一、猪水泡性疾病诊断（论文文献综述）
于文举[1]（2021）在《猪口蹄疫和猪水泡病的鉴别诊断及防治》文中认为猪肉消费市场需求决定了生猪养殖的蓬勃发展,在养猪生产实践中,有许多猪病在临床表现上非常接近,很难区分,给猪病诊断、治疗带来较大困难,耽误了治疗,增加治疗成本和饲料成本,降低养猪的经济效益和社会效益。随着养殖规模的发展,猪口蹄疫和猪水泡病给猪群带来的危害非常严重,进而制约了养猪业的健康发展。本文从病原学、流行病学、临床症状、鉴别诊断、防控措施等方面进行总结阐述,希望对养猪场有所帮助。
孟媛[2]（2021）在《A型塞内卡病毒SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立及亚单位疫苗候选抗原研究》文中研究说明2007年,在加拿大首次报告了 A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）,有感染猪群的情况,随后在美国、巴西、哥伦比亚、中国、泰国、越南均有相关报道。2015年,广东某猪场分离出一株SVA,从而确定了 SVA在我国的流行,SVA在我国的流行给养猪产业带来了巨大的经济损失。目前,我国境内存在许多亚临床感染现象,并且缺乏获批的商品化疫苗可以使用,这种情况增加了我国对A型塞内卡病毒病的防控难度。因此,需要开发一种具有高安全性的SVA新型疫苗。本研究目的是建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并且将其运用于SVA的检测;使用原核表达系统来表达纯化SVA VP1与SVA VP3的重组蛋白,将纯化复性后的SVA VP1与SVA VP3蛋白与佐剂联合免疫小鼠,对小鼠免疫效果进行评估。结果如下:1.SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立:SVA 2C基因标准品的拷贝数在1.99× 107-1.99× 100copies/μL范围内。2C基因标准品的相关系数为0.994,其斜率为3.736,2C检测方法的灵敏性为1.99×100,高于普通PCR 10000倍,2C组间变异系数在0.76～0.93%之间,组内变异系数在0.35～0.66%之间;SVA 3D基因标准品的拷贝数在2.18 × 107-2.18 × 100 copies/μ L范围内,3D基因标准品的相关系数为1.000,其斜率为3.589;3D检测方法灵敏性为2.18 × 100拷贝/μ L,高于普通PCR 1000倍;3D组间变异系数在0.60～1.06%之间,组内变异系数在0.51～0.89%之间;两种基因构建的检测方法均具有良好的特异性,SVA与PCV2、PCV3、FMDV、PRRSV、PEDV、TGEV均不产生交叉反应。采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测了 49份样品,2C检测出阳性率81.6%、3D检测出阳性率85.7%,使用普通PCR方法检测出的阳性率为55.1%。表明建立的SVA SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR较普通PCR方法,具有更高的敏感性与更强的特异性,可以考虑用于SVA的快速检测。2.原核表达SVA VP1蛋白与VP3蛋白:扩增SVA VP1与VP3目的基因片段分别为792bp与717bp,与预期相符;并将SVA VP1与VP3克隆至pET-28a载体,然后,成功构建了 pET-28a-VP1重组质粒和pET-28a-VP3重组质粒,转化至E.coli BL21（DE3）pLySs感受态,再经IPTG诱导表达,分别约35KDa、29KDa的目的蛋白;温度为37℃,0.8mmol/L为诱导剂浓度、4h为诱导时间时,VP1蛋白表达量最高。温度为37℃,1.Ommol/L为诱导剂浓度、6h为诱导时间时,VP3蛋白表达量最高。这两种重组蛋白均是呈现包涵体形式。用His标签Ni2+-NTA金属螯合蛋白质纯化柱纯化蛋白,薄层扫描结果显示VP1重组蛋白与VP3重组蛋白是纯度分别为85%、84%。3.SVA VP1及VP3蛋白联合佐剂小鼠免疫评价:使用VP1浓度为0.56mg/mL、VP3浓度为0.23mg/mL的蛋白,联合氢氧化铝佐剂与弗式佐剂进行小鼠免疫试验,小鼠试验组的免疫抗原剂量是50 μ g/只,其中进行腿部肌肉注射,每只100 μL,首次免疫14d后,进行第二次免疫。并且分别从体液免疫与细胞免疫对小鼠的免疫效果进行评估。结果表明,VP1亚单位疫苗各免疫组的特异性抗体一免后7d均呈上升趋势,于二免后14d时VP1-FCA组特异性抗体效价达到最高值（1:163840）;于二免后14d时VP1-AL组特异性抗体效价达到最高值（1:5120）;中和抗体效价在二免后7d时极显着高于PBS组,VP1-FCA组达到最高值（1:512）,在二免后14d时VP1-AL组达到最高值（1:1024）;小鼠T淋巴细胞亚群CD3+CD4+与CD3+CD8+在二免后VP1-FCA组显着升高（p<0.05）,VP1-AL组极显着升高（p<0.01）;淋巴细胞增殖实验表明VP1-AL组与VP1-FCA组均呈现显着升高（p<0.05）;对免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明IL-4的分泌显着升高（p<0.05）,IL-2与IFN-γ的变化不明显。VP3亚单位疫苗各免疫组组的特异性抗体一免后7d均呈上升趋势,于二免后14d时,VP3-FCA组特异性的抗体效价,已经达到最高值为（1:163840）。VP3-AL组特异性的抗体效价,已经达到最高值为（1:81920）;中和抗体在二免后7d时,效价极显着高于PBS组,在二免后14d,VP3-AL组与VP3-FCA组同时达到最高值,分别是（1:128）、（1:32）;淋巴细胞增殖实验表明VP3-AL组与VP3-FCA组均呈现显着升高趋势（p<0.05）;然后对免疫小鼠血清中含有的细胞因子进行检测,检测结果表明:细胞因子IL-4的分泌显着提高（p<0.05）,IL-2与IFN-γ产生的变化不明显。本研究利用SVA VP1重组蛋白联合佐剂AL组是可诱导小鼠体内产生免疫应答且效果良好,为该抗原后续猪体免疫研究奠定了基础。
高春柳[3]（2021）在《2019-2020年中国部分省份猪塞内卡病毒流行病学调查及反向遗传平台构建》文中研究表明塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）是引起猪塞内卡病的主要原因,其临床症状与其他水泡疾病相似而常被忽略,造成养猪业的经济受损,制约养猪业的健康发展,但目前还没有商品化疫苗,近几年来备受关注。本研究旨在通过对2019-2020年我国部分省份（直辖市、自治区）猪群SVA流行病学调查,分析SVA在我国的三间分布与毒株进化情况。并构建反向遗传平台,同时为进一步研究SVA致病机理、构建标记疫苗等奠定基础。首先,采集2019-2020年我国部分省份（直辖市、自治区）共3 995份的组织混合样品、血清样品,分别进行实时荧光定量RT-PCR和SVA竞争ELISA检测分析,并将检出的阳性样品进行病毒分离及基因组序列对比。结果显示,2019年13个省份（直辖市、自治区）92个场群的组织混合样品1 310份,个体阳性率为6.72%,群体阳性率为23.91%;5个省份（直辖市、自治区）21个场群的828份血清样品,个体阳性率为13.04%,群体阳性率为85.71%。2020年13个省份（直辖市、自治区）101个场群的组织混合样品1 397份,个体阳性率为8.66%,群体阳性率为36.63%;5个省份（直辖市、自治区）13个场群的460份血清样品,个体阳性率为7.61%,群体阳性率为46.15%。2019年下半年组织混合样品个体阳性率与群体阳性率均高于上半年,2020年检测结果与之相反。在成功分离出的10株毒株中,SVA-GXF011-2019、SVA-GXF053-2019、SVA-FJ036-2019、SVA-GX011-2019、SVA-FJ039-2019、SVA-Hu N032-2019与中国株SVA/GX/CH/2018同源性最高在99.20%-99.30%之间,SVA-FJ018-2019、SVA-SD069-2019、SVA-SD072-2019、SVA-SD074-2019与美国分离株USA/IN Purdue 36998/2016同源性最高,均为98.30%。其次,依次扩增CMV启动子、已分离鉴定的GXT91毒株为模板的SVA全基因组、poly A尾巴及丁肝核酶序列（HDVr）,利用同源重组技术,将3段核酸片段整合进低拷贝载体pWSK-29。结果显示,构建好的重组质粒pWSK-29-SVA转染至细胞的效率在70%左右,转染后的病毒盲传至第三代出现细胞病变现象,盲传第五代时的拯救毒株（rSVA）基因组测序结果均正确。不同时间点收获病毒,测定病毒滴度并绘制的生长曲线表现出与亲本GXT91毒株具有相似的复制能力和增殖特性。间接免疫荧光鉴定出特异性的绿色荧光。蚀斑的大小及形态与亲本GXT91毒株基本一致。综上所述,2019-2020年SVA在我国部分地区感染率仍较高、污染面仍较大。我国主要流行毒株在分支（Clade）Ⅰ中。而分离株SVA-FJ018-2019、SVA-SD069-2019、SVA-SD072-2019、SVA-SD074-2019单独出现一个新的分支（CladeⅥ）且与美国毒株同源性较高,有待进一步研究其生物学特征。同时本实验成功构建了SVA反向遗传平台质粒（pWSK-29-SVA）并成功拯救出塞内卡毒株（rSVA）,可为后续开展有关SVA的研究提供有效依据。
郭丽莹[4]（2021）在《塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选与鉴定》文中研究指明塞内卡病毒A（Senecavirus A,SVA）属于小RNA病毒科,是塞内卡病毒属的唯一成员。猪感染SVA后,主要表现为厌食、发烧、流涎、口鼻和蹄部出现水疱、溃疡等,严重者出现跛行,其临床症状与口蹄疫、猪水泡病和水疱性口炎等疾病难以区分。2002年SVA在美国被发现,2014年之后加拿大、巴西、中国、泰国和哥伦比亚也相继报道,病毒感染呈现世界蔓延的趋势。2015年我国广州首次发生SVA疫情,随后疫情陆续扩展至湖北、黑龙江、河南和福建等地,严重影响了我国养猪业的发展,给畜牧养殖业造成了巨大的损失。目前,关于SVA细胞免疫方面的研究较少,但细胞免疫不仅可以刺激机体产生T细胞免疫应答,还有辅助体液免疫应答的作用,而抗原表位作为激活免疫应答最有效的氨基酸短肽,其筛选和鉴定显得尤为重要。生物信息学的飞速发展使得人们利用免疫表位数据库进行抗原表位的筛选成为可能,这种从预测到鉴定的技术极大地节约了研究经费和人力物力成本,有利于抗原表位的快速鉴定。开展抗原表位的研究对于研究病原学、免疫监测、疾病诊断及设计基于表位的疫苗等具有重要意义。有研究表明,SVA的病毒粒子免疫可以刺激T淋巴细胞增殖,刺激后能够检测到IFN-γ特异性T细胞。在此前提下,本课题通过预测并鉴定SVA的T细胞抗原表位,希望有助于研发SVA的T细胞疫苗,进而为研究T细胞免疫应答做铺垫。首先利用生物信息学网站对SVA结构蛋白进行抗原表位的预测,选择得分优且重复率较高的多肽合成,然后构建SVA结构蛋白的真核表达载体质粒（p CDNA3.1-P1）,经蛋白质免疫印迹、间接免疫荧光及间接ELISA实验证实它可以在体外表达,然后将其作为DNA疫苗免疫小鼠,通过病毒中和实验,酶联免疫吸附实验来检测DNA疫苗刺激小鼠产生抗体的能力。之后通过流式细胞术检测质粒免疫小鼠促进淋巴细胞增殖的能力,通过酶联免疫斑点技术检测多肽刺激脾细胞产生IFN-?的数量。最终选择重复率高且效果较好的多肽检测多肽刺激脾细胞产生IFN-?的能力,该多肽可能为SVA的T细胞抗原表位。实验表明虽然DNA疫苗刺激小鼠产生抗体的能力较弱,但小鼠体内仍有抗体产生,再用合成的多肽来进行体外刺激,利用IFN-γELISPOT试剂盒对以上多肽来进行筛选,共筛选出4个效果较好的多肽,分别为1（SFDTASGTF）、9（MPFQSLGTY）、11（ITLTFCGPM）、21（TSVDISVPYI）号多肽,可为SVA候选肽疫苗做铺垫。
伍春平[5]（2021）在《A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定》文中指出A型塞内卡病毒（Senecavirua A,SVA）属于小RNA病毒科、塞内卡病毒属,能引起各日龄的猪群出现类似口蹄疫等水泡性疾病样临床症状,并造成新生仔猪急性死亡,严重危害我国养猪业的发展。由于塞内卡病毒病是一种新发的传染病,以往的研究主要集中在其生物学特性上,而关于SVA疫苗、侵入机制和免疫机理等方面的研究甚少。VP1、VP2和VP3是SVA表面的结构蛋白,其既包含介导病毒入侵宿主细胞的受体结合域,也包含激发机体免疫应答产生中和抗体的抗原表位。因此,本研究对SVA这3个结构蛋白的B细胞抗原表位进行了筛选与鉴定,为SVA的病原学、诊断方法、抗原结构和新型表位疫苗的研究奠定了基础。本实验室前期利用分离获得的SVA田间流行毒株CH-FJ-2017制备了SVA灭活疫苗,并以此免疫猪群,获得免疫血清SOW6-1、PC6-2和PC4-3。本研究首先对3个免疫血清的生物学特性进行了分析鉴定。间接ELISA试验结果表明这些免疫血清与SVA的结构蛋白均具有良好的亲和性,Western Blotting（WB）和间接免疫荧光试验（Indirect Immunofluorescence Assay,IFA）结果表明这些血清与SVA及其结构蛋白均具有良好的免疫反应性,病毒中和试验（Virus Neutralization Test,VNT）结果表明这些血清对SVA流行毒株的中和效价大于1024。然后结合生物信息学预测法和交叠多肽生物合成法,并利用免疫血清对SVA 3种结构蛋白的B细胞抗原表位进行了筛选与鉴定。通过Protparam和PSIPRED在线软件对这3种结构蛋白的理化特性和二级结构进行分析。利用Bcepred、ABCpred、Bepipred、IEDB、SVMpred、Ellipro和SEPPA2.0等7种生物信息预测软件,对各结构蛋白的B细胞抗原表位进行综合分析。合成预测的抗原表位,并通过ELISA试验进行验证。最终在VP1、VP2和VP3蛋白上分别鉴定出3、6和3个B细胞抗原表位。为进一步提高鉴定的准确性,基于这3种结构蛋白的氨基酸序列,构建96个带GST188标签的交叠16肽,相邻交叠多肽之间重叠8个氨基酸残基,并将这些肽段克隆至pXXGST-1原核表达载体,进行大肠杆菌表达。通过WB试验分析这些交叠多肽与血清的免疫反应性,最终在VP1、VP2和VP3蛋白上分别鉴定出7、13和5个阳性片段。最后对筛选的B细胞抗原表位进行了免疫原性分析。根据以上两种方法的筛选结果,选择并合成两种方法鉴定一致性较好的抗原表位,将这些抗原表位分别与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联,并通过豚鼠免疫试验制备血清。这些免疫血清与SVA结构蛋白具有良好的免疫反应性和较高的亲和力,且能特异性识别IBRS-2细胞中感染的SVA。综上所述,本研究鉴定出SVA VP1蛋白2个线性B细胞抗原表位VP1-1（6-21 aa）和VP1-2（221-233 aa）,VP2蛋白4个线性B细胞表位VP2-1（5-16 aa）、VP2-2（35-57 aa）、VP2-3（175-187aa）和VP2-4（267-282 aa）,VP3蛋白1个线性B细胞抗原表位VP3-1（135-153 aa）,并且这些表位都具有能激发机体免疫应答的能力,为进一步研究VP1、VP2和VP3蛋白的功能、诊断方法和新型SVA表位疫苗的研究奠定了基础。
李秀芳[6]（2020）在《口蹄疫与猪水泡病鉴别与防控》文中认为猪口蹄疫和猪水泡病是猪场常见的2种疾病,由于2种疾病在临床症状上有很多相似性,所以导致养殖人员在平常的鉴别诊断中往往出现失误,贻误治疗时机。该文从2种疾病的流行病学、病原特性、防止措施等方面进行鉴别分析。
谢彩华[7]（2020）在《塞内卡病毒qPCR、ddPCR方法的建立及标准物质的制备研究》文中研究指明塞内卡病毒（Seneca Valley virus,SVV）,在遗传上与小RNA病毒科、心病毒属病毒关系相近,临床上能引起猪的鼻吻、蹄冠状带部位出现水疱样病变,偶见腹泻症状,病情急促,新生仔猪病死率高,我国现已出现多省份猪场感染SVV的病例,猪群感染SVV后表现的临床症状与口蹄疫、猪水疱病、水泡性口炎、猪水泡疹等病毒感染后症状非常相似,在临床症状上常常引起混淆。如果未能对以上几种疫病及时作出准确的鉴别诊断,将导致防控措施采取不当,养殖成本大大提高。在我国,2016年首次分离到了SVV。国内外对SVV感染的实验室检测已经开发了电子显微镜、免疫组化、RT-PCR等检测方法。数字PCR（dPCR）技术作为建立在qPCR检测方法的基础上的核酸绝对定量的新技术,与此前发展起来的qPCR核酸相对定量方法比较,其定量方法更加灵敏和准确度更高,而且不需要建立标准曲线可直接判断结果。核酸标准物质是验证SVV检测方法、检测试剂是否科学、可靠的关键,也是实验室质量控制的重要手段,因此核酸标准物质的研制可为精准化疫病防控提供技术保障。国内针对塞内卡病毒检测方法的标准物质十分匮乏,各级检测机构缺少核酸标准物质。本实验设计了塞内卡病毒特异性引物及探针,建立了灵敏性高、特异性好的荧光定量PCR方法;进而筛选了数字PCR仪及试剂,建立了塞内卡病毒数字PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性等特性均进行了验证;采用本研究建立的塞内卡病毒数字PCR方法对分离鉴定的塞内卡病毒进行绝对定量,对其均匀性、稳定性、重复性等进行了测定,制备塞内卡病毒核酸标准物质,联合8个有资质的实验室对塞内卡病毒核酸标准物质进行特性值的确定。结果如下:1、塞内卡病毒和口蹄疫病毒二重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立设计了FMDV和SVV特异性引物和探针,建立了在同一反应体系中可鉴别FMDV和SVV的二重实时荧光RT-PCR检测方法。本方法能高效扩增目的基因;最低能检测到1.0×101拷贝/μL。建立的FMDV和SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法是一种简便、快速、特异性和敏感性较好的诊断方法,可用于FMDV和SVV的快速检测及鉴别诊断。2、SVV微滴式数字PCR方法的建立及应用本研究在SVV实时荧光定量PCR方法的基础上,通过数字PCR supermix的选择、引物探针浓度的优化、反转录时间比对实验、退火温度优化、升降温速度的优化、SVV ddPCR检测方法的动态范围及灵敏度测定、ddPCR结果和荧光定量PCR结果换算等一系列的试验测试,成功建立了SVV ddPCR绝对定量检测方法。本方法能高效扩增塞内卡病毒目的基因,而对其他病原核酸无扩增。敏感性好,最低能检测到3个拷贝/μL。重复性计算出的变异系数为2.39%,建立的SVV数字PCR绝对定量检测方法可进行低峰值的样品进行很好的检测,而且能够对核酸进行绝对量的精确定量,可作为标准物质制备所采用的定量方法。3、塞内卡病毒核酸标准物质的制备、定值与应用本方法对塞内卡病毒候选物的筛选与鉴定,并采用建立的塞内卡病毒ddPCR绝对定量检测方法对塞内卡病毒浓度检测,细胞病毒培养液的预定值、均匀性初检等一系列研究,制备了塞内卡病毒核酸标准物质,并进行了分装;对其进行物理性状检验、灭活检验、支原体检验及其他病毒检验;进行了均匀性评估分析及最小取样量确定;对其短期稳定性及长期稳定性进行了考察。SVV核酸标准物质呈无色透明液体;病毒灭活检验盲传三代后,各代次细胞均无细胞病变;qPCR未扩增出曲线,说明标准物质已经灭活;支原体检验,均为阴性;其他病毒检验除SVV有扩增片段外,其他均无扩增;组内与组间无统计学差异,样品是均匀的;本核酸标准物质的最小取样量为200μl。塞内卡病毒核酸标准物质在4℃环境可稳定9d,在25℃环境可稳定1d。需冷链运输,运输时间不能超过9d。本标准物质在-20℃环境下可稳定6个月,可复融3次。选择8个有资质的实验室对塞内卡病毒核酸标准物质采用ddPCR绝对定量方法进行联合定值,从8个实验室检测的数据计算出塞内卡病毒核酸标准物质的均值为1.6×104 copies/μl,标准值为1.7×104 copies/μl,扩展不确定度为0.3×104 copies/μl。
姚飞[8]（2020）在《塞内卡病毒A VP1、VP2蛋白B细胞表位的筛选与鉴定》文中提出塞内卡病毒病A（Senecavirus A Disease,SVAD）是由A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）引起主要感染猪的病毒性水泡传染病,并可导致新生仔猪急性死亡。本研究运用抗原表位预测法结合交叠合成多肽法对SVA流行毒株CH-FuJ-2017 VP1和VP2结构蛋白上主要B细胞表位进行定位和分析,同时根据鉴定结果选择优势表位进行串联表达,通过Western blot和ELISA方法验证其反应原性,为SVA结构蛋白的免疫特性与功能研究以及表位疫苗的研究等奠定了基础。1、抗原表位预测法筛选B细胞表位:使用DNAStar Protean系统和IEDB等一些在线预测生物学网站分析了SVA两个结构蛋白（VP1和VP2）的完整氨基酸序列。共预测出16个潜在表位,将其分别克隆到pGEX-4T-1质粒中,进行原核表达和纯化。通过Western blot和ELISA方法共鉴定出6个优势表位。2、交叠合成多肽法筛选B细胞表位:基于SVA CH-FuJ-2017毒株VP1的283个氨基酸和VP2的263个氨基酸序列设计和合成了由16个氨基酸组成且相互之间具有8个氨基酸重叠的67段多肽。将这些短肽片段用于ELISA分析,以执行B细胞表位作图。VP1蛋白ELISA筛选出9个表位肽段,VP2蛋白ELISA筛选出15个表位肽段。3、综合以上两种方法得出的结果,选择保守性和反应原性较好的B细胞表位:VP1蛋白（7-26aa）、（48-72aa）、（92-109aa）,VP2蛋白（38-57aa）、（141-148aa）、（154-172aa）和（249-284aa）,佐以通用T细胞表位,设计、构建SVA多表位基因组合,克隆至pET-30a载体,进行原核表达及纯化。本研究制备的重组多表位蛋白经Western blot和ELISA方法验证与SVA VP1和SVA VP2多克隆抗体均有良好的反应原性。为进一步制备SVA表位疫苗以及临床应用提供了技术储备。
宋高媛[9]（2020）在《嵌合FMDV抗原表位的重组SVA构建及免疫原性分析》文中提出2015年塞内卡病毒病传入我国,这是由A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）引起的一种猪病毒性传染病,以鼻吻、蹄部冠状带水泡病变为特征,临床上很难与口蹄疫等疾病区分,且该病由局部地区零星散发逐渐蔓延流行加重,并且尚未有商品化疫苗,严重困扰养猪业。本实验室前期研发的灭活疫苗SVA CH/FJ/2017株已证实具有良好的安全性和有效性。为了更好地实施养猪生产中FMD和塞内卡病毒病的有效防控,利用反向遗传操作技术,本研究以SVA为病毒载体,研制嵌合O型FMDV抗原表位的重组SVA灭活疫苗,实现“一苗防两病”的目的,同时也为微RNA病毒科嵌合病毒及嵌合疫苗的深入研究提供理论依据和技术支持。主要研究内容与结果如下:1.嵌合FMDV抗原表位的重组SVA构建及鉴定利用实验室已建立的SVA反向遗传操作系统,以SVA CH/FJ/2017株全长c DNA感染性克隆为骨架,将O型FMDV结构蛋白VP1的B细胞表位（135～160位和200～213位氨基酸）和非结构蛋白3A的T细胞表位（21～40位氨基酸）重复串联,并与白蛋白信号肽（Human albumin signal peptide,HAS）串联插入到SVA基因组中,构建含有FMDV抗原表位的重组质粒。将重组质粒转染IBRS-2细胞进行重组病毒的拯救,连续传至25代,经遗传稳定性、IFA、Western blot鉴定重组病毒,进而测定TCID50、蚀斑和病毒一步生长曲线分析重组病毒生物学特性。结果显示,成功构建含有B细胞表位的重组质粒p SVA-HAS-OB和含有B细胞表位与T细胞表位的重组质粒p SVA-HAS-OB-3AT,并且拯救出重组病毒,分别命名为r SVA-HAS-OB和r SVA-HAS-OB-3AT。r SVA-HAS-OB和r SVA-HAS-OB-3AT在IBRS-2细胞上连续传至25代次后插入的O型FMDV抗原表位序列可稳定存在,且蚀斑表型和生长特性与亲本病毒（r SVA CH/FJ/2017）相似,病毒含量为108.0TCID50/100mL和108.13TCID50/100mL。2.重组病毒对猪的致病性试验重组病毒与亲本病毒对育肥猪的致病性试验,经颈部肌肉攻毒,剂量为6m L/头,观察临床症状并测定血清中SVA中和抗体。结果显示,在相同的攻毒剂量下,r SVA-HAS-OB和r SVA-HAS-OB-3AT组各有1/3头猪出现临床症状,而r SVA CH/FJ/2017组3头猪均未发病。r SVA-HAS-OB、r SVA-HAS-OB-3AT和r SVA CH/FJ/2017组在感染后第5d可检测到感染血清中SVA中和抗体开始转阳,感染后第9d～第13d检测到SVA中和抗体效价升高至>1024。3.重组病毒免疫原性分析分别将重组病毒和亲本病毒制备灭活疫苗,以5m L/头剂量和颈部肌肉途径接种育肥猪,一免后间隔35d进行第二次免疫,通过病毒中和试验检测血清中SVA中和抗体效价、间接ELISA方法检测血清中FMDV-VP1抗体进行免疫原性评价。结果显示,r SVA-HAS-OB、r SVA-HAS-OB-3AT和r SVA CH/FJ/2017组在一免后第14d均检测到SVA中和抗体效价可达1024;r SVA-HAS-OB和r SVA-HAS-OB-3AT组在二免后第28d均检测到FMDV-VP1特异性抗体。综上所述,本研究利用实验室已建立的SVA反向遗传操作系统,成功构建并拯救出能够表达O型FMDV抗原表位的SVA重组病毒（r SVA-HAS-OB和r SVA-HAS-OB-3AT）,获得的重组病毒与亲本病毒r SVA CH/FJ/2017具有相似的增殖特性。致病性试验结果显示,重组病毒对猪的致病性较亲本病毒略有增强。除此之外,r SVA-HAS-OB和r SVA-HAS-OB-3AT能诱导猪体产生高水平的SVA中和抗体,并能够产生FMDV-VP1抗体。
张永香[10]（2020）在《塞尼卡病毒病的综合防控措施》文中研究说明塞尼卡谷病毒病（Seneca Valley virus, SVV）又称猪原发性水疱病、猪原发性疱疹病、也称塞尼卡病毒A,是由小RNA病毒科塞尼卡病毒属中的塞尼卡谷病毒引起的猪的一种病毒性传染病。该病引起的临床症状主要有口、鼻吻、蹄冠部等部位出现水疱性病变以及新生仔猪的突然死亡。这与猪的口蹄疫、水疱病、水疱疹以及水疱性口炎的临床症状相似甚至难以区分。本文从该病的流行病学、临床症状、病理变化、诊断方法以及防控措施等方面进行综述,为临床有效控制该病的发生提供参考。
二、猪水泡性疾病诊断（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪水泡性疾病诊断（论文提纲范文）
（1）猪口蹄疫和猪水泡病的鉴别诊断及防治（论文提纲范文）
| 1 猪口蹄疫和猪水泡病的鉴别 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状和病理变化 |
| 1.4 鉴别诊断 |
| 2 猪口蹄疫与猪水泡病的防控 |
| 2.1 治疗方法 |
| 2.2 预防措施 |
| 3 结语 |
（2）A型塞内卡病毒SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立及亚单位疫苗候选抗原研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. A型塞内卡病毒的病原学特征 |
| 1.1 形态结构 |
| 1.2 基因结构及功能 |
| 1.2.1 前导蛋白L |
| 1.2.2 结构蛋白P1 |
| 1.2.3 前体蛋白P2 |
| 1.2.4 前体蛋白P3 |
| 2.A型塞内卡病毒的流行病学 |
| 2.1 全球流行情况 |
| 2.2 国内流行情况 |
| 2.3 易感动物 |
| 2.4 分子流行病学 |
| 3.A型塞内卡病毒的症状及病理变化 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 病理学特征 |
| 4.A型塞内卡病毒的诊断 |
| 4.1 病原学诊断 |
| 4.2 血清学诊断 |
| 5.A型塞内卡病毒的防控措施 |
| 5.1 SVA疫情应急预案 |
| 5.2 加强塞内卡的实时监测 |
| 5.3 SVA疫苗的研发 |
| 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 常用溶液及培养基的配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 A型塞内卡病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及应用 |
| 2.1.1 标准质粒的构建 |
| 2.1.1.1 标准质粒的引物设计 |
| 2.1.1.2 PCR扩增反应 |
| 2.1.1.3 连接转化与标准质粒的提取 |
| 2.1.1.3.1 胶回收 |
| 2.1.1.3.2 连接 |
| 2.1.1.3.3 转化 |
| 2.1.1.3.4 标准质粒的提取 |
| 2.1.1.3.5 标准质粒的鉴定 |
| 2.1.1.3.6 重组质粒核苷酸序列测定 |
| 2.1.2 qPCR检测方法的建立 |
| 2.1.2.1 qPCR引物的设计和筛选 |
| 2.1.2.2 标准曲线的建立 |
| 2.1.2.3 荧光定量PCR方法的敏感性实验 |
| 2.1.2.4 荧光定量PCR方法的特异性实验 |
| 2.1.2.5 荧光定量PCR方法的重复性实验 |
| 2.1.3 临床样品检测 |
| 2.1.3.1 样品的处理及cDNA提取 |
| 2.1.3.2 临床样品检测 |
| 2.2 A型塞内卡病毒VP1蛋白与VP3蛋白的原核表达及纯化 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 VP1与VP3基因片段的扩增 |
| 2.2.3 连接 |
| 2.2.4 连接产物的转化与重组质粒的小量提取 |
| 2.2.5 pEASY-Bluentsimple-VP1、pEASY-Bluentsimple-VP3和pET-28a双酶切和连接 |
| 2.2.6 连接产物转化至感受态细胞TranslT1 |
| 2.2.7 重组质粒pET-28a-VP1与pET-28a-VP3的酶切鉴定 |
| 2.2.8 重组质粒pET-28a-VP1与pET-28a-VP3的诱导表达 |
| 2.2.9 SDS-PAGE验证 |
| 2.2.10 Western blot验证 |
| 2.2.11 表达条件的优化 |
| 2.3 重组蛋白的纯化 |
| 2.3.1 重组蛋白大量诱导表达及变性 |
| 2.3.2 VP1与VP3的重组蛋白纯化 |
| 2.3.3 蛋白的复性 |
| 2.4 小鼠免疫实验 |
| 2.4.1 特异性抗体的检测 |
| 2.4.2 中和抗体的检测 |
| 2.4.3 小鼠淋巴细胞的分离 |
| 2.4.4 淋巴细胞增殖实验 |
| 2.4.5 T淋巴细胞亚群检测 |
| 2.4.6 细胞因子的检测 |
| 2.4.7 统计学方法 |
| 结果 |
| 3.1 A型塞内卡病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及应用 |
| 3.1.1 重组质粒pMD-19T-2C,pMD-19T-3D的构建 |
| 3.1.2 qPCR引物的筛选 |
| 3.1.3 标准曲线的建立 |
| 3.1.4 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的的敏感性试验结果 |
| 3.1.5 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的的特异性试验结果 |
| 3.1.6 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的的重复性试验结果 |
| 3.1.7 临床样品检测结果 |
| 3.2 A型塞内卡病毒VP1蛋白与VP3蛋白的原核表达纯化及鉴定 |
| 3.2.1 重组质粒pET-28a-VP1与pET-28a-VP3的构建 |
| 3.2.2 VP1与VP3重组蛋白的原核表达及鉴定 |
| 3.2.3 目的蛋白诱导表达条件的优化 |
| 3.2.3.1 最佳诱导剂浓度 |
| 3.2.3.2 最佳诱导剂时间 |
| 3.2.3.3 最佳诱导剂温度 |
| 3.2.4 VP1与VP3重组蛋白形式的表达 |
| 3.2.5 VP1与VP3重组蛋白的纯化 |
| 3.3 小鼠免疫实验结果 |
| 3.3.1 特异性抗体的检测结果 |
| 3.3.2 中和抗体的检测结果 |
| 3.3.3 T淋巴细胞的亚群检测 |
| 3.3.4 淋巴细胞增值实验 |
| 3.3.5 细胞因子的检测结果 |
| 3.3.5.1 细胞因子IL-4的检测结果 |
| 3.3.5.2 细胞因子IL-2的检测结果 |
| 3.3.5.3 细胞因子IFN-γ的检测结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
（3）2019-2020年中国部分省份猪塞内卡病毒流行病学调查及反向遗传平台构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 SVA研究进展 |
| 1.1 SVA的发生与发展 |
| 1.2 SVA的分子结构 |
| 1.3 SVA流行情况 |
| 1.4 SVA感染症状与机制 |
| 1.5 SVA诊断与疫苗研究 |
| 1.6 SVA的影响及防控措施 |
| 1.7 SVA相关研究 |
| 2 反向遗传平台 |
| 3 本研究目的及意义 |
| 第二章 2019-2020 年中国部分省份猪塞内卡病毒流行病学调查 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒、细胞 |
| 1.2 主要试剂与仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 组织混合样品处理 |
| 2.3 组织混合样品核酸提取 |
| 2.4 组织混合样品检测 |
| 2.5 血清样品检测 |
| 2.6 细胞培养 |
| 2.6.1 细胞培养液的配制 |
| 2.6.2 细胞复苏 |
| 2.6.3 细胞的传代培养 |
| 2.7 病毒分离 |
| 2.8 病毒实时荧光定量RT-PCR鉴定 |
| 2.9 间接免疫荧光鉴定 |
| 2.10 病毒分片段RT-PCR扩增鉴定 |
| 2.11 SVA扩增序列拼接及对比分析 |
| 2.12 检测数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 地区分布情况 |
| 3.2 时间分布情况 |
| 3.3 群间分布情况 |
| 3.4 血清检测情况 |
| 3.5 病毒分离与增殖 |
| 3.6 实时荧光定量RT-PCR鉴定 |
| 3.7 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.8 病毒的RT-PCR鉴定 |
| 3.9 序列比对分析 |
| 3.10 遗传进化及同源性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 同源重组法构建塞内卡病毒反向遗传平台 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒、载体 |
| 1.2 主要试剂与仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 反向遗传平台模板毒株选择 |
| 2.2 毒株遗传稳定性鉴定 |
| 2.3 反向遗传平台引物设计 |
| 2.4 反向遗传平台的构建 |
| 2.4.1 构建策略 |
| 2.4.2 转化DH5α感受态细胞 |
| 2.4.3 菌落PCR鉴定 |
| 2.4.4 获取阳性SVA重组质粒 |
| 2.4.5 病毒转染拯救 |
| 2.4.6 拯救病毒鉴定 |
| 2.4.7 生长曲线分析 |
| 2.4.8 间接免疫荧光试验 |
| 2.4.9 蚀斑形成试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 反向遗传平台模板毒株选择 |
| 3.2 SVA反向遗传平台构建策略 |
| 3.3 SVA全基因及基因PCR扩增 |
| 3.4 同源重组及菌落PCR鉴定 |
| 3.5 病毒拯救 |
| 3.6 拯救病毒鉴定 |
| 3.7 生长曲线分析 |
| 3.8 间接免疫荧光试验鉴定 |
| 3.9 蚀斑形成试验 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 塞内卡病毒病的流行病学 |
| 1.1.1 塞内卡病毒病的发现 |
| 1.1.2 塞内卡病毒病的流行情况 |
| 1.2 塞内卡病毒病的临床症状与病理变化 |
| 1.2.1 塞内卡病毒病的临床症状 |
| 1.2.2 塞内卡病毒病的病理变化 |
| 1.3 塞内卡病毒A的形态与结构 |
| 1.4 塞内卡病毒A的实验室培养 |
| 1.5 塞内卡病毒A的诊断方法 |
| 1.6 塞内卡病毒A感染诱导的免疫应答 |
| 1.6.1 塞内卡病毒A感染诱导的体液免疫应答 |
| 1.6.2 塞内卡病毒A感染引起的细胞免疫应答 |
| 1.7 抗原表位 |
| 1.7.1 抗原表位的概念 |
| 1.7.2 抗原表位的分类 |
| 1.7.3 内源性抗原递呈途径 |
| 1.7.4 外源性抗原递呈途径 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 第二章 塞内卡病毒A灭活抗原及动物抗血清的制备 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 主要生物学试剂和仪器 |
| 2.1.2 细胞的培养、传代及冻存 |
| 2.1.3 塞内卡病毒A培养 |
| 2.1.4 塞内卡病毒A毒价测定 |
| 2.1.5 塞内卡病毒A浓缩纯化 |
| 2.1.6 动物的免疫 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 塞内卡病毒A毒价测定 |
| 2.2.2 塞内卡病毒A浓缩纯化 |
| 2.2.3 塞内卡病毒A特异性血清的制备 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 真核表达载体质粒的构建及体外表达验证 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 主要生物学试剂和仪器 |
| 3.1.2 引物的设计与合成 |
| 3.1.3 质粒的构建 |
| 3.1.4 质粒的提取 |
| 3.1.5 验证质粒在细胞内的表达情况 |
| 3.1.6 动物的免疫 |
| 3.1.7 流式细胞术检测淋巴细胞增殖 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 塞内卡病毒 A 真核表达质粒的构建 |
| 3.2.2 验证质粒在细胞内的表达情况 |
| 3.2.3 流式细胞术检测淋巴细胞增殖 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 抗塞内卡病毒A抗体的血清学检测 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 血清的检测 |
| 4.2.1 小鼠血清的检测 |
| 4.2.2 塞内卡病毒A微量细胞中和实验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 小鼠血清的检测 |
| 4.3.2 塞内卡病毒A微量细胞中和实验 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.2 肽段的设计及合成 |
| 5.1.3 小鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 5.1.4 塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选 |
| 5.1.5 多肽刺激脾细胞IFN-γ的分泌 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选 |
| 5.2.2 多肽刺激脾细胞IFN-γ的分泌 |
| 5.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 A型塞内卡病毒研究概况 |
| 1.1.1 A型塞内卡病毒的分子特征 |
| 1.1.2 A型塞内卡病毒流行病学 |
| 1.1.3 A型塞内卡病毒病临床症状及病理特征 |
| 1.1.4 A型塞内卡病毒诊断与防控 |
| 1.2 抗原表位研究进展 |
| 1.2.1 抗原表位的概述 |
| 1.2.2 抗原表位的研究方法 |
| 1.2.3 表位的应用 |
| 1.2.4 A型塞内卡病毒抗原表位研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 表位预测法鉴定A型塞内卡病毒B细胞抗原表位 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SVA灭活疫苗免疫血清的鉴定 |
| 2.2.2 SVA结构蛋白生物信息学分析 |
| 2.2.3 潜在表位的合成及纯度分析 |
| 2.2.4 潜在表位间接ELISA分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SVA灭活疫苗免疫血清的鉴定结果 |
| 2.3.2 VP1、VP2和VP3 蛋白生物信息学分析结果 |
| 2.3.3 ELISA分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 交叠多肽生物合成法鉴定A型塞内卡病毒B细胞抗原表位 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 仪器 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 交叠多肽原核表达质粒构建 |
| 3.2.2 重组质粒的鉴定与交叠多肽的表达 |
| 3.2.3 WB分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 交叠多肽的表达与鉴定 |
| 3.3.2 抗原表位WB鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 A型塞内卡病毒抗原表位免疫原性分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 仪器 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 抗原表位肽的KLH偶联 |
| 4.2.2 KLH偶联表位多肽免疫豚鼠 |
| 4.2.3 免疫血清ELISA分析 |
| 4.2.4 免疫血清的WB分析 |
| 4.2.5 免疫血清的IFA分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 免疫血清的抗体水平检测和抗体亲和力分析 |
| 4.3.2 免疫血清的免疫反应性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录A GST-188 蛋白的核苷酸序列 |
| 附录B SVACH-FJ-2017(ID: KY747510)核苷酸序列 |
| 附录C SVA结构蛋白的核苷酸序列 |
| 附录D SVA结构蛋白的核苷酸序列 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）口蹄疫与猪水泡病鉴别与防控（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 流行病学 |
| 2 病原学 |
| 3 临床症状 |
| 4 防控措施 |
| 4.1 预防措施 |
| 4.2 疫病防治 |
| 5 结束语 |
（7）塞内卡病毒qPCR、ddPCR方法的建立及标准物质的制备研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 病原学 |
| 1.1 SVV病毒的分类地位 |
| 1.2 SVV病毒的分子结构 |
| 1.3 SVV的发现 |
| 1.4 病毒理化特性 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 传染源 |
| 2.2 易感动物 |
| 2.3 传播途径 |
| 2.4 地理分布 |
| 3 诊断 |
| 3.1 临床症状与病变 |
| 3.2 实验室诊断 |
| 3.2.1 血清学诊断 |
| 3.2.2 病原学诊断 |
| 3.2.3 鉴别诊断 |
| 4 免疫应答 |
| 5 溶瘤特性研究 |
| 6 我国塞内卡病毒感染情况 |
| 7 预防与控制 |
| 8 数字PCR |
| 8.1 dPCR的发展历史 |
| 8.2 dPCR的原理 |
| 8.3 dPCR的应用 |
| 9 标准物质 |
| 10 研究的目的与意义 |
| 第二章 塞内卡病毒和口蹄疫病毒二重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒(菌)株、临床样本 |
| 1.2 仪器设备与主要试剂 |
| 1.3 引物设计和合成 |
| 1.4 总RNA的提取及反转录 |
| 1.5 PCR扩增 |
| 1.6 FMD/SVV标准品的制备 |
| 1.7 FMD/SVV二重qPCR反应条件的优化 |
| 1.8 敏感性试验 |
| 1.9 特异性试验 |
| 1.10 稳定性和重复性试验 |
| 1.11 应用试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 FMD/SVV PCR扩增及标准品的制备 |
| 2.2 FMD/SVV二重qPCR反应条件的优化 |
| 2.3 敏感性试验 |
| 2.4 特异性试验 |
| 2.5 稳定性和重复性试验 |
| 2.6 应用试验 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 SVV数字PCR方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒(菌)株、临床样本 |
| 1.2 仪器设备与主要试剂 |
| 1.3 引物设计和合成 |
| 1.4 核酸的提取 |
| 1.5 RT-ddPCR检测方法的反应条件优化 |
| 1.6 SVV ddPCR检测方法的动态范围及灵敏度测定 |
| 1.7 ddPCR结果和荧光定量PCR结果换算 |
| 1.8 特异性试验 |
| 1.9 重复性试验 |
| 1.10 临床样品验证 |
| 1.11 核酸提取试剂盒的选择与性能评估 |
| 1.12 核酸回收率计算 |
| 2 结果 |
| 2.1 数字PCR supermix的选择 |
| 2.2 引物探针浓度的优化 |
| 2.3 反转录时间比对实验 |
| 2.4 退火温度优化 |
| 2.5 升降温速度的优化 |
| 2.6 SVV ddPCR检测方法的动态范围及灵敏度测定 |
| 2.7 ddPCR结果和荧光定量PCR结果换算 |
| 2.8 特异性试验 |
| 2.9 重复性试验 |
| 2.10 临床样品验证 |
| 2.11 核酸提取试剂盒的选择与性能评估 |
| 2.12 核酸回收率评估 |
| 3 结论 |
| 第四章 塞内卡病毒核酸标准物质的制备、定值与应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒(菌)株、临床样本 |
| 1.2 仪器设备与主要试剂 |
| 1.3 标准物质制备 |
| 1.3.1 研制技术路线 |
| 1.3.2 候选物筛选与鉴定 |
| 1.3.3 病毒培养及浓度测定 |
| 1.3.4 均匀性初检 |
| 1.3.5 分装 |
| 1.3.6 SVV特性的检验 |
| 1.3.7 均匀性评估 |
| 1.3.8 稳定性考察 |
| 1.3.9 标准物质的定值 |
| 1.3.10 不确定度的评定 |
| 1.3.11 SVV标准物质量值结果的表示 |
| 1.3.12 数字PCR仪器的比对试验 |
| 1.3.13 合作者 |
| 2 结果 |
| 2.1 候选物筛选与鉴定 |
| 2.2 病毒培养及浓度测定 |
| 2.3 均匀性初检 |
| 2.4 分装 |
| 2.5 SVV特性的检验 |
| 2.6 均匀性评估 |
| 2.7 稳定性考察 |
| 2.8 标准物质的定值 |
| 2.9 核酸标准物质不确定度评定 |
| 2.10 SVV标准物质量值结果的表示 |
| 2.11 数字PCR仪器的比对试验 |
| 3 结论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（8）塞内卡病毒A VP1、VP2蛋白B细胞表位的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 塞内卡病毒A与塞内卡病毒病 |
| 1.1.1 塞内卡病毒A流行病学 |
| 1.1.2 塞内卡病毒A临床症状及发病机理 |
| 1.1.3 塞内卡病毒A的诊断 |
| 1.1.4 塞内卡病毒A疫苗研究进展 |
| 1.2 表位疫苗研究进展 |
| 1.2.1 抗原表位研究方法 |
| 1.2.2 表位疫苗的设计 |
| 1.2.3 表位疫苗的应用 |
| 1.3 本研究目的意义 |
| 第二章 抗原表位预测法筛选塞内卡病毒AB细胞表位 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 VP1、VP2蛋白生物信息学分析 |
| 2.2.2 原核表达载体的构建 |
| 2.2.3 原核蛋白的表达、纯化 |
| 2.2.4 预测表位Western blot分析 |
| 2.2.5 预测表位ELISA分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 VP1、VP2蛋白生物信息学分析结果 |
| 2.3.2 原核表达载体构建 |
| 2.3.3 融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.4 Western blot鉴定结果 |
| 2.3.5 间接ELISA鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 交叠合成多肽法筛选塞内卡病毒AB细胞表位 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重叠多肽设计、合成 |
| 3.2.2 重叠多肽ELISA分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 塞内卡病毒A多表位基因的设计、表达及反应原性初探 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 主要溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 多表位基因的设计及生物信息学分析 |
| 4.2.2 多表位基因的原核表达载体构建、重组蛋白表达及纯化 |
| 4.2.3 塞内卡病毒重组多表位蛋白的反应原性分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 基本理化性质分析 |
| 4.3.2 抗原性分析 |
| 4.3.3 目的蛋白二级结构分析 |
| 4.3.4 重组多表位蛋白原核载体构建、重组蛋白表达和纯化 |
| 4.3.5 重组多表位蛋白Western blot分析 |
| 4.3.6 重组多表位蛋白ELISA分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）嵌合FMDV抗原表位的重组SVA构建及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞和质粒 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.4 主要抗体 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 主要缓冲液及其配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 嵌合FMDV抗原表位的重组SVA构建 |
| 2.2.3 重组病毒的拯救 |
| 2.2.4 重组病毒的鉴定 |
| 2.2.5 重组病毒的生物学特性分析 |
| 2.2.6 重组病毒对猪的致病性试验 |
| 2.2.7 重组病毒免疫原性分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 嵌合FMDV抗原表位的重组SVA构建及其鉴定 |
| 3.1.1 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.1.2 重组病毒拯救结果 |
| 3.1.3 重组病毒RT-PCR扩增与测序鉴定结果 |
| 3.1.4 IFA检测结果 |
| 3.1.5 Western blot鉴定结果 |
| 3.1.6 遗传稳定性分析结果 |
| 3.1.7 TCID50测定结果 |
| 3.1.8 病毒蚀斑试验结果 |
| 3.1.9 病毒一步生长曲线绘制 |
| 3.2 重组病毒对猪的致病性试验 |
| 3.2.1 攻毒后直肠温度测定与临床症状记录 |
| 3.2.2 攻毒后血清中SVA中和抗体效价的检测结果 |
| 3.3 重组病毒免疫原性的分析 |
| 3.3.1 免疫猪血清中SVA中和抗体效价的检测 |
| 3.3.2 免疫猪血清中O型 FMDV-VP1 特异性抗体的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 嵌合FMDV抗原表位的重组SVA构建及其鉴定 |
| 4.2 重组病毒对猪的致病性试验分析 |
| 4.3 重组病毒免疫原性的分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）塞尼卡病毒病的综合防控措施（论文提纲范文）
| 1 流行病学情况 |
| 2 临床症状 |
| 3 病理变化 |
| 4 诊断方法 |
| 5 治疗措施 |
| 6 预防措施 |
| 6.1 加强饲养管理，提高生物安全措施 |
| 6.2 做好防疫措施，提高猪群抵抗力 |
| 7 小结 |
四、猪水泡性疾病诊断（论文参考文献）
- [1]猪口蹄疫和猪水泡病的鉴别诊断及防治[J]. 于文举. 中国畜禽种业, 2021(12)
- [2]A型塞内卡病毒SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立及亚单位疫苗候选抗原研究[D]. 孟媛. 延边大学, 2021
- [3]2019-2020年中国部分省份猪塞内卡病毒流行病学调查及反向遗传平台构建[D]. 高春柳. 黑龙江八一农垦大学, 2021(10)
- [4]塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选与鉴定[D]. 郭丽莹. 中国农业科学院, 2021
- [5]A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定[D]. 伍春平. 中国农业科学院, 2021(09)
- [6]口蹄疫与猪水泡病鉴别与防控[J]. 李秀芳. 畜牧兽医科学(电子版), 2020(16)
- [7]塞内卡病毒qPCR、ddPCR方法的建立及标准物质的制备研究[D]. 谢彩华. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [8]塞内卡病毒A VP1、VP2蛋白B细胞表位的筛选与鉴定[D]. 姚飞. 中国农业科学院, 2020(01)
- [9]嵌合FMDV抗原表位的重组SVA构建及免疫原性分析[D]. 宋高媛. 安徽农业大学, 2020(03)
- [10]塞尼卡病毒病的综合防控措施[J]. 张永香. 中国动物保健, 2020(01)