一、三种植物多糖对小鼠正常肝细胞和肝癌细胞细胞核酪氨酸蛋白激酶活力的影响（论文文献综述）
王珂欣[1]（2021）在《基于新型网络药理学策略解析复方苦参注射液抗肝癌主要药效成分与作用机制》文中研究说明选题依据:肝癌是世界上流行最高的10种恶性肿瘤之一,死亡率在消化系统恶性肿瘤中位居第二,发病率有上升趋势,而我国每年新发病例占全球一半以上。目前肝癌的治疗手段主要有外科手术切除及放、化疗等,但患者5年内生存率低于30%。因此,探索肝癌发病机制和防治肝癌药物作用机制,是提高肝癌患者生存率和解决临床用药问题的迫切需求。复方苦参注射液在中国已有超过15年的临床应用历史,用于治疗多种类型的实体肿瘤,尤其是癌肿疼痛和消化系统肿瘤中的肝癌。临床研究表明复方苦参注射液可以改善中晚期肝癌患者的症状,且辅助双介入治疗,联合动脉灌注栓塞术,联合化疗均有显着的疗效。实验药理研究表明复方苦参注射液对H22肝癌荷瘤小鼠模型具有抑瘤作用,可显着抑制肝癌细胞增殖,且调控细胞周期。然而,复方苦参注射液在其它肝癌动物模型中是否具有抑制作用?是否具有抑制肝癌转移的作用?除调控凋亡和周期相关信号通路之外,其抑制肝癌细胞增殖及转移的具体机制还有哪些?其抗肝癌的药效物质基础是什么?这些关键科学问题仍然不清晰,需要进行深入、系统的研究。本研究首先从体内外明确了复方苦参注射液抗肝癌的作用;其次,采用计算系统药理学模型预测了复方苦参注射液抗肝癌的药效成分群;最后,基于定量成分导向的网络药理学方法预测了复方苦参注射液抗肝癌的作用机制并进行了验证。研究结果为复方苦参注射液抗肝癌临床用药提供新的科学依据,为进一步开发组分新药提供物质基础,同时也将为其他中药注射剂防治肿瘤研究提供研究思路。目的:（1）明确复方苦参注射液抗肝癌药理作用。（2）构建计算系统药理学模型,探寻复方苦参注射液抗肝癌的药效成分群。（3）基于定量成分导向的网络药理学方法阐释复方苦参注射液抗肝癌的作用机制。方法:（1）通过肝癌细胞增殖和克隆形成实验,以及对二乙基亚硝胺诱发肝癌大鼠肝脏组织的一般和病理学观察及血清生化指标,明确复方苦参注射液对肝癌细胞和大鼠的抑制作用;通过细胞粘附、伤口愈合细胞划痕、Transwell侵袭以及趋化运动实验,明确复方苦参注射液对肝癌细胞侵袭转移的作用。（2）采用计算系统药理学模型,将代谢组学分析、数据收集、网络算法、生物信息学工具相结合,使用一种称为Dijkstra算法模拟药物靶点对疾病分子网络的传播效应,识别出复方苦参注射液抗肝癌药效成分群。（3）通过对复方苦参注射液中高含量成分进行抗肝癌活性筛选,聚焦含量高且活性强的成分,采用网络药理学方法预测复方苦参注射液抗肝癌作用的关键靶点和通路,采用蛋白质免疫印迹技术对预测关键靶点和Wnt/β-catenin信号通路进行体内外验证,明确复方苦参注射液调节Wnt/β-catenin信号通路抗肝癌的机制。采用代谢组学技术,分析复方苦参注射液对差异代谢物的调节作用,阐明复方苦参注射液调节肝癌代谢紊乱的作用机制。最后,整合分析复方苦参注射液抗肝癌作用机制。结果:（1）2 mg/mL复方苦参注射液能显着抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖和克隆形成;1.5和3 mL/kg复方苦参注射液可改善二乙基亚硝胺诱导的肝癌大鼠肝细胞结构的损伤,并不同程度回调肝功能相关指标谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）和γ-谷酰基转肽酶（γ-GT）的水平,表明复方苦参注射液具有抑制肝癌生长的作用。1和2 mg/mL复方苦参注射液具有显着抑制肝癌细胞迁移、侵袭和趋化运动能力,能显着增加细胞-细胞粘附和抑制细胞-基质粘附,表明复方苦参注射液具有抑制肝癌侵袭转移的作用。（2）基于UPLC-MS鉴定出复方苦参注射液中的21个化学成分,多个数据库预测了复方苦参注射液21个化学成分的作用靶点,构建了复方苦参注射液的成分-靶点网络。随后整合了复方苦参注射液调节肝癌代谢紊乱的277个基因作为疾病基因,基于蛋白-蛋白相互作用数据构建了一个全面的复方苦参注射液成分-靶点-互作蛋白-疾病基因网络,并应用Dijkstra算法计算成分的靶点传播到疾病分子网络的最短距离链17412条,从而根据传播系数识别出11个药效成分群:槐定碱、9β-hydroxylamprolobine、苦参碱、槐醇、异苦参碱、（-）-乙酰鹰靛叶碱、N-甲基金雀花碱、氧化槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐醇和（-）-oxylehmannine,并从致病基因和功能通路的覆盖率验证了药效成分群的准确性和可靠性。（3）对复方苦参注射液中含量高的5个化合物进行抗肝癌活性筛选,对具有显着肝癌抑制活性的苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和N-甲基金雀花碱进行网络药理学分析。通过构建复方苦参注射液抗肝癌靶点-相关蛋白网络,预测出关键靶点,在肝癌细胞和大鼠上验证,结果表明复方苦参注射液可以显着增加肝癌细胞和大鼠中CASP3的表达,抑制MMP2,MYC和REG1A的表达。通过对关键蛋白的深入验证发现复方苦参注射液可通过下调细胞和大鼠中Vimentin的表达,增加E-cadherin的表达来抑制上皮间质转化过程。此外,复方苦参注射液可以显着调节细胞和大鼠中Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白β-catenin和GSK-3β及下游蛋白COX2的表达。同时,复方苦参注射液可显着阻滞Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl所致的肝癌细胞中β-catenin和COX2表达水平的升高和GSK-3β表达水平的降低;可抑制LiCl所致的肝癌细胞中上皮间质转化过程、迁移和侵袭作用,表明复方苦参注射液可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥抗肝癌侵袭转移作用。对网络药理学预测的靶点进行通路富集分析,发现复方苦参注射液发挥抗肝癌作用可能与调节代谢通路相关。肝癌大鼠血清和肝脏代谢组学结果表明复方苦参注射液均能显着调节两种样本中差异代谢物柠檬酸和乳酸的含量,改善肝癌的代谢紊乱,其机制可能涉及糖酵解过程关键代谢物和代谢酶,且Wnt/β-catenin信号通路关键下游靶点c-Myc可能介导复方苦参注射液对糖酵解的抑制作用。对复方苦参注射液抗肝癌作用机制整合分析,表明复方苦参注射液可能通过调节β-catenin/c-Myc信号通路,进而干预肝癌代谢重编程和抑制EMT过程来发挥抗肝癌作用。结论:（1）复方苦参注射液对肝癌细胞和二乙基亚硝胺诱发肝癌大鼠具有抑制作用,具有抑制肝癌细胞侵袭转移的作用。（2）复方苦参注射液抗肝癌的主要药效成分可能为槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱、N-甲基金雀花碱,次要药效成分为槐醇、异苦参碱、（-）-乙酰鹰靛叶碱、氧化槐定碱、氧化槐醇、9β-hydroxylamprolobine和（-）-oxylehmannine。（3）复方苦参注射液可能通过调节β-catenin/c-Myc信号通路中关键蛋白,进而干预肝癌代谢重编程和抑制上皮间质转化过程来发挥抗肝癌作用。（4）本研究提出的计算系统药理学模型可用于中药复方物质基础的研究;定量成分导向网络药理学方法可用于预测成分含量明确的中药复方作用机制。
邢媛媛[2]（2021）在《黑沙蒿多糖对肉仔鸡免疫应激的缓解作用及其机理研究》文中进行了进一步梳理本试验通过建立肉仔鸡免疫应激模型并饲喂黑沙蒿多糖（AOP）,探讨AOP对肉仔鸡免疫应激的缓解作用,并利用体内法和体外法相结合,探讨AOP缓解免疫应激反应的机制。主要研究内容及结果如下:试验一:黑沙蒿多糖的提取优化、分离纯化、结构表征和体外活性的研究试验一共包含两部分。试验（1）:采用热水浸提的方法,以水浴时间、水浴温度和料液比进行单因素实验,以AOP得率为响应值,采用响应面法优化AOP的提取条件,采用离子色谱和凝胶色谱法检测AOP分子量及单糖组成。结果表明:AOP的最佳提取条件为:液料比15:1 m L/g,提取时间4.3 h,提取温度60℃。在此条件下,AOP的得率和含糖量分别为5.56%和52.65%;AOP的平均分子量为2.1 k Da（62.6%）和1.5 k Da（37.4%）,由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成,其摩尔比为6.87:10.67:54.13:2.49:18.37:4.83:2.64;此外,AOP具有较好的体外益生作用和抗氧化能力。试验（2）:使用DEAE-52阴离子交换柱和葡聚糖凝胶进一步分离纯化AOP,采用离子色谱、凝胶色谱法和甲基化法检测纯化AOP的分子量、单糖组成和键合结构。结果表明:经过DEAE-52阴离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析得到AOP-Ⅰ,其平均分子量为9.00 k Da,是由岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成的一种中性多糖,其摩尔比分别为0.56:13.75:12.79:54.08:3.15:13.43:0.63:0.67:0.93;AOP-Ⅰ主要由尾端葡萄糖基、→5)-Ara（f）-（1→、→3）-Gal（p）-（1→、→2）-Gal（p）-（1→、→4）-Man（p）-（1→、→6）-Man（p）-（1→、→4）-Gal（p）-(1→和尾端阿拉伯糖基按66.43:1.55:4.81:3.19:6.48:6.74:9.17:1.65的摩尔比构成。试验二:黑沙蒿多糖对肉仔鸡免疫和抗氧化功能的影响本试验采用单因子随机区组试验设计,选取288只1日龄AA肉仔鸡,随机分为6个处理,每个处理6个重复,每个重复8只鸡。其中对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮的基础上分别添加250、500、750、1000 mg/kg AOP和50 mg/kg金霉素,试验期42 d。结果表明:AOP添加剂量在750 mg/kg时,对肉仔鸡生长、免疫及抗氧化功能的调控效果较为明显,有望替代金霉素在肉仔鸡日粮中的使用。试验三:黑沙蒿多糖对肉仔鸡免疫应激的缓解作用及其分子调控机理研究根据试验二的结果,综合生长、免疫和抗氧化指标确定AOP在肉仔鸡日粮中的适宜添加量,作为本试验日粮中AOP的添加量。通过腹腔注射LPS构建肉仔鸡的免疫应激模型,采用2×2因子试验设计,选取192只1日龄AA肉仔鸡随机分为4个处理,6个重复,每个重复8只鸡。试验期为42 d,分为预饲期（0-14 d）、应激Ⅰ期（15-21 d,LPS注射期）、恢复Ⅰ期（22-28 d）、应激Ⅱ期（29-35 d,LPS注射期）和恢复Ⅱ期（36-42 d）。处理1和处理2饲喂基础日粮,处理3和处理4饲喂试验日粮（基础日粮中添加适宜剂量的AOP）。分别在应激Ⅰ期（试验第15、17、19、21 d）和应激Ⅱ期（试验第29、31、33、35 d）给处理1和处理3组的肉仔鸡腹腔注射5 m L/kg体重的LPS溶液（LPS溶液浓度为100μg/m L生理盐水）,处理2和处理4组注射等量的生理盐水。结果表明:日粮中添加AOP可通过提高肉仔鸡蛋白质表观代谢率,降低血清应激激素和促炎细胞因子含量来缓解LPS导致的生长性能的下降;日粮中添加AOP通过抑制TLR4/NF-κB信号通路降低LPS诱导的促炎因子的过量产生;通过激活Nrf2/Keap1信号通路,减轻LPS诱导的抗氧化酶活性下降,从而缓解肉仔鸡的免疫应激和氧化损伤。试验四:黑沙蒿多糖对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的缓解作用本试验采用2×7因子设计,即主效应包括2个应激状态（非应激组:不添加LPS;应激组:添加LPS,添加量为10μg/m L）和6个AOP-Ⅰ添加水平（0、50、100、150、200和250μg/m L）和维生素A（VA）添加组,共设14个处理,每个处理6个重复。结果表明:非应激条件下,AOP-Ⅰ在体外具有显着的免疫调节及抗氧化功能;应激条件下,AOP-Ⅰ可缓解由LPS导致的免疫应激,且缓解作用与VA相当;150μg/m L AOP-Ⅰ可作为体外研究其免疫和抗氧化调节机制的适宜添加量。试验五:黑沙蒿多糖通过TLR4/NF-κB途径对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的缓解作用及其机理研究试验五共包括三部分。试验（1）:采用完全随机试验设计,分为六个处理组:空白对照组、LPS组、LPS+TAK-242组、AOP-Ⅰ组、AOP-Ⅰ+TAK-242组、TAK-242组,每个处理六个重复。结果表明:TLR4是AOP-Ⅰ发挥免疫调节作用的候选靶点。试验（2）:采用完全随机试验设计,分为六个处理组:空白对照组、FITC-LPS组、LPS+FITC-LPS组、LPS组、AOP-Ⅰ+FITC-LPS组、AOP-Ⅰ组,每个处理六个重复。结果表明:AOP-Ⅰ具有干扰LPS与细胞表面受体结合的作用。试验（3）:采用完全随机试验设计,分为八个处理组:对照组、AOP-Ⅰ组、AOP-Ⅰ+PDTC组、PDTC组、LPS组、AOP-Ⅰ+LPS组、LPS+PDTC组、LPS+PDTC+AOP-Ⅰ组,每个处理六个重复。结果表明:非应激状态下,AOP-Ⅰ可通过激活TLR4/NF-κB信号通路进而发挥其免疫调节作用;应激状态下,AOP-Ⅰ可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的过度激活进而缓解PBLs的免疫应激。试验六:黑沙蒿多糖通过Nrf2/Keap1途径对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的缓解作用及其机理研究本试验采用完全随机试验设计,分为八个处理组:对照组、AOP-Ⅰ组、AOP-Ⅰ+ML385组、ML385组、LPS组、AOP-Ⅰ+LPS组、LPS+ML385组、LPS+ML385+AOP-Ⅰ组,每个处理六个重复。结果表明:非应激状态下与应激状态下,AOP-Ⅰ均可通过激活Nrf2/Keap1信号通路发挥其免疫调节作用。
宋晓萍[3]（2021）在《七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究》文中研究指明本实验室前期从七鳃鳗组织中分离纯化一种选择性识别并杀伤肿瘤细胞的免疫蛋白LIP（Lamprey Immune Protein）,其具有凝集素结构域（Jacalin＿like）和气单胞菌溶素结构域（Aerolysin correlation）,LIP蛋白通过识别乳腺癌细胞（MCF-7）膜表面Neu5Gc唾液酸修饰的糖型结构靶向肿瘤细胞,在细胞膜表面沉积进而杀伤肿瘤细胞。由于正常细胞表面没有Neu5Gc修饰的糖型结构,因此LIP蛋白对正常组织细胞（MCF-10A）没有较强或者很少的识别、结合和杀伤效果。肺癌是我国以及国际范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,晚期肺癌主要依靠药物治疗,在治疗过程中对正常细胞也产生杀伤作用等一系列药物副作用。由于药物副作用的存在使得肺癌治疗药物的选择成为临床医生的关注点之一,所以探究LIP对小细胞肺癌和非小细胞肺癌的识别和杀伤作用并揭示其作用机制至关重要。首先,使用LIP蛋白筛查23株不同组织来源的肿瘤细胞系,LIP对各组织来源的肿瘤细胞系有不同的识别能力和杀伤作用,说明LIP对肿瘤细胞杀伤具有特异性选择和一定的广谱性,而对正常组织细胞无结合和杀伤作用。通过高内涵成像分析系统和乳酸脱氢酶（LDH）方法检测LIP对人小细胞肺癌NCI-H446、人肺鳞癌细胞NCI-H520、人肺腺癌A549和正常肺上皮细胞L132的杀伤情况,细胞死亡率结果表明随着LIP浓度的增加,NCI-H446、NCI-H520、A549细胞的活力降低。A549细胞死亡率最低,为26.7%;NCI-H520细胞的死亡率最高,为61.3%。和临床常用的化疗药物顺铂,紫杉醇,5-Fu尿嘧啶比较,低剂量的LIP蛋白也可以达到高剂量化疗药物的杀伤效率,使细胞微团塌陷,破碎,不再聚集成团。同时发现LIP蛋白除单独应用对肿瘤细胞有作用外,与顺铂联合用药处理肿瘤细胞更能增加其对肺癌细胞的杀伤效果,随着浓度的增加,杀伤效率增加。细胞迁移实验结果显示,LIP显着抑制三种肺癌细胞的迁移,相反,它并没有抑制L132细胞的迁移。通过荧光探针、免疫荧光结合共聚焦显微镜对线粒体,内质网及细胞骨架进行观察,结果显示LIP促使肺癌细胞线粒体变短并皱缩成球形,线粒体数量明显减少,荧光消失;LIP引起内质网肿胀和损伤,导致空泡化,严重破坏细胞稳态,使细胞内容物外泄导致凋亡;LIP造成肺癌细胞骨架系统瓦解,微管解聚。采用Annexin V-FITC方法检测LIP对肺癌细胞凋亡的影响,结果显示LIP促使三种肺癌细胞磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）外翻。流式细胞术实验结果显示,2μM和4μM LIP处理L132细胞24 h后,细胞处于相对稳定状态。相同剂量LIP处理NCI-H446、NCI-H520、A549细胞24 h后,细胞凋亡率明显增高。同时,LIP破坏线粒体,降低线粒体膜电位。从共聚焦显微镜图像可以看出,LIP处理的三种肺癌细胞的活性氧（ROS）水平高于未处理的对照组,说明LIP介导肿瘤细胞的破坏与活性氧有关。为了探究LIP诱导肺癌细胞凋亡的机制,LIP处理NCI-H446、NCI-H520和A549细胞后,通过免疫印迹检测PARP1、GRP94、Bip、Caspase-12、Caspase-3、CHOP和p21的表达均显着上调且呈时间和剂量依赖性,明确内质网诱导的凋亡依赖于IRE-1、ATF-6和PERK通路,导致下游CHOP表达上调。在内质网应激抑制剂4-PBA作用48h后,PARP1、GRP94、Bip、Caspase-12、Caspase-3、CHOP和p21的表达水平显着降低。总之,七鳃鳗免疫蛋白LIP通过内质网应激信号通路介导肺癌细胞凋亡。本文建立肺癌小鼠荷瘤模型并在细胞瘤处直接注射LIP蛋白,能显着延缓肿瘤生长速度,肿瘤组织明显缩小,但是对小鼠正常组织细胞没有明显的副作用。通过免疫组化实验检测发现,LIP可以选择性识别人肺癌组织样本,而对癌旁组织无识别效果。
鞠雪莹[4]（2021）在《10-羟基癸烯酸诱导肝癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制的分子机制》文中提出肝癌是一种常见的恶性肿瘤,具有恶性程度强、死亡率高、侵袭和转移性强等特点。常见的化疗药物主要有顺铂、洛铂和5-氟尿嘧啶（5-FU）等,存在副作用大、价格昂贵等问题。因此,寻找和开发一种经济、安全、低毒的潜在天然抗肝癌辅助活性成分或功能因子已成为当前研究热点。10-羟基癸烯酸（10-HDA）,是蜂王浆中特有的活性成分,具有抗菌消炎、提高免疫力、抗肿瘤、抗辐射等多种生物活性。在细胞及分子水平探究10-HDA的抗肝癌分子机制,并阐明其对肝癌细胞诱导凋亡、周期阻滞、活性氧（ROS）水平调控、迁移抑制作用及其对相应信号途径的调控效果,为开发抗肝癌的功能因子和新型抗肿瘤功能性食品提供新的思路和一定的理论依据。以10-HDA为研究对象,以肝癌细胞系为研究模型,通过CCK-8比色法检测10-HDA对肝癌细胞系（Hep G2、Hep3B、Huh7）的杀伤作用和对正常肝、肺、胃细胞（L-02、IMR-90、GES-1）的毒副作用;通过Hoechst 33342/PI双染法、Annexin V/PI染色法以及流式细胞术检测10-HDA对肝癌细胞的诱导凋亡作用;通过流式细胞术及蛋白质免疫印迹法检测10-HDA对肝癌细胞的细胞周期阻滞作用、MAPK/STAT3/NF-κB信号通路之间的关系及相关蛋白的表达情况;通过DCFH-DA荧光探针法和蛋白质免疫印迹法检测10-HDA对肝癌细胞内ROS水平、相关信号通路的调控情况及细胞核转录因子STAT3和NF-κB的表达情况;通过细胞划痕实验和蛋白质免疫印迹法检测10-HDA对肝癌细胞的迁移抑制作用及其相关蛋白的表达情况。10-HDA对肝癌细胞系具有明显的杀伤作用;同时,10-HDA对正常细胞的毒性明显低于5-FU。10-HDA抑制Bcl-2的表达水平,促进Bax的表达水平,使线粒体凋亡途径被激活,线粒体膜电位下降,从而释放细胞色素C（Cytochrome C,Cyt C）,Caspase-3被活化,最终使细胞发生线粒体依赖性凋亡,凋亡率高达49.24%。此外,10-HDA激活了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和信号转导与转录活化因子（STAT）3信号通路,促进了P-JNK、P-P38、IκB-α的表达,抑制了P-ERK、P-STAT3、核转录因子（NF-κB）的表达,但在加入MAPK抑制剂后被阻断;10-HDA抑制细胞核内STAT3和NF-κB核转录因子的表达;10-HDA可通过促进周期蛋白P21的表达,抑制周期蛋白P-AKT、CDK1/2、Cyclin A/B1的表达,使细胞在G2/M期发生周期阻滞;10-HDA能够诱导ROS堆积,在n-乙酰-l-半胱氨酸（NAC）处理后,细胞凋亡情况及蛋白表达明显被逆转。10-HDA通过抑制TGF-β1、P-GSK-3β、Snail、Twist、N-cadherin和Vimentin的表达,上调E-cadherin的表达,使细胞迁移作用被抑制。综上所述,10-HDA能够增加细胞内ROS水平,调控MAPK、STAT3和NF-κB信号通路,使肝癌细胞发生线粒体依赖性凋亡,抑制了AKT信号通路,影响下游周期相关蛋白表达,进而使肝癌细胞在G2/M期发生周期阻滞。此外,10-HDA抑制了TGF-β1信号通路,使肝癌细胞迁移受到了抑制。
陈凯[5]（2021）在《miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究》文中研究说明一、研究背景肝细胞性肝癌（HCC）是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,目前在最致命肿瘤中致死率排名第二。在过去的几十年,针对肝癌已经有了众多治疗手段,如精准的肝段切除术,肝移植术,肝动脉栓塞化疗及肝癌射频消融术等,但是肝癌患者的预后仍然不令人满意,据统计,肝癌患者5年总生存率低于20%。肝癌起病隐匿,肿瘤进展快,容易复发和肝内转移都是导致肝癌预后较差的可能原因。因此,探究肝癌进展,转移的分子学机制有利于寻找潜在的肝癌治疗分子靶点,开发可能的早期肝癌诊断标志物对肝癌的系统治疗非常重要。微小RNA（miRNA）是以由一类进化保守的,由约22个核苷酸组成的非编码小RNA,微小RNA可结合在靶基因信使RNA（m RNA）的3?端的非翻译区（UTR区）通过降解信使RNA或抑制信使RNA翻译的方式发挥转录后调控作用。研究显示微小RNA几乎参与了肿瘤细胞发生发展的全部过程,包括细胞的干性,肿瘤发生,细胞的增殖,细胞的凋亡,细胞的迁移和侵袭,细胞的转移等等。也有越来越多的研究显示各种肿瘤中均有不同微小RNA的异常表达,包括肝癌。例如,miR-876被发现在胆管癌（CCA）中表达降低,并能通过抑制BCL-XL的表达诱导细胞的增殖;miR-589被发现在肝细胞性肝癌中表达增高并能通过STAT3信号通路来促进细胞的干性和化疗抵抗。然而,在肝细胞性肝癌中异常表达和对诊断或者预后有指示作用的miRNA仍然缺乏有待进一步研究。骨膜蛋白（POSTN）,也称为成骨细胞特异性因子2,是一大小为93.3k Da的细胞外基质（ECM）蛋白。POSTN能通过和众多其他蛋白如纤维结合蛋白,胶原蛋白及腱生蛋白等互相联系进而对细胞外基质进行改造。POSTN对胶原纤维的发生,细胞粘附,细胞迁移和上皮间质转换等都有重要作用。目前研究发现多种肿瘤中亦有POSTN的异常表达,包括头颈部肿瘤,肺癌,神经纤维瘤,乳腺癌,结直肠肿瘤及肝细胞性肝癌等,对肿瘤细胞的生存,上皮间质转换,血管生成和肿瘤微环境的形成都有重要作用。例如:研究发现胰腺癌细胞能刺激间质细胞分泌POSTN,进而促进肿瘤基质成绩和上皮间质转化进而促进肿瘤进展。然后,在肝细胞性肝癌中POSTN的表达及调控机制的研究尚少,有待进一步研究。在本文中,我们通过对TCGA数据库中异常表达的miRNA进行筛选,鉴定出了一异常表达的miRNA,即miR-876。我们还进一步探求了其细胞功能和对下游靶基因的调节机制。我们还在众多临床肝细胞性肝癌的临床组织标本中监测了miR-876和其靶基因POSTN的表达,分析了他们的表达和肝细胞性肝癌患者的临床病理参数和预后的关系。我们的研究提示miR-876及POSTN在肝细胞性肝癌中异常表达,可能作为一潜在的诊断性分子标志物和治疗靶点。二、研究方法1.分析49对肝癌及对应的癌旁样本的TCGA数据库,分析异常表达的miRNA,筛选出表达差异倍数最高的前20个微小RNA。2.收集了从2006年到2010年在西南医院肝胆科因患原发性肝细胞性肝癌而行原发性肝癌切除术的共计127例患者的组织样本,本研究说包含的所有病人术前均未接收放疗或者化疗。所有患者术后均定期性影像学（即超声或CT）即血液AFP检测。本研究团队及西南医院临床研究中心完成患者的预后随访,随访为结合到我院复查情况,定期（每2-3月）电话随访。3.采用实时定量PCR的方法检测了肝癌组织样本中miR-876和POSTN的表达水平;采用免疫组化（IHC）方法在原发性肝细胞性肝癌组织样本中检测了样本中POSTN及EMT标志物（E钙粘蛋白,N钙粘蛋白,波形蛋白）的表达情况,并在肝癌合并肝硬化样本中检测了POSTN的表达。4.采用Kaplan-Meier曲线分析（单因素）和Cox回归（多因素）方法分析了影响HCC患者预后的危险因素及独立危险因素,并进一步分析了miR-876和POSTN共表达对HCC预后的影响。5.采用了生物信息学及双荧光素酶报告基因实验研究了miR-876可能的调控靶基因,并进一步采用实时定量PCR及Western Blotting（WB）方法进行验证。6.Mi R-876的具体体内生物学行为在裸鼠实验中进行检测,最终成瘤效果以活体成像方式进行检测验证。7.采用WB方法分析了miR-876的表达对EMT标志物的影响,并在人肝星状细胞系LX-2中检测了纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,胶原蛋白-I的表达。采用transwell小室侵袭实验研究了miR-876对肝癌细胞系的侵袭能力的影响。三、研究结果1.通过对49对肝癌患者的TCGA数据库进行分析,我们筛选出了表达差异倍数排名前20的高表达及低表达miRNA,进一步筛选鉴定出miR-876。2.我们发现miR-876在肝癌细胞系及肝癌组织中低表达。首先,我们发现miR-876在人正常肝细胞系L02中表达高,而在肝癌细胞系SMMC-7721,Hep G2,Huh-7及HCC-LM3中表达较低;接下来我们在50对肝癌及癌旁样本中检测了miR-876的表达,发现miR-876在肝癌组织/癌旁组织的比率62%有降低,16%变化不明显,而仅有22%表达升高。3.miR-876的低表达和肝硬化、癌栓及肝癌TNM分期相关。我们在127例HCC组织样本中检测了miR-876的表达,分析了其表达水平和HCC患者临床病理参数的相关性。发现miR-876的表达和肝硬化（P=0.026）、肝癌癌栓形成（P=0.031）及TNM分期（P=0.021）相关。而和其他病理参数,如患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数量、乙肝、AFP水平、肝Child分级未发现显着相关性。我们还进一步在肝硬化及癌栓患者中检测了miR-876的表达水平,发现miR-876在肝硬化组织样本中表达较非肝硬化患者显着低（P=0.0294）,而其在有肝癌癌栓患者中表达亦显着低（P=0.0367）。4.miR-876抑制细胞侵袭、EMT及细胞纤维化。我们通过构建了miR-876过表达及干扰细胞株,通过transwell细胞侵袭实验发现过表达miR-876的肝癌细胞侵袭力减弱,而干扰miR-876后侵袭力增强,进一步通过WB实验发现过表达miR-876后N-钙粘蛋白及波形蛋白表达减弱,而干扰miR-876后E-钙粘蛋白表达亦减弱。在人星状细胞系LX-2中干扰miR-876表达后发现α-SMA及胶原蛋白-I表达减弱。5.miR-876靶向POSTN,并抑制其表达。我们通过生物信息学分析发现POSTN的3?UTR存在2个能与miR-876种子区结合的序列,进一步双荧光素酶报告基因实验发现野生型p GL3 POSTN荧光素酶质粒和miR-876共转染入293细胞后其萤火虫荧光信号/海肾荧光素酶荧光信号比值显着性降低,进一步WB实验证实当干扰miR-876后HCC细胞POSTN表达升高,而过表达组POSTN显着降低。我们进一步在127例肝癌临床组织标本中同时检测了miR-876和POSTN的表达,发现两者表达呈显着负相关,R值为-0.477,相关线性方程为y=-0.486x+0.394。6.miR-876通过POSTN抑制EMT及细胞纤维化。首先,我们发现过表达POSTN的肝癌细胞侵袭力增强,并促进了EMT标志物及纤维化标志物的表达。其次,我们在过表达POSTN的基础上转染了miR-876,发现共转染miR-876后抵消了侵袭力增加及EMT及纤维化标志物蛋白的表达。7.miR-876在体内动物实验下减弱HCC细胞肿瘤成瘤能力及抑制肿瘤进展。HCC细胞其miR-876过表达的HCC细胞被注入裸鼠肝包膜下,进行动物实验,1月后行活体成像检测,我们发现对照组（无干预的HCC细胞）成瘤数量多,活体成像荧光强度强,而实验组行miR-876过表达后,裸鼠原位肝脏成瘤明显减少,活体检测荧光信号弱,表明在体内实验条件下,miR-876能抑制HCC的成瘤及肿瘤进展。8.POSTN和肝组织EMT及肝硬化相关。我们进一步在127例肝癌组织中检测了POSTN的表达,发现同miR-876类似,POSTN表达和肿瘤数量、肝硬化、肝癌癌栓形成及TNM分期相关,而和其他临床标识物未发现明显相关性,进一步非参数检验验证了肝硬化或肿瘤癌栓组HCC患者的POSTN表达明显增高。IHC实验发现POSTN主要表达与肝癌间质,部分肝癌细胞亦有表达,POSTN高表达的样本N钙粘蛋白及波形蛋白表达增高,而E钙粘蛋白表达降低。而在肝癌伴肝硬化标本中发现POSTN亦有强表达。9.miR-876和POSTN和肝癌患者术后预后相关。进一步KM单因素生存分析发现肿瘤大小（P=0.037）、肝硬化（P=0.041）、肝癌癌栓状态（P=<0.01）、TNM分期（P=0.001）、miR-876低表达（P=0.022）及POSTN高表达（P=0.012）均是影响HCC患者预后的危险因素,多因素回归分析发现肝癌癌栓（风险比=2.530,95%CI区间=1.433-4.468,P=0.001）及POSTN的表达（风险比=1.717,95%CI区间=1.008-2.926,P=0.047）是影响肝癌预后的独立危险因素。进一步共表达分析提示miR-876低表达和POSTN高表达的HCC患者预后较之于miR-876低表达和POSTN高表达更差。四、研究结论综上所述,我们从公开的TCGA数据库中鉴定出了肝癌中一显着性低表达的miRNA,即miR-876。并探索了其对细胞的功能,即能抑制细胞侵袭,EMT和纤维化。而miR-876这些功能是通过调控POSTN的表达实现的。miR-876在体内动物实验下能抑制肝癌的成瘤及进展;我们还在众多肝癌临床标本中从m RNA及蛋白水平证明了miR-876和POSTN的异常表达和肝癌的EMT水平,纤维化水平及进展相关,而miR-876和POSTN的异常表达和HCC的预后相关,而联合miR-876和POSTN检测可能更好预测HCC的预后以及作为潜在的治疗靶点。
韩琳[6]（2021）在《大豆种皮多糖对肝损伤防护的机制研究》文中研究表明肝损伤是各种肝脏疾病共有的一种病理状态,其持续恶化会导致肝硬化、肝纤维化、肝癌。因此,寻找对抗肝损伤有效物质受到广泛关注。活性多糖广泛存在于植物、微生物、动物内,具有高效、低毒、副作用小的特点,已成为抗肝损伤天然药物制剂领域的研究热点,也取得了较多的进展。本课题以大豆种皮抗氧化多糖（SP）为研究对象,系统性研究其制备工艺、结构表征、抗氧化、及对CCl4诱导肝损伤的防护作用机制。主要研究内容和结果如下:1.不同提取方法对多糖提取效率具有一定的影响。采用微波辅助草酸铵提取法获得多糖（ASP）的产率最高（9.3±0.5%）,其次为微波辅助柠檬酸钠提取多糖（SSP）,产率为3.6±0.4%,热水提取法获得多糖的提取效率仅为1.2±0.5%。三种多糖的单糖组成均由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖和半乳糖醛酸构成,但含量存在一定差异。与其他两种多糖相比,ASP中阿拉伯糖、半乳糖醛酸、硫酸根含量较高,蛋白质含量较低,分子量为251 k Da。另外SEM结果表明,与SSP及HSP呈现的松散条带结构不同的是,ASP主要呈片状结构,表面更加光滑。2.对ASP、SSP、HSP的体外自由基清除能力检测,发现ASP、SSP对DPPH的清除效率分别可达76.9±1.9%、63.6±3.3%;对ABTS+的清除效率分别可达85.3±3.8%,68.7±4.5%,总还原力也较HSP有所提升,多糖的自由基清除效率在浓度2-10 mg/m L范围内呈现剂量依赖性,这可能和三种多糖单糖组成以及硫酸根基团含量等差异性密切相关。3.构建CCl4诱导小鼠肝损伤模型,探究三种大豆种皮多糖对体内CCl4诱导肝损伤的防护作用,结果表明:ASP和SSP干预显着降低肝脏丙氨酸转氨酶（ALT）/天冬氨酸转氨酶（AST）相对含量,降低丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）含量、提高谷胱甘肽（GSH）含量,肝组织观察及切片染色结果显示,ASP、SSP可有效减轻组织纤维化、炎症反应,减少脂肪堆积变性,具有显着的肝损伤保护作用。4.基于小鼠肠道菌群16S DNA高通量测序技术研究大豆种皮多糖对肝损伤小鼠的肠道菌群的影响。研究结果表明,CCl4处理的小鼠肠道菌群中厚壁菌门Firmicute含量降低,拟杆菌门Bacteroidetes含量显着上升,Clostridium＿Ⅷ丰度上升,而拟杆菌门Bacteroidetes上升、厚壁菌门Firmicute含量降低与胆固醇含量密切相关。SPs干预可以显着降低拟杆菌门Bacteroidetes含量,提高厚壁菌门Firmicute含量,此外ASP干预可以使双歧杆菌Bifidobacterium含量明显上升,SSP干预可以使乳酸杆菌Lactobacillus、艾克曼菌Akkermansia含量显着升高。Beta多样性结果显示,CCl4可以使小鼠肠道菌群与正常菌群明显分离,而ASP和SSP可对小鼠肠道微生物多样性产生显着影响,使其向正常组肠道菌群靠近,进而对肠道健康产生积极影响5.qRT-PCR结果显示,SSP可上调Nrf2基因,下调Keap1基因的表达,同时间接上调HO-1、NQO1基因的表达,通过调节Nrf2信号通路调节细胞内氧化还原状态,促进抗氧化基因表达,提高肝细胞抗氧化应激能力,防护CCl4所引起的肝细胞氧化损伤,发挥肝脏损伤的保护作用。本论文对不同提取方法获得的大豆种皮多糖的结构、理化性质、抗氧化活性进行了分析,同时也证明了其对CCl4诱导的化学性肝损伤具有体内外防护作用,并揭示了保肝作用的相关机制,以期为开发和综合利用大豆资源提供理论依据,同时也为进一步研发天然高效、低毒副作用的保肝功能食品拓展新思路。
李雅[7]（2021）在《靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并抑制肿瘤干细胞特性的研究》文中提出研究目的肝细胞癌（Hepatocellular carcinomα,HCC）是一种高发生率及高死亡率的原发性肝癌。在全球范围内,每年死于肝癌的患者数目超过80万,在各种恶性肿瘤中死亡率位居第一。目前,临床上除手术切除病灶、经导管肝动脉化疗栓塞术及肝移植等治疗手段外,索拉非尼和乐伐替尼是被FDA批准用于治疗晚期HCC的一线化学药物。临床仅不足30%的患者可以手术治疗,而索拉非尼对患者生存期的延长有限,总生存期仅延长2.3～2.7个月。另外,现有的手术、化疗或放疗的治疗方式对肝癌的转移和复发却难以产生有效的抑制作用。因此,探索肝癌的发生发展机制、寻找潜在的干预靶点或治疗手段极为重要。有研究证实,在铂类、蒽环类等化学药物或放射治疗肿瘤时,肿瘤细胞可发生免疫原性死亡,即肿瘤细胞在发生凋亡的同时,由非免疫原性的细胞转变为具有免疫原性的细胞。免疫原性死亡的肿瘤细胞表面高表达钙网蛋白（Calreticulin,CRT）、内质网中蛋白二硫化异构酶（Endoplasmic reticulum resident protein 57,ERp57）、热休克蛋白（Heat shock proteins,HSPs）、高迁移率族迁徙族蛋白B1（High mobility group protein B1,HMGB-1）等特征性的蛋白分子,这些分子能激发机体免疫细胞对肿瘤细胞的识别与攻击。Calreticulin和ERp57等被作为“eat me”信号分子,促进肿瘤细胞对DC的粘附,激活DC的MHC-I抗原呈递信号通路,从而活化CD8+T细胞。肿瘤细胞膜上的糖蛋白CD47由于能抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用,因而被认为是一种“don’t eat me”信号。死亡的肿瘤细胞释放的ATP可通过P2Y2嘌呤受体促进DC的募集被称作“find me”信号分子。细胞在发生免疫原性死亡早期,作为“eat me”信号的calreticulin和ERp57等在大量转移到细胞表面的同时,细胞膜上CD47的表达水平显着性下降,“don’t eat me”信号和“eat me”信号的此消彼长,使得肿瘤细胞能被DC和巨噬细胞有效识别和吞噬。因此,诱导免疫原性肿瘤细胞死亡是抗肿瘤治疗的目标之一,该作用可以通过激活机体免疫系统产生更强而有效的抗肿瘤效应。信号传导及转录激活因子 3（Signal transducer and activator of transcription,STAT）STAT3是STAT家族的重要成员,其在肿瘤组织中的异常持续激活,可介导多种细胞因子和生长因子的信号向细胞核转导,促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭和转移,抑制肿瘤细胞的凋亡,这与恶性肿瘤的发生发展密切相关。约60%的肝癌患者伴有STAT3高表达,并与不良预后呈正相关。我们之前的研究也证明,阻断STAT3可以通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞抑制HCC的增殖;另外,阻断HCC中STAT3信号通路可以明显提高NK细胞介导的抗肿瘤免疫应答;并且,阻断STAT3的HCC可以诱导抗肿瘤免疫记忆、改善肿瘤免疫微环境。然而,该过程是否与免疫原性死亡有关尚未进行深入的研究。Napabucasin是一种口服的针对STAT3和癌细胞多能性的抑制剂,可下调STAT3驱动的干细胞基因表达和自我更新能力,并诱导细胞死亡。Li等在体内外证实,Napabucasin通过阻断STAT3信号抑制胰腺癌、咽鳞癌、结直肠癌等肿瘤干性特征,进一步影响肿瘤的复发和转移。在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中,Napabucasin针对胰腺癌、结肠癌、卵巢癌等多种转移性实体瘤疗效显着,控制率均达到80%以上。然而,Napabucasin对肝癌的治疗是否有效尚未见报道。鉴于STAT3在肝癌发生发展中的重要作用,我们推测Napabucasin有望应用于肝癌的治疗。因此,本研究利用携带STAT3-shRNA的慢病毒和新型小分子抑制剂Napabucasin阻断肝癌细胞中STAT3信号通路,在体内外模型中观察其是否可以诱导肝癌细胞免疫原性死亡,并深入阐述其作用机制;进一步,系统评价了Napabucasin对肝癌干细胞特征的影响。该研究为肝细胞癌的治疗提供了有潜力的靶点,也为Napabucasin对肝癌治疗的临床应用提供良好的实验依据。研究方法1.利用携带STAT3-shRNA的慢病毒感染Huh7和HepG2.2.15肝癌细胞系,48h后使用RT-qPCR技术检测细胞内STAT3的mRNA水平,其中挽救实验使用携带STAT3-WT和STAT3-Y705F的慢病毒感染STAT3干扰组细胞;CCK-8和Annexin-V/PI标记分别检测细胞的增殖和凋亡;流式细胞术检测细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70、HSP90 和 CD47 的表达变化;ELISA 检测细胞培养上清中ATP的分泌水平。2.从健康志愿者外周血中分离单个核细胞,诱导形成未成熟的hDC,与Huh7和HepG2.2.15细胞共孵育48h后,流式细胞术检测hDC细胞表面CD80和CD86的表达变化。3.使用PMA诱导THP-1形成贴壁巨噬细胞,并进行CM-Dil染料进行标记,与CFSE标记的肝癌细胞共孵育2小时后,流式细胞术检测巨噬细胞对肝癌细胞的吞噬情况。4.利用 western bloting 检测 Huh7 和 HepG2.2.15 细胞中 STAT3/p-STAT3、PKR/p-PKR、eIF2α/p-eIF2α 的表达水平;IP 和 GST pull-down 实验观察 STAT3与PKR的结合作用。5.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中STAT3与CD47表达水平的相关性;从JASPAR数据库获取分析CD47的启动子序列,进一步应用ChIP实验鉴定STAT3是否直接与CD47的启动子序列结合。6.不同浓度的2-DG处理Huh7和HepG2.2.15细胞0-72h,CCK-8检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞表面calreticulin和CD47的表达变化。7.应用Seahorse XF24细胞能量代谢分析仪检测Huh7和HepG2.2.15细胞的糖酵解水平。8.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中HIF-1α、GLUT1、HK2和LDHA的表达水平及与病人生存期的相关性;分析肝癌患者癌组织中STAT3与HIF-1α、LDHA表达水平的相关性。9.应用RT-qPCR技术检测Huh7和HepG2.2.15细胞中糖酵解相关分子HIF-1α、GLUT 1、HK2 和 LDHA 的 mRNA 水平。10.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中GLUT1与CD47表达水平的相关性;从JASPAR数据库获取分析GLUT1的启动子序列,进一步应用ChIP实验观察STAT3是否直接与GLUT1的启动子序列结合。11.以人肝癌细胞系Huh7、HepG2和HepG2.2.15,以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6 为研究对象,CCK-8 检测 Napabucasin、Cryptotanshinone 和 Oxaliplatin处理上述肝癌细胞系48h后的细胞活力。12.Napabucasin 处理 Huh7、HepG2.2.15 和 Hepa1-6 细胞 12h 后,western bloting检测细胞中STAT3/p-STAT3Tyr705的水平;PI标记分析细胞周期;Annexin-V/PI标记检测细胞凋亡情况;Hoechst标记观察细胞核固缩情况;RT-qPCR技术检测肿瘤干性相关的分子Nanog、Sox-2、Klf4和OCT4的mRNA水平;细胞集落形成实验和细胞成球实验分别检测细胞集落形成抑制率和细胞成球率。13.Napabucasin 处理 Huh7、HepG2.2.15 和 Hepa1-6 细胞球后,RT-qPCR 技术检测肿瘤干性相关的分子Nanog、Sox-2、Klf4和OCT4的mRNA水平;JuLITM Stage实时检测细胞球形态;CCK-8检测细胞球活力。14.应用 RT-qPCR技术检测 HepG2.2.15 细胞中 HBx、HBc 和 HBs/p 的 mRNA水平。15.Napabucasin 处理 Huh7、HepG2.2.15 和 Hepa1-6 细胞后,Seahorse XF24细胞能量代谢分析仪检测细胞糖酵解水平;流式细胞术检测细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90的表达变化;与DC共孵育48h后,流式细胞术检测DC表面CD80、CD86、CD40和MHC Ⅱ的表达变化。16.利用携带STAT3-shRNA的质粒转染小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞,48h后使用RT-qPCR技术检测细胞内STAT3的mRNA水平;流式细胞术检测细胞表面 calreticulin、ERp57、HSP70、HSP90 和 CD47 的表达变化。17.从C57BL/6J小鼠骨髓中分离骨髓细胞,诱导培养形成未成熟的mDC,与Hepa1-6细胞共孵育48h后,流式细胞术检测mDC细胞表面CD80、CD86、CD40和MHC Ⅱ的表达变化。18.使用Hepal-6细胞构建C57BL/6J肝脏原位移植瘤小鼠模型,于2周后腹腔注射20mg/kg的Napabucasin,每2天一次,连续治疗8次;分离小鼠肝脏的肝细胞,流式细胞术检测CD95和PD-L1表达水平;分离小鼠肝脏中浸润的淋巴细胞,流式细胞术分析巨噬细胞、DC和CD8+T细胞的浸润量及活化水平。19.使用Hepa1-6细胞构建C57BL/6J皮下移植瘤小鼠模型,第5天开始给予药物治疗,每2天给予小鼠腹腔注射20mg/kg的Napabucasin,连续8次。随后,将小鼠分为两组,一组小鼠剥离其皮下肿瘤,并于1周后在另一侧皮下注射Hepa1-6细胞观察肿瘤复发情况,另一组小鼠用于生存期观察。20.对剥离的小鼠皮下移植瘤组织进行免疫荧光组织化学检测,分析calreticulin、ERp57、CD47和GLUT1的表达水平;分离皮下移植瘤中的肿瘤细胞,流式细胞术检测Ki67、CD95和PD-L1表达水平;RT-qPCR技术检测Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平。21.分离小鼠皮下移植瘤中浸润的淋巴细胞,流式细胞术分析巨噬细胞和DC等抗原呈递细胞的浸润量及活化情况;流式细胞术分析CD4+T和CD8+T细胞的浸润量及免疫抑制功能状态。22.对Hepa1-6细胞构建的皮下移植瘤小鼠模型,第12天皮下形成明显肿瘤块时给予腹腔注射Napabucasin治疗,每2天一次,连续治疗8次。随后,剥离小鼠皮下移植瘤组织分别进行HE和Tunel染色分析肿瘤病理和细胞凋亡情况;分离皮下移植瘤中肿瘤细胞,RT-qPCR技术检测Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平;分离皮下移植瘤中浸润的淋巴细胞,流式细胞术分析CD8+T和NK细胞的浸润量及活化情况。研究结果1.靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡干扰人肝癌细胞系Huh7、HepG2.2.15以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞中STAT3信号通路可以显着性抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,同时促进calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90等“eat me”信号分子的膜转移,促进ATP向细胞外的释放。另外,干扰肝癌细胞中STAT3信号通路可以促进其对DC的活化作用,增加DC表面CD80和CD86的表达。我们观察到“don’t eat me”信号分子CD47在肝癌患者肿瘤组织中高表达,并与STAT3的表达水平呈正相关;CHIP实验证实,STAT3可通过与CD47的启动子区域结合直接调控CD47的转录与表达。因此,干扰肝癌细胞中STAT3信号通路可降低CD47在细胞表面的表达,促进巨噬细胞对其的吞噬。2.STAT3通过与PKR形成复合物调控免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化STAT3通过与eIF2α的上游调节分子PKR结合形成STAT3-PKR复合物,从而调节游离的PKR及其磷酸化水平,进一步调控eIF2α的磷酸化水平。干扰STAT3在Huh7和HepG2.2.15细胞的表达,可以减少STAT3-PKR复合物的形成,使游离的PKR及pPKR增多,从而促进免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化。3.STAT3通过调控糖酵解关键酶-GLUT1抑制HCC免疫原性死亡与正常组织相比,肝癌患者肿瘤组织中糖酵解关键酶HIF-1α、GLUT1、HK2表达水平明显升高,且癌组织中高表达GLUT1、HK2和LDHA的肝癌患者往往伴随着生存期缩短。另外,肝癌患者的癌组织中STAT3与HIF-1α和LDHA的表达水平呈正相关。干扰Huh7和HepG2.2.15细胞中STAT3信号通路,显着性降低糖酵解相关的关键分子HIF-1α、GLUT1、HK2和LDHA的mRNA水平,伴随肝癌细胞的糖酵解水平和最大糖酵解能力均明显降低。糖酵解阻断剂2-DG可抑制Huh7和HepG2.2.15细胞的增殖,并诱导肝癌细胞免疫原性死亡。TCGA数据库显示,肝癌患者的癌组织中GLUT1与CD47的表达水平呈正相关。GLUT1抑制剂STF-31可以显着性增加calreticulin在HepG2.2.15细胞表面的表达,而降低CD47的表达水平。进一步通过CHIP实验证实,STAT3可通过与GLUT1的启动子区域结合直接调控GLUT1的转录与表达。4.STAT3抑制剂Napabucasin体内外诱导肝癌细胞免疫原性死亡并改善肿瘤免疫微环境Napabucasin可显着性增加Huh7和HepG2.2.15以及Hepa1-6细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90的表达量,促进肝癌细胞对DC的活化作用。在Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠模型中,Napabucasin治疗组小鼠肿瘤的生长速度低于溶剂对照组,并且肿瘤细胞表面calreticulin和ERp57的表达水平明显升高,而CD47和GLUT1的水平显着性降低;肿瘤浸润的CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD11c+DC细胞明显增加且活化水平提高,同时肿瘤浸润的CD4+T和CD8+T细胞数量明显增加,并且具有免疫抑制功能的LAG-3、PD1和KLRG1在CD8+T细胞上的表达较对照组均明显减少。进一步,在Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠Rechallenge实验中,Napabucasin治疗组中有75%的小鼠能抵抗第二次接种的Hepa1-6细胞的生长,而溶剂对照组小鼠100%出现肿瘤复发的情况。虽然,Napabucasin在对晚期给予Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠治疗中没有表现出明显的抑制作用,但是可以促进NK细胞的肿瘤浸润,并具有免疫抑制功能的LAG-3、Tim-3在CD8+T细胞和NK细胞上的表达降低,而IFNγ的表达水平的提高。5.STAT3抑制剂Napabucasin激发肝脏原位移植瘤小鼠的抗肿瘤免疫应答在Hepal-6细胞肝脏原位移植瘤小鼠中,Napabucasin治疗可以明显缩小肝脏癌变组织的大小,并伴随CD95+肝细胞数的增加和PD-L1+肝细胞数的减少。同时,Napabucasin治疗组小鼠肝脏中巨噬细胞的浸润数量及表达共刺激分子CD86的表达水平都明显高于溶剂对照组。另外,两组小鼠肝脏中浸润的DC数量虽然明显差异,但Napabucasin治疗组小鼠肝脏中浸润的DC表达的CD80和MHCⅡ的水平较溶剂对照组明显增加。更为重要的是,Napabucasin治疗组小鼠肝脏中CD8+T细胞数量明显增多,并且免疫抑制受体PD-1和LAG-3在CD8+T细胞上的表达降低。6.STAT3抑制剂Napabucasin显着抑制肝癌细胞的干性特征体外实验发现 Napabucasin 抑制 Huh7、SMMC-7721、HepG2、HepG2.2.15和Hepa1-6等肝癌细胞的活力作用强于Cryptotanshinone和Oxaliplatin,其IC50值明显低于另外两种药物。同时,Napabucasin可以抑制Huh7、HepG2.2.15和Hepal-6细胞的集落形成以及成球数,并可以裂解肝癌细胞球体。进一步分析发现,Napabucasin可以抑制Huh7和Hepa1-6细胞及细胞球体中Nanog、Sox-2和OCT4等肿瘤干性相关分子的mRNA水平。7.STAT3抑制剂Napabucasin可抑制Hepa1-6细胞皮下移植瘤生长早期给予Napabucasin治疗可明显抑制肿瘤的生长,延长小鼠生存期。Napabucasin治疗组小鼠肿瘤组织中Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平明显降低,并伴随CD95+肿瘤细胞数的增加和Ki67+、PD-L1+肿瘤细胞数的减少。晚期给予Napabucasin治疗,可以增加肿瘤组织中细胞凋亡数目及坏死区域,与早期治疗结果一致,Napabucasin可以抑制肿瘤组织中干性相关分子的表达。结论在本研究证明干扰STAT3信号通路可诱导肝癌细胞免疫原性死亡,表现为作为“eat me”信号的calreticulin和ERp57等大量转移到细胞表面,而细胞膜上“don’t eat me”信号分子CD47的表达水平显着性下降,且STAT3可以直接靶向CD47启动子;同时,细胞培养上清中作为“find me”信号的ATP释放增加,促使肝癌细胞被DC和巨噬细胞对肿瘤细胞的有效识别和吞噬。另外,干扰STAT3信号通路可降低肝癌细胞糖酵解关键酶水平,降低糖酵解水平,促进肿瘤细胞免疫原性死亡,并且STAT3可直接调控GLUT1的转录。进一步,利用小鼠皮下移植瘤和肝脏原位移植瘤模型证明,STAT3抑制剂Napabucasin处理可以增加肿瘤组织中DC和巨噬细胞的浸润数量及抗原呈递功能,促进CD4+T和CD8+T细胞在肿瘤组织的募集,减少KLRG1+及免疫抑制受体LAG-3+、PD1+的CD8+T细胞数,并产生抗肿瘤的免疫记忆作用。另外,Napabucasin在抑制Hepa1-6细胞的生长的同时,还可以抑制肿瘤干细胞的形成,延长小鼠生存期。意义该研究证明,靶向STAT3信号通路可以诱导肝癌细胞免疫原性死亡,改善肿瘤免疫微环境,逆转肿瘤的免疫耐受状态,在机体产生抗肿瘤免疫记忆中发挥着极为重要的作用,为STAT3作为肝癌治疗靶点及Napabucasin的临床应用提供了充分的理论依据和详实的实验依据,也为下一步建立新的肝癌治疗策略提供新思路。
陈乞[8]（2021）在《地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究》文中认为背景和目的:慢性乙型肝炎相关肝癌发病率及病死率逐年上升。目前肝癌发病机制虽有多种假说,但确切机制至今尚未明确是其妨碍提高防治水平的关键科学问题。多年来防治肝癌的策略主要集中于抗病毒和肝癌细胞本身,忽略了人体内在宿主因素的影响。随着肝癌微环境概念的提出,其作为影响肝癌发生发展的关键因素,逐渐引起研究者的重视。慢性肝病的肝脏炎症和纤维化形成的异常肝再生微环境促进肝癌的发生发展。因此研究通过改善肝再生微环境降低肝癌发生,抑制其进展及转移,具有极大的临床参考价值和深远的科学意义。本文结合临床试验和体外实验两部分,旨在探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制:第一部分,观察地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生率及发生风险的影响。第二部分,揭示共培养条件下TGF-β1活化肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的相关机制,分析其对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡和侵袭能力的影响,探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。方法:1.本试验通过对前期完成的针对HBeAg阴性慢乙肝的随机对照临床试验（中国临床试验注册中心注册号:Chi CTR-TRC-12002962）的单用地五养肝胶囊或单用恩替卡韦或二者联用治疗时间达到48周的患者,进行长达108月前瞻性随访观察（恩替卡韦随访期间不停药）,每6个月检测患者血常规、肝肾功能、凝血功能、乙肝两对半定量、血清HBV DNA水平和甲胎蛋白（AFP）。主要观察评价指标:观察随访期间终点事件肝癌的发生率。次要观察指标:观察随访期间慢乙肝患者生化学及病毒学应答。其中,肝癌累积发病率采用使用乘积限法（Kaplan-Meier）统计,并通过时序检验（log-rank）方法进行比较。2.体外实验通过建立TGF-β1诱导激活的人肝星状细胞LX-2与人肝癌细胞株HCCLM3的共培养模型,模拟肝癌的肝再生微环境。实验分为LX2对照组（LX2-NS）、共培养模型组（Co-culture model）、共培养DWYG组（Co-culture DWYG）,并给予地五养肝胶囊含药血清进行干预,通过CCK-8、流式细胞术、Transwell侵袭实验等细胞生物学方法观察共培养条件下活化人肝星状细胞LX2对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡、侵袭能力的影响,通过Western Blotting、q RT-PCR等分子生物学方法研究共培养条件下活化人肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的机制,分析这一过程中TGF-β/Smad信号通路的Smad2、Smad3、TβRI、Smad7等m RNA和蛋白表达规律,探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。结果:（1）入组基线资料及随访时间比较:对符合纳入标准的170例患者随机分为三组,其中A组为地五养肝胶囊治疗组（56例）,口服地五养肝胶囊;B组为地五养肝胶囊联合恩替卡韦治疗组（57例）,同时应用地五养肝胶囊和恩替卡韦;C组为恩替卡韦对照组（57例）,口服恩替卡韦,对治疗周期达到48周的患者进行108月随访。入组时各组患者在年龄、性别、血常规（包括中性粒细胞NEU、淋巴细胞LYM、中性粒细胞与淋巴细胞比值NLR以及血小板计数PLT）、PT国际标准化比值INR、肝功能包括（ALT、AST、GGT、ALB、TP、TBIL）及血清HBV-DNA水平无显着性差异（P>0.05）。随访从2012年1月1日至2021年1月11日,共随访108个月,平均随访时间84.03个月,中位随访时间94.00个月。地五养肝胶囊组的平均随访时间和中位随访时间分别为90.75个月、99.00个月,地五养肝胶囊联合恩替卡韦组的平均随访时间和中位随访时间分别为78.82个月、92.50个月,恩替卡韦组的的平均随访时间和中位随访时间分别为82.78个月、91.00个月。共计随访患者151例,总计失访率为11.18%（19/170）。其中,地五养肝胶囊组完成随访48例,地五养肝胶囊联合恩替卡韦组完成随访50例,恩替卡韦组完成随访53例,三组失访率依次为14.29%（8/56）、12.28%（7/57）、7.02%（4/57）,失访率组间比较无显着差异（P>0.05）。（2）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者生化学应答的比较:将不同干预方案的三组患者血生化结果进行分析,发现三组组间比较,ALT、AST水平无明显差异（P>0.05）。其他相关ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标,在三组间比较差异不显着（P>0.05）。三组随访患者血生化指标分别与入组时相比,发现三组随访患者肝功能ALT、AST均较前下降（ALT:23.50±15.40 vs 34.70±17.51,25.96±27.45 vs35.87±18.07,28.18±20.30 vs 40.25±21.20;AST:22.08±5.87 vs 28.72±11.24,23.11±11.17 vs 31.91±11.61,27.57±16.85 vs 33.72±14.35）,差异具有统计学意义（P<0.01）,而ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标,较前入组时相比无明显差异（P>0.05）。（3）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者病毒学应答的比较:不同治疗方案的各组患者HBV DNA水平均较入组时明显下降（P<0.05）。HBV DNA水平在随访的三组间组间差异无统计学意义（P>0.05）。各组HBs Ag水平分别与入组时相比,三组HBs Ag水平较前明显降低（P<0.05）。随访结果显示,三组患者中HBs Ag下降>1500 IU/ml依次为34.21%（13/38）、35.71%（10/28）、28.57%（8/28）,经统计学分析三者差异无意义（P>0.05）。（4）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌累积发病率影响:随访至108月,采用Kaplan-Meier（乘积限法）法绘制肝癌发病生存曲线,并计算地五养肝胶囊组、地五养肝胶囊联合恩替卡韦组、恩替卡韦组随访发生肝癌事件的累积发病率依次为0%（0/48）、2%（1/50）、11.32%（6/53）,然后采用时序检验Log Rank（Mantel-Cox）进行分析检验,结果显示:三组患者肝癌累积发病率具有差异（P<0.05）。其中,地五养肝胶囊组肝癌累积发病率（0%）明显低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P<0.05）。地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌累积发病率（2%）低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P<0.05）。地五养肝胶囊组肝癌发病率（0%）低于地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌发病率（2%）,但差异无统计学意义（P>0.05）。提示相对于单独应用恩替卡韦抗病毒治疗,单用地五养肝胶囊或联合应用恩替卡韦均可显着降低HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌发病率。（5）TGF-β1诱导LX2活化以及LX2/HCCLM3共培养体系中LX2的形态学观察:LX2活化前形体不规则呈多边星形,胞突生长不发达,细胞间连接紧密;经TGF-β1（10ng/ml）诱导激活后,细胞体积增大,胞突伸展,细胞间连接疏松,细胞增殖速度加快;与人肝癌细胞HCCLM3共培养后LX2胞伪足更加伸展,呈拉伸状两极生长,细胞增殖明显增快。（6）筛选DWYG含药血清最佳给药浓度:采用CCK-8法检测不同浓度DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖能力的影响。实验结果显示:与对照组相比,随着5%、10%、15%、20%等不同含药血清浓度的升高,各组细胞测得的A450值逐渐下降,HCCLM3细胞增殖活力明显下降（P<0.01）,细胞增殖抑制率逐渐增高（P<0.01）,选取10%为最佳实验用血清含药浓度。（7）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖的影响:（1）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖的影响:与M3对照组A450值（0.69±0.03）相比,共培养模型组（0.75±0.01）HCCLM3细胞增殖活力增强（P<0.01）。与M3对照组A450值（0.69±0.03）相比,共培养DWYG组（0.65±0.01）HCCLM3细胞增殖活力下降（P>0.05）。与共培养模型组A450值（0.75±0.01）相比,共培养DWYG组（0.65±0.01）HCCLM3细胞增殖活力显着降低（P<0.01）。由此可见,共培养模型组HCCLM3增殖率（111.45%）,显着高于M3对照组细胞增殖率（100%）,而共培养DWYG组HCCLM3细胞增殖率（90.77%）显着低于共培养模型组（111.45%）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可能促进肝癌细胞HCCLM3的增殖,DWYG含药血清可能抑制LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖。（2）LX2/HCCLM3共培养体系中LX2的增殖:与LX2对照组（0.62±0.02）相比,共培养模型组（0.71±0.02）LX2细胞增殖活力显着增加（P<0.01）。与LX2对照组（0.62±0.02）相比,共培养DWYG组（0.63±0.01）LX2细胞活力无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组（0.71±0.02）相比,共培养DWYG组（0.63±0.01）LX2细胞增殖能力下降（P<0.01）。与LX2对照组（100%）相比,共培养模型组具有更高细胞增殖率（120.35%）。与共培养模型组（120.35%）相比,共培养DWYG组LX2细胞增殖率（90.77%）显着下降。提示LX2/HCCLM3共培养体系可能促进人肝星状细胞LX2的增殖,DWYG含药血清具有抑制LX2/HCCLM3共培养体系中LX2增殖的作用。（8）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3及LX2两种细胞凋亡的影响:（1）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系HCCLM3细胞凋亡的影响:根据流式细胞仪检测结果显示,与M3对照组（7.52±0.17）相比,共培养模型组（6.23±0.54）细胞凋亡率明显下降（P<0.01）。与M3对照组（7.52±0.17）相比,共培养DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。与共培养模型组（6.23±0.54）相比,共培养DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系抑制HCCLM3的凋亡,而DWYG含药血清可促进LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3的凋亡。与M3阴性对照组（6.23±0.54）相比,M3DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系抑制HCCLM3的凋亡,而DWYG含药血清可促进LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3的凋亡。（2）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞凋亡的影响:与LX2对照组（6.37±0.32）相比,共培养模型组（5.15±0.29）凋亡率明显下降（P<0.01）。与LX2对照组（6.37±0.32）相比,共培养DWYG组（7.36±0.37）细胞凋亡升高（P<0.01）。与共培养模型组（5.15±0.29）相比,共培养DWYG组（7.36±0.37）细胞凋亡显着升高（P<0.01）。表明LX2/HCCLM3共培养体系可一定程度上抑制LX2细胞的凋亡,DWYG含药血清可减弱该抑制作用从而促进LX2/HCCLM3共培养体系中人肝星状细胞LX2的凋亡。（9）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3侵袭能力的影响:与M3对照组（104.00±4.18）相比,共培养模型组（148.80±4.09）HCCLM3侵袭能力明显增强,差异具有统计学意义（P<0.01）。与M3对照组（104.00±4.18）相比,共培养DWYG组（78.00±6.60）侵袭能力下降（P<0.01）。与共培养模型组（148.80±4.09）相比,共培养DWYG组（78.00±6.60）细胞侵袭力显着下降（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可增强HCCLM3侵袭能力,而DWYG含药血清可降低由共培养体系诱导的高HCCLM3侵袭能力。（10）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞EMT相关m RNA的表达的影响:采用RT-PCR检测技术检测EMT相关E-cadherin、Vimentin m RNA的表达,统计结果显示:与LX2对照组相比,共培养模型组E-cadherin m RNA的表达下降（P<0.01）,Vimentin m RNA表达明显升高（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组E-cadherin m RNA的表达增加（P<0.01）,Vimentin m RNA的表达无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组E-cadherin m RNA的表达明显增加（P<0.01）,Vimentin m RNA的表达明显降低（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Vimentin m RNA的表达,抑制E-cadherin m RNA的表达,而DWYG含药血清则促进LX2/HCCLM3共培养体系中LX2细胞E-cadherin m RNA的表达,抑制Vimentin m RNA表达。（11）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞EMT和TGF-β/Smad信号通路相关m RNA的表达的影响:通过实验检测LX2细胞TGF-β/Smad信号通路相关Smad2、Smad3、TβRI、Smad7 m RNA的表达情况,结果分析显示:与LX2对照组相比,共培养模型组Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达升高,Smad7 m RNA表达下降（P<0.01）。与LX2对照组相比共培养DWYG组TβRI m RNA的表达下降（P<0.01）,Smad7 m RNA表达上升（P<0.01）,Smad2、Smad3m RNA表达下降（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达下降（P<0.05）,Smad7 m RNA表达上升（P<0.05）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达,降低Smad7 m RNA的表达,而DWYG含药血清则可促进LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞Smad7 m RNA的表达,抑制Smad2、Smad3、TβRIm RNA表达。（12）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系EMT相关蛋白的表达的影响:与LX2对照组相比,共培养模型组E-cadherin蛋白的表达下降（P<0.01）,Vimentin蛋白表达明显升高（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组E-cadherin蛋白的表达增强（P<0.01）,Vimentin蛋白的表达无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组E-cadherin蛋白的表达增加（P<0.01）,Vimentin蛋白的表达降低（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Vimentin蛋白的表达,抑制E-cadherin蛋白的表达,而DWYG含药血清则促进LX2/HCCLM3共培养体系E-cadherin蛋白的表达,抑制Vimentin蛋白表达。（13）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达的影响:通过实验检测LX2细胞TGF-β/Smad信号通路相关Smad2、Smad3、TβRI、Smad7蛋白的表达情况,结果分析显示:与LX2对照组相比,共培养模型组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达升高,Smad7蛋白表达下降（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达下降,Smad7蛋白表达上升（P<0.01）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达下降,Smad7蛋白表达上升（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达,降低Smad7蛋白的表达,而DWYG含药血清则可促进LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞Smad7蛋白的表达,抑制Smad2、Smad3、TβRI蛋白表达。结论:（1）根据170例地五养肝胶囊治疗HBeAg阴性慢性乙型肝炎RCT临床试验资料,随访至108月,单用地五养肝胶囊组与单用恩替卡韦组和联合用药组在生化学应答、病毒学应答方面疗效相当。单用地五养肝胶囊或者联用恩替卡韦能显着降低肝癌发病率。（2）构建的活化的LX2与HCCLM3共培养体系模拟的肝癌肝再生微环境可促进LX2和HCCLM3增殖活力,抑制LX2和HCCLM3凋亡,增强HCCLM3细胞侵袭能力,其机制可能通过激活TGF-β/Smad信号通路促进EMT。DWYG含药血清能显着抑制共培养体系中的LX2和HCCLM3增殖,促进LX2和HCCLM3凋亡,降低HCCLM3细胞侵袭能力,其机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路过度激活、调节EMT/MET失衡,改善肝癌肝再生微环境,发挥防治肝癌发生发展的作用。
陈琼锋[9]（2021）在《磷脂酰乙醇胺结合蛋白4对肝癌细胞生物行为学的影响及其机制研究》文中指出背景与目的:原发性肝癌是临床常见的一种恶性肿瘤,其中75%至85%的原发性肝癌为肝细胞癌。肝细胞癌的主要危险因素是肝炎病毒感染,由于全球对肝炎病毒的传染控制力度加大,使其发病率保持稳定,但肝癌的死亡率却在逐年上升,主要原因是分子机制多样性和不确定性,难以实施靶向治疗。Akt作为肿瘤生长的重要分子,受促癌因子和癌基因的调控,他的生物学功能与mTORC1和mTORC2的参与密不可分。一方面,Akt的许多生物学功能由mTORC1介导,后者磷酸化S6K1,调节蛋白质合成;另一方面,Akt与血清葡萄糖激酶（SGK）和蛋白激酶C（PKC）一样作为底物,其活性受mTORC2调节。研究发现,PEBP4在许多癌组织中上调,并发挥促癌作用;另外,有报道显示PEBP4与Akt结合并参与其活性调节。然而,PEBP4与Akt-mTOR在肝癌中的相互作用尚未见报道,故成为本课题的研究重点,结果将为肝细胞癌的治疗提供分子靶点。实验方法:1.观察PEBP4对肝癌细胞生物行为学的影响（1）免疫组化:检测肝癌患者癌组织和癌旁组织中PEBP4的表达;（2）Western blot（WB）和qPCR:比较正常肝细胞（LO2）和恶性程度相对不同的肝癌细胞系,包括低恶性程度:MHCC97L,中度恶性程度:He PG2,SMMC-7721,高恶性程度:MHCC97H和HCCLM3中PEBP4的表达情况;（3）构建稳定细胞系:用sh RNA-PEBP4和PCMV6-PEBP4分别敲低MHCC97H细胞和过表达MHCC97L细胞中的PEBP4,WB和qPCR验证细胞系的成功构建;（4）通过CCK8,克隆形成实验,检测敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞生长能力的影响;（5）采用划痕实验,Transwell检测敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响;（6）皮下植瘤实验:在裸鼠皮下（腋窝）接种肝癌细胞,体内观察敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞生长能力的影响;（7）肺转移模型构建:通过裸鼠尾静脉接种肝癌细胞,检测敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞转移能力的影响。2.观察PEBP4对Akt/mTOR信号通路的影响（1）WB检测敲低和过表达PEBP4细胞中Akt/mTOR信号通路的变化;（2）IGF-1刺激敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB检测Akt/mTOR信号通路的变化;（3）Akt腺病毒（Akt-S473D）感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB检测Akt/mTOR信号通路的变化;（4）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞,WB检测Akt/mTOR信号通路的变化。3.探讨PEBP4、Akt/mTOR信号通路在肝癌细胞生物行为学中的作用（1）Akt-S473D感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞,采用CCK8、Transwell分别检测肝癌细胞的生长、迁移和侵袭能力;（2）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞,CCK8、Transwell分别检测肝癌细胞的生长、迁移和侵袭能力。4.观察PEBP4对EMT的影响（1）WB检测敲低和过表达PEBP4细胞系中EMT的变化;（2）免疫荧光检测敲低和过表达PEBP4细胞系中E-cadherin和N-cadherin的变化;（3）IGF-1刺激敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB检测EMT的变化;（4）Akt-S473D感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB和免疫荧光检测EMT的变化;（5）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞,WB和免疫荧光检测EMT的变化。5.探讨PEBP4、Akt、mTOR之间的关系（1）免疫共沉淀检测MHCC97H细胞中PEBP4、Akt、mTOR之间的关系;（2）用N-myc-PEBP4转染HEK293T细胞,免疫共沉淀方法检测PEBP4、Akt、mTOR之间的关系;（3）在敲低PEBP4细胞系中,采用免疫共沉淀检测PEBP4、Akt、mTOR之间的关系;（4）siRNA-mTOR转染HEK293T细胞后,采用免疫共沉淀检测Akt、mTOR、PEBP4之间的关系。结果:1.PEBP4对肝癌细胞生物行为学的影响（1）免疫组化结果显示,癌旁组织中PEBP4表达偏低,癌组织中PEBP4表达偏高;（2）WB和qPCR结果表明,与正常肝细胞（LO2）和恶性程度低的肝癌细胞（MHCC97L）比较,PEBP4在恶性程度高的肝癌细胞（MHCC97H,HCCLM3）中的表达要高;（3）CCK8和克隆形成实验表明,敲低PEBP4使肝癌细胞较对照组的生长能力减弱,而过表达PEBP4使肝癌细胞生长能力增强;（4）敲低PEBP4后,划痕实验和Transwell结果显示肝癌细胞的迁移和侵袭能力减弱,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反;（5）皮下移植实验结果表明敲低PEBP4的肝癌细胞在裸鼠体内的生长能力较对照组下降,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反;（6）肺转移结果显示:敲低PEBP4的肝癌细胞较对照组在裸鼠肺中形成的结节减少,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反。2.PEBP4对Akt/mTOR信号通路的影响（1）与对照组相比,WB结果显示,敲低PEBP4后（a）mTORC2 Ser2481的磷酸化以及mTORC2的底物SGK1、PKCα的磷酸化降低;（b）Akt Ser473和Thr308磷酸化被抑制;（c）Akt调节直接底物RSK2和mTORC1 Ser2448的磷酸化下降;（d）mTORC1介导的p-S6K1表达下降;（e）过表达PEBP4对以上指标的影响结果与敲低PEBP4完全相反;（2）WB结果显示,（a）IGF-1不影响PEBP4的表达;（b）IGF-1不能逆转敲低PEBP4对结果（1）中各指标的影响;（3）Akt-S473D感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞后,WB结果发现:（a）Akt-S473D不影响PEBP4的表达;（b）Akt-S473D对PEBP4敲低引起的mTORC2Ser2481磷酸化下调没有影响;（c）Akt-S473D逆转敲低PEBP4对Akt Thr308磷酸化的下调作用;（d）Akt-S473D抵消敲低PEBP4对RSK2和mTOR Ser2448磷酸化的抑制作用;（e）Akt-S473D逆转敲低PEBP4对p-S6K1表达的下调作用。（4）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞后,WB结果显示:（a）MK-2206对PEBP4的表达没有影响;（b）MK-2206对过表达PEBP4上调mTOR Ser2481、SGK1、PKCα磷酸化没有影响;（c）MK-2206抑制过表达PEBP4对Akt Ser473和Thr308磷酸化的上调作用;（d）MK-2206抑制过表达PEBP4对RSK2和mTOR Ser2448磷酸化的促进作用;（e）MK-2206下调过表达PEBP4对p-S6K1表达的上调作用。3.PEBP4、Akt/mTOR信号通路对肝癌细胞生物行为学的作用（1）CCK8结果显示,Akt-S473D可以部分逆转敲低PEBP4对肝癌细胞生长能力的抑制作用,而MK-2206可以抑制过表达PEBP4对肝癌细胞生长的促进作用;（2）Transwell结果显示,Akt-S473D可以部分逆转敲低PEBP4对肝癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用,而MK-2206可以抑制过表达PEBP4对肝癌细胞迁移和侵袭的促进作用。4.PEBP4对EMT的影响（1）WB结果显示,敲低PEBP4上调E-cadherin的表达,且下调N-cadherin,vimentin和integrin的表达,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反;免疫荧光检测结果与WB一致;（2）WB结果证明,IGF-1刺激PEBP4敲低的细胞并不能影响EMT等指的变化;（3）WB和免疫荧光结果显示Akt-S473D可逆转敲低PEBP4对EMT的作用,且MK-2206可抵消过表达PEBP4对EMT的作用。5.PEBP4、Akt、mTOR之间的关系（1）免疫共沉淀结果显示,无论是在MHCC97H细胞中还是在N-myc-PEBP4转染HEK293T细胞中,都能证明PEBP4,Akt,mTOR之间存在相互作用;（2）在敲低PEBP4细胞系中,免疫共沉淀结果显示,PEBP4与Akt和mTOR之间的相互作用消失,但Akt和mTOR之间的关系仍然存在;（3）siRNA敲除mTOR后,免疫共沉淀结果显示,Akt与PEBP4之间的关系存在,而PEBP4与mTOR之间的关系消失。结论:本实验主要研究PEBP4对肝细胞癌的作用。结果表明,1.PEBP4促进肝癌细胞生物学行为;2.PEBP4促进Akt/mTOR信号通路的活化,籍此调节肝癌细胞的生物行为学;3.PEBP4除了通过Akt发挥功能外,还参与调节其它信号分子,其可能的靶点是mTORC2;4.PEBP4,Akt,mTOR之间存在相互作用,发挥生物学功能。
张志莹[10]（2021）在《西黄丸治疗非小细胞肺癌疗效的系统评价及作用机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:肺癌是临床常见的恶性肿瘤,在世界范围内,发病率在恶性肿瘤中居第二位,死亡率居第一位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要类型,发展新的治疗手段和方法,一直是NSCLC临床需要解决的一大难题。NSCLC的中医研究也在不断发展,西黄丸作为具有确切临床疗效的经典抗癌中药名方,对NSCLC的治疗也发挥了作用。既往的基础研究发现西黄丸可通过诱导肿瘤细胞凋亡、逆转上皮间质转化、调节免疫微环境等多种作用机制发挥抗肿瘤作用,但研究多围绕乳腺癌、胃癌,对于治疗肺癌的机制,仅涉及有效率、体内实验抑瘤率等,较为局限,因此,西黄丸治疗NSCLC的研究还存在较大空间,值得进一步深入。研究目的:本研究结合系统综述、网络药理学、体外实验、体内实验、转录组学等多种方法,研究西黄丸治疗NSCLC的相关机制,为西黄丸在临床治疗NSCLC提供更多的数据支持和科学依据。研究方法:1.首先通过系统综述和meta分析,评价西黄丸在临床随机对照试验中治疗NSCLC的效果,评价指标包括:近期客观有效率、临床症状改善、生活质量、不良反应等。2.通过网络药理学,对西黄丸抗NSCLC的活性成分和主要作用靶点进行预测。首先通过中药数据库BATMAN-TCM检索西黄丸中所有的活性成分及对应靶点,然后通过疾病数据库DisGeNET、GeneCards、OMIM检索NSCLC相关基因,将西黄丸的作用靶点和NSCLC疾病靶点两个数据集进行映射,筛选重复靶点,构建“西黄丸-NSCLC-靶点”数据集。将数据集导入String数据库进行蛋白质蛋白质互作网络,将获得的网络导入Cytoscape3.8.0软件中进行拓扑参数分析,获得“西黄丸-NSCLC-靶点”的核心作用靶点。然后使用Metascape工具对核心靶点进行生物功能注释,分析西黄丸抗NSCLC的主要信号通路和生物过程等。3.通过细胞实验和动物实验,进行西黄丸抗NSCLC的药效学验证。在细胞实验中,通过CCK-8实验、流式细胞术、Transwell实验检测西黄丸对小鼠Lewis肺癌细胞株LL/2增殖、凋亡、细胞周期、迁移能力和侵袭能力的影响。在动物实验中,以C57/BL6小鼠Lewis肺癌皮下瘤为模型,将小鼠分为对照组、西黄丸低剂量组（0.617g/kg,每日灌胃两次）、西黄丸中剂量组（1.233g/kg,每日灌胃两次）、西黄丸高剂量组（2.466g/kg,每日灌胃两次）、顺铂组（3 mg/kg,每周腹腔注射一次）,并另设无瘤的空白组。药物干预15天,观察小鼠的一般状态、皮下移植瘤体积及重量、体重及内脏系数,并通过HE染色观察肿瘤和肝脏的组织病理变化和皮下瘤的肺转移,通过Ki-67免疫组化染色观察对肿瘤增殖的影响,并通过流式细胞数检测小鼠脾脏淋巴细胞的 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和 CD3+CD4+/CD3+CD8+免疫分型。4.通过转录组学方法,对西黄丸高剂量组和对照组的肿瘤组织进行RNA测序,进行mRNA差异分析和基因功能注释,分析西黄丸抗小鼠Lewis肺癌的主要信号通路和生物过程等。5.通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）,对网络药理学和转录组学筛选出的目标分子变化进行检测,包括热休克蛋白（heatshockprotein,HSP）家族、雌激素受体（estrogenreceptor,ER）、维甲酸X受体（Retinoid X receptor,RXR）、过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferator activated receptor,PPAR）等。研究结果:1.Meta分析结果显示,西黄丸辅助治疗NSCLC能够提高近期客观有效率,改善患者的临床症状,提高患者的生活质量。但在改善肝肾功能异常、改善消化道症状和血液系统抑制方面,西黄丸辅助治疗并未有明显获益。2.网络药理学分析显示,西黄丸共检索到74个靶点可预测的活性成分,“西黄丸-NSCLC-靶点”的核心作用靶点共230个,包括HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA1A、ESR1、ESR2、RXRA、RXRB、RXRG、PPARG、PPARA 等。西黄丸抗 NSCLC 的相关KEGG通路有癌症通路、PI3K-Akt信号通路、内分泌抵抗、foxo信号通路、雌激素信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路、催乳素信号通路、Ras信号通路、黏着斑和非小细胞肺癌等。GO富集分析显示,西黄丸抗NSCLC涉及的主要生物过程有细胞对有机环状化合物的反应、细胞对激素刺激的反应、细胞对脂质的反应、凋亡信号通路、对类固醇激素的反应、细胞迁移的正调控、细胞死亡的正调控、细胞运动的正调控等。3.药效学实验显示,西黄丸含药血清在体外对Lewis肺癌细胞株LL/2并无显着的增殖抑制作用,西黄丸浸提液对LL/2有浓度依赖的抑制作用,作用24 h时,西黄丸浸提液对LL/2细胞的IC50为1.830 mg/mL。流式结果显示,作用24 h时,西黄丸浸提液对LL/2细胞有明显的促凋亡作用,能够促进LL/2细胞株向G2/M期转化。Transwell实验结果显示,作用24h时,西黄丸浸提液能够降低LL/2细胞株的迁移能力和侵袭能力,且这种作用呈浓度依赖性。在小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型中,西黄丸对皮下肿瘤的生长抑制作用具有浓度依赖性,其中西黄丸高剂量组能够抑制小鼠皮下瘤的生长,其剂量为临床等效剂量的2倍。肿瘤的病理结果显示,西黄丸高剂量组和顺铂组有大片的细胞坏死区。Ki-67免疫组化染色结果显示,西黄丸和顺铂均能降低Ki-67阳性肿瘤细胞的个数,西黄丸的这种作用与浓度关系不大。肝脏的病理结果显示,各组的肝组织均为正常的肝实质,无明显异常。脾细胞流式分型结果显示,各组小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD4+/CD3+CD8+未见显着统计学差异。4.对西黄丸高剂量组和对照组的皮下瘤进行转录组学测序,结果筛选出406个差异基因,其中130个基因表达上调,276个基因表达下调,差异基因包括:Hspb7、Hspb1、Hspb6等。对差异基因进行KEGG通路富集分析,结果显示,显着性改变明显的信号通路有:肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor,TNF）信号通路、雌激素信号通路、胰岛素分泌、环鸟苷酸依赖性蛋白激酶（cyclic guanosine monophosphate-dependent protein kinase,cGMP-PKG）信号通路、脂肪细胞中的脂肪分解调节、脂肪细胞因子信号通路、催产素信号通路、过氧化物酶体增殖激活受体信号通路等。5.PCR和WB结果显示,西黄丸能够降低小鼠Lewis肺癌肿瘤组织中Hspb6、Hspb7、Hspb1、Hspb2、Hspa1a、Hspa8、Hsph1 和的 mRNA 表达水平,且能够降低 HSPB7、HSP27、HSP70、HSPH1蛋白的表达水平,升高HSC70的蛋白质表达水平,而不影响HSP20、HSP90的蛋白质水平。西黄丸能够降低小鼠Lewis肺癌肿瘤组织中Esr1、Rxra、Krt19、Ppara、Ppard和Pparg的mRNA表达水平,并降低ER、RXRα蛋白的表达,升高PPARδ和PPARγ的蛋白表达,对KRT19和PPARα的表达水平无明显影响。研究结论:1.西黄丸辅助治疗NSCLC能够提高近期客观有效率,改善患者的临床症状,提高患者的生存质量。2.网络药理学实验和转录组学实验显示,西黄丸通过多靶点、多通路作用于NSCLC,核心作用靶点包括HSP家族、ER等。3.西黄丸在体外实验和体内实验中,均表现出抗小鼠Lewis肺癌的作用,在体内实验中无明显毒性,其有效剂量为临床等效剂量的2倍。其抗小鼠Lewis肺癌的机制可能与降低HSP27、HSP70、HSPH1、ER的mRNA和蛋白质表达水平,升高PPARγ的蛋白质表达水平相关。
二、三种植物多糖对小鼠正常肝细胞和肝癌细胞细胞核酪氨酸蛋白激酶活力的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、三种植物多糖对小鼠正常肝细胞和肝癌细胞细胞核酪氨酸蛋白激酶活力的影响（论文提纲范文）
（1）基于新型网络药理学策略解析复方苦参注射液抗肝癌主要药效成分与作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 肝癌研究现状 |
| 2.1 肝癌的发生机制 |
| 2.2 肝癌的治疗 |
| 2.3 肝癌动物模型研究进展 |
| 2.4 结语 |
| 3 复方苦参注射液应用与研究 |
| 3.1 复方苦参注射液化学成分研究 |
| 3.2 复方苦参注射液抗肿瘤药理作用 |
| 3.3 复方苦参注射液抗肿瘤作用机制 |
| 3.4 结语 |
| 4 网络药理学概述 |
| 4.1 网络药理学的理论基础 |
| 4.2 网络药理学研究方法 |
| 4.3 网络药理学在中药研究中的应用 |
| 4.4 结语 |
| 5 本课题的研究意义、研究思路、技术路线、研究内容及主要创新点 |
| 第二章 复方苦参注射液抗肝癌作用研究 |
| 第一节 复方苦参注射液对人肝癌SMMC-7721 细胞的作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 细胞存活率测定 |
| 1.3.3 克隆形成实验 |
| 1.3.4 细胞粘附实验 |
| 1.3.5 伤口愈合细胞划痕实验 |
| 1.3.6 Transwell细胞侵袭实验 |
| 1.3.7 细胞趋化运动能力实验 |
| 1.3.8 数据处理 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞活力的影响 |
| 1.4.2 复方苦参注射液对L02 细胞活力的影响 |
| 1.4.3 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞克隆形成能力的影响 |
| 1.4.4 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞粘附能力的影响 |
| 1.4.5 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞迁移能力的影响 |
| 1.4.6 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞侵袭能力的影响 |
| 1.4.7 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞趋化运动能力的影响 |
| 1.5 讨论与小结 |
| 1.5.1 小结 |
| 1.5.2 讨论 |
| 第二节 复方苦参注射液对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的药理作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物分组、造模及给药 |
| 2.3.2 样本收集 |
| 2.3.3 病理组织分析 |
| 2.3.4 血清生化测试 |
| 2.3.5 数据处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型的动态变化研究 |
| 2.4.2 复方苦参注射液对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的作用研究 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 2.5.1 小结 |
| 2.5.2 讨论 |
| 第三章 基于计算系统药理学模型的复方苦参注射液抗肝癌主要药效成分群研究 |
| 第一节 复方苦参注射液中主要化学成分UPLC-MS定性分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 1.5.1 小结 |
| 1.5.2 讨论 |
| 第二节 基于计算系统药理学模型的复方苦参注射液抗肝癌药效成分群研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞核磁备样方法、检测条件 |
| 2.3.2 细胞液质代谢组学备样方法、液相质谱条件及数据处理 |
| 2.3.3 统计分析 |
| 2.3.4 复方苦参注射液调节肝癌代谢紊乱的代谢酶预测 |
| 2.3.5 复方苦参注射液靶点预测 |
| 2.3.6 复方苦参注射液成分-靶点-互作蛋白-疾病基因网络构建 |
| 2.3.7 传播模型计算 |
| 2.3.8 数据处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 复方苦参注射液抗肝癌表型数据的整合及分析 |
| 2.4.2 复方苦参注射液靶向基因型数据的获取与分析 |
| 2.4.3 基于基因型-表型数据传播模型的构建 |
| 2.4.4 复方苦参注射液抗肝癌药效成分群的预测 |
| 2.4.5 复方苦参注射液抗肝癌药效成分群验证 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 2.5.1 小结 |
| 2.5.2 讨论 |
| 第四章 基于定量成分导向网络药理学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究 |
| 第一节 定量成分导向网络药理学预测复方苦参注射液抗肝癌机制 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 活性成分筛选和验证 |
| 1.3.2 靶点收集 |
| 1.3.3 网络构建和分析 |
| 1.3.4 通路预测 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 复方苦参注射液抗肝癌活性成分筛选和验证 |
| 1.4.2 复方苦参注射液抗肝癌网络分析 |
| 1.4.3 复方苦参注射液抗肝癌通路分析 |
| 1.5 讨论与小结 |
| 1.5.1 小结 |
| 1.5.2 讨论 |
| 第二节 基于Wnt/β-catenin信号通路的复方苦参注射液抗肝癌机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Western Blot实验 |
| 2.3.2 免疫荧光测定 |
| 2.3.3 伤口愈合细胞划痕实验 |
| 2.3.4 Transwell细胞侵袭实验 |
| 2.3.5 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 复方苦参注射液对网络药理学预测的关键蛋白表达的影响 |
| 2.4.2 复方苦参注射液对上皮间质转化过程蛋白表达的影响 |
| 2.4.3 复方苦参注射液对Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响 |
| 2.4.4 复方苦参注射液抑制LiCl诱导的SMMC-7721细胞Wnt/β-catenin通路激活 |
| 2.4.5 复方苦参注射液通过Wnt/β-catenin信号通路抑制LiCl诱导的SMMC-7721 细胞上皮间质转化、迁移和侵袭 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 2.5.1 小结 |
| 2.5.2 讨论 |
| 第三节 基于代谢组学研究复方苦参注射液调节肝癌代谢紊乱的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 肝脏核磁备样方法及检测条件 |
| 3.3.2 血清核磁备样方法及检测条件 |
| 3.3.3 数据处理 |
| 3.3.4 代谢物和代谢酶测试 |
| 3.3.5 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 核磁图谱分析 |
| 3.4.2 寻找相关的生物标志物 |
| 3.4.3 复方苦参注射液对肝癌大鼠代谢轮廓的调节作用 |
| 3.4.4 柠檬酸和乳酸含量变化定量分析 |
| 3.4.5 复方苦参注射液对糖酵解中关键酶活性的作用 |
| 3.4.6 c-Myc介导复方苦参注射液对糖酵解的抑制作用 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 3.5.1 小结 |
| 3.5.2 讨论 |
| 总结与展望 |
| 1 研究工作总结 |
| 2 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 主要缩略词表 |
| 攻读学位期间取得成果 |
| 致谢 |
| 个人情况及联系方式 |
（2）黑沙蒿多糖对肉仔鸡免疫应激的缓解作用及其机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 免疫应激对动物的影响 |
| 1.2 免疫应激的调节机制 |
| 1.3 黑沙蒿及其提取物的研究现状 |
| 1.4 黑沙蒿多糖的生物学功能 |
| 1.4.1 黑沙蒿多糖对动物生长性能的影响 |
| 1.4.2 黑沙蒿多糖对动物免疫功能的影响 |
| 1.4.3 黑沙蒿多糖对动物抗氧化功能的影响 |
| 1.4.4 黑沙蒿多糖对动物胃肠道的影响 |
| 1.4.5 黑沙蒿多糖对动物糖代谢及脂代谢的影响 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 2 试验研究 |
| 2.1 黑沙蒿多糖的提取优化、分离纯化、结构表征和体外活性的研究 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.3 结果与分析 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 黑沙蒿多糖对肉仔鸡免疫和抗氧化功能的影响 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.3 结果与分析 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 黑沙蒿多糖对肉仔鸡免疫应激的缓解作用及其分子调控机理研究 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 材料与方法 |
| 2.3.3 结果与分析 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 2.4 黑沙蒿多糖对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的缓解作用 |
| 2.4.1 引言 |
| 2.4.2 材料与方法 |
| 2.4.3 结果与分析 |
| 2.4.4 讨论 |
| 2.4.5 小结 |
| 2.5 黑沙蒿多糖通过TLR4/NF-κB途径对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的缓解作用及其机理研究 |
| 2.5.1 引言 |
| 2.5.2 材料与方法 |
| 2.5.3 结果与分析 |
| 2.5.4 讨论 |
| 2.5.5 小结 |
| 2.6 黑沙蒿多糖通过Nrf2/Keap1 途径对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的缓解作用及其机理研究 |
| 2.6.1 引言 |
| 2.6.2 材料与方法 |
| 2.6.3 结果与分析 |
| 2.6.4 讨论 |
| 2.6.5 小结 |
| 3 论文总体讨论与结论 |
| 3.1 总体讨论 |
| 3.1.1 黑沙蒿多糖的制备条件及其结构表征 |
| 3.1.2 黑沙蒿多糖对肉仔鸡免疫应激的缓解作用及其机理 |
| 3.2 总体结论 |
| 3.3 创新点 |
| 3.4 有待进一步研究的问题 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的发病机制及临床表现 |
| 1.1.1 肺癌的发生 |
| 1.1.2 罹患肺癌的危险因素 |
| 1.1.3 肺癌的临床表现 |
| 1.2 肺癌的诊断 |
| 1.2.1 肺癌的辅助影像学检查 |
| 1.2.2 获取肺癌组织学或细胞学检查技术 |
| 1.2.3 肺癌的实验室血清学检查 |
| 1.2.4 肺癌的病理学评估 |
| 1.3 肺癌的治疗 |
| 1.4 肺癌的靶向治疗 |
| 1.4.1 非小细胞肺癌靶向药物 |
| 1.4.1.1 以表皮生长因子受体为靶点的药物 |
| 1.4.1.2 间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制药 |
| 1.4.1.3 ROS1 重排抑制药 |
| 1.4.1.4 血管内皮生长因子为靶点的药物 |
| 1.4.1.5 其他 |
| 1.4.2 非小细胞肺癌免疫治疗药物 |
| 1.4.3 SCLC靶向药物的现状 |
| 1.5 七鳃鳗LIP的发现及细胞毒作用 |
| 1.6 本研究目的及意义 |
| 第2章 七鳃鳗LIP蛋白对23 种肿瘤细胞杀伤活性比较分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组LIP蛋白的表达及纯化 |
| 2.2.2 重组LIP蛋白浓度测定 |
| 2.2.3 重组LIP蛋白活性鉴定 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 重组LIP蛋白细胞毒性测定 |
| 2.2.6 流式细胞仪对LIP蛋白杀伤肿瘤细胞定量分析 |
| 2.2.7 Western blot检测LIP蛋白在细胞膜表面的沉积 |
| 2.2.8 数据统计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组LIP蛋白的纯化 |
| 2.3.2 流式细胞仪检测LIP蛋白对肿瘤和正常细胞的识别 |
| 2.3.3 Western Blot检测LIP蛋白在细胞表面的沉积 |
| 2.3.4 LIP蛋白细胞毒性测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 LIP蛋白对三种肺癌细胞的生物学活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Operetta TM高内涵成像分析系统检测LIP蛋白对三种肺癌细胞的杀伤活性 |
| 3.2.2 荧光显微镜检测LIP对三种肺癌细胞微团杀伤活性 |
| 3.2.3 LDH检测LIP对三种肺癌细胞的杀伤活性 |
| 3.2.4 Operetta TM高内涵成像分析系统检测LIP联合顺铂对三种肺癌细胞的杀伤作用 |
| 3.2.5 细胞划痕实验检测LIP蛋白对三种肺癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.2.6 免疫荧光检测LIP蛋白对细胞骨架的影响 |
| 3.2.7 数据统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞杀伤活性探究 |
| 3.3.2 LIP蛋白与多种化疗药物对三种肺癌细胞杀伤活性比较探究 |
| 3.3.3 LIP蛋白与顺铂联合作用三种肺癌细胞探究 |
| 3.3.4 LIP蛋白对三种肺癌细胞迁移能力探究 |
| 3.3.5 LIP蛋白对三种肺癌细胞骨架的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 LIP蛋白对三种肺癌细胞线粒体膜电位及细胞凋亡的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫荧光检测LIP蛋白对线粒体的影响 |
| 4.2.2 Annexin V-FITC检测LIP作用肺癌细胞后细胞凋亡情况 |
| 4.2.3 流式细胞仪检测LIP作用肺癌细胞后细胞凋亡情况 |
| 4.2.4 流式细胞术检测LIP蛋白作用后肺癌细胞线粒体膜电位变化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞线粒体损伤探究 |
| 4.3.2 LIP蛋白诱导三种肺癌细胞凋亡检测 |
| 4.3.3 LIP蛋白通过影响线粒体膜电位变化抑制线粒体功能 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 LIP蛋白通过引起内质网应激激活细胞凋亡通路 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 免疫荧光检测LIP蛋白对三种肺癌细胞内质网的影响 |
| 5.2.2 共聚焦监测LIP蛋白对三种肺癌细胞内ROS的影响 |
| 5.2.3 细胞蛋白提取及蛋白浓度定量 |
| 5.2.4 WesternBlot检测内质网应激及加入抑制剂后凋亡通路相关蛋白的表达 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞内质网的损伤 |
| 5.3.2 LIP蛋白作用三种肺癌细胞后ROS含量变化情况 |
| 5.3.3 三种肺癌细胞中内质网应激诱导的凋亡通路相关蛋白表达情况 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 LIP蛋白在荷瘤小鼠及人源肿瘤组织水平对瘤体的识别和抑瘤作用 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 主要材料 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 注射LIP蛋白对小鼠肺癌细胞瘤的影响 |
| 6.2.2 透射电镜观察鼠肺癌肿瘤组织 |
| 6.2.3 人肺癌肿瘤组织的保存处理 |
| 6.2.4 肿瘤组织包埋及冰冻切片的制备 |
| 6.2.5 人肺癌肿瘤组织的HE染色 |
| 6.2.6 人肺癌肿瘤组织的免疫组织化学染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 小鼠肺癌细胞瘤注射LIP蛋白后的变化 |
| 6.3.2 LIP蛋白促小鼠A549-Luc-C8 细胞瘤的细胞凋亡 |
| 6.3.3 LIP蛋白对荷瘤小鼠正常组织形态的影响 |
| 6.3.4 人肺癌组织的HE染色 |
| 6.3.5 LIP蛋白特异性识别人肺癌组织 |
| 6.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 读博期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
（4）10-羟基癸烯酸诱导肝癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 肝癌的研究进展 |
| 1.2 肝癌的发病因素 |
| 1.2.1 乙型肝炎病毒感染因素 |
| 1.2.2 丙型肝炎病毒感染因素 |
| 1.2.3 黄曲霉毒素因素 |
| 1.2.4 吸烟和过量饮酒 |
| 1.2.5 其他因素 |
| 1.3 肝癌的治疗方法 |
| 1.3.1 手术治疗 |
| 1.3.2 化学治疗 |
| 1.3.3 放射治疗 |
| 1.3.4 免疫治疗 |
| 1.3.5 靶向治疗 |
| 1.4 10-羟基癸烯酸的研究进展 |
| 1.4.1 抗炎抗菌作用 |
| 1.4.2 增强免疫力 |
| 1.4.3 抗肿瘤作用 |
| 1.4.4 抗辐射作用 |
| 1.4.5 降血脂作用 |
| 1.5 细胞信号通路 |
| 1.5.1 细胞凋亡 |
| 1.5.2 细胞周期 |
| 1.5.3 ROS |
| 1.5.4 MAPK信号通路 |
| 1.5.5 STAT3 信号通路 |
| 1.5.6 NF-κB信号通路 |
| 1.5.7 细胞迁移信号通路 |
| 1.6 目的与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验细胞株及10-羟基癸烯酸标准品 |
| 2.1.2 主要实验试剂及试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 细胞复苏 |
| 2.3 细胞培养及体外扩增 |
| 2.4 CCK-8 比色法 |
| 2.5 Hoechst33342/PI染色法 |
| 2.6 流式细胞术 |
| 2.6.1 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法 |
| 2.6.2 线粒体膜电位(JC-1)检测 |
| 2.6.3 DNA含量(细胞周期)检测 |
| 2.6.4 ROS检测 |
| 2.7 蛋白质免疫印迹法(Western Blot) |
| 2.8 细胞划痕实验分析 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 10-HDA对肝癌细胞的杀伤作用及对正常细胞的毒副作用 |
| 3.2 10-HDA诱导人肝癌HepG2 细胞凋亡 |
| 3.2.1 Hoechst33342/PI染色法观察细胞凋亡形态学特征 |
| 3.2.2 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡数量 |
| 3.2.3 JC-1 荧光探针法检测HepG2 细胞线粒体膜电位的变化 |
| 3.2.4 蛋白质免疫印迹法检测HepG2 细胞凋亡相关蛋白的表达情况 |
| 3.3 10-HDA对人肝癌HepG2 细胞周期阻滞作用 |
| 3.3.1 流式细胞术检测HepG2 细胞的阻滞周期 |
| 3.3.2 蛋白质免疫印迹法检测HepG2 细胞周期相关蛋白的表达情况 |
| 3.4 10-HDA 调控 MAPK/STAT3/NF-κB 信号通路诱导人肝癌 HepG2 细胞凋亡机制 |
| 3.4.1 蛋白质免疫印迹法检测MAPK、STAT3和NF-κB信号通路相关蛋白的表达情况 |
| 3.4.2 蛋白质免疫印迹法检测STAT3和NF-κB核转录因子的表达情况 |
| 3.4.3 蛋白质免疫印迹法检测加入MAPK抑制剂后蛋白的表达情况 |
| 3.5 10-HDA调控ROS水平诱导人肝癌HepG2 细胞凋亡 |
| 3.5.1 流式细胞术检测10-HDA对 HepG2 细胞内ROS水平的影响 |
| 3.5.2 流式细胞术检测ROS堆积对HepG2 细胞凋亡的影响 |
| 3.5.3 蛋白质免疫印迹法检测ROS对上游信号蛋白的影响 |
| 3.5.4 蛋白质免疫印迹法检测ROS对 STAT3和NF-κB核转录因子的影响 |
| 3.6 10-HDA抑制HepG2 细胞迁移 |
| 3.6.1 细胞划痕实验检测10-HDA对 HepG2 细胞迁移的影响 |
| 3.6.2 蛋白质免疫印迹法检测细胞迁移相关蛋白的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCC中抑癌miR-876从TCGA数据库的筛选鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-876在HCC细胞及组织中低表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-876 的异常表达和HCC进展及纤维化相关 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-876 抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 miR-876 靶向调控POSTN |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 miR-876 通过POSTN抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 POSTN高表达和HCC组织EMT及肝硬化相关 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 miR-876及POSTN的异常表达和HCC预后相关 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨膜蛋白(POSTN)的结构功能及其在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）大豆种皮多糖对肝损伤防护的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词中英文对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物多糖 |
| 1.1.1 植物多糖的提取、分离纯化 |
| 1.1.2 植物多糖的组成与结构 |
| 1.1.3 植物多糖的活性 |
| 1.2 植物多糖在化学性肝损伤中的作用 |
| 1.2.1 化学性肝损伤的定义及研究现状 |
| 1.2.2 植物多糖抗化学性肝损伤现状 |
| 1.3 植物多糖在调控肠道菌群中的作用 |
| 1.4 本课题立题背景及研究意义 |
| 第二章 不同提取方法对大豆种皮多糖结构及抗氧化活性的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器设备 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 大豆种皮多糖的提取 |
| 2.3.2 理化成分测定 |
| 2.3.3 单糖组成测定 |
| 2.3.4 分子量测定 |
| 2.3.5 FT-IR测定 |
| 2.3.6 扫描电镜 |
| 2.3.7 抗氧化活性评价方法 |
| 2.3.8 数据处理与分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 不同提取方法对多糖提取效率的影响 |
| 2.4.2 不同提取方法对多糖理化性质的影响 |
| 2.4.3 单糖组成分析 |
| 2.4.4 分子量分析 |
| 2.4.5 FT-IR分析 |
| 2.4.6 扫描电镜(SEM)结果分析 |
| 2.4.7 不同提取方法对大豆种皮多糖抗氧化活性的影响 |
| 2.4.8 关联分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 大豆种皮多糖对化学性肝损伤的保护作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器设备 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 动物实验设计 |
| 3.3.2 血清肝功能指标的测定(包含AST、ALT测定方法) |
| 3.3.3 肝组织脂质过氧化物MDA的测定 |
| 3.3.4 肝组织抗氧化指标的测定(包含GSH、ROS测定方法) |
| 3.3.5 肝组织外观观察 |
| 3.3.6 肝组织病理组织学检测 |
| 3.3.7 数据处理与分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 小鼠体重变化及脏器指数 |
| 3.4.2 大豆种皮多糖对小鼠血清肝功能指标的影响 |
| 3.4.3 大豆种皮多糖对小鼠肝脏脂质过氧化的影响 |
| 3.4.4 大豆种皮多糖对小鼠肝脏抗氧化相关物质活性的影响 |
| 3.4.5 肝组织外观观察 |
| 3.4.6 小鼠肝组织病理学变化 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 大豆种皮多糖调节化学性肝损伤的机制初步研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器设备 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 16S rDNA高通量测序检测小鼠肠道菌群组成 |
| 4.3.2 qRT-PCR验证 |
| 4.3.3 数据处理与分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 大豆种皮多糖对小鼠肠道菌群的影响 |
| 4.4.2 基于特定基因的调控规律 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者攻读硕士学位期间发表的论文情况 |
| 致谢 |
（7）靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并抑制肿瘤干细胞特性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一部分: 文献综述 STAT3对肿瘤细胞有氧糖酵解的调节作用 |
| 一、STAT3对肿瘤细胞有氧糖酵解调节酶的调控作用 |
| 1. STAT3对HIF-1α的调节作用 |
| 2. STAT3对HIF-2α的调节作用 |
| 二、STAT3对肿瘤细胞有氧糖酵解关键酶的调控作用 |
| 1. STAT3对糖酵解第一阶段关键酶GLUT1的调控作用 |
| 2. STAT3对糖酵解第二阶段关键酶HK2的调控作用 |
| 3. STAT3对糖酵解第二阶段关键酶PFK的调控作用 |
| 4. STAT3对糖酵解第二阶段关键酶PKM2的调控作用 |
| 5. STAT3对糖酵解第三阶段关键酶LDHA的调控作用 |
| 三、STAT3对免疫细胞有氧糖酵解的调控作用 |
| 四、STAT3和糖酵解对肿瘤细胞免疫原性死亡的影响 |
| 五、总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并改善肿瘤免疫微环境 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂材料和制剂 |
| 二、主要试剂配制 |
| 三、主要仪器设备 |
| 四、主要实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. 靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡 |
| 1.1 干扰STAT3的表达可以抑制肝癌细胞的增殖并促进细胞凋亡 |
| 1.2 干扰STAT3的表达促进calreticulin和ERp57等“eat me”信号分子在肝癌细胞的膜转移 |
| 1.3 干扰STAT3的表达减少“don't eat me”信号分子CD47在肝癌细胞表面的表达 |
| 1.4 干扰STAT3的表达促进肝癌细胞释放ATP |
| 1.5 干扰STAT3的表达增强肝癌细胞对DC的活化作用 |
| 1.6 干扰STAT3的表达增强巨噬细胞对肝癌细胞的吞噬作用 |
| 2. 靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡的机制研究 |
| 2.1 STAT3通过结合PKR调控免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化 |
| 2.2 STAT3通过调控糖酵解关键酶-GLUT1抑制免疫原性死亡 |
| 2.3 STAT3通过调控“don't eat me”信号分子-CD47抑制免疫原性死亡 |
| 3. 抑制小鼠肝癌模型中STAT3信号通路可诱导机体抗肿瘤免疫应答及免疫记忆的产生 |
| 3.1 干扰小鼠肝癌细胞Hepa1-6中STAT3表达可以诱导细胞免疫原性死亡 |
| 3.2 STAT3抑制剂Napabucasin体外诱导肝癌细胞免疫原性死亡 |
| 3.3 STAT3抑制剂Napabucasin体内诱导肝癌细胞免疫原性死亡 |
| 3.4 STAT3抑制剂Napabucasin抑制Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠肿瘤的生长并改善肿瘤免疫微环境 |
| 3.5 STAT3抑制剂Napabucasin激发肝脏原位移植瘤小鼠的抗肿瘤免疫应答 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: STAT3抑制剂Napabucasin抑制肝癌干细胞特性的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂材料和制剂 |
| 二、主要试剂配制 |
| 三、主要仪器设备 |
| 四、主要实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. Napabucasin体外显着抑制肝癌细胞的活力 |
| 2. Napabucasin体外抑制肝癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡 |
| 3. Napabucasin抑制肝癌细胞干性相关分子的表达 |
| 4. Napabucasin抑制肝癌细胞集落形成和成球能力 |
| 5. Napabucasin抑制肝癌干细胞球的细胞活力及干性相关分子的表达 |
| 6. Napabucasin抑制HBV的复制 |
| 7. Napabucasin抑制Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠肿瘤的生长 |
| 8. Napabucasin促进中晚期Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠肿瘤的坏死 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 论文创新性及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议 |
| 已发表学术论文 |
| 待发表学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的临床研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 分组 |
| 1.5 随访及监测指标 |
| 1.6 观察和评价指标 |
| 1.7 安全性评价 |
| 1.8 检验方法 |
| 1.9 试验流程图 |
| 2 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 三组HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者主要基线特征 |
| 3.2 三组HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者失访率比较 |
| 3.3 地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者生化学应答的影响 |
| 3.4 地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者病毒学应答的影响 |
| 3.5 地五养肝胶囊降低HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌发病率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 HBeAg阴性慢性乙型肝炎抗病毒治疗的研究进展 |
| 4.2 HBeAg阴性慢乙肝患者存在肝纤维化的异常肝再生微环境是其肝癌发生风险居高不下的重要机制 |
| 4.3 地五养肝胶囊改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用 |
| 4.4 地五养肝胶囊改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发病率的作用 |
| 5 小结 |
| 第二部分 体外实验研究地五养肝胶囊对肝星状细胞与肝癌细胞共培养体系中两种细胞的影响及其改善EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱的相关机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TGF-β1 诱导LX2 活化以及LX2/HCCLM3 共培养体系中LX2的形态学观察 |
| 3.2 筛选DWYG含药血清最佳给药浓度 |
| 3.3 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中两种细胞增殖的影响 |
| 3.4 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中两种细胞凋亡的影响 |
| 3.5 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中HCCLM3侵袭能力的影响 |
| 3.6 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系LX2细胞EMT和 TGF-β/Smad信号通路相关m RNA的表达的影响 |
| 3.7 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系EMT和TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肝纤维化的异常肝再生微环境影响肝癌发生发展的作用及其机制 |
| 4.2 地五养肝胶囊改善肝再生微环境防治肝癌发生发展的作用及其机制 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 肝再生信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 在校期间论文发表及参与科研情况 |
| 致谢 |
（9）磷脂酰乙醇胺结合蛋白4对肝癌细胞生物行为学的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 引言 |
| 1.1 肝癌基本概况 |
| 1.2 PEBP4 概况 |
| 1.2.1 PEBP4 的结构,分布和功能 |
| 1.2.2 PEBP4 在肿瘤中的作用 |
| 1.2.3 PEBP4 参与的信号通路 |
| 1.3 Akt概况 |
| 1.3.1 Akt的结构,生物学功能和调节 |
| 1.3.2 Akt与肿瘤 |
| 1.4 mTOR概况 |
| 1.4.1 mTOR复合物 |
| 1.4.2 mTOR信号通路 |
| 1.4.3 mTOR与肿瘤 |
| 1.5 EMT概况 |
| 1.5.1 EMT特征和功能 |
| 1.5.2 诱导EMT因素和相关信号通路 |
| 1.5.3 EMT与肿瘤 |
| 1.6 本课题研究内容与创新之处 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 主要创新之处 |
| 第二部分 PEBP4 对肝癌细胞生物行为学的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫组化 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 WB |
| 2.2.4 qPCR检测组织PEBP4的m RNA表达水平 |
| 2.2.5 质粒扩增: |
| 2.2.6 sh-PEBP4 敲低 MHCC97H中 PEBP4,构建敲低 PEBP4 的稳定细胞系 |
| 2.2.7 用PCMV6-PEBP4 过表达MHCC97L中的PEBP4,构建过表达PEBP4 的稳定细胞系 |
| 2.2.8 细胞活力测定 |
| 2.2.9 细胞划痕实验 |
| 2.2.10 克隆形成实验 |
| 2.2.11 Transwell实验 |
| 2.2.12 增殖模型构建(皮下移植模型) |
| 2.2.13 肺转移模型构建 |
| 2.2.14 形态学观察(肺部组织HE染色) |
| 2.2.15 统计学分析:采用SPSS软件对实验结果行统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PEBP4 在肝癌组织和细胞中高表达 |
| 2.3.2 构建敲低和过表达PEBP4 的稳定细胞系 |
| 2.3.3 敲低PEBP4 抑制肝癌细胞的生长 |
| 2.3.4 过表达 PEBP4 促进肝癌细胞的生长 |
| 2.3.5 敲低PEBP4 抑制肝癌细胞的迁移和侵袭 |
| 2.3.6 过表达PEBP4 促进肝癌细胞的迁移和侵袭 |
| 2.3.7 敲低PEBP4 抑制异体移植瘤的生长 |
| 2.3.8 过表达PEBP4 促进异体移植瘤的生长 |
| 2.3.9 敲低PEBP4 抑制肝癌细胞肺转移 |
| 2.3.10 过表达PEBP4 促进肝癌细胞肺转移 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路促进肝癌细胞的增殖、侵袭和转移 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 WB检测敲低和过表达PEBP4 细胞系中Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.3 免疫荧光检测敲低和过表达PEBP4 细胞系中E-cadherin和N-cadherin的表达 |
| 3.2.4 IGF-1 刺激敲低PEBP4 细胞系,WB检测Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.5 Akt抑制剂MK-2206 处理过表达PEBP4 细胞系,WB检测Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.6 Akt-S473D感染敲低PEBP4 细胞系,WB检测Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.7 Akt-S473D和 Akt抑制剂MK-2206 分别处理敲低和过表达PEBP4细胞系,CCK8 检测细胞增殖能力 |
| 3.2.8 Akt-S473D和 Akt抑制剂MK-2206 分别处理敲低和过表达PEBP4细胞系,Transwell检测细胞迁移和侵袭能力 |
| 3.2.9 Akt-S473D和 Akt抑制剂MK-2206 分别处理敲低和过表达 PEBP4细胞系,免疫荧光检测E-cadherin和 N-cadherin的表达 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 敲低PEBP4 下调Akt/mTOR信号通路 |
| 3.3.2 过表达PEBP4 上调Akt/mTOR信号通路 |
| 3.3.3 PEBP4 参与Akt/mTOR信号通路活化 |
| 3.3.4 PEBP4 促进Akt/mTOR信号通路活化 |
| 3.3.5 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭 |
| 3.3.6 敲低PEBP4 抑制EMT进展 |
| 3.3.7 过表达PEBP4 促进EMT进展 |
| 3.3.8 PEBP4 可能通过Akt/mTOR信号通路调节EMT的进展 |
| 3.3.9 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路调节E-cadherin和 N-cadherin的表达 |
| 3.3.10 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路促进EMT的进展 |
| 3.4 讨论 |
| 第四部分 探讨PEBP4、Akt、mTOR之间的关系 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 免疫共沉淀 |
| 4.2.3 N-myc-PEBP4 质粒扩增 |
| 4.2.4 N-myc-PEBP4 转染HEK293T用于免疫共沉淀 |
| 4.2.5 siRNA-mTOR转染HEK293T细胞用于验证siRNA敲低效果 |
| 4.2.6 siRNA-mTOR转染HEK293T细胞用于免疫共沉淀 |
| 4.2.7 Western blot |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PEBP4、Akt、mTOR之间具有相互作用 |
| 4.3.2 mTOR可能通过Akt与 PEBP4 发生作用 |
| 4.4 讨论 |
| 第五部分 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 NF-κB 信号通路在肝细胞癌作用中的研究进展 |
| References |
（10）西黄丸治疗非小细胞肺癌疗效的系统评价及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 非小细胞肺癌的西医研究进展 |
| 综述二 西黄丸抗肿瘤的实验研究进展 |
| 综述三 热休克蛋白与肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 西黄丸治疗非小细胞肺癌的疗效：系统综述和Meta分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 西黄丸抗非小细胞肺癌的网络药理学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 西黄丸抗小鼠Lewis肺癌的药效学研究 |
| 实验一 西黄丸含药血清和浸提液对LL/2细胞株增殖的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 西黄丸浸提液对LL/2细胞株凋亡和细胞周期的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 西黄丸浸提液对LL/2细胞株迁移及侵袭能力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 西黄丸抑制Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤生长的作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤的转录组学的影响 |
| 实验五 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤转录组学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤热休克蛋白家族的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤的ER/RXRα/PPAR的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
四、三种植物多糖对小鼠正常肝细胞和肝癌细胞细胞核酪氨酸蛋白激酶活力的影响（论文参考文献）
- [1]基于新型网络药理学策略解析复方苦参注射液抗肝癌主要药效成分与作用机制[D]. 王珂欣. 山西大学, 2021(01)
- [2]黑沙蒿多糖对肉仔鸡免疫应激的缓解作用及其机理研究[D]. 邢媛媛. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [3]七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究[D]. 宋晓萍. 辽宁师范大学, 2021(09)
- [4]10-羟基癸烯酸诱导肝癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制的分子机制[D]. 鞠雪莹. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [5]miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究[D]. 陈凯. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [6]大豆种皮多糖对肝损伤防护的机制研究[D]. 韩琳. 渤海大学, 2021(11)
- [7]靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并抑制肿瘤干细胞特性的研究[D]. 李雅. 山东大学, 2021
- [8]地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究[D]. 陈乞. 湖北中医药大学, 2021
- [9]磷脂酰乙醇胺结合蛋白4对肝癌细胞生物行为学的影响及其机制研究[D]. 陈琼锋. 南昌大学, 2021(01)
- [10]西黄丸治疗非小细胞肺癌疗效的系统评价及作用机制研究[D]. 张志莹. 北京中医药大学, 2021(01)