病毒蛋白研究 |
| 1.1 VP1蛋白 |
| 1.2 VP2蛋白 |
| 1.3 VP3蛋白 |
| 1.4 VP4蛋白 |
| 1.5 VP6蛋白 |
| 1.6 VP7蛋白 |
| 1.7 NSp1蛋白 |
| 1.8 NSp2蛋白 |
| 1.9 NSp3蛋白 |
| 1.10 NSp4蛋白 |
| 1.11 NSp5蛋白 |
| 1.12 NSp6蛋白 |
| 2 轮状病毒疫苗研究进展 |
| 2.1 轮状病毒减毒活疫苗 |
| 2.1.1 单价疫苗 |
| 2.1.2 多价疫苗 |
| 2.2 灭活疫苗 |
| 2.3 亚单位疫苗 |
| 2.4 DNA疫苗 |
| 2.5 转基因植物口服疫苗 |
| 3 运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌载体系统研究进展 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 大熊猫轮状病毒VP4和VP7基因的克隆 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株、菌株和试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 目的基因的扩增 |
| 2.1.1 引物设计和合成 |
| 2.1.2 大熊猫轮状病毒总RNA的提取 |
| 2.1.3 反转录聚合酶链反应扩增GPRV-VP4和GPRV-VP7 |
| 2.2 目的基因的克隆 |
| 2.2.1 目的片段的回收 |
| 2.2.2 目的基因克隆、鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR扩增目的基因 |
| 3.2 重组质粒PCR和测序鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 轮状病毒VP4-VP7基因真核表达质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌构建与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 试验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 真核表达载体的构建 |
| 1.3 目的基因的转录与表达检测 |
| 1.3.1 转化及鉴定 |
| 1.3.2 无内毒素质粒的提取 |
| 1.3.3 重组质粒转染IPEC-J2细胞 |
| 1.3.4 目的基因表达检测 |
| 1.3.5 目的基因转录检测 |
| 1.4 重组质粒PVAX1-VP4-VP7转化入减毒沙门氏菌S.L7207 |
| 1.4.1 S.L7207感受态细胞制备 |
| 1.4.2 重组工程菌S.L7207/pVAX1-VP4、pVAX1-VP7、pVAX1-VP4-VP7的构建 |
| 1.4.3 重组减毒沙门氏菌S.L7207/pVAX1-VP4-VP7的鉴定 |
| 1.5 重组菌株生长特性鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 真核表达载体构建结果 |
| 2.2 检测基因转录与表达结果 |
| 2.3 重组表达质粒转化沙门氏菌的结果 |
| 2.4 重组菌株生长特性鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 携带GPRV-VP4-VP7基因的DNA疫苗的减毒沙门氏菌的免疫学特征 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组沙门氏菌的体外稳定性试验 |
| 1.2.2 重组沙门氏菌对小鼠的安全性试验 |
| 1.2.3 目的基因在体内转录的检测 |
| 1.2.4 重组菌株免疫后在不同组织中的消长试验(体内定植试验) |
| 1.2.5 重组减毒沙门氏菌免疫小鼠试验 |
| 1.2.6 MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况 |
| 1.2.7 细胞因子检测 |
| 2 结果 |
| 2.0 重组菌株安全性试验结果 |
| 2.1 小鼠体内目的基因转录检测 |
| 2.2 重组菌株免疫后在不同组织中的消长动态 |
| 2.3 重组菌株体外稳定性试验 |
| 2.4 免疫小鼠抗GPRV抗体水平检测结果 |
| 2.5 淋巴细胞增殖检测结果 |
| 2.6 血清细胞因子检测结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、应用改建的人5型腺病毒载体表达成人腹泻轮状病毒第5基因编码的内壳蛋白（论文参考文献）
- [1]应用改建的人5型腺病毒载体表达成人腹泻轮状病毒第5基因编码的内壳蛋白[J]. 彭瑚,洪涛,王长安,张炳华,屈建国. 中华实验和临床病毒学杂志, 1996(04)
- [2]基因优化的表达人轮状病毒重组腺病毒免疫效果研究[D]. 王敏. 中国疾病预防控制中心, 2008(05)
- [3]轮状病毒基因工程疫苗免疫效果的研究[D]. 张彩红. 西北农林科技大学, 2005(02)
- [4]人3、7和55型腺病毒三价疫苗候选株及纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒的研究[D]. 刘甜恬. 广州医科大学, 2018(05)
- [5]特异性抗肿瘤重组腺病毒抑癌作用研究[D]. 陈漉. 吉林大学, 2009(08)
- [6]猪轮状病毒和传染性胃肠炎病毒核酸免疫的研究[D]. 师东方. 东北农业大学, 2002(01)
- [7]猪轮状病毒NSP4基因原核与真核表达载体的构建及其表达研究[D]. 曾艳. 四川农业大学, 2008(02)
- [8]携大熊猫轮状病毒CH-1株VP4-VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建与免疫原性研究[D]. 马磊. 四川农业大学, 2013(04)