一、抗CD20嵌合Fab′片段对B淋巴瘤细胞的生长抑制作用（论文文献综述）
游凤涛[1]（2019）在《CD7-CAR-NK-92MI细胞靶向治疗T细胞肿瘤及双特异CAR-T细胞靶向治疗B细胞肿瘤》文中研究表明近几年,嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法在B细胞恶性肿瘤的临床研究中展现出非常好的临床疗效,但是,针对T细胞肿瘤的CAR-T疗法仍然面临着很大的挑战,我们很难找到一个针对T细胞肿瘤的合适靶点,大部分在T细胞肿瘤细胞上高表达的抗原,在正常T细胞上也会表达,这会导致CAR-T细胞产生自相残杀的现象。CD7分子在大部分的T淋巴细胞白血病细胞中是高表达的,但在一小群正常T淋巴细胞中是不表达的,有研究表明CD7不会对T细胞的发育和功能产生关键的影响。暗示CD7分子可能是T淋巴细胞白血病的一个理想靶点,但是,由于CD7分子在大部分正常T细胞上也表达,在制备过程中CD7-CAR-T细胞也会产生自杀现象,因此在体外很难制备成功。另外,我们也很难从T淋巴细胞白血病患者的体内获得足够的没有被肿瘤细胞污染的正常T细胞来制备CD7-CAR-T细胞。虽然最近有报道显示,在动物模型中,可以通过同时敲除了CD7和T细胞受体的异体CD7-CAR-T来治疗T细胞恶性肿瘤,但在临床实际应用中不能保证100%的基因编辑效率,因此,异体CD7-CAR-T仍然存在移植物抗宿主病（GVHD）的风险。自然杀伤（NK）细胞在对抗恶性细胞的先天免疫防御中发挥着重要作用,也是过继性免疫治疗的理想效应细胞。NK-92细胞系来自于一名非霍奇金淋巴瘤患者外周血中的单核细胞,它是唯一的一株被批准用于临床试验的NK细胞系。NK-92MI细胞来自NK-92细胞系,通过稳定转染白细胞介素-2（IL-2）基因,使其不依赖于IL-2。在本课题中,我们使用我们实验室自主开发的CD7纳米抗体序列构建了单价的CD7-CAR-NK-92MI和二价的dCD7-CAR-NK-92MI细胞,靶向治疗T淋巴细胞白血病。目的:（1）使用我们实验室自主研发的CD7纳米抗体序列,构建靶向CD7的单价CD7-CAR-NK-92MI和二价dCD7-CAR-NK-92MI稳定细胞株;（2）体外检测CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞对CD7阳性肿瘤细胞的细胞毒性;（3）体外筛选2种CAR-NK-92MI细胞的单克隆细胞株,比较不同单克隆细胞株的细胞活性,获得细胞活性最好的一株CAR-NK-92MI单克隆细胞株（mdCD7-CAR-NK-92MI）;（4）评估 mdCD7-CAR-NK-92MI 细胞对 T 淋巴细胞白血病细胞的体内抗肿瘤效果。方法:为了构建CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞株,我们首先设计、合成并构建了 CD7-CAR和dCD7-CAR表达质粒,通过电转方法构建了CD7-CAR-NK-92MI 和 dCD7-CAR-NK-92MI 细胞株,利用细胞流式和 western bloting 的方法对 CD7-CAR-NK-92MI 和 dCD7-CAR-NK-92MI 细胞进行了鉴定。然后通过CSFE/7AAD的体外杀伤方法,检测了 2种CAR-NK-92MI细胞对T淋巴细胞白血病细胞的体外细胞毒性。使用流式细胞分选仪进行了单克隆细胞的分选,并通过CSFE/7AAD细胞毒性检测方法和CBA细胞因子检测方法,比较了不同单克隆细胞的细胞活性,获得活性最好的单克隆细胞株（mdCD7-CAR-NK-92MI）,最后通过T淋巴细胞白血病原代肿瘤细胞建立的小鼠模型,评估了mdCD7-CAR-NK-92MI细胞的体内抗肿瘤作用。结果:我们成功构建了单价的CD7-CAR-NK-92MI和二价的dCD7-CAR-NK-92MI 细胞株,CD7-CAR-NK-92MI 和 dCD7-CAR-NK-92MI 细胞对T细胞白血病细胞系和原代肿瘤细胞都显示出显着的抗肿瘤活性。通过细胞流式分选获得了 8种单价的CD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞和6种二价的dCD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞,并通过细胞毒性实验和细胞因子释放实验获得了活性最好的二价mdCD7-CAR-NK-92MI细胞株。我们观察到二价的mdCD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞对原代T-ALL肿瘤细胞具有显着的细胞毒性。同时,我们也观察到,与对照NK-92MI细胞相比,mdCD7-CAR-NK-92MI细胞与CD7阳性的原代T-ALL细胞孵育后,有显着的干扰素γ和颗粒酶B的释放升高。小鼠实验的结果表明mdCD7-CAR-NK-92MI对PDX小鼠模型中的肿瘤细胞具行明显的抑制作用,显着延长了小鼠的生存期。结论:我们构建了基于CD7纳米抗体序列的CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞,并通过一系列的实验证明了对T-ALL肿瘤细胞的抗肿瘤效果。不仅通过体外实验证实了 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞对T-ALL细胞系和原代肿瘤细胞的特异性细胞毒性,而且还通过动物实验证明了 mdCD7-CAR-NK-92MI细胞可以显着抑制T-ALL原代肿瘤细胞构建的异种移植小鼠模型中的肿瘤进展。总之,我们构建的CD7-CAR-NK-92-MI细胞为T淋巴细胞白血病的治疗提供了一种新的方法或策略。虽然CD19-CAR-T疗法在治疗B细胞恶性肿瘤,特别是B细胞急性淋巴细胞白血病取得了重大的进展,表现出惊人的临床疗效,但是用CD19-CAR-T治疗后的复发率依然很高,肿瘤复发的机制之一是肿瘤细胞可以通过下调肿瘤细胞表面CD19抗原的表达,来逃避CD19-CAR-T细胞的杀伤。解决CD19阴性复发的策略之一是使用靶向B细胞肿瘤细胞上其它分子的CAR-T细胞。除了 CD 19外,CD22、CD20、CD123也是靶向B细胞肿瘤的理想靶点。但类似于CD19,靶向单一抗原依然可能会出现由于抗原丢失导致的肿瘤逃逸。因此,构建可以同时靶向癌细胞上两个抗原的CAR-T细胞,可能是解决由于单抗原丢失导致的肿瘤复发的一种新策略。目的:（1）开发人源化的CD 19和CD20抗体序列,构建hCD 19-hCD20-CAR载体;（2）构建人源化的双特异 hCD19-hCD20-CAR-T细胞和hCD19-hCD20-CAR-Jurkat细胞;（3）检测 hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞是否可以被CD 19阳性或CD20阳性靶细胞特异性活化;（4）评估hCD19-hCD20-CAR-T细胞对CD19过农达肿瘤细胞或CD20过表达肿瘤细胞的生物学功能;（5）评估hCD1 9-hCD20-CAR-T细胞对天然表达CD19和CD20抗原的B细胞肿瘤细胞株的生物学功能。方法:为了构建双特异的hCD19-hCD20-CAR载体,我们首先开发了人源化的CD19scFv和CD20scFv序列,然后设计、合成并构建了hCD19-hCD20-CAR表达质粒,并制备了 hCD19-hCD20-CAR慢病毒,对于T细胞或Jurkat细胞进行转染,制备hCD19-hCD20-CAR-T 细胞和 hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞株。我们通过检测与K562-CD19 或 K562-CD20细胞孵育后hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞表面CD69的表达情况,初步评估hCD19-hCD20-CAR是否可以被CD19或CD20抗原特异性激活。然后我们通过细胞杀伤实验检测了 hCD 19-hCD20-CAR-T细胞对K562-CD19,K562-CD20,K562-CD19-CD20,Raji,Nalm-6 细胞的细胞毒性,并通过检测细胞因子的分泌和细胞表面活化分子的表达,进一步验证了hCD19-hCD20-CAR-T是否可以被靶细胞特异性活化。结果:我们成功开发了人源化的CD19抗体和CD20抗体,获得了人源化的CD19scFv 和 CD20scFv 序列,构建了 hCD19-hCD20-CAR-T 细胞和hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞。hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞与 K562-CD19 或K562-CD20细胞孵育后,CD69有显着升高,而与K562细胞孵育后,hCD1 9-hCD20-CAR-Jurkat细胞表面CD69没有显着升高,说明我们构建的hCD19-hCD20-CAR-Jurkat细胞既可以被CD19阳性肿瘤细胞激活,也可以被CD20肿瘤细胞特异性激活。hCD19-hCD20-CAR-T细胞对K562-CD19和K562-CD20细胞的杀伤结果表明,我们构建的hCD19-hCD20-CAR-T对CD19阳性或CD20阳性的肿瘤细胞都具有特异性杀伤,可以同时杀伤CD19阳性肿瘤细胞或CD20阳性肿瘤细胞,此外,与K562-CD19和K562-CD20细胞孵育后,与T细胞组相比,hCD19-hCD20-CAR-T组的细胞因子释放有显着升高,CD25的表达也有显着增高,说明hCD19-hCD20-CAR-T细胞可以被K562-CD19或K562-CD20细胞特异性激活。hCD19-hCD20-CAR-T细胞对Raji细胞和Nalm-6细胞的体外功能实验结果也显示hCD19-hCD20-CAR-T细胞对Raji细胞和Nalm-6细胞也具有显着的特异性杀伤,而且hCD19-hCD20-CAR-T细胞也可以被Raji或Nalm-6细胞特异性激活。结论:我们成功构建了基于人源化CD19scFv和CD20scFv的hCD19-hCD20-CAR-T细胞,通过一系列体外实验证明了 hCD19-hCD20-CAR-T细胞对CD19阳性肿瘤细胞或CD20阳性肿瘤细胞都具有显着的靶向杀伤作用,因此我们构建的人源化hCD19-hCD20-CAR-T细胞可能可以作为一种靶向治疗B细胞肿瘤的新型治疗手段,或者作为CD19-CAR-T治疗后肿瘤复发的一种补救手段。
袁翔[2]（2014）在《强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM对淋巴瘤BJAB细胞增殖和DNA损伤的作用》文中研究说明背景与目的恶性淋巴瘤是起源于淋巴及网状内皮系统的恶性肿瘤,分为霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma, HL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma, NHL）,其中B型淋巴瘤占主要部分。CD20就是抗体工程药物治疗B系恶性淋巴瘤的一个理想靶点,因为CD20在B系淋巴瘤中表达广泛,并且能快速介导细胞内化。力达霉素（lidamycin, LDM）是烯乙二炔家族的一个新成员,作为一种大分子肽类抗生素,由辅基蛋白（LDP）和发色团（AE）组成,可以拆分和组装,并且具有较强的肿瘤杀伤活性,可作为抗体药物的高效“弹头”。本实验利用基因工程方法,将anti-CD20-Fab片段与力达霉素进行重组,形成强化融合蛋白anti-CD20（Fab）-LDM,靶向治疗B系恶性淋巴瘤。研究强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM体外对CD20表达阳性的淋巴瘤BJAB细胞增殖和DNA损伤的作用。方法流式细胞仪（FACS）检测融合蛋白抗CD20（Fab）-LDP与BJAB细胞的结合活性；激光共聚焦显微镜观察融合蛋白抗CD20（Fab）-LDP靶向结合BJAB细胞；MTT法检测强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM对BJAB细胞的生长抑制作用；单细胞凝胶电泳（single cell gel eletrophoresis, SCGE）检测强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM对DNA的损伤；流式技术检测强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM诱导BJAB细胞的细胞周期的改变。结果融合蛋白抗CD20（Fab）-LDP与BJAB细胞结合活性为阳性；激光共聚焦显微镜下观察,融合蛋白抗CD20（Fab）-LDP靶向结合在BJAB细胞表面；强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM作用于淋巴瘤BJAB细胞后,可以显着抑制BJAB细胞的生长,引起DNA损伤,诱导S期阻滞。结论强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM可以靶向结合淋巴瘤BJAB细胞,并且具有显着的生长抑制作用,其作用机制是引起DNA的损伤。因此,我们认为抗CD20Fab-LDM基因工程抗体提供了一种治疗B细胞淋巴瘤特别是美罗华耐药的B细胞淋巴瘤的新方法。利用DNA重组和分子重建也为制作新型抗肿瘤药物提供了一个很好的技术平台。
张久丁[3]（2010）在《CD20与BCR的相互作用以及抗B淋巴瘤抗体的初步研究》文中研究表明CD20分子是B细胞表面特有的标志物,而且CD20分子表达于绝大多数B淋巴瘤细胞表面,但是在干细胞、祖B细胞、正常的浆细胞或者其它的正常组织细胞中均不表达CD20分子,所以CD20分子是治疗B细胞淋巴瘤的一个重要药物靶点。美罗华是第一个上市的抗CD20单克隆抗体,也是第一个用于B淋巴瘤治疗的抗体。虽然美罗华在治疗各种恶性B淋巴瘤方面取得了巨大的成功,但是CD20的生物学功能仍然不是很清楚。最近有文献报道CD20分子有可能与B细胞受体（BCR）存在相互作用,为此本论文通过构建BCR各组分胞外区与荧光蛋白组成的融合蛋白进行GST沉降实验以及FRET实验确定了CD20分子与BCR发生相互作用的是BCR的胞外区,其组分包括:Ig-β（26-135AA）和sIgM的Cμ2（266-382AA）。同时,本论文利用BCR与CD20分子之间的相互作用构建了三个重链抗体样分子真核表达载体: CD20（140-186AA）-CH1Fc、Ig-α（33-118AA）-CH1Fc和Ig-β（26-135AA）-CH1Fc。其中Ig-α（33-118AA）-CH1Fc通过转染HEK293细胞,表达纯化后已经得到蛋白,另外两种重链抗体样分子的表达纯化工作仍在进行之中。期望三个重链抗体样分子通过胞外区蛋白定位于B淋巴瘤细胞表面,然后利用Fc段诱导的CDC和ADCC效应,以及重链抗体样分子对于BCR或CD20分子的封闭所可能引起的细胞凋亡对于B淋巴瘤细胞进行杀伤。
张冠一[4]（2009）在《抗CD20嵌合抗体的构建、表达和功能研究以及CD20相互作用蛋白的初步研究》文中研究说明非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma, NHL）是一组组织形态和生物学特性各异的淋巴系统恶性肿瘤,是威胁人类生命的十大恶性肿瘤之一,也是发病率增长最快的恶性肿瘤。美罗华（Rituximab）作为一种嵌合抗体彻底改变了非霍奇金淋巴瘤的治疗状况,并且成为了目前最成功的抗肿瘤药物。单独使用Rituximab治疗复发以及难治的NHL缓解率可达50%左右,若与化疗药物联用,在一些NHL亚型中治愈率可达100%,并且副作用很小。2008年美罗华的销售额达到近60亿美元,具有极大的市场价值。美罗华取得成功的原因主要有两点:首先,美罗华是人鼠嵌合抗体,既保留了鼠源可变区的高亲和性,又具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。在降低了人抗鼠抗体（HAMA）反应的发生率的同时,嵌合抗体作为完整抗体分子,在体内半寿期更长,并具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。其次,NHL患者中约85-90%是B细胞淋巴瘤,而CD20是B淋巴细胞和B淋巴瘤细胞表面特有的膜表面蛋白,不表达于造血干细胞、祖细胞、正常浆细胞以及人体其它正常组织[1]。CD20在B细胞表面的表达非常稳定,在与抗CD20抗体结合以后不易脱落与内化[2]。抗体与CD20结合以后,通过诱导细胞凋亡以及ADCC、CDC作用发挥杀伤作用。即便如此在临床应用中,病人还是会产生抗体抵抗。并且人们逐渐开始认识到美罗华的局限性。研制新型的抗CD20抗体成为目前抗肿瘤药物的新热点,并且以提高人源化水平和提高与Fc受体亲和力为目前的主流方法,尤其是人源化程度更高的抗体在临床实验中已经取得了较好的效果。还有研究人员试图从CD20抗原方面入手,解决抗CD20抗体的局限性问题。但是CD20的功能一直都不能确定,甚至连其天然配体都难觅踪影。最初研究人员推测它有可能是一种钙离子通道,因为抗体和CD20结合以后,引起细胞膜内的钙离子流动。目前的研究显示,CD20有自身形成4聚体的趋势,这样推测CD20可能是一种膜表面受体,能起到传导细胞信号的作用[3]。但是其他研究显示了不同的结果:CD20本身并不是传导信号的主体,只是掺入到BCR介导的信号通路中,并抢夺一部分BCR的功能[4]。虽然这些肤浅的了解不足以揭开CD20功能之谜,但是这些研究都表明CD20功能与BCR关系最大。本课题在利用现有条件的基础上,通过定点突变原有抗CD20抗体基因构建合成新的抗CD20嵌合抗体。在寻找比美罗华杀伤效果更好或接近的抗CD20嵌合抗体的同时,以CD20与BCR的作用作为研究CD20功能的一个突破口,寻找到CD20天然的作用蛋白,指导开发出新抗CD20抗体。本课题以抗体功能和寻找抗原相互作用蛋白这两方面入手,寻找构建抗CD20抗体的新方向。该课题使用方法和取得的结果的主要是:1.获得了2种抗体基因,构建了哺乳动物细胞双基因表达载体。通过重叠延伸PCR修改原有抗CD20抗体基因合成新抗CD20抗体轻链和重链可变区。上述序列均测序正确后,将轻链连入pBudCE4.1上游多克隆位点后,再将重链可变区和本室原有的CH1和Fc段序列连入该载体下游多克隆位点。构建完成哺乳动物细胞双基因表达载体。2种抗体分别命名为20R和20S。2.获得了BCR各组分与EGFP融合表达载体。以BCR各组分完整序列为模板,以NCBI上BCR各组分的结构域划分为依据,PCR得出Igα胞外区,Igβ胞外区和IgM重链序列。测序正确后构建与EGFP融合表达载体。其中IgM分成3段构建,包括CH1+CH2, CH2+CH3,CH3+CH4,这些片段与EGFP融合表达载体则分别命名为IgM1, IgM2, IgM3。Igα胞外区和Igβ胞外区与EGFP融合表达载体命名为Igα和Igβ。3.在CHO-K1细胞中表达了抗体蛋白、纯化了表达产物并对其进行了初步鉴定。将构建完成的2种含有抗体基因的双基因表达载体转染至CHO-K1细胞中进行表达并挑取单克隆,以直接ELISA筛选出高表达的细胞株。转瓶扩大培养阳性克隆,以蛋白A亲和层析柱纯化得到目的蛋白,说明其含有人Fc段;BCA法测定纯化后蛋白浓度。SDS-PAGE检测显示,纯化蛋白的相对分子量大小约为150kD,与标准抗体分子大小一致并在凝胶成像系统软件Gel-Pro Analyzer分析纯化蛋白中完整的抗体蛋白含量近70%。结合BCA法测定的蛋白浓度,最后得出20R和20S这2种纯化蛋白中完整抗体的浓度为:120 mg/L和77 mg/L。4.两种方法验证抗体诱导细胞凋亡的能力（1）细胞凋亡试剂盒检测抗体诱导细胞凋亡。以CD20+细胞Raji、Ramous（均为Burkitt淋巴瘤细胞）检测表达抗体诱导CD20+细胞凋亡的能力;以人白血病细胞株HL60检测抗体与CD20-细胞凋亡的诱导能力。抗体蛋白以2μg/ml、5μg/ml、20μg/ml这3个浓度分别作用于Raji、Ramous细胞。最后结果显示这2种抗体均可诱导CD20 +细胞凋亡,并且有较明显的剂量依赖效应。而且对CD20-细胞的生长没有明显影响。说明这2种抗体具有特异诱导CD20+细胞凋亡的能力。（2）流式细胞技术检测抗体诱导的细胞凋亡。实验方法与细胞凋亡试剂盒检测抗体诱导细胞凋亡类似,但是细胞接种量扩大到3×106细胞/ml,并且在抗体作用的24小时后,只用PI单染细胞,并用流式细胞仪检测凋亡细胞的数量。结果显示这2种细胞均可诱导细胞凋亡,并且20R比20S在同等剂量下诱导细胞凋亡的能力高1倍多。5.嵌合抗体诱导的CDC效应的检测美罗华、20R和20S分别以2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml这3个浓度作用于2×106细胞/ml的Raji细胞。并设无抗体作用的阴性对照孔。其中实验组与阴性对照组各设3个副孔。在抗体与细胞孵育15分钟后,加入10%的未灭活的人血清,即引入补体。血清孵育30分钟后加入CCK8。当阴性对照组呈现橘红色后检测OD450nm吸光值。最后结果显示美罗华的杀伤效果最好,20R和20S次之。而且20R的杀伤效果大概为美罗华的66%左右,20S的杀伤效果不好。6.得到了5种表达目的基因与EGFP融合表达的293细胞。利用293细胞具有半贴壁和自动成团的趋势,在加压过程中反复挑选高表达的多克隆细胞团。用Westen Blotting检测表达状况。结果显示得到了表达Igα胞外区-EGFP、Igβ胞外区-EGFP、IgM1-EGFP、IgM2-EGFP、IgM3-EGFP这5种细胞。这些细胞表达的蛋白仍然用其载体的名字命名,分别为Igα、Igβ、IgM1、IgM2和IgM3。7. GST-Pull Down验证CD20相互作用蛋白为Igβ和IgM。将诱饵蛋白CD20-GST结合到GST Bind resin上,分别与Igα、Igβ、IgM1、IgM2、IgM3这5种细胞裂解液作用。离心、清洗数次并去掉上清后,用还原性Loading Buffer在100℃下洗脱resin,最后用Westen Blotting检测。最后结果显示CD20可以与Igβ和IgM的CH2区结合,与Igα和IgM3不结合。本课题合成了2种抗CD20嵌合抗体,对CD20+细胞有一定杀伤作用。其中20R有成为药物应用于临床的潜力。但是这2种抗体与目前应用于临床中最好的抗CD20抗体具有一定差距。说明,修改的一系列位点可能为抗CD20抗体结合CD20的关键部位,或者为Fab’特殊的结构为必需。这样以后若合成抗CD20嵌合抗体可以避开这些区域,并结合一些抗CD20抗体的临床实验,设计合成新的抗CD20嵌合抗体。在寻找CD20相互作用蛋白方面,本课题没有从大量的血液细胞膜表面蛋白中搜寻CD20相互作用蛋白。而是根据目前研究的状况,从BCR方面入手探讨CD20相互作用蛋白。发现了CD20可能与Igβ及IgM的CH2区作用。这样我们推测CD20所引起的细胞内钙离子流,极有可能就是BCR的部分功能。而且接下来可以利用Igβ和IgM的CH2区的序列特征设计新的抗CD20抗体,即用Igβ和IgM的CH2区这些人体内天然存在的蛋白构建抗体。这些抗体可能会达到更好的治疗效果和更小的副作用。本课题可能为抗CD20抗体的研制和CD20功能的继续探讨开辟了一个新的领域。
谷岳[5]（2009）在《抗TNF-α小分子抑制剂的研究及抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表达载体的构建、表达和活性的初步测定》文中进行了进一步梳理肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα,TNF-α）主要是由巨噬细胞分泌的一种多功能细胞因子,一方面它能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发生出血性坏死;另一方面它又是一种较强的内源性炎症介质,过量的TNF-α表达可以引起组织损伤、重症感染性休克、自身免疫性疾病等,可以说TNF-α作为一个调节生理平衡的关键细胞因子,在人类对抗肿瘤及其他疾病中扮演了“双刃剑”的角色。依据TNF-α的双重作用,本实验课题主要分为两个部分,首先完成了一类TNF-α小分子抑制剂的设计、筛选及活性测定,其次对抗CD20Fab-TNFα融合蛋白在B系淋巴瘤中的功能作用进行了初步研究。在过去的30年中,随着对某些炎性疾病如风湿性关节炎、克罗恩氏病、银屑病及强直性脊柱炎在细胞和分子水平上病理机理的阐明,人们发现这些疾病之间有着共同的发生机制。而由TNF-α及其受体所构成的细胞因子信号通路网络在炎性疾病的发生发展过程中起着核心作用。阻断TNF-α活性已成为治疗上述免疫性疾病的主要手段。目前,国际上用于抗TNF-α治疗用药物主要有三种,皆为蛋白类药物,这些生物大分子一方面具有特异性好、结合能力强的特点,但另一方面也存在着稳定性较差,在患者体内易降解并极易产生免疫耐受的缺点。因此,探索新的免疫抑制剂研究策略来研制靶向抗TNF-α的小分子药物,已成为国内当前临床免疫治疗急需解决的难题之一。本文利用计算机辅助药物设计（computer-aided drug design,CADD）,以靶蛋白及其受体的复合晶体结构为模板,从小分子化合物库中虚拟筛选出300-500个抗TNF-α的抑制剂,并购买其中的80个代表性化合物做进一步的生物活性测定。包括初步的抑制TNF-α对L929细胞毒性实验;流式细胞仪法测定筛选的小分子化合物阻断量子点标记的TNF-α结合受体的实验;MTT法进一步分析筛选出的小分子化合物在不同剂量时抑制TNF-α对L929细胞毒性的作用;采用AnnexinV-FITC检测上述小分子对TNF-α诱导的细胞凋亡的抑制作用。活性筛选结果显示有3个小分子化合物对TNF-α有显着抑制活性;对其中较好的一个进行了深入研究,实验结果表明,该化合物能特异性阻断量子点标记的TNF-α与受体的结合,并呈剂量依赖性;该化合物具有较强的抑制TNF-α（1ng/ml）对L929细胞毒性的作用,表现为剂量依赖性,半数抑制浓度（IC50）为10umol/L;该化合物能抑制TNF-α诱导的L929细胞凋亡,并呈剂量依赖性。实验证明,利用以上计算机虚拟筛选并结合人工筛选及生物学活性检测的方法能够发现针对特定靶点的小分子抑制剂。尽管TNF-α在自身免疫性疾病中起到核心作用,但人们最初认识它却是作为一个能够诱导肿瘤细胞发生坏死的细胞因子。体外实验表明,TNF-α具有很强的抗增殖功能和细胞毒性。因此,在上个世纪80年代就被应用于恶性肿瘤的临床治疗当中。但全身系统性使用TNF-α治疗会产生一些严重的不良反应,限制了其应用。到目前为止,直接利用TNF-α杀灭肿瘤的治疗方法进展缓慢,仅局限于在隔离肢体灌注疗法中治疗黑色素瘤、骨肉瘤等。利用抗体的靶向作用将药物运输到目标部位已成为当前靶向治疗的主要手段和方法。已有研究表明,用单克隆抗体将TNF-α运送到肿瘤组织血管部位,使其在该部位浓集,可以达到破坏肿瘤新生血管从而杀灭肿瘤的目的。CD20是B淋巴细胞上的跨膜蛋白质分子,主要参与调节B淋巴细胞的增殖与分化,在免疫系统中起重要作用。其在B细胞中特有的表达方式、生物学作用和存在形式决定了其成为治疗B淋巴细胞瘤的主要靶点。研究表明,抗CD20的抗体可直接抑制B淋巴瘤细胞生长并诱导其凋亡的发生,该凋亡的发生与钙离子相关,并且CD20分子的二聚化和多聚化能够有效增强其诱导凋亡的能力。本实验在我室原有抗CD20Fab表达载体的基础上,成功构建了抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表达载体并表达出可溶性蛋白,之后又对其活性进行了初步的研究探讨。证明了CD20Fab部分具有与Raji细胞表面CD20分子的结合能力,并验证了融合蛋白TNF-α部分的细胞毒活性。本实验的创新性在于期望利用CD20抗体的靶向作用将TNF-α用送到肿瘤部位以增强其诱导凋亡的作用,并且利用TNF-α在可溶状态下的自身三聚化可以使与之偶联的抗CD20Fab三聚化,从而达到B淋巴细胞表面CD20分子三聚化的目的。
王晶[6]（2008）在《重组人源化单克隆抗体SM09临床前药代动力学和主要药效学研究》文中指出重组人源化单克隆抗体SM09为作用于CD20抗原的单克隆抗体,拟申报治疗用生物制品注册分类2类新药。本文的工作旨在对其主要药效学及临床前动物的药代动力学过程做整体评价,为临床研究提供依据。重组人源化单克隆抗体SM09亲和力的测定通过蛋白定量实验将重组人源化单克隆抗体SM09（简称SM09）和商品化靶向CD20单抗美罗华（利妥昔单抗,Rituximab）的蛋白含量进行归一,并用SPR技术测定重组人源化单克隆抗体SM09的解离常数Kd为3.65×10-9M,亲合常数Ka为0.27×109 M-1,说明SM09与CD20抗原的结合能力较强。SM09的解离常数与美罗华的解离常数9.55×10-9M相近,为同一数量级。重组人源化单克隆抗体SM09体外药效学研究应用流式细胞仪检测SM09-FITC标记人源非何杰金氏淋巴瘤（NHL）建株的传代细胞株Raji、Ramos和Daudi细胞（Burkitt’s淋巴瘤细胞）,比较表面表达CD20抗原量及CD20阳性细胞百分比。Raji、Ramos和Daudi细胞98%以上为CD20阳性,CD20抗原量表达量从高到低依次为Raii、Daudi、Ramos。基于一系列的细胞实验,考察了SM09对Burkitt’s细胞Raji、Ramos和Daudi细胞的直接生长抑制作用、补体依赖的细胞毒效应（CDC）、诱导凋亡作及抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）。实验证明SM09对Raji、Ramos和Daudi细胞具有以上几种作用。重组人源化单克隆抗体SM09体内药效学研究猕猴单次静脉滴注30mg·kg-1SM09,考察CD20+细胞、T细胞、单核＼巨噬细胞的变化,及滴注后全血红细胞、白细胞和蛋白含量的变化。实验结果表明给药后1小时CD20+细胞迅速减少,并持续保持在较低水平,T细胞、单核＼巨噬细胞没有明显变化,血细胞计数仪检测结果表明滴注后全血红细胞、白细胞和蛋白含量均没有明显变化。生物样品中重组人源化单克隆抗体SM09分析方法的建立用氯胺T方法标记重组人源化单克隆抗体SM09,标记后的125I-SM09经分离纯化,其放化纯度为96.0±0.3%,标记后SM09与高度表达CD20抗原的Raji细胞有高度亲和力并且可以被非标记SM09竞争下来。使用SHPLC和TCA沉淀两种方法测定生物样品中的125I-SM09,经过确证,两种方法的特异性、灵敏度、精密度和回收率均可以满足临床前药代动力学的测定需求。重组人源化单克隆抗体SM09在猕猴体内的药代动力学研究单次给药:猕猴单次静脉滴注不同剂量125I-SM09(100mg·kg-1、30mg·kg-1、10mg·kg-1)后,药代动力学过程符合二房室模型,在所用剂量范围内SM09在猕猴体内呈线性消除。测定总放射性、TCA沉淀放射性和SHPLC放射性三种检测方法的可比性较好。多次给药:猕猴静脉滴注125I-SM09 30mg·kg-1/周×4周,体内药动学符合二房室模型。以总放射性、TCA沉淀放射性和SHPLC放射性三种方法得到的药时曲线下面积AUC0-t,半衰期t1/2β和血浆清除率CL,第4次给药后和第1次给药后相比没有显着性增高,提示连续用药没有药物蓄积,也没有导致药酶的诱导或抑制。第1次给药和第4次给药的血药浓度波动百分数（FI）和波动度（DF）以总放射性、TCA酸沉放射性和SHPLC方法计算均没有显着性变化。重组人源化单克隆抗体SM09在猕猴体内组织分布和排泄组织分布:静脉滴注125I-SM09（10 mg·kg-1）后放射性蛋白主要分布在血清、胃内容、肝,脾和颈部淋巴结也有较高的浓度,说明该药物有一定的靶向性。泌尿系统的放射性较高,提示主要经肾脏排泄。脑、脊髓和肌肉的浓度最低。SHPLC分析猕猴给药后的血清放射性色谱图表明主要是保留时间在8.0 min的原形125I-SM09峰,在其后没有出现明显的125I-标记降解小分子和大分子结合125I-标记峰。排泄:静脉滴注125I-SM09后放射性主要从尿中排泄,少量从粪中排泄,70%的放射性在给药后72小时内已经排泄,72小时以后至31天的排泄较缓慢,168小时的排泄达到90%以上。血浆蛋白结合:空白猕猴血浆体外加入125I-SM09,在室温平衡6h以上进行SHPLC分析,未见与血浆蛋白结合与降解。
耿树生[7]（2007）在《抗CD20抗体的改造及其生物活性研究》文中研究表明CD20是人B淋巴细胞表面特有的标志,它表达在正常人B淋巴细胞表面,但在多数恶性B淋巴细胞表面也呈高表达,因此它是治疗B细胞型非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin’s lymphoma, NHL）的理想靶抗原。基于本项目组前期研究获得CD20嵌合抗体TGLA （IgG1κ）的基础上,本论文通过特异性靶向结合、亲和力分析、B淋巴瘤细胞的体外杀伤效应和荷瘤动物的体内抑瘤等实验,评价了TGLA嵌合抗体的生物学活性；此外,本论文还利用计算机生物信息学的抗原抗体立体结构模建分析系统,对一株具有生物学活性的抗CD20鼠源抗体1-28（IgM）,进行了人源化改造,分别构建了两种融合蛋白形式的嵌合抗体（IgG型）,并分析比较了人q1区对于改造后的工程抗体生物活性的影响。1.抗CD20嵌合抗体TGLA的体内、外生物活性研究免疫共沉淀的结果证实：抗CD20嵌合抗体TGLA可特异性的沉淀出CD20蛋白；并且间接荧光分析的结果进一步表明TGLA可与CD20+细胞系特异性结合。补体依赖的细胞毒性作用（complement-dependent cytotoxicity, CDC）和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）分析证明：TGLA能够特异性地杀伤恶性B淋巴细胞；应用TGLA治疗荷瘤裸鼠,平均存活期延长了1.7倍。2.抗CD20抗体1-28的结构模拟、改造及结合活性检测在计算机模拟基础上,把鼠源抗CD20抗体1-28（IgM）的轻、重链可变区基因和人IgG1的Fc或完全的重链恒定区融合,分别构建了两种工程抗体LH23（VL-Linker-VH-Hγ-Cγ2-Cγ3）和LH1-3 （VL-linker-VH-Cγ1-Hγ-Cγ2-Cγ3）。把构建的表达载体瞬时转染293T细胞后,通过western blot证实两种工程抗体均可被抗人IgG抗体所识别；FACS分析证实两种工程抗体都可与CD20+细胞系特异性结合,其中LH1-3与CD20+细胞系Daudi、Raji细胞结合活性明显高于LH23,与同源模建、分子力学方法预测的结果一致。这些实验结果充分说明人q1区的刚性结构对于由IgM型改造成的IgG型抗体是十分关键的。
石姝[8]（2007）在《抗CD20四价基因工程抗体的构建及抗肿瘤作用研究》文中研究指明Rituximab（C2B8单抗）是美国FDA批准上市的第一个治疗非霍奇金氏淋巴瘤的基因工程抗体，尽管该药在临床治疗中显示出良好的疗效，但仍有48％的患者对该抗体治疗无理想反应，其重要原因是C288与CD20抗原的亲和力较低，因此不能有效杀伤低表达CD20分子的B淋巴瘤细胞。在本研究中，我们设计、构建并表达了2种新型四价结构的C2B8基因工程抗体，由于该抗体具有较低的解离速率（off-rate），因而能够在体外杀伤低表达CD20分子的B淋巴瘤细胞，具有较C2B8更强的抗肿瘤作用。本课题通过竞争抑制实验、补体介导的细胞毒实验（CDC）、抗体依赖细胞介导的细胞杀伤实验（ADCC）以及凋亡实验对四价抗体和C2B8抗体的体外生物学功能进行比较分析，同时还探讨了抗体与Clq、Fc受体的结合、抗体在CD20+细胞上的解离率、CD20+细胞在体外人全血环境中的清除情况以及抗体在动物体内的半衰期(T1／2)。研究结果显示，在体内具有稳定结构的四价抗体因为解离率明显降低而产生了显着强于C2B8的CDC作用，从而能够杀伤低表达CD20分子的肿瘤细胞。通过体外全血中清除低表达CD20肿瘤细胞的实验，进一步证实四价C2B8抗体可通过CDC和ADCC机制发挥作用。本研究可能为低表达CD20B淋巴瘤的治疗提供新型抗体药物。
杨铭,范冬梅,刘银星,熊冬生,许元富,邵晓枫,杨纯正[9]（2005）在《抗CD20嵌合抗体突变型Fab′片断诱导凋亡过程中活性氧Caspase-3的变化》文中指出目的研究抗CD20嵌合抗体突变型Fab′片断诱导Raji细胞凋亡过程中活性氧（ROS）,Caspase3的变化。方法利用MTT法测定突变型Fab′片断抑制细胞生长,形态学方法观察凋亡细胞的变化,用流式细胞仪检测DCFHDA荧光探针标记细胞内ROS的变化,以及用酶标仪和Westernblot检测细胞内Caspase3的变化。结果MTT法测定突变型Fab′片断对Raji细胞的生长具有抑制作用,其抑制作用呈明显的剂量依赖性,荧光显微镜下观察细胞出现凋亡,流式细胞仪,酶标仪以及Westernblot检测细胞内ROS,Caspase3的表达增高,并与作用时间,剂量呈依赖关系。结论ROS,Caspase3表达的增高,在抗CD20嵌合抗体突变型Fab′片断诱导Raji细胞凋亡的过程中起到重要作用。
王玉刚[10]（2005）在《基于计算机辅助分子设计的抗CD20单克隆抗体的改造》文中进行了进一步梳理鼠源单克隆抗体在临床应用中有以下缺点:诱发人体产生人抗小鼠抗体（human anti-mounse antibody,HAMA）反应,在人体内半寿期短,不能够有效地激活人体的生物效应功能,如补体依赖的细胞毒作用（complement-dependent cytotoxicity,CDC）及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）。通过分子生物学技术对鼠抗体进行人源化改造在一定程度上可以克服这些缺点。本室制备的鼠源抗CD20单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）1-28具有潜在的应用价值。本研究在对mAb 1-28（简称1-28）功能进行验证的基础上,通过计算机辅助分子设计和分子生物学技术对其进行改造,构建了抗CD20嵌合抗体C1-28和新型小分子抗CD20抗体5S（ScFv-Fc）,并对其抗原结合特性及通过CDC杀伤肿瘤细胞的功能进行了初步研究。 1 抗CD20单克隆抗体1-28的免疫学特性及功能分析 首先分析了1-28与靶细胞的结合活性。间接免疫荧光的结果显示,1-28可与人B细胞淋巴瘤Daudi细胞和Raji细胞结合,而不与人T细胞系Jurkat细胞结合,表明1-28与靶细胞的结合是特异的。流式细胞术分析结果显示,1-28与Daudi和Raji细胞结合的阳性率达99%以上。相对亲和力（relative binding affinity）测试结果显示,1-28的亲和力为美罗华亲和力的1/12左右。通过ELISA法测定出1-28的亲和常数为K=1.6×1010 M-1。竞争实验的结果提示1-28与另外两种抗CD20抗体（美罗华、2H7）识别的是不同的抗原表位。1-28对Raji细胞和Daudi细胞都具有生长抑制效应,但是程度不同。另外,1-28可以诱导Raji细胞和Daudi细胞发生凋亡。1-28还可通过激活补体杀伤靶细胞。以Raji细胞为研究对象时,其半数杀伤浓度为1.26 nmol/L。1-28对非靶细胞Jurkat没有CDC的功能,提示这种杀伤是特异的。
二、抗CD20嵌合Fab′片段对B淋巴瘤细胞的生长抑制作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗CD20嵌合Fab′片段对B淋巴瘤细胞的生长抑制作用（论文提纲范文）
（1）CD7-CAR-NK-92MI细胞靶向治疗T细胞肿瘤及双特异CAR-T细胞靶向治疗B细胞肿瘤（论文提纲范文）
| 中文摘要1 |
| Abstract1 |
| 中文摘要2 |
| Abstract2 |
| 第一部分: 一种新型CD7嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞靶向治疗T细胞急性淋巴细胞白血病 |
| 引言 |
| 一、材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞,质粒及宿主菌 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 相关试剂及常用缓冲液配置 |
| 二、方法 |
| 2.1 CD7-CAR载体构建 |
| 2.2 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞的构建 |
| 2.3 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞的流式分析 |
| 2.4 蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)分析 |
| 2.5 细胞表面CD7分子的表达检测 |
| 2.6 细胞毒性实验 |
| 2.7 CAR-NK-92MI/dCD7-CAR-MK-92MI单克隆细胞的筛选 |
| 2.8 单价CD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞的体外功能比较 |
| 2.9 二价dCD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞的体外功能比较 |
| 2.10 mdCD7-CAR-NK-92MI细胞对T-ALL原代肿瘤细胞的细胞毒性 |
| 2.11 动物实验 |
| 2.12 统计分析 |
| 三、结果 |
| 3.1 CD7-CAR和dCD7-CAR重组质粒的构建 |
| 3.2 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-CAR-NK-92MI细胞的构建 |
| 3.3 肿瘤细胞表面CD7抗原检测 |
| 3.4 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞对T-ALL肿瘤细胞系的细胞毒性 |
| 3.5 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞对T-ALL原代肿瘤细胞的细胞毒性 |
| 3.6 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞的体外功能比较 |
| 3.7 mdCD7-CAR-NK-92MI细胞对原代T-ALL肿瘤细胞的细胞毒性 |
| 3.8 mdCD7-CAR-NK-92MI细胞对原代T-ALL肿瘤细胞的体内抗肿瘤作用 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 第二部分: 一种新型双特异嵌合抗原受体修饰的T细胞靶向治疗B细胞肿瘤 |
| 引言 |
| 一、材料 |
| 1.1 细胞,质粒及宿主菌 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 相关试剂及常用缓冲液配置 |
| 二、方法 |
| 2.1 CD19抗体重链和轻链可变区的人源化改造 |
| 2.2 CD20抗体重链和轻链可变区的人源化改造 |
| 2.3 载体构建 |
| 2.4 CAR慢病毒制备 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 流式检测 |
| 2.7 细胞毒性 |
| 2.8 细胞因子检测 |
| 2.9 细胞活化相关分子的检测 |
| 2.10 与CAR-T细胞孵育后肿瘤细胞表面抗原表达情况的检测 |
| 2.11 统计分析 |
| 三、结果 |
| 3.1 CD19鼠源抗体的人源化改造 |
| 3.2 CD20鼠源抗体的人源化改造 |
| 3.3 CAR质粒构建 |
| 3.4 CAR-T细胞及CAR-Jurkat细胞的构建 |
| 3.5 肿瘤细胞抗原检测结果 |
| 3.6 hCD19-hCD20-CAR-Jurkat细胞与靶细胞孵育后CD69的表达 |
| 3.7 hCD19-hCD20-CAR-T对抗原过表达K562细胞的体外功能研究 |
| 3.8 hCD19-hCD20-CAR-T对B细胞肿瘤细胞系的体外功能研究 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 综述 NK细胞及NK-92细胞系在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 中英文主要缩略词表 |
| 致谢 |
（2）强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM对淋巴瘤BJAB细胞增殖和DNA损伤的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 恩镰孢菌素的研究进展一来源、特性及生物活性 |
| 参考文献 |
| FOXO转录因子 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 附录三 |
| 致谢 |
（3）CD20与BCR的相互作用以及抗B淋巴瘤抗体的初步研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 CD20 与B 细胞受体（BCR）的研究背景 |
| 1.1.1 CD20 简介 |
| 1.1.2 BCR 简介 |
| 1.1.3 CD20 与BCR 的联系 |
| 1.2 抗B 细胞淋巴瘤抗体 |
| 1.2.1 单克隆抗体简介 |
| 1.2.2 抗B 淋巴瘤单抗简介 |
| 1.3 实验技术与方法 |
| 1.3.1 荧光共振能量转移（FRET） |
| 1.3.2 重链抗体 |
| 1.4 本论文的研究目的及设计 |
| 第2章 实验相关基因表达载体的的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验用载体与菌株 |
| 2.1.4 培养基和溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建CD20 和BCR 各部分与EGFP 的融合蛋白表达载体 |
| 2.2.2 构建FRET 实验相关载体 |
| 2.2.3 构建原核表达载体GST-Cμ2（266-382AA） |
| 2.2.4 构建重链抗体样分子 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 CD20 和BCR 各部分与EGFP 融合蛋白表达载体的构建 |
| 2.3.2 FRET 实验相关质粒的构建 |
| 2.3.3 原核表达载体GST-Cμ2（266-382AA）的构建 |
| 2.3.4 重链抗体样分子的构建 |
| 第3章 CD20 分子与BCR 的相互作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验试剂及耗材 |
| 3.1.3 实验用细胞株 |
| 3.1.4 培养基和溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HEK293 细胞相关实验 |
| 3.2.2 SDS-PAGE 及Western blotting |
| 3.2.3 GST 沉降实验（GST pull down assay） |
| 3.2.4 FRET 实验 |
| 3.2.5 原核细胞表达纯化GST-Cμ2（266-382AA）融合蛋白 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 GST 沉降实验检测CD20 分子的相互作用蛋白 |
| 3.3.2 FRET 实验验证 CD20(140-186AA) 与Cμ2Cμ3(266-472AA)的相互作用 |
| 3.3.3 Cμ2(266-382AA)与CD20(140-186AA)的相互作用 |
| 第4章 重链抗体样分子的表达及纯化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验仪器 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 ELISA 法测定重链抗体样分子表达水平 |
| 4.2.2 ProteinA 柱亲和层析纯化重链抗体样分子 |
| 4.2.3 Folin-酚法测定蛋白浓度 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 三个重链抗体样分子的转染及稳定表达 |
| 4.3.2 重链抗体样分子细胞表达水平的鉴定 |
| 4.3.3 重链抗体样分子的纯化及浓度测定 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
（4）抗CD20嵌合抗体的构建、表达和功能研究以及CD20相互作用蛋白的初步研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 基因表达载体的构建 |
| 材料与方法 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 蛋白的表达、纯化和鉴定 |
| 材料与方法 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 蛋白的体外实验 |
| 材料与方法 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）抗TNF-α小分子抑制剂的研究及抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表达载体的构建、表达和活性的初步测定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 肿瘤坏死因子-α小分子抑制剂的设计、筛选及活性测定 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验部分 |
| 1.3 结论 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表达载体的构建、蛋白表达及活性的初步测定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.3 结论 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录一 溶液配制 |
| 附录二 常见英文缩写 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表文章 |
| 申请专利 |
（6）重组人源化单克隆抗体SM09临床前药代动力学和主要药效学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写 |
| 前言 |
| 第一部分 重组人源化单克隆抗体SM09主要药效学研究 |
| 第一章 重组人源化单克隆抗体SM09亲和力的测定 |
| 1.重组人源化单克隆抗体SM09与美罗华的蛋白含量归一实验 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 小结 |
| 2.BIAcore3000测定重组人CD20抗原与重组人源化单克隆抗体SM09亲和常数实验 |
| 2.1 实验原理 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 小结 |
| 第二章 重组人源化单克隆抗体SM09体外药效学研究 |
| 1.Burkitt's淋巴瘤细胞表面CD20抗原的表达 |
| 1.1 实验原理 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法和步骤 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 小结 |
| 2.重组人源化单克隆抗体SM09对Burkitt's细胞的生长抑制作用 |
| 2.1 实验原理 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 小结 |
| 3.重组人源化单克隆抗体SM09对Burkitt's细胞的CDC作用 |
| 3.1 实验原理 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法和步骤 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 小结 |
| 4.重组人源化单克隆抗体SM09诱导Burkitt's细胞凋亡作用 |
| 4.1 实验原理 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验步骤 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 小结 |
| 5.重组人源化单克隆抗体SM09对Burkitt's细胞介导的ADCC效应 |
| 5.1 实验原理 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法和步骤 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 小结 |
| 第三章 猕猴单次静脉滴注30mg·kg-1重组人源化单克隆抗体SM09后对外周血白细胞的作用和对全血细胞的作用 |
| 1.实验原理 |
| 2.实验材料 |
| 2.1 药品和仪器 |
| 2.2 动物 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 实验设计 |
| 3.2 流式细胞仪检测 |
| 3.3 血细胞测定 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 猕猴单次静脉滴注30mg·kg-1重组人源化单克隆抗体SM09后对外周血白细胞的作用结果 |
| 4.2 猕猴单次静脉滴注30mg·kg-1重组人源化单克隆抗体SM09后对全血细胞的作用 |
| 5.小结 |
| 第二部分 重组人源化单克隆抗体SM09非临床药代动力学研究 |
| 第一章 重组人源化单克隆抗体SM09的125I标记、放化纯度鉴定和生物活性检定 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 放射性标记 |
| 2.2 标记反应物的分离纯化 |
| 2.3 放化纯度鉴定 |
| 2.4 蛋白含量测定 |
| 2.5 生物活性检定 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 标记反应物分离纯化放射性、蛋白洗脱图谱 |
| 3.2 125I-SM09的放化纯度 |
| 3.3 标记后生物活性的检定 |
| 4.结论 |
| 第二章 SHPLC和TCA酸沉方法测定猕猴生物样品中125I-SM09含量的方法学确证 |
| 1.SHPLC法测定猕猴血清125I-SM09浓度的方法学确证 |
| 1.1 实验原理 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 灵敏度和线性 |
| 1.3.2 准确度和精密度 |
| 1.3.3 回收率 |
| 1.3.4 稳定性 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 灵敏度和线性 |
| 1.4.2 准确度和精密度 |
| 1.4.3 回收率 |
| 1.4.4 稳定性 |
| 1.4.5 特异性 |
| 1.5 结论 |
| 2.三氯醋酸(TCA)沉淀测定生物样品中125I-SM09含量的方法学确证 |
| 2.1 原理 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 灵敏度及可靠定量低限(LLOQ) |
| 2.4.2 线性 |
| 2.4.3 精密度和回收率 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 猕猴单次和多次静脉滴注125I-SM09的药代动力学研究 |
| 1.实验目的 |
| 2.实验材料 |
| 2.1 药品及试剂 |
| 2.2 动物 |
| 2.3 实验仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 实验设计 |
| 3.2 血清药物浓度测定 |
| 3.3 统计及数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 猕猴血清中125I-SM09浓度的测定 |
| 4.2.猕猴单次静脉滴注不同剂量125I-SM09后血清药物浓度时间变化 |
| 4.2.1 总放射性法测定血药浓度 |
| 4.2.2 TCA酸沉法测定血药浓度 |
| 4.2.3 SHPLC法测定血药浓度 |
| 4.3 猕猴多次静脉滴注中剂量125I-SM09后血清药物浓度时间变化 |
| 4.4 猕猴单次静脉滴注不同剂量125I-SM09后药代动力学参数 |
| 4.4.1 总放射性法 |
| 4.4.2 TCA酸沉法 |
| 4.4.3 SHPLC法 |
| 4.5 猕猴中剂量30mg/kg多次静脉滴注125I-SM09后药代动力学参数 |
| 5.猕猴单次和多次静脉滴注125I-SM09的药代动力学评价 |
| 5.1 猕猴单次静脉滴注不同剂量125I-SM09后的药代动力学评价 |
| 5.2 猕猴中剂量30mg/kg多次静脉滴注125I-SM09后药代动力学评价 |
| 第四章 125I标记SM09在猕猴体内的分布、排泄和血浆蛋白的结合研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 组织分布实验 |
| 2.2 粪尿排泄实验 |
| 2.3 体外蛋白结合实验 |
| 2.4 统计及数据处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1.三氯醋酸(TCA)沉淀测定生物样品125I-SM09含量的方法学确证 |
| 3.2 猕猴静脉滴注125I-SM09后不同时间各组织放射性分布 |
| 3.2.1 猕猴静脉滴注125I-SM09后不同时间各组织总放射性分布 |
| 3.2.2 猕猴静脉滴注125I-SM09后不同时间各组织TCA酸沉放射性分布 |
| 3.3 猕猴静脉滴注125I-SM09(100mg·kg-1)后放射性从粪尿中的排泄 |
| 3.4 125I-SM09与血浆蛋白的结合研究 |
| 4.小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（7）抗CD20抗体的改造及其生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写及中英文对照 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 单克隆抗体简介 |
| 1.1.1 鼠源性单克隆抗体 |
| 1.1.2 嵌合抗体 |
| 1.2 CD20靶抗原 |
| 1.2.1 CD20靶抗原的特征 |
| 1.2.2 CD20分子的限制性表达 |
| 1.2.3 CD20分子的生理功能 |
| 1.3 CD20抗体的临床研究 |
| 1.3.1 Rituximab |
| 1.3.2 Zevalin |
| 1.3.3 Bexxar |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第2章 抗CD20嵌合抗体TGLA体内、外生物活性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 细胞培养液 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.2.4 试剂 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 体外实验 |
| 2.3.1.1 RT-PCR |
| 2.3.1.2 双夹心ELISA法检测蛋白含量 |
| 2.3.1.3 Western blot分析抗体的分子量 |
| 2.3.1.4 免疫沉淀 |
| 2.3.1.5 TGLA抗体与细胞结合实验 |
| 2.3.1.6 异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体 |
| 2.3.1.7 抗体竞争性抑制实验 |
| 2.3.1.8 抗原抗体复合物在细胞表面稳定性实验 |
| 2.3.1.9 亲和常数的测定 |
| 2.3.1.10 TGLA抗体对细胞生长的抑制作用 |
| 2.3.1.11 TGLA抗体诱导B细胞凋亡的检测 |
| 2.3.1.12 补体依赖的细胞毒性作用(CDC) |
| 2.3.1.13 人外周血中效应细胞的分离 |
| 2.3.1.14 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC) |
| 2.3.2 动物实验 |
| 2.3.2.1 TGLA抗体异常毒性实验 |
| 2.3.2.2 荷瘤裸鼠模型的建立 |
| 2.3.2.3 移植瘤细胞表面标记检测 |
| 2.3.2.4 TGLA抗体抑制肿瘤疗效观察 |
| 2.3.2.5 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 体外实验 |
| 2.4.1.1 RT-PCR分析 |
| 2.4.1.2 嵌合抗体分子量大小分析 |
| 2.4.1.3 TGLA识别抗原的分子量 |
| 2.4.1.4 TGLA与CD20~+细胞的特异性结合 |
| 2.4.1.5 TGLA的亲和常数 |
| 2.4.1.6 美罗华对TGLA-FITC单抗的竞争抑制作用 |
| 2.4.1.7 抗原抗体复合物在细胞表面稳定性分析 |
| 2.4.1.8 嵌合抗体TGLA对Daudi和Raji细胞的生长抑制作用 |
| 2.4.1.9 FACS分析TGLA诱导Daudi和Raji细胞的凋亡 |
| 2.4.1.10 TGLA对Daudi和Raji细胞的CDC作用 |
| 2.4.1.11 TGLA对Daudi细胞的ADCC作用 |
| 2.4.2 动物实验 |
| 2.4.2.1 抗体异常毒性实验 |
| 2.4.2.2 人B-淋巴细胞荷瘤裸鼠模型的建立 |
| 2.4.2.3 TGLA抗体抑制肿瘤疗效 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 抗CD20抗体1-28的结构模拟、改造及结合活检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 细胞系 |
| 3.2.2 细胞培养液 |
| 3.2.3 菌株 |
| 3.2.4 试剂 |
| 3.2.5 仪器 |
| 3.2.6 引物合成及序列测定 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 抗体结构模拟 |
| 3.3.2 LH23载体构建 |
| 3.3.3 LH1-3载体构建 |
| 3.3.4 电转细菌感受态的制备 |
| 3.3.5 电转化 |
| 3.3.6 转染 |
| 3.3.7 双夹心ELISA法检测蛋白含量 |
| 3.3.8 Western blot分析抗体的分子量 |
| 3.3.9 间接免疫荧光分析 |
| 3.3.10 补体依赖的细胞毒性作用 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 利用同源模建、分子力学方法构建抗CD20抗体scFv空间构象 |
| 3.4.2 表达载体的构建 |
| 3.4.2.1 LH23表达载体构建和鉴定 |
| 3.4.2.2 LH1-3表达载体构建和鉴定 |
| 3.4.3 ELISA定量目的蛋白 |
| 3.4.4 工程抗体的分子量 |
| 3.4.5 间接免疫荧光分析工程抗体的特异性结合 |
| 3.4.6 CDC作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 博士学位期间发表论文 |
| 博士期间参加的会议 |
| 专利申请 |
（8）抗CD20四价基因工程抗体的构建及抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 抗CD20四价基因工程抗体序列的克隆及相关载体的构建 |
| 实验一 抗CD20四价基因工程抗体基因序列的克隆 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 实验二 抗CD20四价基因工程抗体真核表达载体的构建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 抗CD20四价基因工程抗体的CHO细胞表达及纯化 |
| 实验一 CHO细胞克隆的筛选及抗CD20四价基因工程抗体的生物活性检测 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 实验二 抗CD20四价基因工程抗体纯化方法的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 抗CD20四价基因工程抗体的体外生物学功能研究 |
| 实验一 抗CD20四价基因工程抗体体外结合活性及竞争活性的鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 实验二 抗CD20四价基因工程抗体补体介导细胞溶解作用及解离率的检测 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 实验三 抗CD20四价基因工程抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒作用及促凋亡作用的检测 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 实验四 抗CD20四价基因工程抗体体外人全血环境中对CD20阳性细胞的清除作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 抗CD20四价基因工程抗体的动物体内药代动力学研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文小结 |
| 综述 基因工程抗体的研究进展 |
| 致谢 |
（10）基于计算机辅助分子设计的抗CD20单克隆抗体的改造（论文提纲范文）
| 英文缩写及中英文对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 抗CD20单克隆抗体1-28的功能鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 嵌合抗体C1-28和C2H7的构建、表达及功能检测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 新型小分子抗体5S的设计、构建及免疫学功能检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1 文献综述 |
| 附录2 博士期间发表及待发表的文章目录 |
四、抗CD20嵌合Fab′片段对B淋巴瘤细胞的生长抑制作用（论文参考文献）
- [1]CD7-CAR-NK-92MI细胞靶向治疗T细胞肿瘤及双特异CAR-T细胞靶向治疗B细胞肿瘤[D]. 游凤涛. 苏州大学, 2019(04)
- [2]强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM对淋巴瘤BJAB细胞增殖和DNA损伤的作用[D]. 袁翔. 北京协和医学院, 2014(01)
- [3]CD20与BCR的相互作用以及抗B淋巴瘤抗体的初步研究[D]. 张久丁. 吉林大学, 2010(09)
- [4]抗CD20嵌合抗体的构建、表达和功能研究以及CD20相互作用蛋白的初步研究[D]. 张冠一. 中国人民解放军军事医学科学院, 2009(10)
- [5]抗TNF-α小分子抑制剂的研究及抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表达载体的构建、表达和活性的初步测定[D]. 谷岳. 中国协和医科大学, 2009(07)
- [6]重组人源化单克隆抗体SM09临床前药代动力学和主要药效学研究[D]. 王晶. 沈阳药科大学, 2008(08)
- [7]抗CD20抗体的改造及其生物活性研究[D]. 耿树生. 河北大学, 2007(04)
- [8]抗CD20四价基因工程抗体的构建及抗肿瘤作用研究[D]. 石姝. 第二军医大学, 2007(03)
- [9]抗CD20嵌合抗体突变型Fab′片断诱导凋亡过程中活性氧Caspase-3的变化[J]. 杨铭,范冬梅,刘银星,熊冬生,许元富,邵晓枫,杨纯正. 肿瘤防治研究, 2005(11)
- [10]基于计算机辅助分子设计的抗CD20单克隆抗体的改造[D]. 王玉刚. 中国人民解放军军事医学科学院, 2005(07)