一、大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶编码基因的分子克隆及其在大肠杆菌中的高效表达（论文文献综述）
万晓余,郑雄,吴淑华,侯云德[1]（1996）在《大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶编码基因的分子克隆及其在大肠杆菌中的高效表达》文中提出利用聚合酶链反应（PCR）技术从大肠杆菌染色体DNA中克隆了大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶约0.8kb的编码基因,序列测定表明其序列与已发表资料一致,将此0.8kb的甲硫氨酸氨肽酶的编码基因克隆到原核高效表达载体pBV220上,转化大肠杆菌后进行表达,SDS-PAGE表明表达产物分子量为32 000,表达量约占菌体蛋白的20%左右,活性测定表明其活性中达20U/ml菌液。
高新星[2]（2014）在《枯草芽孢杆菌氨肽酶分泌表达、分子改造及生理功能研究》文中研究指明氨肽酶（Aminopeptidases，简称APs，EC3.4.11）是一类能从蛋白质和多肽N端选择性切除氨基酸残基的外切蛋白酶，在食品、医药、化工行业有着广阔的市场前景。目前商品化的氨肽酶主要是利用野生菌种进行生产，由于野生菌产酶能力较低，氨肽酶的价格相对较贵。此外，氨肽酶在实际应用过程中的水解效果主要受到自身底物特异性和稳定性的影响。因此，利用基因工程手段实现氨肽酶的高效分泌表达和底物特异性、稳定性的改造能有效降低氨肽酶的生产成本，增强氨肽酶的应用效果，这对于提高氨肽酶的产品竞争力有着重要意义。本课题组从腐乳中筛选到的一株野生菌株Bacillus subtilis Zj016，其所产胞外氨肽酶（BSAP）具有较好的应用潜力。本论文从野生菌中克隆出目的基因并在B. subtilis表达系统中实现了高效分泌表达，随后对重组BSAP的酶学性质、底物特异性改造、稳定性改造以及生理功能进行了详细的研究，主要内容如下：（1）BSAP基因克隆及分泌表达的研究。BSAP编码基因长度为1368bp，目的蛋白由455个aa组成，N端含有一个31个aa长度的信号肽。BSAP与来源于B. subtilis168的ywaD基因编码的蛋白具有高度同源性，仅有四个氨基酸不同。比较目的基因在E. coli和B. subtilis蛋白表达系统的表达水平，结果显示在E. coli中BSAP未能利用自身信号肽分泌至胞外且酶活较低，而在重组菌B. subtilis （PMA-BSAP）中BSAP利用自身信号肽实现了分泌表达，胞外酶活达到52.4±2.04U mL-1，是野生菌种产酶能力的18倍，是大肠杆菌重组菌E. coli （pET-BSAP）产酶能力的9倍左右。酶学性质表征结果显示纯酶最适反应温度和pH分为50℃和8.5，纯酶在低于60℃及pH7.5-9.0的环境中较为稳定。除了Co2+之外，其它不同的二价金属离子对重组BSAP都有不同程度的抑制作用，其中以Zn2+和Ni2+的抑制作用较强烈。重组BSAP对具有较大脂肪族侧链的疏水性氨基酸（Leu）以及碱性氨基酸（Arg和Lys）的催化能力最强，但不能催化侧链基团较大的芳香族氨基酸（Phe和Pro）和酸性氨基酸（Glu和Asp）。经产酶条件优化后，重组菌B. subtilis（PMA-BSAP）在摇瓶中产酶能力达到137U mL-1，是未优化前产量的2.6倍。基于摇瓶发酵条件探索发酵产酶的放大实验，在15L发酵罐上完成了其发酵产酶过程，产酶能力达到摇瓶发酵水平。（2）BSAP酶分子底物特异性改造的研究。基于同源建模和底物对接技术实现了BSAP酶分子与底物分子Bestatin的对接，分析酶分子底物结合区域与底物的相互作用并确定了四个与底物有直接作用的氨基酸位点（Leu370、Asn385、Ile387、Val396）。采用饱和突变和底物特异性筛选技术筛选出五个底物特异性有明显变化的突变体，并对突变体底物特异性的改变机理进行了探讨。比较不同底物特异性BSAP的应用效果发现，利用不同底物特异性BSAP协同水解大豆蛋白时展现出最高的水解能力，水解度是野生型BSAP单独水解时的1.26倍。（3）BSAP酶分子稳定性改造的研究。利用分子动力学模拟技术分析BSAP结构，发现其结构中含有一个热不稳定性结构域（PAdomain），删除该结构域能够有效地提高酶分子的结构稳定性。热稳定性实验和胰蛋白酶酶解实验结果显示，删除PAdomain后的突变体BSAP-ΔPA比BSAP展现出更好的温度稳定性和抗胰蛋白酶降解的能力。在催化能力方面，分别以aminoacyl-pNA和Peptide A（12aa）为底物测定BSAP和BSAP-ΔPA催化常数，结果显示删除PAdomain不会影响酶分子对小分子底物的催化活性和底物特异性，但大大提高了酶分子对大分子多肽的催化能力。大豆蛋白水解实验结果显示BSAP-ΔPA较野生型BSAP展现出更好的水解能力。（4）BSAP生理功能的研究。基于Xer/dif重组系统成功敲除B. subtilis168基因组中ywaD基因以及用ywaD-ΔPA替换ywaD基因，构建了两种突变菌株BS-AP-K和BS-AP-R。通过比较了野生型、BS-AP-K、BS-AP-R三种菌株在不同培养基以及不同温度下的生长情况，发现敲除氨肽酶会对菌株生长带来的不利影响，这种影响会随着培养温度的升高而更加明显。通过培养过程中添加多种游离氨基酸可以弥补氨肽酶的缺失对菌株生长带来的不利影响。
王慧[3]（2016）在《芽孢杆菌遗传操作体系初建及工程菌株分子改良》文中进行了进一步梳理芽孢杆菌（Bacillus）是革兰氏阳性菌,不含内毒素,能够将蛋白质分泌到胞外,是多种重要工业酶的生产菌株。随着分子生物学和基因工程的迅速发展,芽孢杆菌作为基因表达系统得以不断完善,并展现出良好的应用前景。本研究旨在建立和优化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）表达系统,对工业用野生型芽孢杆菌的遗传操作系统进行改良,以进一步提高工程菌株的表达量,并建立具有应用潜力的芽孢杆菌高效表达体系。本文首先对枯草芽孢杆菌表达系统载体进行建立及优化,其中包括含有不同启动子的表达载体（如:组成型启动子P43、乳糖诱导型启动子Pgrac、木糖诱导型启动子Pxyl、淀粉酶启动子PamyQ）、含有不同筛选标记的克隆载体（如:卡那霉素Kan、红霉素Em、氯霉素Cm、四环素Tet）、以及含不同整合位点的整合载体的构建;其次对枯草芽孢杆菌转化方法进行优化,有效的提高了遗传转化效率,从而建立了一套完善的枯草芽孢杆菌表达技术,为外源基因的高效分泌和表达提供平台。利用该表达体系,实现了氨肽酶基因lapB在枯草芽孢杆菌中的高效表达,其摇瓶水平上的酶活达到了58.8 U/mL。通过菌种改良获得了能够进行内源性BamHI甲基化修饰的枯草芽孢杆菌菌株,通过对转化质粒的甲基化修饰,以及感受态制备条件的摸索,建立了中温α-淀粉酶工业生产菌株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BF.7658的遗传转化方法。以该高效分泌淀粉酶的菌株为宿主菌,实现了碱性蛋白酶基因的高效异源分泌表达,重组解淀粉芽孢杆菌工程菌株AprEA在摇瓶培养72小时的分泌表达水平可达7800 U/mL,具有较好的应用潜力。解淀粉芽孢杆菌K11是本研究室保存的一株能高效分泌中性蛋白酶的野生型菌株,在摇瓶水平上其中性蛋白酶分泌水平可达到2700 U/mL。为进一步提高其中性蛋白酶的表达水平,本研究克隆了解淀粉芽孢杆菌K11的中性蛋白酶基因K11npr,并构建了游离型表达载体pKan300-K11npr和pUB110-K11npr。将多拷贝的游离型重组质粒转化K11菌株后获得解淀粉芽孢杆菌重组菌F20和110N-6。重组菌F20和110N-6在牛奶初筛平板上的蛋白酶活性明显要高于野生型菌株K11。通过发酵条件优化,重组菌110N-6在摇瓶水平上的酶活力可达到8995 U/mL,比野生型菌株提高了2倍多,在15升发酵罐的酶活力可达到24,000-28,000 U/mL,是目前已报道表达水平最高的中性蛋白酶。重组表达质粒的不稳定性很大程度上限制了含高拷贝游离质粒的重组芽孢杆菌的广泛应用。本研究所构建的两个游离型表达载体pKan300-K11npr和pUB110-K11npr,其最大的差异是前者含有能在大肠杆菌中复制的pBR322-ori复制元件,而后者中只含有芽孢杆菌复制元件。对重组菌的遗传稳定性分析结果表明:重组菌F20的遗传稳定性远远不如重组菌110N-6,在无选择压力的培养基上连续传代,重组菌F20传至第八代后质粒即全部丢失,而重组菌110N-6传至一百代,质粒稳定性仍保持在90%以上。推测表达载体中同时含有两种不同的复制元件可能是质粒在芽孢杆菌中不稳定的重要原因之一。本研究所构建的重组质粒pUB110-K11npr在菌株110N-6中非常稳定,可以满足工业化大生产要求。枯草芽孢菌株AS.1398是经过长期诱变获得的表达中性蛋白酶的商业菌株。通过研究不同浓度的氨苄青霉素对菌株细胞壁合成的抑制作用,建立了AS.1398菌株的遗传转化方法。将重组表达载体pUB110-K11npr导入AS.1398菌株中获得的解淀粉芽孢杆菌重组菌,其中性蛋白酶的分泌能力比AS.1398菌株的酶活力提高一倍,在摇瓶水平上其酶活力可达到9295 U/mL。本研究从多个方面对枯草芽孢杆菌表达系统进行了优化,并尝试了多种野生型芽孢杆菌的转化条件,成功建立了针对野生型芽孢杆菌的遗传转化体系,同时解决了芽孢杆菌中重组质粒不稳定的难题,为工业菌株发展成为新的基因工程表达体系提供新的思路。
丁国伟[4]（2014）在《米曲霉脯氨酸氨肽酶基因克隆及其异源表达》文中研究说明脯氨酸氨肽酶具相对严格的底物特异性，能特异地水解多肽或蛋白N-端的脯氨酸残基。作为氨肽酶系列中的一种，脯氨酸氨肽酶除可用于蛋白类食品水解加工产物中苦味的去除，还在胶原蛋白水解应用方面有较好的应用前景。本论文以米曲霉JN-412（Aspergillus oryzae JN-412，CGMCC8474）总RNA为模板，试剂盒合成双链cDNA，特异性引物扩增得到编码脯氨酸氨肽酶的cDNA序列，成功构建了产脯氨酸氨肽酶的重组大肠杆菌BL21/pap，并获得大量可溶性的活性蛋白。通过Ni2+-NAT亲和层析一步纯化获得了电泳纯的重组脯氨酸氨肽酶，纯化倍数和回收率分别为3.3和36.7%。对重组酶酶学性质研究发现，该氨肽酶的最适温度和pH值分别为60oC和7.5。该氨肽酶具有较好的pH稳定性，分别在pH5.0-11.0的缓冲体系中30oC保温1h，残留活性在80%以上。对于该酶的热稳定性，在50oC保温1h残留酶活仅有10%。Zn2+、Cu2+和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该氨肽酶有强烈的抑制作用，还原剂（DTT、-巯基乙醇）和金属离子螯合剂EDTA对该酶没有影响，Zn2+和-巯基乙醇共同存在，Zn2+的抑制作用被削弱。该氨肽酶与中性蛋白酶复配应用于胶原蛋白的水解，分析各实验组水解液中氨基酸组成的变化发现：与三组对照组相比，利用中性蛋白酶和脯氨酸氨肽酶复合水解的水解液中氨基酸量明显增加。通过优化得到摇瓶阶段的最佳产酶条件：葡萄糖5g·L-1；蛋白胨20g·L-1；酵母膏30g·L-1；Mg2+7.5mmol·L-1；K2HPO412.54g·L-1；KH2PO42.31g·L-1，初始pH7.2，对数期种子2%，装液量50mL/250mL，最佳诱导时机为接种后9h（OD600≈11.44），诱导时乳糖终浓度3g·L-1，诱导时间为12h，最终酶活力达到了78.42U·mg-1，菌体干重（DCW）为4.55g·L-1（OD600≈13.67）。在7L发酵罐上分别进行了分批和补料分批发酵实验，对产脯氨酸氨肽酶重组大肠杆菌的高密度培养（HCDC）进行了摸索，发现指数流加补料策略有效地控制了菌体生长过程中乙酸的积聚，OD600是分批发酵的9.16倍，达到了142（DCW=44.96g·L-1）。酶活力达到了211.20U·mg-1，是分批发酵的2.3倍。利用分子动力学模拟确定脯氨酸氨肽酶中柔性较大的区段（238-246），该区段远离脯氨酸氨肽酶的催化中心，序列分析发现该区段中发现存在柔性氨基酸Gly241，通过Discovery studio2.5中Build Mutants模块构建G241P突变体，对该突变体进行分子动力学模拟发现，通过将该位点突变为刚性氨基酸Pro后，该区段柔性下降，构象趋于稳定。将突变体的基因在大肠杆菌中进行表达，纯化后测定突变体的热稳定性，结果发现突变体T50比原始酶提高了4.8oC。
黄浩[5]（2017）在《一种赖氨酸氨肽酶在大肠杆菌中表达的策略及其特性表征》文中研究表明赖氨酸氨肽酶（Lysine aminopeptidase,LAP）是一类能够水解多肽N末端附近肽键的外切蛋白酶,对于切割赖氨酸残基释放出游离赖氨酸的效率最高。它能够作为一种风味蛋白酶,去除蛋白水解液中形成的苦味肽提高产品的适口性,还可以广泛应用于饲料加工、医疗诊断、蛋白测序、美容护肤等行业,具有很高的研究意义和应用价值。耐热酶在高温条件下能够维持一定的活性,应用于工业生产能够降低成本、简化工艺、提高生产率,前景十分广阔。本文以铜绿假单胞菌NJ-814（Pseudomonas aeruginosa NJ-814）基因组DNA为模板,设计特异性引物克隆出赖氨酸氨肽酶编码基因lap,构建重组质粒pET42a-lap热激转化到原核表达宿主E.coli BL21中形成重组菌BLAP,并成功实现了重组赖氨酸氨肽酶的表达。BLAP在发酵初始培养基中16℃,220 r·min-1诱导72 h后胞内酶活达到稳定值2.54 U·m L-1。通过构建分子伴侣、添加表面活性剂、添加渗透剂等措施寻求重组蛋白的胞外分泌策略,研究发现向发酵液中添加浓度为1%的山梨醇能够促进约0.29 U·mL-1的胞内重组酶分泌到胞外。利用镍柱亲和层析（Ni-NTA）进行分离纯化得到电泳纯的重组酶酶液,纯化倍数4.7,回收率83.5%。对纯化后重组酶酶学性质研究发现,在pH 8.5左右重组酶具有最高的催化活力,最适反应温度为80℃,其pH稳定区间为6.010.0,经过70℃热处理1 h仍能保留60%以上的酶活性。金属离子Ni2+、Zn2+和蛋白抑制剂DDT、β-巯基乙醇、EDTA对重组赖氨酸氨肽酶酶活具有明显的抑制作用,Mn2+、Ca2+、Cu2+和PMSF对酶活影响有限,而Mg2+和Co2+能够促进重组酶的活性,Co2+能将重组酶酶活提高为原来的4倍。该重组酶能够水解Arg-pNA、Leu-pNA和Lys-pNA三种底物,但对Lys-pNA水解能力最强,酶动力学分析显示以Lys-pNA为底物时的米氏常数Km值为4.86 mmol·L-1、最大反应速率Vmax值为8.76μmol·L-1·min-1。摇瓶阶段优化后最利于重组酶表达的培养基为:0.5%葡萄糖,2%鱼粉蛋白胨,3%酵母浸膏,55 mmol·L-1 K2HPO4,17 mmol·L-1 KH2PO4,0.4 mmol·L-1 CoCl2,初始pH 7.5,装液量40 m L/250 m L。以2%的接种量于37℃,220 r·min-1摇床中培养8 h后向发酵液中加入终浓度0.5 mmol·L-1的诱导剂IPTG,转到16℃,240 r·min-1摇床中诱导重组赖氨酸氨肽酶表达。经过优化后最高酶活达到3.47 U·m L-1,为优化前的1.37倍。利用全质粒PCR技术对赖氨酸氨肽酶编码基因的特定位点进行定向突变,通过删除位于非活性中心的PA结构域,获取热稳定性提高了约10%的突变赖氨酸氨肽酶,为揭示耐热蛋白酶的结构和功能建立了一定的关系。初步考察了突变酶与碱性蛋白酶复配水解大米蛋白的应用,结果显示该酶能够有效作用于分子量2000 Da以上的多肽,复配水解后水解液中180 Da以下的游离氨基酸等小分子物质比未处理原料的提高了97倍。
郭凯霞[6]（2020）在《旋毛虫氨基肽酶的克隆表达与功能鉴定》文中研究指明旋毛虫病是一种因食用含有旋毛虫幼虫囊包的未煮熟的或生的肉类（通常是猪肉）引起的寄生虫病。它可引起的症状,从全身性发热,恶心,呕吐,腹痛,腹泻,肌痛到更严重的脑炎和心肌炎。旋毛虫侵入小肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IECs）进一步发育是其感染宿主的关键,这一过程不只是机械性损伤,还可能与旋毛虫的一些水解蛋白酶有关。在旋毛虫感染性幼虫体外与IECs共培养后增加的蛋白中发现了一种旋毛虫氨基肽酶（Trichinella spiralis aminopeptidase,TsAP）,推测该蛋白可能与旋毛虫侵入宿主IECs有关。本研究对TsAP基因进行了克隆表达,获得了重组的TsAP（rTsAP）。应用q PCR、Western blot分析TsAP在旋毛虫不同虫期的转录、表达水平,并进行免疫荧光（IFA）分析虫体定位。通过对特异性底物─亮氨酸-对硝基苯胺（Leucine-p-nitroanilide,L-p NA）的水解测定rTsAP的酶活性。应用Western blot、ELISA和IFA技术分析rTsAP与IECs蛋白的结合作用,通过RNA干扰技术及侵入实验证明TsAP对旋毛虫侵入、发育及生殖的影响。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物、细胞、质粒和菌种旋毛虫（T1）为本实验室昆明小鼠保种;实验动物为BABL/c小鼠,购于河南省实验动物中心;细胞为小肠上皮细胞（IECs）,为本实验室从正常小鼠小肠分离鉴定得到;克隆和表达菌均为BL21,克隆载体为p MD19-T,表达载体为p QE-80L。2.TsAP生物信息学分析利用NCBI在线网站预测TsAP（Gen Bank accession no:XP＿003377703.1）的结构域和酶活性位点。运用Bio Edit软件,将TsAP与其他旋毛虫属氨基肽酶进行序列比对,用MEGA7.0的邻接法构建TsAP的系统发育进化树。3.TsAP的克隆表达及抗原性分析将TsAP基因连接到克隆载体p MD19-T中,测序后,经双酶切将TsAP基因连接到p QE-80L表达载体上,构建重组表达质粒p QE-80L/TsAP。表达出重组蛋白rTsAP,过镍柱纯化后,免疫小鼠制备抗rTsAP免疫血清。将p QE-80L/TsAP/BL21未诱导全菌蛋白、诱导全菌蛋白、过柱纯化后的rTsAP进行Western blot,分析rTsAP的抗原性。4.TsAP在旋毛虫各个虫期的表达及虫体定位用Trizol提取各个虫期[肌幼虫（ML）、肠道感染性幼虫（IIL）、成虫（AW）、新生幼虫（NBL）]RNA,并反转录为c DNA,通过q PCR分析TsAP基因在不同虫期的转录。制备各个虫期虫体可溶抗原,经Western blot分析TsAP在各个虫期的表达情况。收集不同虫期新鲜虫体制成石蜡切片,进行免疫荧光分析TsAP在旋毛虫不同虫期表达及定位。5.rTsAP酶活性测定rTsAP具有催化特异性底物L-p NA水解产生p NA的能力,p NA的光吸收峰值波长为405 nm,通过测定405 nm处吸光值的变化,计算出rTsAP的酶活力。通过测定不同温度、不同p H值以及有不同金属离子和酶抑制剂存在时反应的OD405,观察rTsAP酶反应的最佳温度、p H值,以及不同金属离子和抑制剂对酶活性的影响。6.TsAP与IECs的结合作用及其对旋毛虫幼虫侵入IECs时的作用应用Western、ELISA和IFA技术证明TsAP与IECs的结合作用。将rTsAP与肠道感染性幼虫（IIL）接种至IEC单层,同时设置BSA、抑制剂对照组,证明TsAP在旋毛虫侵入IECs时的作用。将rTsAP免疫血清与IIL接种至IEC单层,以旋毛虫感染鼠血清为阳性对照、正常鼠血清为阴性对照,观察特异性抗体封闭对IIL侵入IECs的阻断作用。7.干扰TsAP基因的表达对旋毛虫幼虫侵入IECs的影响设计TsAP特异性si RNA（si RNA-842）,通过Western blot分析si RNA-842干扰的最适浓度和最佳时间,测定干扰后的肌幼虫虫体可溶蛋白中天然的酶活性,然后将干扰后的肌幼虫经胆汁激活为肠道感染性幼虫（IIL）后进行体外侵入实验,观察TsAP基因表达沉默后对旋毛虫幼虫侵入IECs的阻断作用。8.干扰TsAP基因后幼虫攻击感染实验将60只BALB/c小鼠分成3组（每组20只）,将3μМsi RNA-842、Control si RNA或PBS干扰后的肌幼虫,按300条/只经口分别接种于20只小鼠。感染后6 d,每组剖杀10只小鼠收集肠道成虫并计数,拍照虫体测其长度。每组随机抽取30条雌虫,在24孔板中用RPMI-1640培养,72 h后对每组雌虫所产新生幼虫计数,并拍照测长度。感染后60 d,剖杀剩余小鼠,计算肌幼虫虫荷并测长度。9.统计分析将实验得到的数据用Excel 2010进行整理,运用SPSS 20.0进行统计分析,根据所用实验方法和数据类型选择相应的统计方法,包括单因素方差分析与卡方检验。检验水准为α=0.05。结果1.TsAP生物信息学分析旋毛虫氨基肽酶包含两个M17家族的结构域,属于金属蛋白酶。有8个酶活性位点,分别为264赖氨酸（Lys）、269天冬氨酸（Asp）、276赖氨酸（Lys）、287天冬氨酸（Asp）、348天冬氨酸（Asp）、350谷氨酸（Glu）、352精氨酸（Arg）、376亮氨酸（Leu）,他们紧密排布于该蛋白分子空间结构中,构成底物结合催化位点。进化树显示,旋毛虫属的11个种/基因型的单系群得到了很好的支持,与肠道寄生鞭虫关系较近。在旋毛虫属内,发现了两个不同的进化枝:一个是成囊型旋毛虫进化枝,另一个是非成囊型旋毛虫进化枝。2.TsAP的克隆表达及抗原性分析将TsAP基因连接到克隆载体p MD19-T中,测序结果表明TsAP基因与Gen Bank上TsAP的基因序列相似度为98%。双酶切后将TsAP基因连接到p QE-80L上,构建重组表达质粒p QE-80L/TsAP。加入0.8 m M IPTG,16°C诱导24 h后收集菌体进行SDS-PAGE,在分子量为55.7 k Da处出现一条蛋白带,可溶性分析表明rTsAP在上清中较多。将纯化后的rTsAP免疫小鼠制备抗rTsAP免疫血清。将p QE-80L/TsAP/BL21未诱导全菌蛋白、诱导全菌蛋白、过柱纯化后的rTsAP进行Western blot分析,结果显示,rTsAP可以被旋毛虫感染鼠血清、抗rTsAP免疫血清及His单抗识别,证明其抗原性良好。3.TsAP在旋毛虫各个虫期的表达及虫体定位qPCR结果显示,TsAP在旋毛虫不同虫期转录水平的差异有统计学意义（F=110.851,P<0.001）。肠道感染性幼虫、成虫和新生幼虫分别为肌幼虫的3.03倍（P<0.001）、1.72倍（P<0.01）、0.14倍（P<0.01）。Western blot结果显示抗rTsAP血清可识别旋毛虫不同虫期粗抗原中天然的TsAP,且不同虫期TsAP的表达量有差异（F=55.706,P<0.001）。肠道感染性幼虫、成虫TsAP蛋白表达量分别为肌幼虫的1.60倍（P<0.001）、1.71倍（P<0.001）,新生幼虫蛋白表达量为肌幼虫的1.14倍（P>0.05）。虫体切片免疫荧光试验结果表明TsAP主要定位于旋毛虫皮层和雌成虫的胚胎中。4.rTsAP酶活性测定rTsAP的酶活性随着rTsAP蛋白浓度的增加而逐渐增强,在浓度为0.032μg/μL时趋于平稳,最适反应温度为50°C,最佳p H值为8.0。Mn2+、Co2+、Ni2+对rTsAP的酶活性均有增强作用,作用大小为Mn2+>Co2+>Ni2+。金属蛋白酶抑制剂1,10-Phenanthroline对rTsAP的酶活性有抑制作用,其他蛋白酶抑制剂对酶活性没有影响。rTsAP对Leu-p NA的水解作用符合米曼氏动力学,动力学参数Vmax为28.99μM·min-1,Km为14.04 m M。5.rTsAP与IECs的结合Far-Western结果显示IECs蛋白被抗rTsAP抗体识别12条带（49.8、45.6、42.3、38.6、36.8、35.5、32.9、30.7、28.7、27.3、25.3、17.3 k Da）,被感染旋毛虫小鼠血清识别4条带（42.3、38.8、35.8、28.7 k Da）,但不能被正常鼠血清识别。证明rTsAP能够与IECs蛋白特异性结合,并可能与旋毛虫侵入鼠小肠IECs有关。ELISA结果显示rTsAP能与IECs蛋白结合,OD值与IEC蛋白包被浓度有关（r=0.878,P<0.01）,随着IECs蛋白浓度增加而升高（F=127.553,P<0.001）;OD值还与rTsAP孵育浓度有关（r=0.868,P<0.05）,随着rTsAP浓度增加而升高（F=938.272,P<0.001）。IFA与共聚焦显微镜检查结果显示,rTsAP与IECs的结合部位主要在胞浆。6.rTsAP与抗rTsAP免疫血清对旋毛虫侵入IECs的作用rTsAP浓度为12、16、20、24μg/m L时与对照组的侵入率差异均有统计学意义（P<0.01）,对旋毛虫侵入IECs的促进率分别为23.61%、28.98%、31.77%和32.48%。表明rTsAP对旋毛虫的侵入具有促进作用,且促进率与rTsAP浓度相关（r=0.916,P<0.001）,随浓度的增加而增加（F=215.761,P<0.001）。抗rTsAP免疫血清稀释度为1:100、1:200、1:400、1:800时与正常血清组的侵入率差异均有统计学意义（P<0.01）,对旋毛虫侵入IECs的抑制率分别为35.66%、27.62%、21.02%和18.61%。证明抗rTsAP免疫血清对旋毛虫侵入IECs有抑制作用,且其抑制率与抗rTsAP免疫血清剂量相关（r=0.924,P<0.001）,随抗rTsAP免疫血清稀释度的增加而降低（F=175.096,P<0.001）。7.沉默TsAP基因对旋毛虫侵入IECs的阻断作用Western blot结果显示,si RNA-842浓度为2μM、3μM、4μM时,TsAP蛋白表达量分别被抑制了44.64%、57.98%和40.71%（P<0.01）;干扰天数为1 d、3 d、5 d时,TsAP蛋白表达量分别被抑制了23.59%、43.17%和50.90%（P<0.01）。结果表明si RNA-842浓度为3μM,培养时间为5 d时干扰效果最好,且si RNA-842对TsAP干扰具有特异性。si RNA-842干扰后,与PBS组相比TsAP酶活性抑制率为49.72%（F=1246.154,P<0.001）。沉默TsAP基因对幼虫侵入IECs的抑制率为32.35%（F=921.579,P<0.001）。8.干扰TsAP基因后对旋毛虫侵入、发育及生殖力的影响siRNA-842处理组与PBS组相比,6 d成虫减虫率为39.58%（F=50.033,P<0.001）,雌虫生殖力（新生幼虫产量）明显降低（F=171.278,P<0.001）,肌幼虫减虫率为56.03%（F=180.217,P<0.001）。与PBS组相比,si RNA-842处理组雌成虫长度明显变短（F=43.018,P<0.001）,雄成虫长度亦明显变短（F=94.371,P<0.001）,新生幼虫长度缩短（F=78.893,P<0.001）,肌幼虫长度缩短（F=129.492,P<0.001）。Control si RNA组与PBS组差异无统计学意义（P>0.05）。结论1.旋毛虫氨基肽酶（TsAP）在旋毛虫发育的各个时期均有表达,且主要分布于虫体皮层及雌成虫胚胎。2.rTsAP具有酶活性,在温度为50°C、p H值为8.0时酶活性最高,Mn2+、Co2+、Ni2+对rTsAP的酶活性均有增强作用,金属蛋白酶抑制剂1,10-Phenanthroline对rTsAP的酶活性有抑制作用。3.rTsAP可与IECs特异性结合,对旋毛虫幼虫侵入IECs具有促进作用;抗rTsAP免疫血清或沉默TsAP基因可以抑制旋毛虫幼虫侵入IECs。4.TsAP在旋毛虫的侵入、发育和生殖中起着至关重要的作用,可作为抗旋毛虫疫苗的一个候选靶标。
张晓舟[7]（2006）在《枯草杆菌新型表达系统和遗传操作体系的建立及应用》文中研究指明枯草杆菌由于具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白较理想的宿主。但由于受自身分泌蛋白酶多、构建的重组表达质粒不太稳定等因素影响，其应用受到一定的限制。近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统发展迅速，并展现出良好的应用前景。本文旨在建立一套枯草杆菌高效表达和分泌系统，实现甲基对硫磷水解酶基因mpd在枯草杆菌中的高效表达和分泌，以解决其在原始菌株中表达存在的一些问题；同时本文亦对枯草杆菌同源重组和载体转化等遗传操作体系进行了一些探索性研究。 以mpd基因为报告基因，构建了一个新型的方便而高效的启动子探针pUC-mpd。构建了枯草杆菌168的基因组DNA的启动子文库，利用启动子探针从文库中克隆了一系列启动子功能片段并比较了其在大肠杆菌中的启动子强度，得到了两个克隆有强启动子片段的克隆pMPDP3和pMPDP29。测定并分析了重组载体pMPDP3和pMPDP29克隆到的两个强启动子功能片段的序列，分别为两个功能未知基因ytkA和ywoF基因上游的启动子，mpd基因分别与ytkA和ywoF基因的信号肽编码序列发生了融合表达。对两个启动子的结构及两个基因与MPH的融合表达产物进行了预测和分析。ytkA基因表达产物的信号肽为脂蛋白信号肽，而ywoF基因表达产物的信号肽为分泌型信号肽。 利用大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pNW33N与mpd基因构建了穿梭启动子探针pNW33N-mpd。利用该探针钓取启动子后可以不经亚克隆而直接转入枯草杆菌测定和比较启动子的强弱。利用穿梭启动子探针重新克隆了ytkA和ywoF基因的启动子与信号肽编码序列，构建了mpd基因穿梭表达载体pNYTM和pNYWM。将载体pNYTM和pNYWM转入枯草杆菌1A751重组表达mpd基因。发现在枯草杆菌中，ytkA基因的启动子强度远强于ywoF基因的启动子。1A751（pNYTM）的mpd重组表达产物与细胞结合，而1A751（pNYWM）的mpd重组表达产物大部分分泌在发酵液上清中。利用ytkA基因的强启动子和nprB基因的分泌型信号肽重新构建了mpd基因的分泌表达载体pYNMK。将pYNMK转入缺失了8种蛋白酶的枯草杆菌WB800，使mpd基因获得了更高水平的分泌表达，91.4％的酶分泌在上清液中，表达量是出发菌株的10.8倍。 进而利用PCR方法克隆和融合了P43启动子功能片段和nprB基因信号肽编码序列，构建了新的大肠杆菌-枯草杆菌分泌表达载体pP43NMK。将pP43NMK导入到枯
王凯航[8]（2019）在《一种内毒素合成途径抑制的整合表达型大肠杆菌菌株的构建及应用》文中研究表明疫苗在预防和治疗多种人类疾病中发挥着重要的作用。大肠杆菌具有生长快速、培养简单、遗传背景清楚等特点,已被广泛地应用于重组蛋白的表达和生产,但被应用于基因工程疫苗的研发和生产直至近年来才取得突破。目前,大肠杆菌表达系统应用于重组蛋白的表达仍存在一些问题,例如蛋白产物中存在内毒素污染、质粒载体具有不稳定性以及药用重组蛋白生产过程中的抗生素添加问题等。这些不利因素将对重组蛋白的性质、产量、纯化工艺以及使用的安全性带来一定影响。为了解决这些问题,本研究首先从参与大肠杆菌ER2566菌株脂多糖合成途径的关键基因入手并对其进行改造,构建了一种低内毒素水平的菌株,并利用该菌株进行乙肝疫苗候选抗原分子的大规模生产。结果表明与ER2566菌株相比,改造菌株保持了原有的重组蛋白表达能力且获得的重组蛋白具有良好的理化性质,改造菌株表达产物中的内毒素具有起始含量更低（约两个数量级）、经过相同纯化工艺更易去除等特点。我们进一步探索了这些基因位点用于异源基因整合表达的可行性。构建了一种低内毒素水平的整合表达型菌株,并用于HPV疫苗候选抗原分子的表达研究。结果表明基于脂多糖合成途径基因位点构建的整合表达型菌株与基于质粒载体进行表达的原始菌株ER2566相比具有更优良的性质,具体表现为:在无抗生素添加的高密度发酵条件下,3-5拷贝整合表达型菌株中的重组蛋白总体表达量更高且具有更低的内毒素水平。此外,两种表达方式获得的重组蛋白之间具有相似的理化性质。这些结果说明了参与脂多糖合成途径的基因位点可以用于重组蛋白的整合表达。总而言之,本论文中构建的大肠杆菌菌株将为包括基因工程疫苗在内的重组蛋白类药物的研发和生产提供一种新的表达方式。
黄金波[9]（2019）在《RNA m6A甲基转移酶METTL3锌指结构域的结构与功能研究》文中指出在RNA中存在多达100多种不同的化学修饰。RNA m6A甲基化是mRNA和lncRNA中最丰富的修饰,主要存在于RRACH（A是被甲基化的碱基;R代表嘌呤;H为非G的碱基）的保守序列中,并且在3’UTR富集。RNA m6A在进化上很保守,在病毒、细菌、酵母、植物、线虫、果蝇、小鼠、人类等物种的mRNA中大量存在。RNA m6A参与的生理功能在分子、细胞,以及组织与系统层面都有涉及。RNA m6A主要由三类蛋白调节,分别是writer（“编码器”）、eraser（“消码器”）和reader（“读码器”）。Writer是一个多蛋白大型复合物,其中METTL3、METTL14形成二元复合物行使主要的催化功能,其他蛋白参与调控作用。Eraser蛋白包括FTO和ALKBH5,负责m6A的去甲基化;Reader蛋白主要包括YTHDC1、DC2和YTHDF1、DF2、DF3家族,负责m6A的识别和RNA的命运决定。本文致力于RNA m6A修饰被甲基化过程的分子机制研究。在本文之前,我们已解析人源METTL3-METTL14的甲基转移结构域（methyltransferase domain,MTD）的复合物晶体结构。但是,活性实验证明该复合物没有甲基转移活性。生物信息学和进化分析表明,在METTL3的MTD前存在两个串联的CCCH型Zinc finger domain（ZFD）。实验证明,在MTD复合物基础上加上ZFD结构域,就能完全回补全长复合物的甲基化活性,说明ZFD在全酶复合物中的作用不可或缺。此前对于ZFD是如何调控METTL3-METTL14复合物活性的分子机制并不清楚。本文通过核磁共振（NMR）、小角散射实验（SAXS）、等温滴定量热（ITC）、Sortase蛋白连接等生物化学和生物物理学方法,解析了人源METTL3 ZFD的溶液结构。我们发现ZFD在调节METTL3-METTL14复合物活性的过程中扮演着target recognition domain（TRD）的角色。ZFD表面的一些正电荷和疏水性氨基酸参与了与底物RNA的相互作用。在催化过程中,ZFD通过与底物RNA的相互作用,将“抓获”的RNA送入MTD催化口袋,然后迅速释放,并回到原来的位置继续“抓捕”。ZFD与底物RNA的弱相互作用有利于RNA释放。总之,我们的研究为此后进一步阐明RNA m6A的催化机制奠定了的基础。
刘志海[10]（2018）在《畜禽源碳青霉烯耐药菌新型金属β-内酰胺酶变异体耐药机制研究》文中研究表明抗生素的发现与应用给人类及动物的健康带来了福音,促进了现代医学的发展。然而抗生素大量、广泛的使用也使细菌产生了耐药性,尤其是产MBLs（金属β-内酰酶）“超级耐药菌”的出现,严重地威胁畜禽养殖业的健康发展与公共卫生安全。碳青霉烯类抗生素是临床上治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的少数几类特效药物。目前,能高效水解碳青霉烯类抗生素的产MBLs（如NDM和VIM）耐药菌已在人医临床中广泛流行,且不断进化出药物水解活性更强的变异体,而被人医临床高度重视。值得注意的是,虽然碳青霉烯类药物未被批准用于我国畜禽养殖业,但产MBLs耐药菌株已在我国家禽养殖链条中出现和流行。然而,现有研究仅表明NDM和VIM是目前流行最广、最典型的MBLs,其在畜禽养殖业中的流行特点以及在畜禽养殖环境中的进化特征还未探明。本研究旨在探索我国畜禽源碳青霉烯类耐药菌中NDM和VIM的流行现状及其新型变异体耐药机制。本研究于2015-20]7年从我国山东和广东部分地区共采集畜禽及其相关养殖环境样品1160份,包括鸡源818份,猪源342份。菌株分离鉴定结果显示有433株菌为blaNDM阳性（鸡源426株,猪源7株）、4株菌为blaVIM阳性（均为鸡源）。其中,鸡源携带NDM的宿主菌为大肠杆菌（n=344,80.8%）和肺炎克雷伯菌（n=79,18.5%）;猪源流行的NDM宿主菌为大肠杆菌（n=4,57.1%）和鲍曼不动杆菌（n=3,42.9%）。364株分型成功的blaNDM阳性菌中主要流行的 NDM 亚型为 NDM-5（n=207,55.8%）,其次是 NDM-9（n=94,25.3%）和 NDM-1（n=63,17.0%）。4株blaVIM阳性菌中仅有一株为VIM-2。值得一提的是,有7株NDM（大肠杆菌）和3株VIM（恶臭假单胞菌）阳性菌株不能被归类到现有已知基因型,可能为新的MBLs变异体。对上述7株不含有已知NDM亚型的菌株序列分析,发现两种不同的NDM-1变异体,分别命名为NDM-17（6株）和NDM-20（1株）,这是首次从畜禽源细菌中发现的新NDM变异体。与NDM-1相比,NDM-17和NDM-20的氨基酸序列同时存在V88L和M154L氨基酸替换（与NDM-5一致）;同时还分别存在两个新的氨基酸替换位点（E170K和R270H）。与NDM-1和NDM-5相比较,NDM-17能介导更高水平的碳青霉烯类耐药;而NDM-20介导耐药能力与NDM-5 一致,但强于NDM-1。酶动力学试验表明NDM-17具有比NDM-1显着高的药物水解效率和比NDM-5高的药物亲和活性,表明NDM-17具有更好的酶活性。NDM-20水解青霉素类和头孢类药物的活性显着高于NDM-5,但碳青霉烯酶活性略低于NDM-5,这显示了 NDM-20可以特异性地提高酶的水解活性;也进一步提示了 NDM可能正在向提高酶活性或者提高特定类药物水解活性的方向进化。稳定性试验结果表明NDM-17和NDM-20的稳定性显着高于NDM-1,原因是M154L替换显着增加了 NDM的稳定性。基因定位结果显示blaNDM-17和blaNDM-20均定位于大小46,161bp的IncX3型可转移性质粒上。通过序列比对分析3株未能分型的VIM序列发现了一种VIM新变异体,将其命名为VIM-48。与VIM-2相比,VIM-48的C-末端存在11个连续氨基酸的改变,这种改变不同于VIM变异体以往单个氨基酸替换的进化方式。为了探明11个连续氨基酸对VIM-48的作用,本研究构建了 11个连续氨基酸的缺失株VIM-D（Δ）以及VIM-2为参照分析其生物活性。分析结果显示VIM-48比VIM-2和VIM-D（Δ）介导的碳青霉烯类耐药水平更高。酶动力学表明VIM-48通过增加亲和活性进而增强了碳青霉烯酶活性,而VIM-D（Δ）显着降低了酶催化效率,提示了 C-末端氨基酸对于维持VIM酶活性具有重要的作用。稳定性试验证实了 VIM-48的稳定性高于VIM-2;而缺失株VIM-D（Δ）显着降低了酶稳定性,说明C-末端11连续氨基酸的改变是VIM-48稳定性增强的成因。这些研究结果表明VIM-48可能是一种酶活性和稳定性增加的优势变异体,VIM的进化方式也存在从氨基酸的点替换向多位点连续替换扩大的迹象。综上所述,本研究在探索我国部分地区畜禽源碳青霉烯类耐药菌中NDM和VIM的流行现状研究的基础上,鉴定了 NDM-17、NDM-20和VIM-48三种MBLs新的变异体,阐明了它们生物活性特征,提示金属β-内酰胺酶可能正朝生物活性和稳定性增强的方向进化,这势必会加大碳青霉烯类耐药菌防控以及新药研发的难度。同时,研究揭示了 MBLs的进化不仅发生在医学临床耐药菌中,也发生于畜禽源耐药菌中;一旦这类菌株在畜禽中广泛流行,可存在着沿食物链传递的风险,将会给临床治疗带来更大的困难。对新型MBLs变异体的研究和认识还为碳青霉烯耐药菌的防控及公共卫生安全的风险评估奠定了理论基础和数据支持。
二、大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶编码基因的分子克隆及其在大肠杆菌中的高效表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶编码基因的分子克隆及其在大肠杆菌中的高效表达（论文提纲范文）
（2）枯草芽孢杆菌氨肽酶分泌表达、分子改造及生理功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 氨肽酶的概述 |
| 1.1.1 氨肽酶的定义 |
| 1.1.2 氨肽酶的分类 |
| 1.1.3 氨肽酶的来源 |
| 1.1.4 氨肽酶的应用 |
| 1.1.5 氨肽酶的生产 |
| 1.2 细菌氨肽酶的特性 |
| 1.2.1 细菌氨肽酶的理化性质 |
| 1.2.2 细菌氨肽酶的表达调控 |
| 1.2.3 细菌氨肽酶的生理功能 |
| 1.2.4 细菌氨肽酶的三级结构 |
| 1.2.5 细菌氨肽酶的催化机制 |
| 1.3 氨肽酶的定向进化研究 |
| 1.3.1 定向进化概述 |
| 1.3.2 氨肽酶的分子改造研究 |
| 1.3.3 计算机模拟技术在蛋白质工程中的应用 |
| 1.4 论文的研究背景、意义和主要研究内容 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌氨肽酶基因克隆表达、酶学性质分析及重组菌产酶条件优化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 试剂与仪器 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 DNA 操作方法 |
| 2.2.5 B.subtilis Zj016 氨肽酶基因的克隆 |
| 2.2.6 BSAP 重组质粒的构建与表达 |
| 2.2.7 重组 BSAP 的表达 |
| 2.2.8 重组 BSAP 纯化条件与方法 |
| 2.2.9 分析方法 |
| 2.2.10 枯草芽孢杆菌重组菌产酶条件优化方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 B.subtilis Zj016 氨肽酶基因的克隆及序列分析 |
| 2.3.2 表达载体 pET-BSAP 和 PMA-BSAP 的构建 |
| 2.3.3 重组 BSAP 在 E. coli (pET-BSAP)中的表达与纯化 |
| 2.3.4 重组 BSAP 在 B. subtilis (PMA-BSAP)中的表达与纯化 |
| 2.3.5 重组 BSAP 动力学参数分析 |
| 2.3.6 重组 BSAP 底物特异性分析 |
| 2.3.7 重组 BSAP 最适反应温度和温度稳定性分析 |
| 2.3.8 重组 BSAP 最适反应 pH 和 pH 稳定性分析 |
| 2.3.9 二价金属离子对重组 BSAP 酶活影响分析 |
| 2.3.10 B. subtilis (PMA-BSAP)产酶条件优化及发酵罐小试 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于结构分析改造重组 BSAP 底物特异性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 试剂与仪器 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 |
| 3.2.4 DNA 操作方法 |
| 3.2.5 野生型 BSAP 和突变体的纯化条件与方法 |
| 3.2.6 同源建模和底物对接计算机模拟技术 |
| 3.2.7 大豆蛋白水解实验 |
| 3.2.8 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 BSAP 结构同源模拟、底物对接及突变位点选择 |
| 3.3.2 BSAP 突变体的表达、筛选及底物特异性分析 |
| 3.3.3 不同底物特异性 BSAP 的温度稳定性和二级结构分析 |
| 3.3.4 不同底物特异性 BSAP 的反应动力学参数分析 |
| 3.3.5 不同底物特异性 BSAP 在大豆蛋白水解实验中效果分析 |
| 3.3.6 复合突变对 BSAP 底物特异性的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 柔性结构域缺失提高 BSAP 稳定性和催化效率 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 试剂与仪器 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 |
| 4.2.4 DNA 操作方法 |
| 4.2.5 野生型 BSAP 和突变体的纯化条件与方法 |
| 4.2.6 分子动力学模拟 |
| 4.2.7 胰蛋白酶水解实验 |
| 4.2.8 大豆蛋白水解实验 |
| 4.2.9 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 BSAP 序列比对及结构分析 |
| 4.3.2 BSAP 和 BSAP-ΔPA 结构分子动力学分析 |
| 4.3.3 BSAP-ΔPA 的表达与纯化 |
| 4.3.4 BSAP 和 BSAP-ΔPA 稳定性分析 |
| 4.3.5 PA domain 对 BSAP 的催化能力的影响 |
| 4.3.6 BSAP 和 BSAP-ΔPA 在大豆蛋白水解实验中效果分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 BSAP 生理功能研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 试剂与仪器 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 |
| 5.2.4 DNA 操作方法 |
| 5.2.5 分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 BS-AP-K 和 BS-AP-R 突变菌株的构建和鉴定 |
| 5.3.2 野生型和突变菌种在 LB 培养基和 SPM 中生长情况比较 |
| 5.3.3 不同温度下野生型和突变菌种在 SPM 中生长情况比较 |
| 5.3.4 野生型和突变菌种培养上清液中游离氨基酸和多肽分布的差异分析 |
| 5.3.5 游离氨基酸添加对野生型和 BS-AP-K 菌株在 SPM 中生长的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（3）芽孢杆菌遗传操作体系初建及工程菌株分子改良（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 工业微生物育种技术 |
| 1.1.1 诱变育种 |
| 1.1.2 遗传育种 |
| 1.1.3 基因工程育种 |
| 1.2 芽孢杆菌表达系统概述 |
| 1.2.1 芽孢杆菌表达系统 |
| 1.2.2 芽孢杆菌表达系统特点 |
| 1.3 芽孢杆菌表达系统的遗传操作体系 |
| 1.3.1 芽孢杆菌表达系统宿主菌株 |
| 1.3.2 芽孢杆菌表达系统载体系统 |
| 1.3.3 芽孢杆菌表达系统转化方法 |
| 1.4 芽孢杆菌表达系统基因表达特点 |
| 1.4.1 启动子 |
| 1.4.2 信号肽和信号肽酶 |
| 1.4.3 终止子 |
| 1.4.4 外源蛋白的分泌表达 |
| 1.4.5 芽孢杆菌蛋白质分泌机制 |
| 1.4.6 影响蛋白分泌的因素 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌遗传操作体系的建立及其应用 |
| 第一节 枯草芽孢杆菌遗传操作体系的建立和完善 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株与载体 |
| 1.1.2 引物的合成与测序 |
| 1.1.3 试剂与仪器 |
| 1.1.4 培养基及溶液的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 DNA片段的纯化或切胶回收 |
| 1.2.3 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 1.2.4 大肠杆菌阳性重组子的鉴定 |
| 1.2.5 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 1.2.6 芽孢杆菌基因组DNA的提取 |
| 1.2.7 芽孢杆菌对抗生素敏感性检测 |
| 1.2.8 枯草芽孢杆菌分泌表达载体的构建 |
| 1.2.9 枯草芽孢杆菌克隆载体的改造 |
| 1.2.10 枯草芽孢杆菌整合载体的构建 |
| 1.2.11 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备与转化 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 芽孢杆菌对抗生素的敏感性检测试验 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌分泌表达载体的构建 |
| 1.3.3 枯草芽孢杆菌克隆载体的改造 |
| 1.3.4 枯草芽孢杆菌整合载体的构建 |
| 1.3.5 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备 |
| 第二节 氨肽酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与载体 |
| 2.1.2 引物的合成与测序 |
| 2.1.3 试剂与仪器 |
| 2.1.4 培养基及溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 B.subtilis基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 氨肽酶基因lap B的克隆与序列分析 |
| 2.2.3 氨肽酶基因表达载体p BSlac-lap B的构建 |
| 2.2.4 氨肽酶活性的测定 |
| 2.2.5 氨肽酶重组表达菌株的摇瓶发酵试验 |
| 2.2.6 表达产物SDS-PAGE蛋白电泳分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 氨肽酶基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 氨肽酶基因重组表达载体的构建 |
| 2.3.3 氨肽酶基因在枯草芽孢杆菌中的重组表达 |
| 2.3.4 重组氨肽酶表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 碱性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与载体 |
| 3.1.2 引物合成与DNA测序 |
| 3.1.3 试剂与仪器 |
| 3.1.4 培养基及溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PCR引物 |
| 3.2.2 芽孢杆菌菌株的分子生物学鉴定 |
| 3.2.3 Bam HI甲基化酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达 |
| 3.2.4 解淀粉芽孢杆菌BF.7658 感受态细胞的制备 |
| 3.2.5 碱性蛋白酶酶活力测定 |
| 3.2.6 碱性蛋白酶基因apr E的克隆及序列分析 |
| 3.2.7 碱性蛋白酶基因表达载体的构建 |
| 3.2.8 解淀粉芽孢杆菌BF.7658 的转化 |
| 3.2.9 碱性蛋白酶重组表达菌株的摇瓶发酵试验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 芽孢杆菌菌株的分子生物学鉴定 |
| 3.3.2 枯草芽孢杆菌B. subtilis WB600的遗传改良 |
| 3.3.3 碱性蛋白酶基因的克隆及序列分析 |
| 3.3.4 碱性蛋白酶基因表达载体的构建 |
| 3.3.5 碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的异源表达 |
| 3.3.6 碱性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的异源表达 |
| 3.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 中性蛋白酶生产菌株的遗传改造 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与载体 |
| 4.1.2 引物合成与DNA测序 |
| 4.1.3 试剂与仪器 |
| 4.1.4 培养基及溶液的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PCR引物 |
| 4.2.2 中性蛋白酶酶活力测定 |
| 4.2.3 产中性蛋白酶菌株的分子鉴定 |
| 4.2.4 中性蛋白酶基因的克隆及序列分析 |
| 4.2.5 B. amyloliquefaciens K11中性蛋白酶基因表达载体的构建 |
| 4.2.6 中性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 |
| 4.2.7 解淀粉芽孢杆菌感受态细胞的制备 |
| 4.2.8 中性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的表达 |
| 4.2.9 中性蛋白酶重组表达菌株的摇瓶发酵试验 |
| 4.2.10 重组质粒遗传稳定性分析 |
| 4.2.11 中性蛋白酶重组表达菌株摇瓶发酵条件优化 |
| 4.2.12 中性蛋白酶重组表达菌株发酵罐测试 |
| 4.2.13 中性蛋白酶部分酶学性质测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 产中性蛋白酶菌株的分子鉴定 |
| 4.3.2 中性蛋白酶基因的克隆 |
| 4.3.3 中性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的异源表达 |
| 4.3.4 中性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的过表达 |
| 4.3.5 重组质粒遗传稳定性分析 |
| 4.3.6 中性蛋白酶重组表达菌摇瓶发酵条件优化 |
| 4.3.7 中性蛋白酶重组表达菌 110N-6 发酵罐试验 |
| 4.3.8 中性蛋白酶酶学性质分析 |
| 4.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）米曲霉脯氨酸氨肽酶基因克隆及其异源表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 氨肽酶概述 |
| 1.1.1 氨肽酶催化特性及分类 |
| 1.1.2 氨肽酶来源 |
| 1.1.3 氨肽酶应用 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 国外研究现状 |
| 1.2.2 国内研究现状 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统 |
| 1.4 重组大肠杆菌的高密度培养 |
| 1.5 立题意义 |
| 1.6 本文研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基与溶液 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 脯氨酸氨肽酶编码基因的克隆 |
| 2.2.2 PCR 产物的纯化及回收 |
| 2.2.3 PCR 产物与 T 载连接及测序 |
| 2.2.4 感受态的制备及转化 |
| 2.2.5 脯氨酸氨肽酶基因的序列分析 |
| 2.2.6 脯氨酸氨肽酶二级结构分析及三维结构模拟 |
| 2.2.7 目的基因与 pET-28a(+)载体连接 |
| 2.2.8 阳性克隆的挑选及验证 |
| 2.2.9 工程菌生长曲线的测定 |
| 2.2.10 脯氨酸氨肽酶酶活力的测定 |
| 2.2.11 工程菌的诱导表达及表达验证 |
| 2.2.12 IPTG 诱导表达条件的初步探索 |
| 2.2.13 重组酶的纯化 |
| 2.2.14 重组酶酶学性质的探索 |
| 2.2.15 摇瓶发酵条件优化 |
| 2.2.16 重组菌在 7 L 发酵罐上高密度发酵的探究 |
| 2.2.17 重组酶水解胶原蛋白水解产物分析 |
| 2.2.18 Gly241Pro 突变体构建 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 脯氨酸氨肽酶基因（pap）的克隆 |
| 3.2 A. oryzae JN-412 脯氨酸氨肽酶与其他氨肽酶氨基酸序列比较 |
| 3.3 A. oryzae JN-412 脯氨酸氨肽酶二级结构分析及三维结构建模 |
| 3.4 产脯氨酸氨肽酶重组大肠杆菌菌株的构建 |
| 3.5 脯氨酸氨肽酶在大肠杆菌中的表达 |
| 3.6 脯氨酸氨肽酶在大肠杆菌中表达条件的优化 |
| 3.6.1 产脯氨酸氨肽酶重组大肠杆菌生长曲线 |
| 3.6.2 诱导后培养温度对重组脯氨酸氨肽酶表达的影响 |
| 3.6.3 IPTG 浓度对重组脯氨酸氨肽酶表达的影响 |
| 3.6.4 诱导时间对重组脯氨酸氨肽酶表达的影响 |
| 3.6.5 重组脯氨酸氨肽酶的纯化 |
| 3.7 重组酶酶学性质研究 |
| 3.7.1 pH 值对重组脯氨酸氨肽酶活性及稳定性的影响 |
| 3.7.2 温度对重组脯氨酸氨肽酶活性及稳定性的影响 |
| 3.7.3 金属离子及抑制剂对重组脯氨酸氨肽酶活性的影响 |
| 3.7.4 重组脯氨酸氨肽酶动力学分析 |
| 3.7.5 脯氨酸氨肽酶在水解胶原蛋白方面的应用探究 |
| 3.8 摇瓶发酵培养基及发酵条件优化 |
| 3.8.1 葡萄糖添加量的优化 |
| 3.8.2 氮源种类及添加量的优化 |
| 3.8.3 基础培养基中 Mg2+浓度的优化 |
| 3.8.4 诱导时机的优化 |
| 3.8.5 乳糖添加量的优化 |
| 3.8.6 诱导时间的优化 |
| 3.8.7 发酵培养基初始 pH 的优化 |
| 3.8.8 装液量的优化 |
| 3.8.9 接种量的优化 |
| 3.8.10 摇瓶发酵培养基的确定 |
| 3.9 发酵罐培养 |
| 3.9.1 分批发酵 |
| 3.9.2 补料分批发酵 |
| 3.10 Gly241Pro 突变对脯氨酸氨肽酶热稳定性的影响 |
| 3.10.1 分子动力学模拟确定突变位点 |
| 3.10.2 突变体分子动力学模拟 |
| 3.10.3 突变酶基因表达及蛋白纯化 |
| 3.10.4 野生酶及突变酶动力学参数测定 |
| 3.10.5 野生酶及突变酶热稳定性测定 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 申请专利 |
| 附件 |
（5）一种赖氨酸氨肽酶在大肠杆菌中表达的策略及其特性表征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 氨肽酶概述 |
| 1.1.1 氨肽酶来源 |
| 1.1.2 氨肽酶分类 |
| 1.1.3 氨肽酶应用 |
| 1.2 氨肽酶研究进展 |
| 1.2.1 国外研究进展 |
| 1.2.2 国内研究进展 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达系统的构成 |
| 1.3.2 大肠杆菌表达系统的优缺点 |
| 1.3.3 pET表达系统 |
| 1.4 定向突变 |
| 1.5 立题意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基与溶液 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 P.aeruginosa NJ-814 全基因组的提取 |
| 2.2.2 氨肽酶编码基因的克隆 |
| 2.2.3 PCR产物的纯化与验证 |
| 2.2.4 目的基因和质粒的连接 |
| 2.2.5 E. coli感受态的制备 |
| 2.2.6 热激转化 |
| 2.2.7 阳性转化子的筛选 |
| 2.2.8 重组质粒的提取与验证 |
| 2.2.9 重组酶的诱导表达及验证 |
| 2.2.10 重组菌菌体浓度的测定 |
| 2.2.11 重组酶酶活测定方法 |
| 2.2.12 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.13 重组酶的分离纯化 |
| 2.2.14 重组酶的酶学性质 |
| 2.2.15 重组酶胞外表达措施 |
| 2.2.16 重组酶诱导条件和发酵条件优化 |
| 2.2.17 全质粒PCR定向突变 |
| 2.2.18 应用初探 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 重组赖氨酸氨肽酶表达菌株的构建 |
| 3.1.1 重组质粒的构建 |
| 3.1.2 重组质粒转化表达 |
| 3.2 胞外分泌策略 |
| 3.3 酶学性质研究 |
| 3.3.1 最适反应pH和pH稳定性 |
| 3.3.2 最适反应温度和温度稳定性 |
| 3.3.3 金属离子和抑制剂对酶活的影响 |
| 3.3.4 底物特异性和动力学分析 |
| 3.3.5 质谱分析 |
| 3.4 重组菌产酶诱导条件的优化 |
| 3.4.1 诱导温度的影响 |
| 3.4.2 诱导剂浓度的影响 |
| 3.4.3 诱导时机的影响 |
| 3.5 重组菌产酶发酵条件的优化 |
| 3.5.1 碳氮源 |
| 3.5.2 金属离子 |
| 3.5.3 初始pH |
| 3.5.4 转速 |
| 3.5.5 接种量 |
| 3.5.6 装液量 |
| 3.6 定向突变 |
| 3.7 重组酶的应用初探 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（6）旋毛虫氨基肽酶的克隆表达与功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词(Abbreviations) |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫及旋毛虫病 |
| 1.2 氨基肽酶 |
| 1.3 氨基肽酶在寄生虫中的研究 |
| 1.4 研究目的和内容 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 旋毛虫虫种、实验动物、细胞、质粒和菌种 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 主要试剂配方 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 生物信息学分析 |
| 3.2 TsAP基因的克隆 |
| 3.3 rTsAP的表达纯化 |
| 3.4 rTsAP免疫血清的制备 |
| 3.5 TsAP表达时相及虫体定位 |
| 3.6 rTsAP的酶活性分析 |
| 3.7 rTsAP与小鼠肠上皮细胞(IECs)结合 |
| 3.8 rTsAP及其免疫血清对旋毛虫幼虫侵入IECs的影响 |
| 3.9 沉默TsAP基因对旋毛虫侵入、发育及生殖力的影响 |
| 3.10 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 生物信息学分析 |
| 4.2 构建系统进化树 |
| 4.3 TsAP的克隆 |
| 4.4 rTsAP的原核表达及纯化 |
| 4.5 ELISA检测rTsAP免疫血清效价 |
| 4.6 rTsAP抗原性分析 |
| 4.7 TsAP在不同虫期的转录与表达 |
| 4.8 TsAP在旋毛虫不同发育时期的虫体定位 |
| 4.9 rTsAP酶活性测定 |
| 4.10 rTsAP与 IECs的结合作用 |
| 4.11 rTsAP及其免疫血清对旋毛虫侵入IECs的影响 |
| 4.12 沉默TsAP基因体外实验 |
| 4.13 沉默TsAP基因体内实验 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 氨基肽酶在寄生虫中的研究 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（7）枯草杆菌新型表达系统和遗传操作体系的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语说明 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 芽孢杆菌表达系统发展简史 |
| 2 芽孢杆菌表达系统概述 |
| 2.1 芽孢杆菌表达系统的特点 |
| 2.2 芽孢杆菌表达系统的宿主菌株 |
| 2.2.1 枯草杆菌宿主菌株 |
| 2.2.2 短短小芽孢杆菌宿主菌株 |
| 2.2.3 可作为宿主的其他种 |
| 2.3 芽孢杆菌表达系统的载体 |
| 2.3.1 自主复制载体 |
| 2.3.2 染色体整合载体 |
| 2.3.3 噬菌体载体 |
| 2.3.4 芽孢杆菌载体举例 |
| 2.4 芽孢杆菌的转化方法概述 |
| 2.4.1 感受态转化 |
| 2.4.2 原生质体转化 |
| 2.4.3 碱金属离子转化法 |
| 2.4.4 电转化 |
| 2.4.5 质粒的其它转移方式 |
| 3 芽孢杆菌表达系统的基因表达概述 |
| 3.1 芽孢杆菌基因表达的特点 |
| 3.1.1 能够形成芽孢 |
| 3.1.2 多Sigma因子 |
| 3.1.3 启动子的特征 |
| 3.1.4 终止子 |
| 3.1.5 16S RNA 3’端序列 |
| 3.1.6 革兰氏染色与基因表达 |
| 3.1.7 外源蛋白的分泌表达 |
| 3.1.8 外源蛋白的细胞内表达 |
| 3.1.9 单基因受多调控基因调控 |
| 3.1.10 一个调控基因往往影响多个基因的表达 |
| 3.2 芽孢杆菌表达系统中已表达的基因 |
| 3.2.1 已表达的真核基因 |
| 3.2.2 已表达的原核基因 |
| 3.2.3 蛋白质工程 |
| 4 枯草杆菌表达系统存在问题及今后发展方向 |
| 4.1 关于表达真核基因方面 |
| 4.2 关于表达酶的方面 |
| 4.3 关于表达杀虫晶体蛋白(ICP)方面 |
| 4.4 关于致病菌炭疽芽孢杆菌方面 |
| 4.5 利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加强芽孢杆菌在各方面的应用 |
| 参考文献 |
| 第二章 枯草杆菌高效表达和分泌系统的建立及mpd基因的重组分泌表达 |
| 第一节 以mpd为报告基因的新型启动子探针载体的构建及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株,质粒及培养基 |
| 1.2 酶、抗生素和化学试剂 |
| 1.3 大肠杆菌普通感受态细胞的制备及转化 |
| 1.4 质粒DNA的小量提取 |
| 1.5 质粒DNA的小量酶切 |
| 1.6 甲基对硫磷水解酶基因mpd的扩增 |
| 1.7 启动子探针的构建 |
| 1.8 枯草杆菌1A1基因组DNA的提取 |
| 1.9 枯草杆菌基因组DNA启动子文库的构建及启动子克隆 |
| 1.10 甲基对硫磷水解酶酶活力单位的定义及酶活测定 |
| 1.10.1 酶活力单位定义 |
| 1.10.2 酶活测定原理 |
| 1.10.3 酶活测定步骤 |
| 1.10.4 酶活的计算方法 |
| 1.11 启动子片段的测序和分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 mpd基因片断的扩增及启动子探针的构建 |
| 2.2 枯草杆菌基因组DNA的提取和部分酶切条件的建立 |
| 2.3 基因组DNA启动子基因文库的构建及强启动子片断的克隆 |
| 2.4 启动子片段的序列测定及分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 利用枯草杆菌ytkA和ywoF基因启动子与信号肽重组表达mpd基因 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 酶和引物 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 枯草杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 1.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 |
| 1.5.1 聚丙烯酰胺凝胶的灌制 |
| 1.5.2 电泳 |
| 1.5.3 凝胶的染色及脱色 |
| 1.6 甲基对硫磷水解酶的酶谱(Zymogram)分析 |
| 1.7 mpd基因的克隆及穿梭启动子探针的构建 |
| 1.8 穿梭表达载体pNYTM和pNYWM的构建 |
| 1.9 枯草杆菌1A751表达菌株的构建 |
| 1.10 穿梭载体pUBC19的构建 |
| 1.11 利用ytkA启动子和nprB信号肽编码序列构建分泌表达载体 |
| 1.12 枯草杆菌WB800表达菌株的构建 |
| 1.13 甲基对硫磷水解酶(MPH)活性检测及活力测定 |
| 1.14 枯草杆菌表达菌株的发酵试验 |
| 1.15 重组表达MPH的SDS-PAGE检测和酶谱分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 穿梭启动子探针pNW33N-mpd的构建和鉴定 |
| 2.2 穿梭表达载体pNYTM和pNYWM的构建和转化 |
| 2.3 枯草杆菌表达菌株甲基对硫磷水解酶表达活性的定性检测 |
| 2.4 表达菌株B.subtilis 1A751(pNYTM)和1A751(pNYWM)的发酵试验 |
| 2.5 分泌表达载体pYNMK的构建和转化 |
| 2.6 表达菌株WB800(pYNMK)的发酵试验及重组MPH分析 |
| 3 讨论 |
| 第三节 利用P_(43)启动子和NprB信号肽编码序列构建高效分泌表达载体重组表达mpd基因 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 酶和引物 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 P43启动子与NprB信号肽编码序列的克隆及融合 |
| 1.5 穿梭分泌表达载体pP43NMK的构建 |
| 1.6 表达菌株WB800(pP43NMK)的构建 |
| 1.7 表达菌株WB800(pP43NMK)的摇瓶发酵试验 |
| 1.8 MPH的SDS-PAGE和酶谱分析 |
| 1.9 重组表达MPH的分离和纯化 |
| 1.9.1 样品的制备和预处理 |
| 1.9.2 二乙氨基-乙基-葡萄糖凝胶A-50(DEAE-Sephadex A-50)的预处理 |
| 1.9.3 装柱 |
| 1.9.4 加样及洗脱 |
| 1.9.5 收集 |
| 1.9.6 洗脱曲线的绘制 |
| 1.9.7 合并与浓缩 |
| 1.9.8 A-50凝胶的再生 |
| 1.9.9 MPH的电洗脱纯化 |
| 1.10 重组表达MPH的鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 穿梭表达载体pP43NMK的构建 |
| 2.2 MPH在WB800(pP43NMK)中的重组表达和分泌 |
| 2.3 重组表达MPH的酶谱分析 |
| 2.4 重组表达MPH的纯化和鉴定 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 短短小芽孢杆菌cwp基因强启动子的克隆及应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 酶和引物 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 短短小芽孢杆菌B15总DNA的提取 |
| 1.5 分子操作 |
| 1.6 细胞壁蛋白基因(cwp)启动子和信号肽编码保守序列的扩增 |
| 1.7 PCR产物的克隆和测序 |
| 1.8 甲基对硫磷水解酶基因(mpd)穿梭分泌表达载体的构建和转化 |
| 1.9 枯草杆菌表达菌株的构建 |
| 1.10 甲基对硫磷水解酶(MPH)活性检测及活力测定 |
| 1.11 枯草杆菌WB800(pP15MK)的发酵试验 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 启动子和信号肽编码序列的扩增,克隆及分析 |
| 2.2 甲基对硫磷水解酶基因穿梭分泌表达载体的构建 |
| 2.3 表达菌株甲基对硫磷水解酶表达活性的定性检测 |
| 2.4 表达菌株B.subtilis WB800(pP15MK)的发酵试验 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 枯草杆菌新型通用无标记同源重组系统的建立及应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 酶和引物 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 淀粉酶活性的检测 |
| 1.5 分子生物学操作 |
| 1.6 载体pDGIEF的构建 |
| 1.7 载体pDGIEF-mpd的构建 |
| 1.8 载体pIEFBPR的构建 |
| 1.9 载体pIEFBPR-ID的构建 |
| 1.10 甲基对硫磷水解酶活性的检测 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 以mazF基因为反向筛选标记的同源重组载体pDGIEF的构建 |
| 2.2 MazF cassette的在枯草杆菌1A751染色体上的整合和删除 |
| 2.3 mpd基因在枯草杆菌BS752S中的整合表达 |
| 2.4 通用型同源重组整合载体的构建 |
| 2.5 枯草杆菌BS753S的bpr基因的in-frame删除 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 pUB110衍生质粒在芽孢杆菌间的转移现象及其应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 培养基及试剂 |
| 1.3 枯草杆菌感受态细胞的制备 |
| 1.4 枯草杆菌质粒的提取 |
| 1.5 甲基对硫磷水解酶(MPH)活性检测 |
| 1.6 菌株胞外蛋白酶活性的检测 |
| 1.7 重组质粒的转移 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 pUB110衍生质粒在枯草杆菌之间的转移 |
| 2.2 mpd基因在野生芽孢杆菌中的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 全文总结 |
| 1 全文研究内容总结、讨论与展望 |
| 2 本论文研究的主要创新点 |
| 附录 |
| 附录1 实验用培养基及分子生物学试剂 |
| 附录2 枯草杆菌普通化学感受态细胞制备用试剂 |
| 附录3 甲基对硫磷酶活测定所用仪器及试剂 |
| 附录4 相关载体序列 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）一种内毒素合成途径抑制的整合表达型大肠杆菌菌株的构建及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.1.1 大肠杆菌K-12系和B系菌株 |
| 1.1.2 重组蛋白在大肠杆菌中表达的调控体系 |
| 1.1.3 基于质粒载体的表达研究 |
| 1.1.4 基于大肠杆菌染色体的表达研究 |
| 1.2 外源基因在大肠杆菌染色体中的整合策略 |
| 1.2.1 位点特异性重组系统 |
| 1.2.2 λ-Red同源重组系统 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9基因编辑系统 |
| 1.3 细菌内毒素 |
| 1.3.1 大肠杆菌脂多糖合成途径 |
| 1.3.2 内毒素的检测方法 |
| 1.3.3 内毒素的去除方法 |
| 1.4 基于原核表达系统的基因工程疫苗现状 |
| 1.4.1 现阶段基因工程疫苗研发及上市情况 |
| 1.4.2 基因工程疫苗中活性成分的主要形式 |
| 1.4.3 常用的表达系统及比较 |
| 1.5 本研究的目的和意义以及研究思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 菌株及质粒 |
| 2.1.3 常用酶及单克隆抗体 |
| 2.1.4 培养基及其他常规溶液 |
| 2.1.5 软件 |
| 2.1.6 分子克隆实验所用到的引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 λ-Red同源重组鉴定及抗性标签去除 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9基因编辑及鉴定 |
| 2.2.4 细菌总基因组的提取及基因组测序和分析 |
| 2.2.5 细菌总mRNA提取及转录组测序和分析 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.2.7 质粒保有率测定 |
| 2.2.8 蛋白表达及纯化 |
| 2.2.9 蛋白的质量分析 |
| 2.2.10 细菌内毒素定量检测 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 大肠杆菌ER2566菌株基因组学研究 |
| 3.1 大肠杆菌ER2566菌株的基因组学研究 |
| 3.1.1 大肠杆菌ER2566菌株基因组测序数据统计 |
| 3.1.2 基因组拼接组装 |
| 3.1.3 基因功能预测及注释 |
| 3.1.4 基因共线性分析 |
| 3.2 第一部分小结 |
| 第二部分 低内源性内毒素的大肠杆菌ER2566菌株改造及应用 |
| 3.3 大肠杆菌脂多糖突变菌株的构建 |
| 3.3.1 基因敲除及鉴定 |
| 3.3.2 基因点突变及鉴定 |
| 3.4 改造菌株脂多糖分子的定量检测 |
| 3.5 改造菌外源蛋白表达情况研究及生长曲线绘制 |
| 3.6 改造菌株高密度发酵研究 |
| 3.6.1 高密度发酵条件下改造菌株的生长情况 |
| 3.6.2 培养及表达条件优化 |
| 3.6.3 HBVCR-T3B蛋白表达后纯化及质量等同性研究 |
| 3.7 第二部分小结 |
| 第三部分 单拷贝整合表达菌株的构建及评价 |
| 3.8 单拷贝染色体整合表达菌株构建及染色体整合位点研究 |
| 3.8.1 整合位点处转录本丰度的测定 |
| 3.8.2 整合表达菌株构建及蛋白表达情况鉴定 |
| 3.9 外源基因整合表达稳定性研究 |
| 3.10 高密度发酵研究 |
| 3.11 HPV L1蛋白在整合表达菌株中的表达情况及性质鉴定 |
| 3.12 第三部分小结 |
| 第四部分 多拷贝整合表达菌株的构建及评价 |
| 3.13 多拷贝整合菌的构建及鉴定 |
| 3.14 摇瓶培养条件下蛋白表达情况研究 |
| 3.15 发酵培养条件下蛋白表达情况研究 |
| 3.16 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 大肠杆菌ER2566菌株的基因编辑策略 |
| 4.2 异源基因整合位点和拷贝数对其表达量的影响 |
| 4.3 大肠杆菌脂多糖合成途径的改造 |
| 4.4 低内毒素的整合表达型大肠杆菌应用于重组蛋白类药物生产中的优势 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 在校期间发表的论文 |
| 在校期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
（9）RNA m6A甲基转移酶METTL3锌指结构域的结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 核酸修饰及RNA m~6A修饰 |
| 1.2 RNA m~6A化学修饰研究历史 |
| 1.2.1 调控RNA m~6A修饰的蛋白(writers/erasers/readers) |
| 1.2.2 RNA m~6A“编码器”的研究历史 |
| 1.2.3 RNA m~6A“消码器”蛋白的鉴定 |
| 1.2.4 RNA m~6A“读码器”蛋白的鉴定 |
| 1.3 RNA m~6A的生物学功能 |
| 1.3.1 RNA m~6A在分子层面的影响 |
| 1.3.2 RNA m~6A对细胞发育的影响 |
| 1.3.3 RNA m~6A对疾病与免疫系统的影响 |
| 1.3.4 RNA m~6A对性别决定及胚胎发育的影响 |
| 1.3.5 RNA m~6A维持生物节律与细胞周期 |
| 1.3.6 RNA m~6A与长时记忆形成的关系 |
| 1.4 RNA m~6A的结构生物学研究进展 |
| 1.4.1 RNA m~6A“编码器”结构基础 |
| 1.4.2 RNA m~6A“消码器”结构基础 |
| 1.4.3 RNA m~6A“读码器”结构生物学基础 |
| 1.5 本文研究目的及意义 |
| 第二章 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验常用表达体系菌株及载体 |
| 2.1.1 常用表达体系菌株 |
| 2.1.2 常用载体 |
| 2.2 实验常用仪器 |
| 2.3 实验常用软件和网站 |
| 2.4 实验主要试剂及耗材规格 |
| 2.4.1 实验常用试剂盒 |
| 2.4.2 实验常用试剂耗材 |
| 2.5 实验主要溶液配方 |
| 2.5.1 分子克隆所需试剂及配方 |
| 2.5.2 蛋白表达纯化所需试剂及配方 |
| 2.5.3 蛋白连接实验所需试剂及配方 |
| 2.5.4 甲基转移酶酶活实验所需试剂及配方 |
| 2.5.5 蛋白质结晶主要用到的缓冲试剂 |
| 2.5.6 RNA检测分离变性胶配方 |
| 2.6 主要实验方法 |
| 2.6.1 感受态制备原理及方法 |
| 2.6.2 载体构建 |
| 2.6.3 蛋白表达与纯化 |
| 2.6.4 等温滴定量热(ITC)实验 |
| 2.6.5 限制性蛋白酶水解实验 |
| 2.6.6 甲基转移酶活性实验 |
| 2.6.7 Sortase蛋白连接酶蛋白连接实验 |
| 2.6.8 稳定同位素标记目的蛋白方法 |
| 2.6.9 X-射线小角散射(SAXS)实验方法 |
| 2.6.10 非天然氨基酸标记目的蛋白方法 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 克隆的构建及蛋白的表达 |
| 3.1.1 METTL3-METTL14 克隆的构建 |
| 3.1.2 复合物蛋白的表达 |
| 3.1.3 ZFD蛋白的表达 |
| 3.2 ZFD在全酶复合物中调控底物互作的机制初探 |
| 3.2.1 ZFD-MTD与底物之间的相互作用探索 |
| 3.2.2 ZFD调控活性的系统筛选 |
| 3.2.3 ZFD结构的保守性 |
| 3.3 ZFD-MTD与 ZFD结晶实验的探索 |
| 3.3.1 MTD复合物晶体的重复(大肠杆菌来源) |
| 3.3.2 新的蛋白组合的晶体实验的探索 |
| 3.3.3 不同底物RNA的选择 |
| 3.3.4 加入底物与ligand的共结晶实验 |
| 3.3.5 单独ZFD蛋白的结晶筛选 |
| 3.4 核磁实验结果初探 |
| 3.4.1 解析ZFD-MTD结构的新策略 |
| 3.4.2 ZFD与 MTD之间的蛋白连接实验 |
| 3.4.3 单独的ZFD保持结构完整性 |
| 3.4.4 ZFD与底物RNA之间的相互作用 |
| 3.4.5 ZFD与 MTD之间的柔性连接(linker) |
| 3.5 ZFD溶液结构的解析 |
| 3.5.1 顺磁探针标记目的及策略 |
| 3.5.2 小角散射(SAXS)实验结果 |
| 3.5.3 ZFD的溶液结构解析 |
| 3.6 ZFD对底物识别机制的探索 |
| 3.6.1 RNA与 ZFD的 mapping实验 |
| 3.6.2 ZFD对不同底物RNA的选择偏好 |
| 3.6.3 ZFD在 m~6A修饰中的调控模型 |
| 3.7 本章总结 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 待解决的生物学问题 |
| 4.1.1 催化RNA m~6A的过程是非常动态多变的 |
| 4.2 分子机制研究 |
| 4.2.1 底物时有如此特异性的选择机制 |
| 4.2.2 RNA m~6A writer的催化机制 |
| 4.3 小分子药物开发 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 常用基因序列 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）畜禽源碳青霉烯耐药菌新型金属β-内酰胺酶变异体耐药机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 抗生素使用及细菌耐药性产生 |
| 1.2.2 碳青霉烯类耐药性产生机制 |
| 1.2.3 碳青霉烯酶研究进展 |
| 1.2.4 金属β-内酰胺酶NDM及VIM研究进展 |
| 1.3 研究内容及方法 |
| 1.3.1 畜禽源产碳青霉烯酶耐药菌流行现状分析 |
| 1.3.2 新型MBLs变异体进化方式及对耐药能力影响的研究 |
| 1.3.3 新型MBLs变异体的酶活性研究 |
| 1.3.4 新型MBLs变异体替换位点作用研究 |
| 第二章 碳青霉烯类低敏感菌株的分离及耐药性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 碳青霉烯类低敏感菌株分离和鉴定结果 |
| 2.3.2 金属β-内酰胺酶编码基因筛查和分类结果 |
| 2.3.3 碳青霉烯类耐药菌对抗菌药物的敏感性测试结果 |
| 2.3.4 鸡源bla_(NDM)阳性菌多重耐药基因的分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 我国bla_(NDM)阳性菌流行特点 |
| 2.4.2 我国bla_(NDM)基因流行亚型特点 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 大肠杆菌中NDM-17和NDM-20的发现和进化特征的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 NDM-17和NDM-20序列特点 |
| 3.3.2 NDM-17和NDM-20编码基因定位分析 |
| 3.3.3 NDM-17和NDM-20编码基因遗传环境及质粒特征 |
| 3.3.4 NDM-17和NDM-20编码基因功能性特点 |
| 3.3.5 NDM-17和NDM-20融合蛋白表达质粒的构建结果 |
| 3.3.6 NDM-17和NDM-20融合蛋白表达结果 |
| 3.3.7 NDM-17和NDM-20融合蛋白纯化结果 |
| 3.3.8 NDM-17和NDM-20活性验证和浓度测定分析 |
| 3.3.9 NDM-17和NDM-20酶动力学参数 |
| 3.3.10 NDM-17和NDM-20替换位点作用分析 |
| 3.3.11 NDM-17和NDM-20蛋白结构分析 |
| 3.3.12 NDM-17和NDM-20携带菌株流行病学调查分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 材料与方法的优化和应用 |
| 3.4.2 基因功能研究与酶动力学结果不一致分析 |
| 3.4.3 NDM-17和NDM-20替换位点对生物活性影响分析 |
| 3.4.4 NDM-1变异体进化分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 恶臭假单胞菌中VIM-48的发现和进化特征的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 VIM-48序列特点 |
| 4.3.2 VIM-48进化分析 |
| 4.3.3 VIM-48编码基因遗传环境分析 |
| 4.3.4 VIM-48编码基因功能性分析 |
| 4.3.5 VIM-48融合蛋白表达质粒构建结果 |
| 4.3.6 VIM-48融合蛋白表达分析 |
| 4.3.7 VIM-48融合蛋白纯化结果 |
| 4.3.8 VIM-48酶动力学参数分析 |
| 4.3.9 VIM-48稳定性分析 |
| 4.3.10 VIM-48结构分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 VIM-48编码基因形成机理分析 |
| 4.4.2 VIM-48结构与功能分析 |
| 4.4.3 VIM-48发现的意义 |
| 4.4.4 VIM-48发现对抑制剂研发的启示 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶编码基因的分子克隆及其在大肠杆菌中的高效表达（论文参考文献）
- [1]大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶编码基因的分子克隆及其在大肠杆菌中的高效表达[J]. 万晓余,郑雄,吴淑华,侯云德. 中华实验和临床病毒学杂志, 1996(04)
- [2]枯草芽孢杆菌氨肽酶分泌表达、分子改造及生理功能研究[D]. 高新星. 江南大学, 2014(03)
- [3]芽孢杆菌遗传操作体系初建及工程菌株分子改良[D]. 王慧. 中国农业科学院, 2016(01)
- [4]米曲霉脯氨酸氨肽酶基因克隆及其异源表达[D]. 丁国伟. 江南大学, 2014(03)
- [5]一种赖氨酸氨肽酶在大肠杆菌中表达的策略及其特性表征[D]. 黄浩. 江南大学, 2017(02)
- [6]旋毛虫氨基肽酶的克隆表达与功能鉴定[D]. 郭凯霞. 郑州大学, 2020(02)
- [7]枯草杆菌新型表达系统和遗传操作体系的建立及应用[D]. 张晓舟. 南京农业大学, 2006(02)
- [8]一种内毒素合成途径抑制的整合表达型大肠杆菌菌株的构建及应用[D]. 王凯航. 厦门大学, 2019(08)
- [9]RNA m6A甲基转移酶METTL3锌指结构域的结构与功能研究[D]. 黄金波. 华中农业大学, 2019(02)
- [10]畜禽源碳青霉烯耐药菌新型金属β-内酰胺酶变异体耐药机制研究[D]. 刘志海. 中国农业大学, 2018(12)