一、中国人丙型肝炎病毒结构基因cDNA分子克隆及序列分析（论文文献综述）
杜寿文[1]（2015）在《干扰素诱导跨膜蛋白抑制痘苗病毒作用及其机制研究》文中指出干扰素诱导跨膜蛋白（IFITMs）是目前发现的唯一一类阻断病毒进入细胞的宿主限制因子（HRFs），对很多病毒感染均表现出抑制活性，包括囊膜病毒和非囊膜病毒，如IAV、HIV-1及呼肠孤病毒等。然而，IFITMs所抑制病毒几乎都是RNA病毒，还没有发现该类蛋白对DNA病毒抑制作用的详细报道。因此，为了探究IFITMs蛋白在痘病毒感染中扮演的角色，本研究主要围绕该类蛋白和痘苗病毒的相互作用这一主题，综合应用分子生物学、慢病毒包装技术、真核表达技术、免疫荧光技术、荧光显微镜技术、流式细胞仪、实时荧光定量PCR方法、分子荧光标记病毒示踪技术、siRNA沉默技术、免疫沉淀-质谱分析技术、激光共聚焦显微镜技术以及生物信息学等方法，系统分析IFITMs对痘苗病毒感染、复制及进入的影响以及痘苗病毒感染对该类蛋白的表达调控规律，初步探讨IFITMs的作用机制及其可能的相互作用分子。根据本课题组前期研究基础，首先对来源于HEK293T、HeLa和人PBMCs细胞的IFITMs基因与GenBank登陆基因进行同源性分析，发现IFN处理HEK293T细胞源的IFITM1基因与PBMCs源的基因编码氨基酸序列完全一致；HeLa源的IFITM3蛋白氨基酸序列与其他来源的序列存在1个氨基酸差异（HeLa：R71；其他：C71）；不同源的IFITM2蛋白氨基酸序列存在3个氨基酸差异。而且IFITM2与IFITM3的氨基酸同源性最高、结构相似，IFITM1结构与前两者不同。最终，我们选择人PBMCs细胞来源的IFITMs基因为靶基因，设计引物在N端添加Flag标签序列，然后对其在真核细胞中的表达进行验证，数据显示，IFITMs蛋白在真核细胞内获得表达，为进一步抗病毒研究奠定了基础。进而利用瞬时过表达方法检测IFITMs蛋白对痘苗病毒感染的影响。研究发现，IFITMs过表达对痘苗病毒表现出一定的抑制活性。为了更好地研究IFITMs对痘苗病毒的作用，利用慢病毒表达系统筛选构建了多种稳定表达IFITMs蛋白的细胞系（HEK293T、HeLa、BHK-21、Vero与A549），IFITMs在这些细胞系中无论是mRNA水平还是蛋白水平都获得表达。而且，分离稳定过表达IFITM3的HEK293T和HeLa细胞的膜蛋白或胞浆蛋白，Western blot检测发现IFITM3蛋白主要定位在细胞膜上，可能与其作用有关。基于建立的这些细胞系，进行病毒感染试验。通过荧光显微镜、流式细胞仪等分析发现，低感染复数的痘苗病毒在稳定表达IFITMs蛋白的HEK293T、A549、BHK-21或Vero细胞系中的感染明显受到抑制，但在HeLa细胞系中没有发现IFITMs对痘苗病毒感染显着的抑制作用，表明IFITMs抗病毒作用的发挥具有细胞依赖性。实时荧光定量PCR和Western blot方法对感染不同时间点病毒基因的表达进行分析，发现IFITMs蛋白延缓病毒基因的转录和表达，由于前期发现该类蛋白对病毒基因的表达没有直接影响，因此认为IFITMs通过抑制病毒的增殖延缓了病毒基因的转录和表达。在IFITM3稳定表达的BHK-21细胞系中病毒生长曲线显示，IFITM3抑制病毒的增殖。噬斑分析实验表明，IFITM3抑制病毒在细胞间的传播和扩散，抑制病毒的复制。此外，实验中还发现IFITMs蛋白抑制鸡痘病毒感染BHK-21细胞。为了进一步探讨内源性IFITMs在细胞固有抗病毒反应和IFN介导的抗病毒反应中的作用，设计了靶向干扰IFITMs的siRNAs，在IFITM蛋白组成性高表达的A549和HeLa细胞中进行了siRNA干扰实验，显示内源性IFITMs蛋白敲低后没有表现出感染显着增强现象，但减弱了IFN介导的抗痘苗病毒作用，而且表现出细胞类型差异。另外，在过表达IFITM3的293T细胞系中的siRNA干扰实验显示，IFITM3沉默后增强病毒感染。此外还分析了siRNA处理及处理后病毒感染时的细胞活性，发现IFITMs基因沉默对细胞的活力没有显着影响，但在病毒感染时维持细胞活性发挥一定的作用。在以上研究的基础上，以IFITM3为主要研究对象，对其在抑制病毒感染的作用阶段及机制进行了初步探索。研究发现，IFITM3抑制病毒早晚期基因转录起始，表明IFITM3作用于病毒早期基因转录起始之前的病毒颗粒的进入阶段。进而，利用激光共聚焦显微镜和分子荧光标记病毒技术分析了IFITM3对病毒-细胞结合的影响，研究发现IFITM3干扰病毒-细胞吸附过程。同时，利用激光共聚焦显微镜观察病毒进入过程，综合以上数据发现IFITM3在病毒进入阶段已经发挥抑制作用。此外，在过表达IFITM3的BHK-21细胞系中对IFITM3进行了定位分析，结果发现IFITM3在细胞膜和细胞浆内均有定位，结合前面IFITM3为膜蛋白的数据，表明该蛋白定位于细胞膜等膜结构上，有利于解释该蛋白对病毒吸附的干扰作用。通过内体酸化或酸化抑制分析显示，IFITM3主要抑制低pH介导进入的病毒感染，且细胞培养环境pH的降低不利于IFITM3作用的发挥。此外，还发现痘苗病毒感染晚期下调IFITMs蛋白的表达，但在mRNA水平变化不明显。此外，痘苗病毒感染后细胞内部分IFN产生通路上关键分子的转录分析显示，STING、IRF3和IRF7转录变化显着，但在感染晚期IFN和IFNβ转录增强（48hpi）。提示，痘苗病毒感染负调节IFITMs蛋白的表达。同时为了更好地理解IFITM3作用机制，我们还利用“Flag免疫沉淀-质谱分析”筛选了病毒感染时IFITM3可能的相互作用蛋白，发现65个未感染细胞鉴定结果中不存在的宿主蛋白和6个痘苗病毒蛋白，正在对这些蛋白进行验证，在下一步更为精细的实验分析中，可能会发现相关的相互作用分子，阐明其作用分子机制。综上，本论文为深入理解IFITMs的抗病毒谱和病毒与细胞间复杂的相互作用关系提供了一些线索。尽管当前对于IFITMs抗病毒的认识主要集中在有囊膜的RNA病毒，但我们提供了在过表达的情况下，IFITMs蛋白通过干扰痘苗病毒的进入阶段限制病毒感染。同时我们还分析了IFITMs蛋白在IFN介导的抗病毒反应中的作用。这些结果有助于探讨IFITMs蛋白作为病毒进入抑制因子的潜在应用价值及深入分析痘苗病毒进入途径和IFITMs抗病毒分子机制。
苏晓慧[2]（2014）在《狂犬病SRV9病毒糖蛋白基因重排质粒pMD-NG及辅助表达质粒的构建》文中进行了进一步梳理采用RT-PCR方法，分别扩增了狂犬病SRV9病毒结构基因的完整开放阅读框，分别得到了N基因、P基因、M基因、G基因，L基因序列，片段大小分别为1352bp，983bp，608bp,1572bp和6384bp，并依次连接于pMD19-T克隆载体，经PCR、双酶切及基因测序鉴定。结果表明狂犬病病毒SRV9的N基因高度保守，没有发生突变，M基因发生两处同义碱基突变。采用pcDNA3.1（+）表达载体构建了含有SRV9核蛋白（N）、磷酸化蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）、RNA依赖的RNA聚合酶蛋白（L）的5个辅助表达载体质粒，分别命名为pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-M，pcDNA-G、pcDNA-L。经过酶切及测序鉴定，pcDNA-P和pcDNA-M中有各有1处碱基突变，pcDNA-G中也有两处碱基突变。经软件分析N蛋白、G蛋的抗原位点和疏水性没有变化，表明所构建的辅助质粒可以用于狂犬病病毒SRV9基因重排的反向遗传学系统。通过重组PCR技术分别融合SRV9N-G基因和SRV9P-M基因，将融合基因克隆于pMD19-T克隆质粒中进行酶切测序鉴定。除融合基因的个别碱基发生无意义突变外，融合部位完全。融合部位的忠实度说明采用重组PCR方法构建病毒全长cDNA简便快捷、行之有效的一种方法。
夏婷婷[3]（2014）在《狂犬病病毒结构基因的克隆及犬瘟热病毒N蛋白基因与eGFP基因重组质粒的构建》文中研究指明本研究从BHK-21细胞培养的狂犬病病毒SRV9株病毒液中提取病毒总RNA，通过反转录PCR（Reverse transcript PCR，RT-PCR）技术进行狂犬病病毒结构基因的扩增，得到1352bp的N基因（核蛋白基因，nucleoprotein gene，N），893bp的P基因（磷酸化蛋白基因，phosphoprotein gene，P），608bp的M基因（基质基因，matrix protein gene，M），1574bp的G基因（糖蛋白基因，glycoprotein gene，G），3372bp的L1基因（大转录蛋白1，large protein gene1，L1）以及3012bp L2基因（大转录蛋白2，large protein gene2，L2），并将其分别连接于pMD19-T载体，进行测序并与SAD B19株比对，实验结果如下：N基因、P基因、M基因、G基因、L1基因以及L2基因的核苷酸序列与SAD B19株的核苷酸同源性分别为100%、99.66%、99.67%、99.04%、100%及98.70%，氨基酸序列的同源性分别为100%、98.99%、100%、98.65%、100%以及99.91%。应用重组PCR技术进行基因片段的拼接，构建增强型绿色荧光蛋白eGFP基因与犬瘟热病毒N蛋白基因的重组质粒（pT-eGFP-CDV N）、狂犬病病毒融合基因P-M的重组质粒（pT-PM）以及融合基因L1-L2的重组质粒（pT-L）。实验结果如下：通过重组PCR技术获得的融合基因eGFP-CDV N、P-M和L的片段分别为2292bp、1501bp和6384bp，重叠区域完全重合，未发生突变及错位。本研究成功构建融合基因片段，为狂犬病病毒SRV9株全长cDNA的构建以及RV减毒重组基因疫苗的研究探索条件。
印春生[4]（2014）在《表达FMDV-VP1重组PPRV的构建及生物学特性与免疫应答研究》文中认为口蹄疫（Foot and mouth disease, FMD）和小反刍兽疫（Peste des petits ruminants, PPR）是严重危害山羊、绵羊等家养和野生反刍动物的两种烈性病毒性传染病,分别由口蹄疫病毒（FMDV）和小反刍兽疫病毒（PPRV）引起。在我国,FMD和PPR均被列为一类动物传染病,疫苗免疫是防控此两种疫病的重要手段。灭活疫苗广泛应用于羊的FMD免疫预防,但其存在免疫期短、成本昂贵、不能完全阻止病毒在体内复制等不足。PPR弱毒疫苗N75/1株已被证明安全、有效,广泛应用于亚、非等PPR流行国家和地区。包括中国在内的广大发展中国家同时存在FMD和PPR流行,给养羊业造成重大经济损失。采用N75/1株为载体,研制表达FMDV保护性抗原的重组病毒活疫苗,有可能实现一种活疫苗预防PPR和FMD两种疫病,不仅有利于降低FMD防疫成本,提高FMD免疫覆盖率,而且弥补了灭活疫苗缺乏激活细胞介导免疫反应的不足。本研究旨在验证上述疫苗技术策略的可行性。为此,本研究首先以亚洲1型FMD疫苗毒株所提取的RNA为模板,以合成的VP1特异性引物进行RT-PCR扩增,获得了该毒株的VP1基因,并将其连接至pET-21a载体后进行表达。将纯化的VP1蛋白免疫大耳白兔制备了多克隆抗体,ELISA测定其抗体效价为1：8192。同时,应用表达纯化的VP1蛋白作为包被抗原建立了检测牛亚洲1型FMDV抗体的间接ELISA方法。再利用已经建立的PPRV/N75/1株反向遗传操作系统,构建了表达亚洲1型FMDV-VP1蛋白的重组PPRV。构建简要过程为先在pN75/1-insertion质粒载体的P和M基因之间插入了亚洲1型FMDV-VP1基因,构建了pN75/1-VP1重组质粒,再将pN75/1-VP1质粒、pCA-N、 pCA-P和pCA-L共转染入Vero细胞,获得了重组病毒,命名为rPPRV-VP1。rPPRV-VP1在Vero细胞上的生长曲线与PPRV/N75/1相似,病毒含量达107.7TCID50/mL; IFA和Western-blot分析证实VP1蛋白在rPPRV-VP1感染Vero细胞获得正确表达；将rPPRV-VP1在Vero细胞上连续传25代次,对不同代次病毒液的病毒含量测定和RT-PCR分析,证明rPPRV-VP1在传代过程中能够保持稳定表达重组VP1蛋白,显示出良好的遗传稳定性。为验证rPPRV-VP1对免疫靶动物的安全性和研究抗体持续期,采用6×107TCID50剂量颈部皮下接种5只山羊,持续观察28日。结果表明rPPRV-VP1对山羊具有良好的安全性；同时以6×106TCID50接种山羊后定期采血检测PPRV和FMDV中和抗体,结果表明,接种后第56日两种病毒中和抗体效价均达到峰值,并能够维持到接种后140日无明显下降。最后对rPPRV-VP1的免疫原性及其对FMDV的攻毒保护效力进行了评价。rPPRV-VP1和N75/1疫苗株分别按6×106TCID50剂量,分别颈部皮下接种健康易感山羊和牛,接种后定期采血检测PPRV和FMDV的中和抗体,并在免疫后接种亚洲1型FMDV强毒进行FMD攻毒保护效力测定。羊的试验结果为,接种后第14日,所有rPPRV-VP1接种羊PPRV和亚洲1型FMDV中和抗体均转为阳性；PPRV/N75/1接种照羊PPRV中和抗体全部转阳,但FMDV中和抗体保持阴性；两组羊的PPRV中和抗体滴度无显着差异。接种后第40日时进行攻毒,观察10日,接种PPRV/N75/1的4只羊均表现出典型FMD症状；接种rPPRV-VP1的6只羊中,4只羊观察期间无任何口蹄疫症状,另2只羊的发病时间延迟,且症状较PPRV/N75/1组羊明显较轻。牛的试验结果为,接种rPPRV-VP1的5头牛均诱导产生显着的亚洲1型FMDV中和抗体,而PPRV/N75/1接种的2头牛均未产生FMDV抗体。接种后第21日时进行攻毒,观察10日,接种PPRV/N75/1的2头牛均表现典型的FMD症状,接种rPPRV-VP1的5头牛中有2头未发现FMD症状,另3头牛和PPRV/N75/1接种牛相比FMD发病时间推迟,症状显着减轻。总结,本研究利用PPRV/N75/1株反向遗传系统,构建了表达亚洲1型FMDV-VP1的重组病毒rPPRV-VP1。rPPRV-VP1接种山羊安全性良好；接种山羊和牛均可诱导产生PPRV和FMDV中和抗体,并能够产生对亚洲1型FMDV强毒的攻击的免疫保护。结果证明,PPRV/N75/1株作为构建FMD活载体疫苗具有技术可行性,有可能实现一种活病毒疫苗同时预防PPR和FMD两种重大动物疫病。
朱嘉磊[5]（2014）在《Ⅳ型猪源HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系的建立》文中研究指明戊型肝炎（hepatitis E, HE）是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）感染引起的病毒性肝炎症,具有急性病毒性肝炎的临床和流行病学特征,其临床症状与甲型肝炎相似。急性戊型肝炎患者一般发病期为3至4周左右,期间除了体内转氨酶水平升高之外,一般不产生明显的并发症。但研究也表明,急性戊型肝炎对孕妇具有威胁。孕妇在妊娠期内,感染急性戊型肝炎的概率要大于其他人群,因其导致的流产率接近20%。免疫力低下的患者感染HEV后能够发展为慢性戊型肝炎。有些慢性戊型肝患者因肝脏快速纤维化而出现肝硬化,并最终导致肝功能衰退甚至肝脏衰竭。现有的研究已发现,戊型肝炎病毒共分为4种基因型,其中Ⅳ型HEV能普遍感染人和牲畜,在卫生条件差或饮水问题严重的地区极易大规模爆发和流行,对社会造成巨大和健康隐患和经济损失。为了对Ⅳ型HEV更好的进行检测和生物学活性研究,本文做了两方面的研究：研究一根据GenBank收录的多株Ⅳ型猪HEV ORF2保守基因序列,设计一对特异性引物,建立起一套Ⅳ型HEV SYBR Green Real-time RT-PCR方法,并对其稳定性,特异性及灵敏度做了相关分析,同时与常规的巢式PCR（或称nested-RT-PCR）进行比较。结果显示,建立的标准曲线相关系数（R2）、组内重复性Ct值变异系数（CV%）和组间重复性Ct值变异系数（CV%）均符合要求,显示该方法具有良好的稳定性。且与传统的巢式PCR相比,本研究所建立的荧光定量PCR方法能更好的运用于对Ⅳ型猪HEV的检测和定量研究。研究二为获得单一的、高纯度的Ⅳ型猪HEV病毒液,本研究将猪戊型肝炎急性期内的Ⅳ型HEV阳性粪便悬液经快速离心和过滤后感染人肝癌细胞（smmc-7721）,进行病毒毒株的纯化与扩增,成功的建立起一套稳定的Ⅳ型猪HEV体外细胞培养体系。接种阳性粪便悬液的细胞在接毒后发生大量凋亡并裂解,并发现人肝癌smmc-7721细胞系支持Ⅳ型猪HEV的增值。对不同初始病毒接种量下HEV的增值趋势分析显示,在一定条件和范围内,HEV初始接种量越大,病毒的增值速度越快,增值效率也越高。此外对Ⅳ型猪HEV毒株进行了7次持续的传代培养,细胞上清液中HEV的拷贝量最高可在接毒后第72天增值至2.05×107copies/mL。与传统的HEV体外细胞培养体系相比,本研究根据人肝癌smmc-7721细胞所建立的体外培养体系能更好的应用于对Ⅳ型猪HEV进行大量的、持续的培养。通过本研究,初步构建起一套较为稳定的Ⅳ型猪HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系,能在检测对Ⅳ型猪HEV进行检测的同时,对HEV在smmc-7721细胞中的增值进行较为准确的定量。本研究对戊型肝炎的检测与防治具有积极的意义,也利于对在分子水平对HEV展开进一步的研究。
马云云[6]（2014）在《HTLV-1 HBZ对cyclin D1表达的调控作用和HTLV-1 ELISA检测方法的建立》文中研究说明背景与目的人类T淋巴细胞白血病病毒（human T-lymphotropic virus,HTLV）是最早发现的人类逆转录病毒,主要包括四种亚型,其中HTLV-1和HTLV-2二者的基因水平70%同源。成人T细胞白血病（adult T-cell leukemia,ATL）和HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫（HTLV-1assoeiated myelopathy/Tropical SPastio paraparesis,HAM/TSP）是主要的HTLV-1感染相关性疾病。HTLV-1和HTLV-2可通过垂直途径，性接触和肠道外途径（血液传播和静脉用药）进行传播,在全球均有流行。HTLV-1主要流行于日本、加勒比地区,中美洲和南美洲及中非西非等地区。HTLV-2流行主要是印第安人群和某些中非部落,以及欧洲和北美的某些特定人群。我国属于HTLV非流行区,自1985年来开展过几次HTLV流行调查,感染率为0.06%-1.27%,流行区域主要分布于东南沿海地区。但对于人口大省的河南和湖北,对HTLV感染及流行的研究报道较少。由于不同地域的病毒株之间存在差异,目前的HTLV-1检测方法均存在一定的假阳性或假阴性问题。HBZ是近年来在HTLV-1感染细胞中发现的一种由基因组负链或互补链编码产生的病毒蛋白,在大部分ATL细胞中成阳性表达,可以抑制Tax介导的病毒基因表达。HBZ还能通过它的bZIP结构域,与宿主的多种bZIP因子相互作用,从而改变下游基因转录活性,被认为在HTLV-1致病机制上起着重要作用。但HBZ在HTLV-1感染细胞中的致瘤作用机制还需进一步探讨。本研究以HBZ病毒蛋白为对象,研究HBZ对293T细胞周期蛋白cyclin D1表达的影响,并以HBZ为基础,初步建立了HTLV-1的ELISA检测方法,最后,对华中地区不同人群中的HTLV1/2感染情况作了流行病学调查。为了解HBZ在细胞周期进程中的作用机制,改进HTLV-1筛查方法,以及了解河南湖北两省HTLV感染流行状况,提供了一定的实验基础和理论依据。第一部分HBZ通过与转录因子CREB相互作用抑制cyclin D1表达方法1.扩增全长HBZ、HBZ-AD以及HBZ-bZIP三个片段,分别克隆入慢病毒载体LV5,包装纯化重组慢病毒；分别将三个慢病毒感染293T细胞,CEM细胞及Jurkat细胞,建立稳定表达HBZ三个片段的细胞系。2. RT-PCR和Western Blot检测293T-HBZ细胞、CEM-HBZ细胞及Jurkat-HBZ细胞中cyclin D1的nRNA水平和蛋白质水平。3.构建cyclin D1启动子全长及包含不同转录因子区域的五个报告基因载体,检测表达不同HBZ片段的细胞中cyclin D1启动子的活性状况。4.提取空白293T细胞及293T-HBZ细胞总蛋白,利用anti-HA抗体进行免疫共沉淀（CoIP）,再利用anti-CREB抗体通过Western Blot检测HBZ与CREB司在体内的相互关系。5.构建CREB的原核表达载体pGEX-2T-CREB,利用诱导、表达、纯化获得的融合蛋白GST-CREB与HBZ进行GST pull-down,检测HBZ与CREB司在体外的相互关系。6.构建HBZ-bZIP的原核表达载体pGEX-2T-HBZ-bZIP,利用诱导纯化的GST-HBZ-bZIP融合蛋白进行GST pull-down,检测HBZ-bZIP和HBZ-AD与CREB间在体外的相互关系。结果1.HBZ、HBZ-AD、HBZ-bZIP三个重组慢病毒载体经酶切和测序鉴定正确；三个重组慢病毒感染、筛选得到稳定表达HBZ、HBZ-AD、HBZ-bZIP的细胞株。2. RT-PCR和Western Blot结果均显示,与空白293T细胞相比,293T-HBZ细胞和293T-HBZ-bZIP细胞中cyclin D1基因表达水平显着降低。说明HBZ的bZIP结构域可以降低细胞中cyclin D1转录和表达水平。3.将cyclin D1全长启动子报告基因载体pGL3-CD1转染空白CEM细胞、CEM-HBZ细胞、CEM-HBZ-AD细胞及CEM-HBZ-bZIP细胞后,表达HBZ和HBZ-bZIP的细胞中cyclin D1启动子活性降低。当报告基因载体中启动子片段长度包含CRE位点时（CD2和CD3）,细胞中启动子活性无明显下降；而当删除CRE位点后（CD4）,空白细胞和HBZ-AD细胞中启动子活性下降约50%,说明CRE位点是cyclin D1启动子上的一个重要转录因子。4.CoIP结果显示,利月anti-HA抗体对293T-HBZ细胞总蛋白进行沉淀获得的复合物中,可以检测到CREB;利用GST-CREB融合蛋白进行GST pull-down实验结果说明CREB和HBZ蛋白在体外可以直接结合。5.进一步GST pull-down实验结果显示,GST-CREB融合蛋白可以与HBZ-bZIP相互结合,而GST-HBZ-bZIP融合蛋白也可以与CREB相互结合；GST-CREB融合蛋白可以与HBZ相互结合,但不与HBZ-AD目互结合。第二部分以HBZ为抗原的HTLV-1ELISA检测方法的初步建立方法1.PCR扩增HBZ目的基因,克隆入T载体,酶切鉴定后,亚克隆入原核表达载体pET-29a,经PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定后,构建HBZ原核表达载体。2.通过IPTG诱导HBZ蛋白表达,并利用His标签通过Ni2+亲和层析柱纯化蛋白,SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定后,对目的蛋白进一步进行透析纯化。3.以HBZ蛋白为抗原包被酶标板,以亲和素标记的HBZ蛋白为酶标抗原,利用双抗原夹心法检测血清标本中的相应抗体,优化反应条件,建立HTLV-1ELISA检测方法。4.通过对标准血清、临床血清的检测,与其他商品试剂盒的比较,以及稳定性检测,对该ELISA检测方法进行评价。结果1.PCR扩增得到HBZ片段,酶切鉴定及测序鉴定证实得到重组原核表达质粒pET-29a-HBZ。2.通过IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示25kD处特异性条带；经过Ni2+亲和层析柱对表达蛋白进行纯化后,SDS-PAGE电泳显示25kD处单纯条带；Western Blot结果显示纯化后的HBZ蛋白具有良好的抗原性。3.纯化HBZ蛋白标记生物素后,经亲和素鉴定酶标抗原活性良好；确定使用30μl标本,并采用“三步法”的反应模式检测40min,可获得较好的检测效果。4.对参比血清的检测结果显示该ELISA方法具有较好的检测效果；稳定性检测结果显示该ELISA检测试剂具有较好的稳定性；对临床血清标本的检测,及与国内外商品试剂进行比较的结果显示,该检测法灵敏度和特异性分别为71.6%,96.7%,Kappa值为0.54,有较好的一致性。第三部分华中地区不同人群中的HTLV-1/2流行病学调查方法1.收集2008年-2011年间,河南湖北两省血清标本5480份,包括献血人群（3548份）,血液肿瘤患者（908份）和高危人群（1024份）三组。利用北京万泰的HTLV检测试剂盒对标本进行初步筛查,阳性标本再进一步通过Western Blot确证HTLV-1或HTLV-2感染情况。2.对感染状况及高危因素进行单因素方差分析及多元逻辑回归分析。3.对经Western Blot证实的HTLV-1阳性标本提取前病毒基因组,对全长基因组序列进行分段扩增,与T载体连接后送测序,利用生物学软件对序列进行拼接；对HTLV-1前病毒基因组序列进行分析,并利用进化树进行同源性分析。结果1.ELISA检出17例HTLV-1/2抗体阳性标本,经过Western Blot证实,HTLV-1抗体阳性7例,HTLV-2抗体阳性3例。2. HTLV-1和HTLV-2间感染率无差异,但高危人群组较献血源组HTLV-1感染率增加（P=0.03）; HTLV-1与HIV、HBV、HCV合并感染较常见（P<0.05）。HTLV-1感染流行与HIV及HBV相关（P=0.006,P=0.000）。3.经过测序和拼接获得HTLV-1全病毒基因组序列（KC807984）；该序列长度为9034bp,属Genotype A,与其他中国病毒株亲缘关系最密切,与日本病毒株及加拿大病毒株亲缘较近。结论1.HBZ可以通过其bZIP结构域,与转录因子CREB相互作用,影响CREB与cyclinD1启动子区域的CRE位点结合,进而抑制下游基因的转录,导致293T细胞中cyclin Dl表达水平降低,为HBZ在细胞周期变化中的作用机制研究提供理论依据。2.初步建立了以HBZ为抗原的HTLV-1ELISA检测方法。3.流行病学调查发现华中地区不同人群中存在HTLV-1/2感染病例,无偿献血人群及血液肿瘤患者中感染率低,高危人群组中HTLV-1/2感染率相对较高,HIV和HBV感染是HTLV-1感染的高危独立因素；测序得到的HTLV-1病毒基因组序列分析显示与国内其他病毒株亲缘关系近,为本地区特定人群进行HTLV-1/2筛查及制定无偿献血标准提供资料依据。
金宏丽[7]（2013）在《狂犬病病毒SRV9株反向遗传系统的建立与初步应用研究》文中研究说明狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染引起的高致死性人兽共患传染病，一旦出现临床症状，死亡率几乎100%。RABV属于单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组主要编码5种结构蛋白。近年来随着负链RNA病毒反向遗传学的发展，不同毒株狂犬病病毒的反向遗传操作系统也相继被建立。基于反向遗传操作系统的狂犬病病毒载体也被广泛用于新型疫苗的研制和神经示踪等研究。狂犬病病毒SRV9株是我国研究者将狂犬病病毒SAD株在BHK细胞上通过空斑克隆筛选出的弱毒疫苗株，对多种动物无致病性，且具有免疫原性好等优点。因此，建立狂犬病病毒SRV9株反向遗传操作系统，并利用其构建与筛选新型安全、高效狂犬病疫苗对于我国狂犬病的综合防控具有重要意义。此外，也可以以此构建新型病毒载体用于其它疫病新型疫苗研究。为分析狂犬病病毒SRV9株全长基因组序列，通过Primer Premier V5.0软件对SRV9株全长基因序列设计13对测序引物，分别PCR并连接到pEASY-Blunt载体后进行序列测定。测序结果与网上公布序列一致。通过DNAStar软件分析SRV9株全长基因序列，利用单一酶切位点，将全长cDNA分为相互重叠的四段，根据重叠区域的酶切位点拼接全长。并且通过PCR方法分别在全长的3′端和5′端引入锤头状核酶HamRZ和乙肝丁型核酶HdvRZ序列，以pCI和pcDNA3.1（+）载体为基础，构建全长真核表达质粒pCI-SRV9和pD-SRV9。同时分别以pCI和pcDNA3.1（+）载体为基础，构建分别表达SRV9株N、P、G、L蛋白的辅助质粒：pCI-N、pCI-P、pCI-G、pCI-L；pD-N、pD-P、pD-G、pD-L。在表达载体构建过程中，起始密码子前增加了可增强蛋白表达的Kozak序列，终止密码子后增添了额外的终止密码子，用以有效终止转录。分别将pCI-SRV9或pD-SRV9与相应的辅助质粒通过脂质体LipofectamineTM2000共转染BSR细胞并拯救重组病毒，其中全长质粒与辅助质粒N、P、L、G的使用量依次为2.5μg、0.625μg、0.3125μg、0.125μg、0.1875μg。结果表明，两种质粒表达系统均可拯救到有感染活性的病毒，且pD-SRV9表达质粒的拯救效率（8/8）远高于pCI-SRV9表达质粒（3/30）。对拯救获得的重组病毒进行体外生物学特性分析，结果表明：拯救获得的重组病毒在BSR、NA细胞上的生长性能与野生型SRV9无明显差异（p>0.05）。通过PCR方法在狂犬病病毒SRV9株基因组的P与M基因间引入外源基因表达元件，根据引入元件的具体位置不同，构建了两种外源基因表达载体：第一种为在P基因的终止密码子后、P基因的转录终止信号poly A前引入外源基因表达元件PE-PS-BsiWI-PmeI，命名为pD-SRV9-PM-eGFP；第二种为在P基因的转录终止信号polyA后、M基因的转录起始信号前引入外源基因表达元件PS-BsiWI-PmeI-PE，命名为pD-SRV9-sPM-eGFP。其中PE、PS分别为模拟的SRV9株P基因的转录终止信号TGAAAAAAA和转录起始信号AACACCCCT。将eGFP作为指示目的基因插入上述两种表达载体的相应酶切位点间构建表达eGFP的全长质粒。将两种表达外源基因的全长表达质粒与辅助质粒共转染BSR细胞，结果均可成功拯救到表达eGFP的重组狂犬病病毒，两者的拯救效率无明显差异，获得的2种表达eGFP的重组病毒在体外的生长特性无显着差异，且与野生病毒也无显着差异，即外源基因eGFP的插入和表达不影响重组狂犬病病毒的体外生长特性。本研究成功构建了狂犬病病毒SRV9株反向遗传系统，并研制了可表达外源基因的重组狂犬病病毒载体，为进一步研究RABV的致病机理、研制狂犬病新型疫苗或开发以RABV为载体的其它疾病疫苗奠定基础。
刘存霞[8]（2013）在《鸡痘病毒282E4株基因组和蛋白质组解析、载体构建与HIV重组疫苗研究》文中提出鸡痘病毒（Fowlpox virus, FPV）是脊椎动物痘病毒科、禽痘病毒属的代表成员,该病毒仅感染禽类,可引起禽类动物的疾病。因禽痘病毒通常不感染人与其他哺乳动物,且能有效表达大量的外源DNA,并可在感染细胞的胞浆中复制等特点而成为活病毒载体研究的热点。然而,目前对FPV的基因组、结构、毒力、致病机制、宿主范围及其免疫逃逸等方面尚无系统深入的研究。为设计出更加安全、有效的FPV表达载体系统,本研究以FPV282E4株为研究对象,开展其基因组背景分析、蛋白质组成、新型表达载体构建及重组鸡痘病毒载体疫苗筛选和实验免疫研究。本研究首先采用高通量Illumina测序技术对中国弱毒疫苗株FPV282E4株进行全基因组测序,通过对测序数据组装后利用基因预测软件进行基因de novo预测及功能注释。结果测定FPV282E4全基因组为308829bp,GC含量约为28%,预测出313个编码序列（Coding sequence, CDS）,并与FPVUS株、CNPV ATCC株进行核酸平等共线性分析,通过功能注释表明FPV282E4的基因具有核营酸代谢、运输、转录、复制、重组、修复及翻译后修饰、伴侣蛋白和信号转导功能。在此基础上,采用LC-ESI-MS/MS对鸡痘病毒282E4株进行蛋白质全谱分析,鉴定出76个蛋白,对其进行功能注释,结果与基因组序列相互印证,从而为重组鸡痘病毒载体构建及感染与致病机制研究奠定理论基础。基于FPV282E4全基因组序列测定数据,针对本实验室前期在鸡痘病毒载体构建中遇到的重组效率较低、筛选周期长等问题,本研究优化FPV282E4株5个非必需CDS区作为候选同源重组臂,通过插入含有PE/L早／晚期启动子和终止信号的三基因表达盒,进行重组鸡痘病毒载体的构建,分别以红、绿、蓝三种荧光蛋白基因作为报告基因,进行病毒重组及外源基因表达活性的验证。荧光蛋白表达检测结果表明,三个表达盒均可独立表达外源基因；通过对rFPV进行形态学、生物特性检测,结果成功构建出3个rFPV,且基因缺失未影响重组鸡痘病毒的形态及其复制,3株重组鸡痘病毒无差异。在成功获得表达载体的基础上,以本实验室前期构建的包含HIV-1复合多表位（MEGNp24）、CpG基序和CTB基因（CCMp24）的免疫原为基础,构建表达HIV-1复合多表位的rFPV-CCMP24,通过荧光噬斑筛选纯化rFPV-CCMP24。采用PCR、RT-PCR、Western Blot方法进行重组病毒及外源基因表达的鉴定。成功获得rFPV-CCMp24,重组病毒复制效率及病毒滴度与野生株FPV一致,重组病毒能够在体外表达外源基因且具有反应原性。然后开展了rFPV-CCMp24的小鼠免疫试验,分析其免疫原性,同时结合前期构建的重组痘苗病毒rddVTT-CCMp24进行联合免疫研究,通过检测特异性HIV-1抗体、淋巴细胞刺激指数、淋巴细胞分泌IFNy以及流式细胞术检测CD3+CD4+、CD3+CD8+等指标,综合分析免疫效果,探寻有效的病毒载体为基础的免疫策略。结果显示,rFPV-CCMp24单独免疫及与rddVTT-CCMp24联合免疫,均能诱导细胞免疫及体液免疫。本研究为研制有效鸡痘病毒活载体疫苗及多载体疫苗联合免疫的临床前实验研究奠定了基础。
张润祥[9]（2013）在《重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究》文中提出干扰素（Interferon，IFN）是由动物细胞产生的，具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等作用的一类细胞因子。IFN分为I型、II型和新发现的III型，III型干扰素又称为IFN-λs，其氨基酸水平和蛋白质功能与I型相近。由于IFN-λs受体组织分布特异性，IFN-λs主要在呼吸道、消化道和皮肤黏膜组织以及上皮细胞或某些肿瘤细胞发挥抗病毒作用，与IFN-α相比，能够有效地降低毒副作用。在我国，奶牛病毒性传染病如口蹄疫（FMD）、牛病毒性腹泻病（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）等可通过消化道、呼吸道传播的疫病，至今危害仍比较严峻，因此牛IFN-λs成为继IFN-α和IFN-β后，抗病毒制剂研发的一个方向。为深入研究牛IFN-λs的抗病毒活性及其机制，揭示其用于防治牛病毒病的可行性，本研究利用毕赤酵母分泌表达系统表达了无冗余氨基酸的重组牛IFN-λ3，同时酵母分泌表达了重组牛IFN-α和IFN-β，大肠杆菌表达系统表达了重组牛IFN-β和IFN-γ，深入研究了各重组干扰素的抗病毒活性，比较了IFN-λ3与I型和II型干扰素单独或联合应用抗病毒活性的异同，主要研究内容如下：1.首先在毕赤酵母表达系统实现了无冗余氨基酸重组牛IFN-λ3的可溶性表达。参考酵母密码子使用偏好性，同时考虑自由能和二级结构等要素，将已知的牛IFN-λ3（boIFN-λ3）基因序列优化成适合酵母表达的最优序列，然后利用重叠延伸PCR技术将设计的相互重叠20bp左右的14条寡核苷酸融合，获得boIFN-λ3基因和及其等位基因命名为boIFN-λ3*（1个基因差异使得成熟肽第18位氨基酸不同）。通过酶切连接的方式，成功构建酵母分泌表达载体pPICZαA-boIFN-λ3和pPICZαA-boIFN-λ3*。在毕赤酵母表达系统中通过一系列的筛选鉴定，如阳性重组酵母菌的鉴定，高表达酵母菌株的筛选，诱导表达条件的优化等最终表达了重组boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白，表达量均可达1.2g/L，均以糖基化蛋白（23kDa大小，占总蛋白70%左右）和非糖基化蛋白（18kDa大小，占总蛋白15%左右）2种形式表达。经硫酸铵盐析和阳离子交换层析获得了纯化蛋白，重组蛋白均具有良好的抗原性，同时制备了抗boIFN-λ3*多抗。在MDBK-VSV系统测定重组boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白的生物学效价分别为2.39±0.15×106U/mg/ml和2.15±0.40×106U/mg/ml。理化特性方面，重组蛋白均对胰酶敏感，对热较为不敏感（63℃），对酸碱部分敏感（pH2活性下降2倍），可被特异性抗体中和。从重组蛋白的表达、纯化、糖基化分析、理化特性、生物学活性和致细胞毒性等综合分析，重组蛋白boIFN-λ3和boIFN-λ3*没有区别。2.表达纯化了重组牛IFN-α/IFN-β/IFN-γ并初步测定了它们的生物学活性。为比较重组boIFN-λ3与I型和II型IFN的抗病毒活性，酵母分泌表达系统表达了重组牛IFN-α和IFN-β，大肠杆菌系统表达纯化了重组牛IFN-β和IFN-γ，测定它们的生物学活性分别为1.50±0.98×107、1.25±0.38×104、2.44±0.91×103和0.81±0.21×105U/mg/ml。在MDBK-VSV系统中4种重组干扰素抗病毒效价大小排序为boIFN-α>boIFN-λ3> boIFN-γ>boIFN-β。在EBK和MDBK细胞上利用MTT法测定4种重组干扰素的细胞毒性，结果显示，重组boIFN-λ3和其他IFNs单独或联合应用致细胞毒性均较小。3.重组boIFN-λ3和boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ诱导Mx1蛋白和ISRE启动子活性的研究。经过Western blot检测重组boIFN-λ3在4种上皮细胞源细胞（EBK、BT、MDBK和BMEC）中均能够诱导产生Mx1蛋白。采用双荧光素酶报告基因系统，通过检测ISRE报告基因的表达水平来间接反映干扰素的生物活性。结果显示不同浓度的重组IFNs诱导启动子表达均呈一定程度的剂量依赖性，重组boIFN-λ3和boIFN-γ诱导报告基因的表达水平呈时间依赖性，48h达到较高水平；而boIFN-α和boIFN-β能够快速的诱导报告基因表达，干扰素作用12h即达到较高的水平，且维持到48h。联合应用时部分组合比单独应用时诱导ISRE活性高。因此各IFNs刺激产生的ISRE启动子活性的差异可能是重组boIFN-λ3与其他IFNs协同抗病毒活性的机理之一。4.比较研究了重组boIFN-λ3和重组boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ抗IBRV、FMDV和BVDV的研究。通过TCID50法测定抗IBRV和FMDV活性，抗cpBVDV采用噬斑减数法，抗ncpBVDV采用半定量RT-PCR法。结果显示重组boIFN-λ3和其他3种重组IFNs均具有抗IBRV和FMDV的活性，且呈一定程度的剂量和时间依赖性。其中抗FMDV活性较强，抗IBRV活性较弱。重组boIFN-λ3可条件性的抑制cpBVDV和ncpBVDV的增殖，即在先孵育干扰素后感染病毒时，重组boIFN-λ3可抑制BVDV增殖，反之则没有作用。5.重组boIFN-λ3和boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ协同抗病毒的研究。通过测定干扰素作用后的病毒-细胞混悬液的TCID50，结果显示重组boIFN-λ3抗IBRV时和boIFN-γ协同作用强，抗FMDV时，boIFN-λ3在EBK和BT细胞上均显示出和boIFN-α/boIFN-β明显的协同作用，提示在临床应用时可以联合应用重组boIFN-λ3和其他干扰素。推测协同机制可能与ISRE启动子活化水平及干扰素刺激基因（ISGs）的表达等有关。6. ncpBVDV持续性细胞感染是否影响重组boIFN-λ3抗病毒活性的研究。ncpBVDV（HLJ-11）感染MDBK细胞后在不同浓度重组boIFN-λ3和重组boIFN-α压力筛选下传代8次，通过半定量RT-PCR检测BVDV核酸，结果显示在干扰素压力下，病毒可以耐受干扰素，造成细胞持续性感染，而此种状态下的MDBK细胞仍能感染VSV，且不影响重组boIFN-λ3在此细胞上发挥抗VSV活性，因此这种细胞是耐受BVDV同时对IFN敏感的细胞。另一方面，ncpBVDV预先感染MDBK细胞不影响boIFN-λ3和其他IFNs在此细胞上发挥抗VSV和IBRV的作用。因此，牛IFN-λ3蛋白的研制及其与I型和II型干扰素抗病毒活性的深入比较研究为进一步了解牛IFN-λs的生物学功能提供了理论基础并为抗病毒制剂的制备提供了物质材料。
曾艳丽[10]（2012）在《1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及体外细胞培养系统的建立》文中认为研究背景和目的丙型肝炎病毒（HCV）引起的急、慢性肝病表现为很宽的临床谱,从症状轻微到肝功能衰竭,慢性丙型肝炎患者有20%-30%在10-30年后将进展为肝硬化甚至肝癌。目前全球约有一亿八千万人口感染HCV。HCV的流行率高,慢性化率高,抗HCV筛查不能可靠的避免其经输血途径传播,又无疫苗预防。丙型肝炎治疗的关键是抗病毒治疗,国际上公认的治疗方案为：聚乙二醇化干扰素（PEG-IFN）联合利巴韦林,平均持续病毒学应答率（SVR）为56%左右。研究发现不同的基因型抗病毒治疗方案、疗程不同,且抗病毒治疗的应答率也存在差异。如HCV1b型患者应用PEG-IFNa与利巴韦林（1000mg/d）联合治疗至少需要48周,SVR约为15%-50%；HCV2/3型患者应用PEG-IFNa与利巴韦林（800mg/d）联合治疗仅仅需要24周,SVR约为80%。我国主要的HCV流行基因型为1b型,但值得注意的是,即使均为HCV1b型感染者,对干扰素治疗的结果也可截然不同。部分HCV1b型患者经抗病毒治疗后可达到SVR甚至痊愈,另一部分则疗效极差。虽然近期两个新型的蛋白酶抑制剂Boceprevir和Telaprevir已经被批准用于临床,但其远期疗效还有待评价。因为HCV感染呈现慢性、隐匿的特点,随着病程的进展,丙肝相关性终末期肝病患者的数量在未来二十年内将继续增长,迄今仍是世界性的医学、社会难题和经济负担。为何部分HCV1b型患者对抗病毒治疗反应良好,能够痊愈,另一些则反之?究竟哪些因素与丙型肝炎患者抗病毒治疗疗效预测的关系密不可分?如何更有效、更合理地使用干扰素进行抗病毒治疗、提高丙肝抗病毒治疗的疗效?这是目前慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗研究的热点和难点。HCV是单股正链RNA病毒,属于黄病毒科,全长约9.6kb,包括一个大的开放阅读框及两侧的5,和3’非编码区,可以编码约3000个氨基酸的前体多聚蛋白。翻译后,前体多聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成10个具有独立功能的HCV蛋白,根据功能的不同分为结构蛋白（C、E1、E2、p7）和非结构蛋白（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。因为HCV所依赖的RNA聚合酶缺乏校正功能,其基因组序列呈高度异质性,不同的分离株在全基因序列上差异达30%-35%。一直以来,由于缺乏实用的动物模型和有效的HCV体外细胞培养系统,严重影响了HCV复制机制、疫苗研制及新HCV防控策略的研究。1999年,HCV体外细胞培养研究取得了阶段性进展,Lohmann等构建了带新霉素磷酸转移酶基因作为筛选标志的HCV亚基因组（删除了结构基因,从C到NS2及P7）复制子,这是一个双顺反子结构,第一个顺反子由HCV IRES引导,第二个顺反子（NS2-5B）由插入的脑心肌炎病毒（EMCV） IRES引导。用体外转录的RNA转染Huh7细胞,在硫酸新霉素（G418）的筛选下,获得了少数细胞克隆。复制子刚转染细胞后,其复制子水平较低,随着不断传代,其RNA复制水平明显提高,经序列分析表明高复制的复制子发生了较多的适应性突变。经实验证实,重要的适应性突变有10余处,散布于整个多蛋白编码区,尤其以表达病毒RNA聚合酶的NS5A区较集中,且不同的适应性突变具有协同效应。适应性突变是复制子在特定细胞内培养取得成功的关键之一,它通过增强宿主细胞活化分子与其结合以及去除细胞抑制因子与其相互作用而有利于复制子的复制和表达。随后,一些其他基因型的HCV复制子,如HCV1a （H77）、2a （JFH1）等复制子均被报道。复制子部分揭示了HCV与宿主细胞间复杂的相互关系,对HCV的基础研究和抗病毒药物筛选具有重要意义,特别是在新的抗HCV药物如NS3与NS4蛋白酶抑制剂、NS5B多聚酶抑制剂的研发中的发挥了重要作用。然而由于不含结构基因,非结构基因复制子在细胞培养系统中不能产生完整的HCV颗粒,难以满足深入研究HCV生物学特点、特别是针对结构基因的保护性抗原的鉴定和疫苗研制,以及全方位筛选抗病毒药物的需要。因此,很多研究者致力于建立一个可以产生感染性HCV病毒颗粒的细胞培养系统。2005年,Wakita等、Zhong等和Lindenbach等分别成功地建立了HCV2a型全长基因体外细胞培养系统。而且由此产生的病毒颗粒可在细胞内连续传代而感染性不会减低,获得了稳定的、可产生高效感染性病毒颗粒的体外细胞培养系统。在此基础上,HCV细胞培养技术取得了突飞猛进的发展并广泛的应用于相关研究中。虽然近年来这些方面的研究有很大进展,但是仍然有很多亟待解决的问题。目前已经建立的有效地HCV体外培养系统,基本都是在JFH1（2a型）毒株的基础上发展起来的,而我国丙型肝炎的主要流行毒株是1b型,与国外建立的细胞培养系统所用的HCV基因型不同。HCV1b型全基因细胞培养系统难点较多,研究进展较缓慢,但不少学者也在此方面做了很大努力。2005年Heller T等构建了HCV1b基因型全长cDNA,两端加有核酶后克隆至真核表达载体,转染Huh7.5细胞,可以检测到病毒的复制,蛋白的表达,并能够获得感染性病毒颗粒,但是该系统产生的病毒颗粒感染性很不理想。国内一些学者将含1b型HCV全长cDNA的重组质粒和高效表达T7RNA聚合酶的vTF7-3共转染细胞,通过vTF7-3表达T7RNA聚合酶的辅助作用,可使细胞高效产生HCV RNA,并发现病毒颗粒的产生。但该系统生产的重组HCV颗粒中含有痘病毒的污染,给病毒颗粒的分离纯化带来不便,且vTF7-3也有一定的细胞毒性,在以痘病毒为辅助病毒的体系中,细胞很快死亡,故在每次培养HCV是,都须重复进行细胞培养、转染重组质粒和感染痘病毒等操作,过程繁琐,实验安全性也存在一定的隐患。此外,这两个体系都需要辅助质粒或重组病毒提供凡是启动子激活物和加工因子,HCV核酸的初始复制也非RNA病毒复制的自然状态,而是以质粒DNA为模板的转录,故最为HCV复制机制和抗HCV药物的筛选平台,其作用受到限制。至今,国内尚未见到关于HCV1b型细胞培养系统完全成功的报道。本研究旨在通过HCV完整半基因组扩增测序的方法分析病毒基因变异对PEG-IFN联合利巴韦林治疗1b亚型慢性丙型肝炎疗效的影响,试图阐明病毒基因组变异对干扰素疗效方面发挥的作用；并在此基础上,用已发生适应性突变的HCV1b复制子来插入HCV1b结构基因以建立我国流行株1b型全基因HCV细胞培养系统,为我国丙型肝炎发病机制的研究,HCV结构基因中保护性抗原的鉴定及疫苗的研制、研发抗HCV新药和新疗法、高通量筛选已见临床疗效的药物、药物单体,探索新的联合用药方案以提高疗效,并阐明疗效机制提供良好的平台。第一章HCV5’端半基因组的扩增及其序列变异对PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC疗效的影响研究方法收集慢性丙型病毒性肝炎患者治疗前血清标本,纳入研究的61例患者诊断符合《丙型肝炎防治指南》抗病毒治疗标准,所有患者均为1b型HCV病毒感染,并完成PEG-IFN联合RBV抗病毒治疗48周且随访24周,其中获得持续性病毒学应答（SVR组）的患者35例,未获得持续性病毒学应答（Non-SVR组）的患者26例。采用长片段RT-PCR法扩增包括完整核心蛋白至NS3蛋白的HCV5’端5.2kb半基因组序列,测序后分析病毒基因组序列变异与抗病毒疗效之间的关系。统计学分析：计量资料采用独立样本t检验,计数资料采用X2检验；SVR组和Non-SVR组总氨基酸变异个数和特异性氨基酸变异个数的比较采用Mann-Whitney U检验；而特异性变异占总氨基酸变异的百分比使用X2检验。两组熵值的比较采用Mann-Whitney U检验；平均基因组距离采用独立样本t检验。P值小于0.05时有统计学差异,所有统计学分析使用SPSS13.0软件。结果中国患者治疗前HCV的氨基酸变异情况可以影响PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC的疗效。我们分别比较了两组患者1b型HCV半基因组氨基酸变异总数和特异性氨基酸变异情况,中国CHC患者治疗前体内病毒氨基酸的变异性与抗病毒疗效相关,且氨基酸变异主要集中在p7,NS2和NS3蛋白。SVR组患者P7、NS2和NS3蛋白的特异性氨基酸变异个数（P=0.036,P<0.001和P=0.006）、特异性氨基酸变异的比例（P<0.001,P<0.001和P<0.001）、熵值(（P=0.019,P=0.023和P=0.046）以及基因组距离(（P<0.001,P<0.001和P=0.011）均显着高于Non-SVR组。第二章HCV1b replicon细胞培养系统的建立研究方法我们以两个获赠的1b复制子质粒为基础,构建在Huh7.5.1细胞内能够长期、稳定、高拷贝复制的亚基因组复制子细胞培养系统。其一是1b-G复制子质粒,该复制子含有HCV Conl分离株NS3-NS5B非结构基因的cDNA序列,在NS5A区含S2204I适应性突变。其二是lb-H复制子质粒,该复制子与1b-G相比,在新霉素抗性基因的上游插入了一个荧光素酶报告基因以方便检测,且其适应性突变位于NS3区的E1202G和T1280I,以及NS4B区的K1846T。具体方法是,将Scal酶切的线性化1b-H复制子和1b-G复制子质粒为模板,在T7RNA聚合酶的作用下,体外转录出复制子RNA,然后将此RNA转染至Huh7.5.1细胞,以含800μg/ml G418的培养基进行筛选,根据克隆形成情况对克隆进行分离培养,然后用RT-PCR、间接免疫荧光、Western Blot和荧光素酶检测等方法对克隆细胞中的HCV核酸和蛋白进行检测。结果用1b-H和1b-G复制子转染Huh7.5.1细胞后,都获得了G418抗性克隆,并在最终分离出的细胞克隆中,检出HCV复制子特异性的RNA和NS5A蛋白。由于lb-H复制子中含有荧光素酶报告基因,我们通过检测报告基因的表达活性来分析病毒的复制水平,代替繁琐的RT-PCR和Western Blot检测方法,较好地方便了实验研究。第三章我国N型肝炎流行株1b型全基因HCV细胞培养系统的建立研究方法选取两例“难治性丙肝”患者血清,扩增HCV5’端半基因组序列并构建克隆,选取15-20个克隆进行测序分析病毒准种的优势株；选取优势克隆株质粒,通过重叠延伸PCR的方法引入合适的酶切位点,再通过酶切连接的方法,以完整的Core-NS2区基因替换复制子中的外源性基因序列,从而构建HCV1b全长cDNA重组质粒；然后将全长cDNA克隆经Scal酶切线性化,在T7RNA聚合酶作用下体外转录制备全长HCV RNA,并转染Huh7.5.1细胞,荧光定量RT-PCR检测细胞上清和细胞内HCV RNA, Western Blot方法检测病毒蛋白的表达,间接免疫荧光法检测病毒蛋白的表达以及含病毒细胞上清的感染性。结果本研究在lb replicon的基础上,将来源于中国患者血清病毒的完整结构基因（core-p7）和部分非结构基因（NS2及NS3）插入复制子,成功构建了四个不同的1b型HCV全长cDNA克隆。将这些1b型HCV RNA转染Huh7.5.1细胞后,虽然未能成功建立感染性细胞培养系统,却能检测到低水平的病毒RNA的复制。经比较后发现,我们构建的1b-H-P2、1b-H-80和1b-G-P2、1b-G-80在非结构基因区适应性突变的不同导致它们RNA复制水平有所不同,在一定程度上也说明不同的适应性突变位点之间存在协同作用。结论本研究表明中国患者治疗前HCV的氨基酸变异情况可以影响PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC的疗效,氨基酸变异主要集中在p7,NS2和NS3蛋白。完整扩增HCV5’端半基因组为构建HCV全长细胞培养系统打下了基础,并且序列分析的结果为HCV蛋白与干扰素抵抗的体外研究实验提供了线索。同时我们成功建立了针对我国人群易感染的HCV lb亚型体外复制子的细胞模型,不仅为本实验室HCV致病机制的研究及对抗病毒药物的评价提供了一个新的途径,也为下一步建立1b型HCV全长细胞培养系统提供了一个良好的技术平台。在1b-H和1b-G复制子的基础上,我们成功构建了4个1b型HCV全长cDNA质粒,虽然未能成功建立感染性细胞培养系统,却能检测到低水平的病毒RNA的复制。分析原因,可能是由于病毒在装配和释放的过程中,某些环节存在未能阐明的问题,导致产生的病毒颗粒感染活性低下；也可能是因为所构建的cDNA还存在某些缺陷,不能产生完整的病毒颗粒。为了排除后一种原因,我们使用已经明确在痘病毒辅助系统辅助下能有效复制并产生感染性病毒颗粒的1bHCV cDNA为模板,重新构建1b型HCV全长cDNA,转染细胞后仍然未能获得感染性病毒颗粒。此结果表明,我们构建的1b型全长cDNA不具有感染性与基因序列缺陷无关。病毒在细胞中能否成功复制与装配,是病毒与细胞相互选择的结果,但细胞环境复杂,蛋白与细胞因子众多,因此影响1b型HCV感染性细胞培养系统成功建立的因素有待进一步研究。
二、中国人丙型肝炎病毒结构基因cDNA分子克隆及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中国人丙型肝炎病毒结构基因cDNA分子克隆及序列分析（论文提纲范文）
（1）干扰素诱导跨膜蛋白抑制痘苗病毒作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 内源性抗病毒免疫研究进展 |
| 1.1 病毒性疾病流行的严峻形势 |
| 1.2 内源性免疫概述 |
| 1.3 病毒诱导的干扰素抗病毒反应 |
| 1.4 干扰素刺激基因与宿主限制因子 |
| 1.5 内源性限制因子与天然免疫 |
| 1.6 内源性限制因子与病毒进化关系 |
| 1.7 结语 |
| 第2章 IFITMs 家族蛋白结构与功能 |
| 2.1 IFITMs 作为内源性限制因子的发现 |
| 2.2 IFITMs 抗病毒谱 |
| 2.3 IFITMs 定位、结构与翻译后修饰 |
| 2.4 IFITMs 蛋白作用模式与机制 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 立题依据 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 人 IFITMs 基因克隆、鉴定及其抗痘苗病毒作用初探 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 稳定表达人 IFITMs 基因细胞系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 人 IFITMs 抑制痘病毒感染与复制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 人 IFITM3 抑制痘苗病毒感染机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 痘苗病毒感染对 IFITMs 蛋白表达影响及 IFITM3 相互作用分子筛选 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表学术论文及主要科研成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（2）狂犬病SRV9病毒糖蛋白基因重排质粒pMD-NG及辅助表达质粒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 狂犬病病毒及其反向遗传学的研究进展 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 狂犬病病毒分子生物学特性 |
| 1.3 狂犬病新型疫苗的研究 |
| 1.4 反向遗传学技术在狂犬病毒研究中的进展 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 1.6 本试验研究内容 |
| 第2章 狂犬病病毒 SRV_9株基因组的克隆及表达质粒的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 狂犬病 SRV_9病毒融合基因 NG、PM 重组质粒的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 I |
| 附录 II |
| 附录 Ⅲ |
| 致谢 |
（3）狂犬病病毒结构基因的克隆及犬瘟热病毒N蛋白基因与eGFP基因重组质粒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 狂犬病概述 |
| 1.2 犬瘟热概述 |
| 1.3 狂犬病病毒载体概述 |
| 1.4 绿色荧光蛋白应用的概况 |
| 1.5 本实验研究目的及意义 |
| 1.6 本实验研究内容 |
| 第2章 狂犬病病毒 SRV9株基因组的分段克隆及分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 应用重组 PCR 技术构建融合基因重组质粒 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 I：常用试剂及配制 |
| 附录 II：测序结果 |
| 致谢 |
（4）表达FMDV-VP1重组PPRV的构建及生物学特性与免疫应答研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 插图和附表清单 |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1 小反刍兽疫概述 |
| 2 口蹄疫概述 |
| 3 反向遗传技术在副粘病毒研究中的应用 |
| 4 口蹄疫新型疫苗研究进展 |
| 5 研究的目的及意义 |
| 6 研究内容 |
| 7 研究目标 |
| 第二章 亚洲1型FMDV-VP1蛋白抗体制备及间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 表达亚洲1型FMDV-VP1基因的重组PPRV的构建与鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 rPPRV-VP1的生物学特性及免疫原性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 rPPRV-VP1免疫羊和牛后的FMDV攻毒保护性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第六章 结论和创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）Ⅳ型猪源HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 戊型肝炎病毒概述及分子流行性病学研究进展 |
| 1 HEV的特征 |
| 2 HEV基因型和亚基因型的基因差异 |
| 3 HEV的进化史 |
| 4 戊型肝炎在世界范围内的分布情况 |
| 5 不同传播环境下各HEV毒株的基因相关性 |
| 6 不同区域人源与猪源HEV的基因相关性 |
| 7 人源HEV和猪源HEV的基因差异 |
| 8 人畜共患HEV的潜在人类传染源 |
| 9 感染HEV人群的实际数量 |
| 10 戊型肝炎的检测和防治 |
| 11 讨论 |
| 研究1 Ⅳ型猪源HEV荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒毒株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 工具酶和试剂 |
| 1.4 菌种和克隆载体 |
| 1.5 所用培养基和溶液 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.3 目的基因的RT-PCR体系 |
| 2.4 标准质粒的构建 |
| 2.5 Real-time RT-PCR反应体系的建立 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RT-PCR产物大小及测序结果 |
| 3.2 标准质粒浓度测定 |
| 3.3 标准曲线的建立 |
| 3.4 Real-time RT-PCR方法的重复性分析 |
| 3.5 Real-time RT-PCR方法与常规nested-RT-PCR方法的比较分析 |
| 3.6 Real-time RT-PCR方法的特异性分析 |
| 4 讨论 |
| 研究2 Ⅳ型猪源HEV体外细胞培养体系的建立 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 对细胞病变(CPE)的观察 |
| 2.2 对病毒培养物HEV RNA的nested-RT-PCR检测 |
| 2.3 对不同初始病毒接种量下HEV的增值趋势分析 |
| 2.4 病毒的传代培养 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）HTLV-1 HBZ对cyclin D1表达的调控作用和HTLV-1 ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 HBZ与转录因子CREB相互作用抑制cyclin D1表达 |
| 0 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 以HBZ蛋白为抗原的HTLV-1抗体ELISA检测法的建立 |
| 0 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 华中地区不同人群中的HTLV-1/2流行病学调查 |
| 0 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 个人简历 |
| 博士研究生期间发表的文章 |
| 博士研究生期间获得奖励 |
| 致谢 |
（7）狂犬病病毒SRV9株反向遗传系统的建立与初步应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 负链 RNA 病毒的反向遗传学 |
| 1.1 简介 |
| 1.2 负链 RNA 病毒的复制策略 |
| 1.3 反向遗传学的发展 |
| 1.4 反向遗传系统的应用 |
| 1.5 局限性 |
| 1.6 展望 |
| 第二章 狂犬病病毒及狂犬病病毒载体 |
| 2.1 狂犬病病毒简介 |
| 2.2 RABV 作为研究工具 |
| 2.3 狂犬病新型疫苗研究 |
| 2.4 RABV 载体在预防其他疾病中的应用 |
| 2.5 RABV 疫苗载体安全性问题 |
| 2.6 RABV 结构蛋白作为携带外源抗原的载体 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 狂犬病病毒 SRV9 株全基因组序列测定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 狂犬病病毒 SRV9 株反向遗传操作系统的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达外源基因的重组狂犬病病毒真核表达载体的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
（8）鸡痘病毒282E4株基因组和蛋白质组解析、载体构建与HIV重组疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 基因组学和蛋白质组学研究进展 |
| 1 基因组学研究进展 |
| 2 蛋白质组学研究进展 |
| 第2章 禽痘病毒及其载体系统研究进展 |
| 1 禽痘病毒生物学特性 |
| 2 禽痘病毒载体及其应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 鸡痘病毒282E4株全基因组测序及序列分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第2章 鸡痘病毒282E4株全谱蛋白质组鉴定与分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第3章 新型鸡痘病毒穿梭载体的构建及功能验证 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 表达HIV-1复合表位重组鸡痘病毒的构建与筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第5章 HIV-1复合表位多载体疫苗联合免疫实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（9）重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 IFN-α、IFN-β和 IFN-γ概述 |
| 1.2 IFN-λs（III 型干扰素）研究进展 |
| 1.2.1 基因及蛋白结构 |
| 1.2.2 表达和调节 |
| 1.2.3 IFN-λs 的受体 |
| 1.2.4 信号转导 |
| 1.2.5 抗病毒 |
| 1.2.6 抗肿瘤活性 |
| 1.2.7 免疫调节活性 |
| 1.3 牛干扰素研究进展 |
| 1.4 利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究 |
| 1.4.1 毕赤酵母及其他常用表达系统简介 |
| 1.4.2 毕赤酵母可溶性表达影响因素 |
| 1.4.3 利用毕赤酵母表达干扰素的研究 |
| 1.5 目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌 |
| 2.1.2 细胞、病毒、培养基、血清 |
| 2.1.3 酶、抗体、生化试剂和耗材 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 牛 IFN-λ3（boIFN-λ3）在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 2.2.2 重组牛 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的表达 |
| 2.2.3 重组牛 IFN-λ3/IFN-α/IFN-β/IFN-γ生物学活性初步测定 |
| 2.2.4 重组牛 IFN-λ3 的理化特性分析 |
| 2.2.5 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的细胞毒性检测 |
| 2.2.6 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ比较对 Mx1 蛋白和 ISRE 活性的影响 |
| 2.2.7 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究 |
| 2.2.8 ncpBVDV 持续性细胞感染对重组牛 IFN-λ3 抗病毒活性影响 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 牛 IFN-λ3 在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 3.1.1 牛 IFN-λ3 的基因优化 |
| 3.1.2 牛 IFN-λ3 PCR 扩增 |
| 3.1.3 重组表达载体 pPICZαA-boIFN-λ3 的构建和鉴定 |
| 3.1.4 重组 boIFN-λ3 酵母菌株的筛选鉴定 |
| 3.1.5 高表达重组酵母菌株的筛选 |
| 3.1.6 诱导表达条件的优化 |
| 3.1.7 重组蛋白 boIFN-λ3 和 boIFN-λ3*的 Western blot 分析 |
| 3.1.8 重组蛋白 boIFN-λ3 和 boIFN-λ3*的纯化 |
| 3.1.9 重组蛋白 boIFN-λ3 和 boIFN-λ3*的糖基化分析 |
| 3.1.10 抗 boIFN-λ3 多克隆抗体的制备 |
| 3.3 重组牛 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的表达 |
| 3.3.1 重组 boIFN-β的表达 |
| 3.3.2 重组 boIFN-α的表达 |
| 3.3.3 重组 boIFN-γ的表达 |
| 3.4 重组牛 IFN-λ3/IFN-α/IFN-β/IFN-γ生物学活性初步测定 |
| 3.5 重组牛 IFN-λ3 理化特性分析 |
| 3.6 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的细胞毒性检测 |
| 3.6.1 重组 boIFN-λ3 的细胞毒性检测 |
| 3.6.2 重组 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ细胞毒性检测 |
| 3.7 牛 IFN-λ3 可刺激细胞产生 Mx1 蛋白并活化 ISRE |
| 3.7.1 牛 IFN-λ3 刺激多种牛源细胞产生 Mx1 蛋白 |
| 3.7.2 牛 IFN-λ3 和 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ均能够诱导 ISRE 启动子活性 |
| 3.8 重组牛 IFN-λ3 和 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ均具有抗 IBRV/FMDV 和 BVDV 活性 |
| 3.8.1 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ均具有抗 IBRV 活性 |
| 3.8.2 重组牛 IFN-λ3 和 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ均具有抗 FMDV 活性 |
| 3.8.3 重组 boIFN-λ3 条件性的抑制 cp 型和 ncp 型 BVDV 增殖 |
| 3.9 ncpBVDV 持续性细胞感染不影响重组牛 IFN-λ3 抗病毒活性 |
| 3.9.1 boIFN-λ3 压力筛选下 ncpBVDV 仍能建立持续性细胞感染状态 |
| 3.9.2 细胞感染 ncpBVDV 后不影响 boIFN-λ3 抗其他病毒活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 酵母分泌表达和纯化 |
| 4.2 重组牛 IFN-λ3 的理化特性和生物活性 |
| 4.3 牛 IFN-λ3 与 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较分析 |
| 4.4 牛 IFN-λ3 与 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ协同抗病毒研究 |
| 4.5 ncpBVDV 持续性细胞感染与 IFN-λ3 抗病毒的关系 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（10）1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及体外细胞培养系统的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 0.1 HCV的分子生物学特征 |
| 0.2 丙型肝炎病毒感染周期与病毒RNA的复制 |
| 0.3 HCV复制子系统 |
| 0.4 HCV全长细胞培养系统 |
| 0.5 支持HCV复制子及HCV全长基因组复制的细胞系 |
| 0.6 1b型HCV全基因细胞培养系统的研究现状 |
| 0.7 本研究的目的和意义 |
| 0.8 总结与展望 |
| 第一章 HCV 5’端半基因组的扩增及其序列对PEG-IFN/RBV治疗1 b亚型CHC疗效的影响 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 HCV 1b replicon细胞培养系统的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 我国丙型肝炎流行株1b型全基因HCV细胞培养系统的建立 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕/博士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、中国人丙型肝炎病毒结构基因cDNA分子克隆及序列分析（论文参考文献）
- [1]干扰素诱导跨膜蛋白抑制痘苗病毒作用及其机制研究[D]. 杜寿文. 吉林大学, 2015(08)
- [2]狂犬病SRV9病毒糖蛋白基因重排质粒pMD-NG及辅助表达质粒的构建[D]. 苏晓慧. 新疆农业大学, 2014(05)
- [3]狂犬病病毒结构基因的克隆及犬瘟热病毒N蛋白基因与eGFP基因重组质粒的构建[D]. 夏婷婷. 新疆农业大学, 2014(05)
- [4]表达FMDV-VP1重组PPRV的构建及生物学特性与免疫应答研究[D]. 印春生. 中国农业大学, 2014(08)
- [5]Ⅳ型猪源HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系的建立[D]. 朱嘉磊. 扬州大学, 2014(01)
- [6]HTLV-1 HBZ对cyclin D1表达的调控作用和HTLV-1 ELISA检测方法的建立[D]. 马云云. 郑州大学, 2014(06)
- [7]狂犬病病毒SRV9株反向遗传系统的建立与初步应用研究[D]. 金宏丽. 吉林大学, 2013(09)
- [8]鸡痘病毒282E4株基因组和蛋白质组解析、载体构建与HIV重组疫苗研究[D]. 刘存霞. 吉林大学, 2013(11)
- [9]重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究[D]. 张润祥. 东北农业大学, 2013(08)
- [10]1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及体外细胞培养系统的建立[D]. 曾艳丽. 南方医科大学, 2012(04)