一、鸡传染性支气管炎腺胃病变型毒株免疫原基因的分离鉴定（论文文献综述）
朱国强,严维巍,孙龙生,王碧林,万洪全,周继宏,庄国宏,王永坤[1]（1998）在《腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒变异株的比较研究》文中研究指明腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）变异株Ｈ９５提纯样品经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ，证明Ｈ９５株单抗ＤＥ７和Ｍ４１株单抗６ＤＨ８均能识别Ｈ９５株５４０００蛋白多肽。采用单抗、多抗介导间接ＥＬＩＳＡ试验表明，Ｈ９５毒株能与抗ＩＢＶＭ４１Ｎ蛋白单抗６ＤＨ８和ＩＢＶＭ蛋白单抗ＭＣ发生反应，也能与抗Ｍ４１、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｔ、Ｈ５２、Ｎ１１５和分离株Ｃ９００１、ＤＬＺ９１１１的多抗血清反应，同时抗Ｈ９５株的４株单抗、多抗血清也能与上述毒株反应。卵磷脂酶Ｃ处理的Ｈ９５株的血凝活性能被相应的Ｈ９５株的单克隆抗体和高免血清所抑制，也能被Ｍ４１单抗和高免血清所抑制。通过ＲＴ－ＰＣＲ获得了Ｈ９５毒株的免疫原基因Ｓ１，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ和ＩＢＶ的Ｓ探针检测呈阳性。
张小荣[2]（2012）在《2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究及以马立克病毒为载体的基因工程疫苗研制》文中提出禽传染性支气管炎病毒（avian infectious bronchitis virus,IBV）属于冠状病毒科冠状病毒属中的γ-冠状病毒,由该病毒感染引起的疾病称为禽传染性支气管炎（avian infectious bronchitis,IB）,是一种对鸡危害非常严重的急性、高度传染性的病毒性呼吸道疾病,可导致鸡的增重和饲料报酬降低,也能引起蛋鸡产蛋量和蛋的品质下降等,因此具有重要的经济意义,免疫预防是目前控制该病的最为有效的手段。IBV的重要特点之一就是血清型众多,不同血清型之间交叉保护性较低甚至完全不能保护,因此在生产中必须选用与流行毒株血清型一致的疫苗才能取得良好的免疫保护效果。不同血清型的IBV具有典型的地域性流行特征,而且由于病毒基因组的突变和毒株间的重组使得新的血清型不断出现,使免疫预防日益复杂化。本研究的目的旨在通过系统的流行病学监测了解近年来不同基因型IBV在我国的流行状况,通过生物信息学分析阐明不同IBV基因型间遗传演化的规律和发展趋势,并针对流行的优势基因型毒株研制新型疫苗。1、2009-2011年间国内IBV流行病学监测与流行株的遗传进化分析2009-2011年间,共从国内主要养鸡省份分离到IBV流行毒株54株,其中肉鸡源毒株52株,蛋鸡源毒株2株。在肉鸡源毒株中我们发现存在较高比例的IBV与H9亚型AIV的混合感染（25/52）,发生混合感染的鸡群往往发病更为严重,且混合感染样品对接种的鸡胚表现出更强的致病性,该结果提示这两种病毒之间可能存在一定程度的致病协同作用。对所有分离毒株S1基因进行克隆和基因测序,共发现4种不同的S1基因长度,分别为1611bp、1617bp、1620bp和1626bp,说明S1基因中碱基的插入和缺失是一种非常普遍的现象。将54个分离株S1基因序列和近年来在国内及周边国家和地区流行的13个基因型共57个参考毒株的S1基因序列用Mega4.1软件进行遗传进化分析,结果显示54个分离株可以分为QX型（42株）、HN-08型（5株）、LSC/991型（2株）、TW-I型（2株）、Mass型（1株）、793/B型（1株）和CHⅢ型（1株）等7个基因型。在所有分离株中,QX型分离株数量最多,占总数的77.8%（42/54）。从进化树中还可以看出,QX型分离株又可以进一步细分为两个不同的基因亚群-Cluster Ⅰ（21株）和Cluster Ⅱ（21株）,经典的QX型参考毒株QXIBV和LX4株均属于Cluster Ⅰ亚群,而Cluster Ⅱ亚群中的毒株均在2010年才开始出现。为了更加系统地描述同期内国内不同基因型IBV的分布情况,我们将已经在GenBank发表全长S1基因序列的所有同时期分离株共296株合并进行遗传进化分析,结果显示,350个同时期分离株可分为19个基因型,其中11个基因型均能根据现有文献报道找到同源的参考毒株,根据各基因型中包含的毒株数量多少依次为：QX型（219株）、HN-08型（26株）、LSC/99I型（22株）、LDT3/03型（12株）、TW-I型（12株）、CH Ⅲ型（11株）、Mass型（10株）、LDL/971型（3株）、CH VI型（3株）、TW-Ⅱ型（2株）和793/B型（1株）,此外还有8个基因型未能归入已被正式命名的已知基因型,因此暂定名为未定型Ⅰ～未定型Ⅷ。从分型结果可以看出,我国流行的IBV基因型具有典型的地域性分布特征,大多数在周边国家和地区广泛流行的基因型在我国并未发现。为阐明国内不同基因型毒株之间的遗传演化关系,根据遗传进化和基因分型的结果,从不同基因型中选择代表性毒株,用RDP3.31软件对S1基因进行重组分析。结果显示当前国内流行的毒株中存在广泛的重组现象,不同基因型间的重组事件不仅导致同一基因型内部发生分化,出现了不同基因亚群,而且经过多次的同源重组后可能会导致新的基因型毒株的出现。综合不同基因型间发生的系列重组事件,可以推断：QX型、LSC/991型、793/B型、LDL/971型、TW-Ⅰ型和TW-Ⅱ型是目前在我国流行的所有基因型毒株的原型毒株,除此以外的新出现的基因型均是在这6个基因型的基础上经过一次或多次的同源重组而产生的变异株。2、Mass型H120活疫苗对当前流行的主要基因型代表毒株的免疫保护效力试验根据遗传进化分析的结果,从当前主要流行的三个IBV基因型中挑选出4个代表毒株：AH/2009/1（QX型Cluster Ⅰ亚群）、JS/2010/12（QX型Cluster Ⅱ亚群）、JS/2009/5（LSC/99I型）和JS/2010/6（HN08型）,分别用Mass型IBV活疫苗（H120株）进行免疫保护效力试验,以评价现有疫苗对流行毒株的免疫保护状况。结果显示H120疫苗株对不同基因型的IBV毒株免疫保护效力存在较大差异,对同属于Mass基因型的M41强毒株能够提供完全保护，且能显着降低攻毒后气管和肾脏的排毒率；对于QX型毒株AH/2009/1和JS/2010/12,基本达到临床保护标准,但试验鸡气管和肾脏带毒的比例远远高于M41攻毒组,说明局部免疫保护效果不是非常理想；对于HN08型的JS/2010/6株和LSC/991型的JS/2009/5株保护效果均不理想,攻毒后鸡群表现出较为严重的临床症状和相当高的气管和肾脏排毒率。该结果提示我们,现有疫苗已经不能对当前流行的主要基因型毒株提供良好的免疫保护,急需研究开发与流行毒株基因型一致的新疫苗用于该病的防控。3、以马立克病毒为载体研制QX型IBV基因工程疫苗本研究以MDV CV1988/Rispens疫苗毒株为载体,以其IRS-US间隔区作为插入位点,选择网状内皮组织增生症病毒（REV）基因组长末端重复序列（LTR）作为启动子,构建含QX型IBV分离株CK/CH/JS/06Ⅱ S1基因及报告基因EGFP的转移载体pUP-LTR-EGFP-S1-DOWN。将MDV基因组DNA与转移载体共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经同源重组获得重组病毒,通过多轮荧光筛选和纯化,最终获得的重组病毒命名为rMDV-EGFP-S1。进一步通过Cre重组酶介导的重组反应敲除EGFP报告基因,获得仅带有LTR启动子和S1基因的重组病毒,命名为rMDV-S1。通过PCR和间接免疫荧光试验（IFA）对重组病毒进行鉴定,结果表明S1基因完全按照预定方式正确插入到MDV基因组中并能够表达S1蛋白。将重组病毒在CEF上进行连续30代传代培养,经PCR和IFA试验鉴定,该重组病毒具有良好的遗传稳定性。重组病毒rMDV-S1。对QX型IBV强毒株CK/CH/JS/06Ⅱ的免疫攻毒保护效力试验结果显示,重组病毒按5×103PFU/羽的剂量免疫1日龄SPF鸡,免疫后4w攻毒,免疫组试验鸡发病率和死亡率分别为30%和5%,对照组则分别为100%和30%,经χ2检验差异显着（p<0.05）。排毒检测结果显示,免疫组气管排毒率在攻毒后部分时间点与对照组相比差异显着,攻毒后14d扑杀时肾脏排毒率差异极显着（p<0.01）。免疫组试验鸡攻毒后的增重未受明显影响,与对照组相比差异显着（p<0.05）。病理组织学检查结果显示与对照组相比免疫组试验鸡肾脏的病变程度相对较轻。所有结果均表明重组病毒对QX型强毒株的攻击能够提供良好的免疫保护。重组病毒对MDV强毒株RB1B的免疫攻毒保护试验结果显示,与亲本病毒CV1988/Rispens相比,对MDV本身的免疫保护效率未受明显影响,说明该重组病毒可以作为二联疫苗同时用于IB和MD两种疾病的免疫预防。
朱国强,王永坤,孙龙生,周继宏,庄国宏,严维巍,王碧林,田慧芳,朱坤喜[3]（1996）在《腺胃病变型鸡传染性支气管炎毒株H95的研究》文中研究表明从某疫区的鸡腺胃病鸡群中分离到Ｈ＿（９５）毒株，在ＳＰＦ鸡胚稳定传至１５代，具有规律性死亡和典型胚胎病变特征，ＥＩＤ＿（５０）＝５×１０（－５．５）／ｍｌ。用病料和鸡胚尿囊液毒分别感染试验鸡，均引起与自然病例相同的典型病理变化。病料和Ｈ＿（９５）鸡胚尿囊毒提纯的病毒液经负染后电镜观察，均具有典型冠状病毒形态。病毒液经卵磷脂酶Ｃ处理后能凝集鸡红细胞，并能破相应的抗体所抑制。采用率抗、多抗介导的间接ＥＬＩＳＡ和血凝抑制试验交叉反应表明，Ｈ＿（９５）株与ＩＢＶ行密切的血清学关系。用反转录聚合酶链反应获得了Ｈ＿（９５）毒株的免疫原（Ｓ＿１）基因，经ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印和ＩＢＶ的Ｓ探针检测均呈阳性。结果表明，从腺胃病变型鸡群分离的Ｈ＿（９５）毒株属冠状病毒科ＩＢＶ成员
徐雪,赵军,王川庆,王泽霖,杨霞,周欣,迪丽拜尔·阿木提[4]（2011）在《鸡传染性支气管炎病毒河南流行毒株S1基因的变异分析》文中提出经鸡胚接种、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、气管环培养等方法从河南不同地区发病鸡群中先后共分离、鉴定出7株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）.应用RT-PCR方法对7株病毒以及IBVH120疫苗株的S1基因全序列进行扩增,并对其进行克隆测序及序列分析.结果显示:8株IBV的S1基因全长分为4类,分别是1 632、1 6201、617和1 611 bp;序列相互之间存在多位点变异,同时存在型特异性的插入和缺失;其S蛋白裂解位点序列模式有HRRRR、RRFRR和RRSRR 3种;同源性及遗传进化分析显示Jin-13为呼吸型毒株,YI为ArkDPI型肾型毒株,HN/SG株与国内其他肾型分离株亲缘关系均较远;河南肾型分离株HN/HL、XP/1/09、XP/3、WZL与山东肾型分离株之间的同源性较高且其亲缘关系最近,而与河南HN99株的亲缘关系较远.说明河南地区存在不同的IBV流行毒株,这些流行毒株在主要保护性抗原蛋白S1基因上发生了一定的变异.
贺秀媛[5]（2002）在《鸡传染性支气管炎病毒LX4株主要结构基因的研究》文中认为细菌、病毒等所产生的生物性毒物对机体的代谢、繁殖机能有着重要的影响，目前对细菌毒素的研究比较透彻，已经上升到分子水平，特别是通过病原微生物全基因组序列的测定，使人们从更高层次上把握病原微生物的致病机理及其规律成为可能。到目前为止，已完成了近10个细菌全基因组序列的测序工作，更多细菌的全基因组序列正在进行中。细菌全基因组序列测序工作的完成将给人类分析和研究编码细菌毒性蛋白的毒力基因、认识和阐明毒性蛋白的毒理带来新的机遇。而对病毒这方面的研究相对滞后，为了探讨病毒对细胞、组织的毒性作用及其毒理，分析病毒基因组中主要结构基因在致病和免疫中的功能，研制阻断病毒与细胞融合的药物及其有效的疫苗，为其防制提供全新的思路，就必须以基因组的分析为基础。本研究首先分离鸡传染性支气管炎病毒我国地方流行毒株（IBV-LX4），然后进行形态学和生物学特性的鉴定并进行蚀斑纯化。在此基础上，根据国内外已发表的IBV基因序列，分别设计特异性引物，应用不同引物进行反转录合成cDNA，分片段对IBV的主要结构基因进行PCR扩增，并分别将各个目的片段克隆到pUC19载体上，在大肠杆菌DH5α中实现目的基因的分子克隆，经蓝白斑筛选、限制性内切酶分析、PCR鉴定，筛选出重组阳性质粒，并对各个目的基因片段进行序列测定，从而获得IBV主要结构基因全序列。通过计算机分析软件，对我国IBV地方流行毒株LX4的主要结构基因全序列、分子特征及遗传变异进行分析比较，并初步分析预测传染性支气管炎病毒主要结构蛋白上可能存在的T细胞和B细胞表位。实验结果表明： 1．生物学特性：鸡胚尿囊液经离心、磷钨酸负染后，电镜观察该病毒为典型的冠状病毒；该毒株的第一代尿囊液对鸡胚无肉眼可见的致病作用，当继代到第5代后，胚体严重病变；病毒在鸡胚中随着接种时间的延长，其效价增高，96h可达到48h的2倍；该毒株可在CEF上生长，但不能形成明显的蚀斑；经1％胰酶处理后可凝集鸡红细胞；鸡胚的第四代尿囊液病毒回归动物体，病死鸡肾脏呈典型的花斑肾，腺胃则未见肉眼可见的病变。证明分离到的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。 2．S1基因：其全序列共1614bp（从起始密码子ATG到S前体蛋白裂解位点），编码537个氨基酸，其氨基端有一编码18个氨基酸的信号肽序列，第12～13位氨基酸残基构成了信号肽的切割位点，14～19位与111～124位氨基酸残基为S1蛋白的跨膜区域。S1蛋白中含有19个高度保守的潜在的糖基化位点及17个半胱氨酸。同源分析结果显示不同毒株S1基因均存在基因缺失、基因替换和基因插入等变异现象。S1基因除与QX的亲缘关系较近外，与其它参考株的同源率均低于80％，可能为一株国内流行性的变异株。 3．S2基因：核苷酸序列全长2023bp，编码625个氨基酸，包含完整的阅读框架，其中SZ C端约560—595位之间的35个氨基酸高度疏水，216～232位氨基酸残基与412～417位氨基酸残基为其另外的两个跨膜区。SZ基因序列中含有 19个半肤氮酸，13个糖基化位点。在 SZ与 SI交界处的切割序列为 HANRR。SZ N端第一个氨基酸为色氨酸（Ser），C端 560～587为一山正电荷组成的区域，古有两个长的 a－螺旋。SZ较为保守，其变异主要表现为点突变，且C端比N端的保守程度更大。与其他毒株之问核昔酸序列的同源性为幻％－引％，氨基酸序列的同源率为86％～N％。 4．A／I基回。序列全长678hi，，编码：125个氨基酸，包含完整的阅读框架，含有两个糖基化位点，9个高度保守的半肤氨酸，25～35位、52～95位之间的氨基酸残基为其两个跨膜区域，35～45位与88～98位之间的氨基酸残基为其两个信号肽，41位、92位氨基酸处为信号肽的切割位点。问源分析发现不问毒株间M基因存在着缺失、插入、及点突变等变异现象，且5”末端易发生变异，3”木端较为保守；与其他毒株 IBV M 基因核昔酸序列的同源性为 85％－100％，氨基酸序列的同源性为83％～100？／o。 5．N基因：全序列为1230hp，编码409个氨基酸，包含完整的开放阅读框架。其变异主要表现为基因缺失、基因替换和基因插入，且变异没有集中区域的高变区。与其他毒株间（除V18／91外）核昔酸序列的同源性为85％～99％，氨基酸序列的同源率为83％～91％。 综合以上实验结果，本实验得出以下结论： l)生物学实验证实国内地方分离株 I．X4为鸡传染性支气管炎病毒。 幻首次克隆并测定了我国地方分离株LX4的主要结构基因核合酸序列，实验证实编码纤突蛋白巧)、膜蛋白 ＊)和核蛋白＊)的基因均存在基囚插入、缺夫与点突变现象，而SZ基因仅表现为点突变。 3)各结构基因的变异程度不同，纤突蛋白SI基因的变异最大，纤突蛋白SZ的变异次之，膜蛋白基因最为保守，其N端前42位氨基酸较易变异，C端更为保守。核蛋白中间比两端保守。基于SI基因高变区（前500m）。整个引基因、N基因的基因分型结果是一致。 4)LX4株纤突蛋白裂解位点处氨基酸的组成为 Hll］ll；UI，这种序列的毒株不同于已报道的其它传染性支气管炎病毒。 引首次预测了其主要结构蛋白
荣骏弓,康丽娟,谷守林,吴东来,尹训南,王云峰,江国托,褚桂芳[6]（1999）在《腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定》文中研究表明从１９９７年在辽宁省大连市某鸡场发生的一种以腺胃肿大为特征的鸡的传染病病例中收集腺胃组织（Ｄ９７１）接种ＳＰＦ鸡胚，传至１３代，具有规律性死亡和典型胚胎病变特征，ＥＩＤ５０为１０－６．４８／０．２ｍｌ。Ｄ９７１毒株感染ＳＰＦ鸡胚尿囊液经负染电镜观察，可见直径为８０～１２０ｎｍ，有囊膜和纤突的冠状病毒粒子。Ｄ９７１毒株经卵磷脂酶Ｃ处理后能凝集鸡红细胞，并能特异的被Ｄ９７１多抗所抑制。用反转录聚合酶链反应获得了Ｄ９７１毒株免原（Ｓ１）基因ｃＤＮＡ，经１％琼脂糖凝胶电泳可见１．７ｋｂ的特征性条带。用Ｄ９７１毒株接种ＳＰＦ鸡，能引起与自然病例相似的病理变化，并分离到病毒。用Ｄ９７１毒株可直接感染ＳＰＦ鸡胚成纤维细胞。结果证实从腺胃病变型ＩＢ鸡群中分离的Ｄ９７１毒株是冠状病毒科ＩＢＶ成员。
徐雪[7]（2010）在《输卵管囊肿鸡群4种病原调查及IBV流行毒株S1基因变异分析》文中研究说明1.鸡杆菌属（Gallibacterium）是巴氏杆菌科的一个新属,代表种是鸭源鸡杆菌（Gallibacterium anatis）,国外学者已证实鸡杆菌与输卵管炎及输卵管囊肿有一定的关系;王川庆等首次报道了河南省部分发生输卵管囊肿鸡群有较高的鸡杆菌感染率。国外有报道称鸡杆菌经常与产蛋下降综合征病毒（egg drop syndrome,EDS76V）、鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）及鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）等混合感染,而鸡杆菌可能扮演着诱发并加剧其他感染的角色。为了了解国内输卵管囊肿患鸡鸡杆菌感染的情况,并探讨EDS76V、MG和IBV在鸡输卵管囊肿发生过程中所扮演的角色,作者对河南、山西部分输卵管囊肿鸡群及临床健康鸡群进行了上述相关病原感染情况的调查:采集输卵管囊肿鸡群心、肝、脾、肺、气管、输卵管、卵巢和十二指肠,同时采集泄殖腔、上腭裂、喉头和气管棉拭子,样品经血平板划线培养,对疑似鸡杆菌分离物通过定位于16S RNA和23S RNA转录间区序列的特异性PCR扩增鉴定。结果显示:输卵管囊肿鸡群鸡杆菌阳性率41.67%（40/96）,临床健康鸡群鸡杆菌阳性率27.3%（9/33）;棉拭子样品的PCR检测结果显示:所有被检鸡群中仅河南某一鸡场不同批次鸡群个别鸡混合感染有IBV、EDS76V和MG,这一结果初步排除了IBV、MG和EDS76V在这些鸡群输卵管囊肿发生过程中的主要作用,说明鸡杆菌在鸡输卵管囊肿中可能扮演着极为重要的角色,而且临床健康鸡群也存在鸡杆菌的感染,提示人们在防治鸡输卵管囊肿时不可忽视鸡杆菌的作用。2. IBV血清型众多,且各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用,给本病的防治带来很大困难。对IBV流行毒株进行分型对于选择合适疫苗具有重要意义。IBV S1基因是其主要的免疫原基因,该基因全序列分析可为确定流行毒株血清型提供参考。本研究从河南部分疑似传支感染鸡场分离到6株病毒,并对其进行了以下研究:1)病毒接种鸡胚可见胚体上有白色絮状物附着,尿囊膜明显增厚,胚体发育缓慢且有出血斑点;鸡胚尿囊液无直接血凝性;分离物对气管环纤毛有明显的损伤;随着传代次数的增加,孵化至18日龄的鸡胚可见典型侏儒胚变化;病毒核衣壳基因的特异性RT-PCR扩增产物电泳结果为阳性,证实所有分离株均为IBV;2)对上述分离株及参考株YI株、H120疫苗株的S1基因进行了扩增、克隆及序列比较。结果显示8株IBV S1全基因长度分四类,分别是1632bp、1620bp、1617bp和1611bp,序列相互之间存在多位点的变异,同时存在插入和缺失现象;S蛋白裂解位点序列模式有HRRRR、RRFRR和RRSRR三种;同源性分析显示呼吸道型Jin-13株与H120株同源率为97.3%,肾型YI株与ArkDPI11株同源率高达99.8%,腺胃病变型HN/SG株与各毒株同源性仅有79.5%～88.4%;河南肾型分离株HN/HL、XP/1/09、XP/3、WZL株与山东肾型分离株之间的同源性为94.8%～99.1%;遗传进化分析显示YI株与ArkDPI型毒株亲缘关系最近;Jin-13株与H120株亲缘关系较近,HN/HL株、XP/1/09、XP/3、WZL株和山东肾型分离株亲缘关系较近,与河南HN99株亲缘关系较远;而HN/SG株与国内肾型分离株亲缘关系均较远。结果说明河南地区存在不同的IBV流行毒株,而且在S1基因分子水平上发生了明显的变异。3)在上述S1基因全序列分析的基础上,对GenBank上公布的其余21株IBV的S1基因序列进行了分析,找出呼吸型疫苗株和国内肾型流行毒株相对保守的差异序列,据此设计合成两对引物并建立了可以对这两类IBV毒株进行鉴别的反转录-复合PCR。运用该方法对分离的IBV流行毒株和疫苗毒株进行了S1基因部分序列的扩增,结果显示该方法能将我国地方流行的肾型IBV毒株与呼吸型疫苗株完全区分开来,可对本病进行快速分型,为临床上选择合适血清型疫苗提供参考。
王碧林,朱国强,王永坤[8]（1998）在《鸡传染性支气管炎腺胃病变型毒株免疫原基因的分离鉴定》文中提出以腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒分离株Ｈ９５提取的ＲＮＡ为模板，按ＩＢＶＢｅａｕｄｅｔｅ株Ｓ１基因两侧对应序列，设计一对２７ｂｐ引物，引物间跨幅为１７Ｋｂ。用反转录聚梧酶链反应（ＲＴＰＣＲ）获得与预期大小一致的核酸片段。ＲＴＰＣＲ产物凝胶电泳后，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹，经Ｓ１探针检测呈阳性，表明获得分离株Ｈ９５Ｓ１基因。从核酸水平说明以腺胃病变为特征的分离毒Ｈ９５为传支新出现的变异株。此结果与我们血清学鉴定结果一致。
周生[9]（2007）在《禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究》文中进行了进一步梳理禽传染性支气管炎（IB）呈世界广泛流行，是危害养鸡生产最严重的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒（IBV）很容易发生变异，导致新的变异株不断出现，且不同毒株之间交叉保护力弱，使该病经常在免疫和非免疫的禽群爆发，造成了严重的经济损失。在前期工作基础上，本研究对IBV肾型分离株SAIBk株的全基因组和11株分离株的3′端非编码区进行了序列测定和分析，并进一步构建了SAIBk株S1、M、N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行表达研究，在此基础上构建了S1、M、N基因的真核表达质粒并对其免疫原性进行了比较研究，为从分子水平研究IBV的流行进化及研制预防和控制IB的DNA疫苗奠定基础。1．选择具有一定代表性的IBV致肾病变型分离株SAIBk株，采用RT-PCR方法将其基因组分19个片段进行了扩增、测序及分析。结果表明：SAIBk株能引起鸡胚矮化，形成侏儒胚；其病毒经蔗糖密度梯度离心纯化后，在电镜下可观察到典型的冠状病毒粒子；SAIBk株基因组全长27520bp，核苷酸组成中A+T的含量占61.74％；具有典型的冠状病毒基因组结构，其528-20410位为RNA依赖的RNA聚合酶基因，编码两个多聚蛋白ORF1a和ORF1b，20361-27155位主要编码病毒的各种结构蛋白，包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白；SAIBk株与Beaudette、Mass41、Ca199、BJ、KQ6基因组序列的同源率介于85.6％-87.6％之间；不同区域的同源性比较结果表明，3′UTR和5′UTR是基因组中最为保守的区域，同源率介于90％-98％之间，而S1基因是基因组中变异最大的区域，同源率介于74.8％-83.2％之间。本试验在国内外首次对IBV肾型分离株的基因组全序列进行了测定，丰富了冠状病毒的生物信息数据库，为进一步研究该病的分子流行病学和DNA疫苗奠定了基础。2．选择11株IBV分离株，采用RT-PCR方法对其3′端非编码区进行了测序及分析。结果表明：11株分离株3′端非编码区的PCR扩增片断长度介于328bp—512bp之间；将11株分离株与Genbank上登录的15个毒株的序列进行比较分析，表明3′非编码区存在大量的碱基插入和缺失，不同毒株之间碱基数目最大相差208bp；根据不同毒株在3′非编码区片段的大小，可以将26个毒株分成4组；26株毒株3′非编码区的进化树分析结果与按照3′非编码区片段大小进行分组有较一致的结果。其中的基因Ⅰ型和基因Ⅱ型毒株均属于第二组，基因Ⅲ型毒株属于第三组，基因Ⅳ型毒株属于第四组，而第一组的毒株均为国外分离毒株。本试验通过测定11株IBV分离株3′端非编码区的序列，为IBV分离株的分子流行病学研究提供科学依据。3．构建S1、M和N基因的荧光融合表达质粒，转染Vero细胞后观察结构蛋白在细胞内的表达与分布。结果表明：酶切分析和测序结果证明构建了融合表达质粒pS1-EGFP、pM-EGFP、pN-EGFP、pS1-DsRed、pM-DsRed、pN-DsRed；在S1、M、N结构蛋白上均未分析出有核定位信号；转染了pS1-EGFP、pS1-DsRed质粒的Vero细胞，细胞的胞浆和胞核区均显示出绿色荧光或红色荧光，荧光的强度随着转染时间的增加而增强；pM-EGFP、pM-DsRed质粒转染的Vero细胞，激发的绿色和红色荧光仅分布在胞浆区域，且分布不均匀，表明pM-EGFP、pM-DsRed质粒表达的M-EGFP和M-DsRed在胞浆中发生了聚集；pN-EGFP、pN-DsRed质粒表达的融合蛋白在胞浆区域或胞核区域发生了部分聚集。本试验首次构建了S1、M和N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行了表达研究，为进一步研制的IBV DNA疫苗提供了理论基础。4．选择高效的真核表达载体pcDNA3.1（+），将分离株SAIBk株的S1、M、N基因分别插入其多克隆位点，构建真核表达质粒pIBVS1、pIBVM和pIBVN，对构建的表达质粒进行酶切和测序鉴定，用脂质体转染Vero细胞，进行蛋白的表达和鉴定。结果表明：酶切和DNA测序证实重组质粒pIBVS1、pIBVM、pIBVN构建正确；通过RT-PCR、间接免疫荧光检测证实IBV的S1、M、N基因能在细胞中正确的转录和表达。本试验构建了S1、M和N基因的真核表达质粒，并在细胞中进行了表达检测，为进一步的DNA疫苗免疫试验提供了材料。5．将构建的pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒单独或按比例混合进行动物免疫试验。结果表明：雏鸡免疫pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒后，均能产生特异性抗体，对强毒的攻击具有一定的保护力，其中pIBVM的保护率为37.5％；将pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒混合免疫所产生的抗体水平和对强毒攻击的保护力，均要优于单基因的效果；将三基因混合的质粒以脂质体为佐剂进行免疫原性研究，在试验期间脂质体包裹DNA疫苗组与裸质粒疫苗组的抗体水平差异不显着，但前者的抗体水平一直要高于后者；脂质体包裹DNA疫苗组的外周血CD4+T、CD8+T淋巴细胞数量要显着高于裸质粒疫苗组，两者差异显着（P＜0.05）或极显着（P＜0.01）；在攻毒保护率上，脂质体包裹DNA疫苗组的保护率为72.7％，要优于三基因混合裸质粒DNA疫苗组的54.5％。本研究首次在国内外对M基因及S1、M、N基因混合DNA疫苗的免疫原性进行了比较研究，研制出脂质体包裹的三基因混合DNA疫苗，对有效的预防和控制IB的流行具有重要的意义。
陈盛星[10]（2017）在《5株IBV地方分离株临床优势毒株的筛选》文中认为鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是一种在鸡群传播较快的呼吸道疾病,导致产蛋鸡群生长性能和鸡蛋品质下降等情况。该病病原——鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）的套叠式复制方式使得其基因型、血清型众多且仍处于不断增加的趋势。这就意味着,商品化疫苗株常常无法对地方性流行的IB提供有效的免疫保护。因此,根据地方流行毒株来筛选疫苗株或疫苗候选株,成为地方范围内防控IB的重要方向。本研究通过对某地区流行的5株IBV毒株进行血清交叉中和试验以及S1基因测序与对比分析,对该地区流行毒株进行血清分型和基因分型,并筛选出优势毒株,对研制区域性IB疫苗具有重要的参考价值。方法:本实验首先用18～20胚龄的气管环组织作为培养系统,对5株IBV地方分离株（JHL毒株、XPX毒株、SM毒株、ZDZ毒株、DJ毒株）进行气管环半数感染量（TOC-ID50）的测定;其次,制备出各个毒株的阳性血清,采用固定病毒-稀释血清的方法,在气管环组织培养物上进行血清交叉中和试验,用于血清分型;再次,对此5株IBV毒株S1基因进行序列测定与分析比较,用于基因分型;最后根据分型结果筛选出优势毒株,并通过动物回归试验进行免疫保护效果的验证。结果:（1）JHL、XPX、SM、ZDZ、DJ 毒株的 TOC-ID50 分别为1 0-6/ml、10-6.71/ml、10-5.10/ml、10-5.5/ml、10-5.72/ml;（2）血清交叉中和试验结果显示,JHL与XPX、SM、DJ、ZDZ毒株的抗原相关系数分别是 26%、55%、50%、34%,XPX 与 SM、DJ、ZDZ 毒株的抗原相关系数分别是42%、68%、38%,SM与DJ、ZDZ毒株的抗原相关系数分别是45%、47%,DJ与ZDZ毒株的抗原相关系数是52%;5个毒株之间的抗原相关系数范围在26%至68%,最高为DJ与XPX的68%,但没有高于80%,结果表明5个毒株存在着抗原相关性,属于相同血清型的不同亚型。（3）S1基因测序分析及基因分型结果显示,5个IBV毒株的S1基因序列均存在不同程度的碱基突变和缺失,经过建树分析可知,JHL毒株、XPX毒株及DJ毒株属于QX型毒株;SM分离株属于4/91分群中的毒株;ZDZ分离株属于Mass型分离株。（4）优势毒株筛选和动物回归试验结果显示,通过几个毒株间血清型和基因型相互关系的对比,选择DJ这个毒株来免疫动物进行攻毒保护试验;未免疫组鸡群在攻毒后出现精神沉郁,剖检肾脏出现尿酸盐沉积,免疫组攻毒后未出现明显临床症状与病变。血凝抑制（HI）试验结果显示,免疫组鸡只攻毒后第2周血清效价在3.4log2～3.9log2之间,第2～5周其血清效价逐步上升,第5周血清效价在5.7log2～6.5log2之间。未免疫组鸡只在攻毒4周后的血清效价在3.6log2～4.4log2之间,此后有开始上升的趋势。相比于未免疫组,免疫组鸡只在攻毒后的血清抗体产生时间较早,且效价较高,结果表明,使用DJ毒株进行免疫接种可以对其它4个分离株起到较好的临床保护作用。结论:JHL、XPX、SM、ZDZ及DJ 5株分离株均为同种血清型不同亚型;JHL毒株、XPX毒株及DJ毒株这三个分离株基因型为QX型;SM毒株与4/91型;ZDZ毒株为Mass型;DJ毒株为本实验中的优势毒株。
二、鸡传染性支气管炎腺胃病变型毒株免疫原基因的分离鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡传染性支气管炎腺胃病变型毒株免疫原基因的分离鉴定（论文提纲范文）
（2）2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究及以马立克病毒为载体的基因工程疫苗研制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 文献综述 禽传染性支气管炎研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一章 2009～2011年间国内部分地区IBV分子流行病学研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Mass型H120活疫苗对不同基因型IBV流行毒株的免疫保护效力试验 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 表达QX型IBV S1蛋白的重组马立克病毒构建与免疫效力试验 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（4）鸡传染性支气管炎病毒河南流行毒株S1基因的变异分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.1.1 试剂 |
| 1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株 |
| 1.1.3 病料来源 |
| 1.1.4 SPF (无特定病原体) 鸡胚 |
| 1.1.5 参考序列 |
| 1.2 方 法 |
| 1.2.1 病毒分离培养 |
| 1.2.2 分离物毒力鉴定 |
| 1.2.3 尿囊液中病毒RNA的提取 |
| 1.2.4 引物设计 |
| 1.2.5 分离物中IBV的检测 |
| 1.2.5.1 IBV cDNA第1条链的合成。 |
| 1.2.5.2 PCR扩增。 |
| 1.2.5.3 电泳鉴定。 |
| 1.2.6 IBV S1基因的扩增与克隆 |
| 1.2.7 阳性克隆测序及序列分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 病毒分离培养 |
| 2.1.1 对鸡胚的致病性 |
| 2.1.2 气管环培养 |
| 2.2 N基因的PCR扩增 |
| 2.3 IBV S1基因的扩增 |
| 2.4 S1基因的克隆及质粒鉴定 |
| 2.5 S1基因的序列测定 |
| 2.6 IBV分离株的S1基因分析 |
| 2.6.1 S1基因及推导的氨基酸序列比较 |
| 2.6.2 S1基因全序列及编码的氨基酸序列的同源性分析 |
| 2.6.3 以IBV |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（5）鸡传染性支气管炎病毒LX4株主要结构基因的研究（论文提纲范文）
| 中英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 鸡传染性支气管炎与鸡传染性支气管炎病毒 |
| §1 鸡传染性支气管炎 |
| §2 病原研究简介 |
| 第二章 鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白的分子特征 |
| §1 纤突蛋白（S） |
| §2 膜蛋白（M） |
| §3 核蛋白（N） |
| §4 小囊膜蛋白（3c） |
| 第三章 鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的研究进展 |
| §1 N基因 |
| §2 N蛋白 |
| §3 变异和进化 |
| §4 N蛋白的表达 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第四章 传染性支气管炎病毒毒株的分离、鉴定及生物学特性研究 |
| §1 材料与方法 |
| §2 结果 |
| §3 讨论 |
| §4 小结 |
| 第五章 IBV分离株LX4主要结构基因的克隆与序列测定 |
| §1 材料与方法 |
| §2 结果 |
| §3 讨论 |
| §4 小结 |
| 第六章 IBV-LX4株主要结构基因遗传变异分析 |
| §1 材料与方法 |
| §2 结果 |
| §3 讨论 |
| §4 小结 |
| 第七章 IBV国内分离株LX4抗原表位的预测 |
| §1 材料与方法 |
| §2 结果 |
| §3 讨论 |
| §4 小结 |
| 第八章 IBV-LX4 S1基因鸡痘转移载体的构建 |
| §1 材料与方法 |
| §2 结果 |
| §3 讨论 |
| 结论 |
| 进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）输卵管囊肿鸡群4种病原调查及IBV流行毒株S1基因变异分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 中英文缩写表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 鸡输卵管囊肿及其病因学研究进展 |
| 1.1 鸡输卵管囊肿的临床表现及其危害 |
| 1.1.1 流行病学特征 |
| 1.1.2 临床表现及危害 |
| 1.2 病因学研究进展 |
| 1.2.1 国内早期研究概况 |
| 1.2.2 国外早期研究概况 |
| 1.2.3 鸡杆菌与输卵管囊肿 |
| 1.3 结语 |
| 2. 鸡传染性支气管炎病毒致病性、分型及分子生物学特性研究进展 |
| 2.1 病毒致病性及分型研究 |
| 2.1.1 IBV 致病性及临床分型 |
| 2.1.2 血清学分型 |
| 2.1.3 基因分型 |
| 2.2 分子生物学特征 |
| 2.2.1 基因组特征 |
| 2.2.2 S基因研究进展 |
| 2.2.3 遗传变异机制 |
| 2.3 结语 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 鸡杆菌阳性鸡群IBV、MG 和EDS_(76)V 的 PCR 检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 试验二 免疫鸡群传染性支气管炎病毒的分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 试验三 6 株鸡传染性支气管炎病毒流行毒株 S1 基因的变异分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 试验四 基于S1 基因的反转录-复合PCR 对肾型与呼吸型IBV 的分型研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 附录 |
（9）禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 禽传染性支气管炎概述 |
| 前期工作基础 |
| 存在的问题 |
| 本研究的意义 |
| 第一章 IBV肾型分离株SAIBk株全基因组序列测定与分析 |
| 摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 IBV肾型分离株和鸡胚 |
| 2.1.2 宿主菌、质粒和分子生物学试剂 |
| 2.1.3 生化试剂 |
| 2.1.4 器皿及试剂处理 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒培养及致鸡胚病变观察 |
| 2.2.2 病毒的纯化及电镜观察 |
| 2.2.3 病毒RNA提取 |
| 2.2.4 SAIBk株基因组的RT-PCR分段扩增 |
| 2.2.5 3′-RACE获取基因组3′末端片断 |
| 2.2.6 5′-RACE获取基因组5′末端片断 |
| 2.2.7 RT-PCR产物的克隆 |
| 2.2.8 重组质粒的序列测定 |
| 2.2.9 基因组全序列的生物信息学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 SAIBk株的致鸡胚病变 |
| 3.2 病毒的纯化及电镜观察 |
| 3.3 SAIBk株基因组RT-PCR分段扩增结果 |
| 3.4 3′-RACE和5′-RACE获取病毒基因组末端片断结果 |
| 3.5 RT-PCR产物的克隆和序列测定结果 |
| 3.6 基因组全序列的生物信息学分析结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 病毒的电镜观察 |
| 4.2 SAIBk株基因组的分段扩增 |
| 4.3 SAIBk株基因组的生物信息学分析 |
| 5. 小结 |
| 第二章 11株IBV分离株3′非编码区序列的测定与分析 |
| 摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 种毒和鸡胚 |
| 2.1.2 宿主菌、质粒和分子生物学试剂 |
| 2.1.3 生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的增殖 |
| 2.2.2 病毒RNA提取 |
| 2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.4 3′非编码区的RT-PCR扩增 |
| 2.2.5 3′非编码区产物的克隆 |
| 2.2.6 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.7 重组质粒的序列测定 |
| 2.2.8 3′非编码区的序列分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 3′非编码区序列的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 3′非编码区的序列测定和基本特性分析 |
| 3.3 3′非编码区序列的同源性分析 |
| 3.4 3′非编码区核苷酸序列的进化树分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 IBV 3′非编码区的特征 |
| 4.2 3′非编码区的序列分析 |
| 5. 小结 |
| 第三章 S1、M、N基因荧光融合表达质粒的构建及表达研究 |
| 摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞株、质粒和宿主菌 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒RNA提取 |
| 2.2.2 S1、M、N基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2.3 S1、M、N基因荧光融合表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.4 S1、M、N蛋白的定位序列分析 |
| 2.2.5 荧光融合表达质粒的转染和表达检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 S1、M、N基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 S1、M、N基因融合表达质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 S1、M、N基因融合表达质粒的测序鉴定 |
| 3.4 S1、M、N蛋白的定位序列分析结果 |
| 3.5 荧光融合表达质粒在细胞中的表达结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 报告基因的选择 |
| 4.2 核定位信号分析 |
| 4.3 S1、M、N基因在细胞中的表达 |
| 5. 小结 |
| 第四章 SAIBk株S1、M、N基因真核表达质粒的构建 |
| 摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 S1、M、N基因的PCR扩增 |
| 2.2.2 S1、M、N基因真核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 S1、M、N基因真核表达质粒的鉴定 |
| 2.2.4 真核表达质粒的表达检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 S1、M、N基因的PCR扩增结果 |
| 3.2 S1、M、N基因真核表达质粒的鉴定 |
| 3.3 真核表达质粒的表达检测结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 目的基因的选择 |
| 4.2 载体的选择 |
| 4.3 真核表达质粒的转染 |
| 4.4 真核表达质粒表达产物的检测 |
| 5. 小结 |
| 第五章 SAIBk株S1、M、N基因DNA疫苗的制备和免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、实验动物和攻毒用毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 质粒的制备与纯化 |
| 2.2.2 脂质体的制备 |
| 2.2.3 疫苗的配制 |
| 2.2.4 S1、M、N基因DNA疫苗的免疫原性比较研究 |
| 2.2.5 脂质体包裹的三基因混合DNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3. 结果 |
| 3.1 质粒的制备与鉴定 |
| 3.2 脂质体及疫苗的制备结果 |
| 3.3 S1、M、N基因DNA疫苗的免疫原性比较结果 |
| 3.4 脂质体包裹的三基因混合DNA疫苗的免疫原性比较结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 S1、M、N单基因DNA疫苗的免疫原性 |
| 4.2 三基因混合DNA疫苗的免疫原性 |
| 4.3 脂质体包裹的三基因混合DNA疫苗的免疫原性 |
| 4.4 DNA疫苗的免疫反应与攻毒保护 |
| 5. 小结 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| (一) IB的概述 |
| (二) IBV的分子生物学研究进展 |
| (三) IB的疫苗及佐剂研究 |
| (四) DNA疫苗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1. 英汉缩略名词对照表 |
| 附录2. SAIBk株的全基因序列 |
| 在读期间发表的论文、论着及获奖情况 |
（10）5株IBV地方分离株临床优势毒株的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 综述 |
| 1 鸡传染性支气管炎研究概况 |
| 2 鸡传染性支气管炎病原学 |
| 2.1 分类地位 |
| 2.2 形态学特征 |
| 2.3 理化特征和生物学特征 |
| 2.4 培养特性 |
| 3 鸡传染性支气管炎病毒的基因组与编码蛋白 |
| 3.1 基因组 |
| 3.2 编码蛋白 |
| 4 鸡传染性支气管炎病毒的分型 |
| 4.1 免疫型 |
| 4.2 临床分型 |
| 4.3 血清型 |
| 4.4 基因分型 |
| 5 鸡传染性支气管炎病毒疫苗分类 |
| 5.1 灭活疫苗 |
| 5.2 活疫苗 |
| 5.3 基因工程疫苗 |
| 5.4 DNA疫苗 |
| 6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 5株鸡传染性支气管炎病毒的血清分型 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与SPF种蛋 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒增殖 |
| 2.2 病毒阳性血清的制备 |
| 2.3 气管环组织培养 |
| 2.4 TOC-ID50测定 |
| 2.5 血清交叉中和试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 各毒株TOC-ID_(50)检测结果 |
| 3.2 血清交叉中和试验结果 |
| 3.3 血清交叉中和相关稀释 |
| 4 讨论 |
| 第三章 5株鸡传染性支气管炎病毒的基因分型 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与SPF种蛋 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 病毒RNA提取 |
| 2.3 反转录反应 |
| 2.4 PCR反应、测序及序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸡传染性支气管炎病毒S1基因扩增与测序结果 |
| 3.2 鸡传染性支气管炎病毒S1基因序列分析结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 优势毒株筛选与动物实验 |
| 1 材料 |
| 1.1 SPF种蛋与公鸡 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 优势毒株的选择 |
| 2.2 动物验证试验 |
| 2.2.1 实验动物分组与处理 |
| 2.2.2 红细胞凝集试验(HA) |
| 2.2.3 血凝抑制试验(HI) |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状与病理变化 |
| 3.2 抗体效价测定结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1. S1基因测序结果 |
| 致谢 |
四、鸡传染性支气管炎腺胃病变型毒株免疫原基因的分离鉴定（论文参考文献）
- [1]腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒变异株的比较研究[J]. 朱国强,严维巍,孙龙生,王碧林,万洪全,周继宏,庄国宏,王永坤. 中国兽医学报, 1998(03)
- [2]2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究及以马立克病毒为载体的基因工程疫苗研制[D]. 张小荣. 扬州大学, 2012(07)
- [3]腺胃病变型鸡传染性支气管炎毒株H95的研究[J]. 朱国强,王永坤,孙龙生,周继宏,庄国宏,严维巍,王碧林,田慧芳,朱坤喜. 江苏农学院学报, 1996(04)
- [4]鸡传染性支气管炎病毒河南流行毒株S1基因的变异分析[J]. 徐雪,赵军,王川庆,王泽霖,杨霞,周欣,迪丽拜尔·阿木提. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2011(03)
- [5]鸡传染性支气管炎病毒LX4株主要结构基因的研究[D]. 贺秀媛. 西北农林科技大学, 2002(02)
- [6]腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定[J]. 荣骏弓,康丽娟,谷守林,吴东来,尹训南,王云峰,江国托,褚桂芳. 中国预防兽医学报, 1999(02)
- [7]输卵管囊肿鸡群4种病原调查及IBV流行毒株S1基因变异分析[D]. 徐雪. 河南农业大学, 2010(05)
- [8]鸡传染性支气管炎腺胃病变型毒株免疫原基因的分离鉴定[J]. 王碧林,朱国强,王永坤. 中国畜禽传染病, 1998(01)
- [9]禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究[D]. 周生. 四川农业大学, 2007(02)
- [10]5株IBV地方分离株临床优势毒株的筛选[D]. 陈盛星. 福建农林大学, 2017(01)