一、E-3胶技术鉴定（论文文献综述）
彭中灿,赫军,潘雪格,叶贤胜,李昕昕,殷伟峰,张维库,续洁琨[1]（2021）在《山茱萸化学成分的分离与鉴定》文中研究指明目的研究山茱萸Cornus officinalis水提物中的化学成分。方法采用大孔吸附树脂、硅胶、ODS、Sephadex LH-20等柱色谱和反相高效液相色谱方法对山茱萸化学成分进行系统分离和纯化,并通过HR-ESI-MS、NMR等波谱学技术鉴定所分离的化合物结构。结果从山茱萸中共分离得到18个化合物,分别鉴定为5-（1′-羟乙基）-烟酸甲酯（1）、3,4-二羟基苯甲醛（2）、对甲氧基桂皮酸（3）、川楝苷B（4）、dunnianoside D（5）、4-O-（6′-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖基）-顺-对香豆酸（6）、3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（7）、1-O-β-D-葡萄糖基-4-烯丙基苯（8）、2-甲氧基-4-（2-丙烯基）苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（9）、（-）-（E）-4-羟基-3-甲氧基苯丙烯-4-O-β-L-吡喃木糖基-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷（10）、4-羟基-3-甲氧基苯丙-8-烯-4-O-β-D-吡喃木糖基-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷（11）、二氢山柰酚（12）、二氢槲皮素（13）、根皮苷（14）、柚皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（15）、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷（16）、芦丁（17）和槲皮素-3-O-刺槐双糖（18）。结论化合物1～15和18为首次从该植物中分离得到,其中,化合物1～6、8～11、13和15为首次从山茱萸属植物中分离得到。
高帅[2]（2021）在《激活NF-κB信号通路鲑甲病毒蛋白的筛选及致病机制的研究》文中进行了进一步梳理鲑甲病毒（Salmonid Alphavirus）感染鲑科鱼类引起胰脏病（Pancreas disease,PD）和昏睡病（Sleeping disease,SD）,在欧洲养殖场广泛暴发,死亡率在60%～90%之间,幸存鱼通常生长发育迟缓,给鲑科鱼类养殖业造成巨大损失。宿主感染病毒首先启动天然免疫应答,并通过宿主细胞的模式识别受体（Pattern recognition receptor,PRR）识别病毒,激活下游信号传导途径,通过产生炎性细胞因子,I型干扰素（IFN）和其它介质来诱导先天免疫应答,而NF-κB信号通路是宿主发挥抗病毒作用的机制之一。本研究将探究SAV激活NF-κB信号通路的分子机制,及其介导炎症反应的关键蛋白,并对其作用位点进行确定,分析SAV蛋白激活NF-κB信号通路介导炎症反应的分子机制,进一步阐明SAV蛋白与宿主细胞蛋白互作激活NF-κB信号通路介导炎症反应的分子机制。通过SAV感染CHSE-214细胞,利用双荧光素酶报告系统验证SAV激活NF-κB的能力,同时应用双荧光素酶报告系统筛选激活NF-κB的SAV蛋白及其关键功能域,及上游模式识别受体,验证筛选出的蛋白对NF-κB信号通路的激活作用及其产生的下游相关炎症因子;通过质谱筛选与SAV关键蛋白相互作用的CHSE-214宿主细胞蛋白,并采用CO-IP技术、激光共聚焦共定位、双荧光素酶报告系统验证病毒与宿主细胞之间的互作,分析SAV蛋白激活NF-κB通路的分子机制及其对病毒复制的影响。结果如下:1.首先利用双荧光素酶报告系统检测SAV对NF-κB的激活能力,发现SAV V4640感染CHSE-214细胞后可以显着性的激活NF-κB,且随着SAV感染CHSE-214细胞的时间和滴度的增加,双荧光素酶活性值显着上调,表明SAV能够激活NF-κB信号通路,且与感染时间和病毒滴度呈现出时间和剂量依赖性。进一步筛选SAV激活NF-κB信号通路介导炎症反应的关键蛋白,发现SAV非结构编码蛋白Nsp2在激活NF-κB的能力上效果显着,且与Nsp2转染质粒的浓度呈现剂量依赖性,而其它蛋白激活能力明显低于Nsp2。2.利用Western Blot分析发现Nsp2在蛋白水平上可以使NF-κB核转移、p65磷酸化、及IκBα降解,利用实时荧光定量PCR分析发现SAV Nsp2激活NF-κB信号通路后促使下游炎性因子IL-6、IFN-1和Mx1的表达;在将Nsp2转染于CHSE-214细胞时使用NF-κB抑制剂,能够显着性降低下游炎症因子的产生。结果解析了非结构蛋白Nsp2致使NF-κB核转移,诱导产生下游炎症因子的机制。3.将Nsp2全长进行截短,构建重组质粒pCMV-Nsp2-A、pCMV-Nsp2-B、pCMV-Nsp2-C、pCMV-Nsp2-A1、pCMV-Nsp2-A2、pCMV-Nsp2-B1、pCMV-Nsp2-C1、pCMV-Nsp2-ML和pCMV-Nsp2-Zf-AD;利用NF-κB双荧光素酶报告系统对Nsp2激活NF-κB的关键功能域位点进行精确定位。结果表明,SAV Nsp2基因的A2（1-279aa）、ML（279-421aa）、Zf（398-495aa）3段均能够激活NF-κB,其中ML截短蛋白为关键功能域,激活NF-κB的能力最强。4.将SAV感染CHSE-214细胞,同时设置Nsp2重组质粒转染CHSE-214细胞试验组,通过实时荧光定量PCR检测CHSE-214细胞内的TLR信号通路以及关键的接头蛋白的表达。结果显示,SAV V4640和Nsp2均可以显着上调宿主细胞CHSE-214病原模式识别受体TLR3、TLR7和TLR8以及接头蛋白TRAF6、MAVS的表达。证明SAV和Nsp2可以在宿主中引起固有性免疫反应并可以触发机体的抗病毒防御机制。激活宿主细胞的上游分子机制为TLR7和TLR8作用于TRAF6蛋白,RIG-Ⅰ作用于MAVS蛋白招募TRAF6蛋白后作用于IKK家族激活NF-κB促使下游炎性细胞因子的产生。说明SAV V4640及Nsp2是通过TLR3、TLR7、TLR8信号通路和RIG-Ⅰ信号通路共同激活NF-κB信号通路。5.为研究Nsp2是否能够影响SAV的复制,利用实时荧光定量PCR检测Nsp2转染CHSE-214细胞后24 h、48 h和72 h细胞内SAV的病毒载量。结果表明,与对照组相比,转染Nsp2实验组在72 h产生的病毒载量被显着性抑制,推断是由于转染Nsp2激活NF-κB信号通路在72 h时产生的大量IFN-1对SAV的繁殖有抑制作用。6.利用IP技术钓取与SAV Nsp2蛋白相互作用的宿主细胞CHSE-214的蛋白,利用质谱分析筛选出174个与Nsp2互相作用的宿主蛋白。通过NCBI blast分析注释将筛选出的宿主细胞蛋白进一步采用GO注释及KEGG代谢通路的注释。结果表明,根据GO注释分析结果显示这174个蛋白中与Nsp2互作的蛋白参与了动物器官发育,生物发育,泛素ERAD途径,内质网内泛素机制,对内质网的应激反应,翻译,肽生物合成过程,核糖核蛋白复合物的产生等生物过程。KEGG分析结果表明与炎症反应相关的蛋白共有5个,其中与NF-κB信号通路相关的Toll样受体信号通路和RIG-Ⅰ信号通路的富集蛋白基因编号分别是A0A060YTB0（IKK）和A0A2P1K3U9（DDX3）。进而初步判定SAV Nsp2蛋白与相应的宿主细胞CHSE-214中的IKK和DDX3蛋白的相互作用可以介导NF-κB信号转导途径。7.将A0A060YTB0（IKK）和A0A2P1K3U9（DDX3）宿主蛋白放入数据库中进行富集,根据蛋白互作的网络结果分析可知RIG-Ⅰ信号通路中A0A2P1K3U9（DDX3）蛋白富集程度高。进一步利用激光共聚焦和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）方法验证了Nsp2与DDX3在CHSE-214细胞中互作的真实性。此外,双荧光素酶报告系统试验结果显示DDX3与Nsp2互作会降低双荧光素酶活性,DDX3会抑制NF-κB的激活。表明Nsp2与DDX3结合后解除DDX3对NF-κB的抑制,从而激活NF-κB的信号传导。综上所述,本研究首次确定了SAV能够感染宿主细胞显着激活NF-κB信号通路,并且非结构蛋白Nsp2蛋白能够单独激活NF-κB信号通路,鉴定了非结构蛋白Nsp2激活NF-κB的关键结构域位于第279-421氨基酸之间。确定了TLR3、TLR7、TLR8和RIG-Ⅰ介导的信号通路共同参与了Nsp2及SAV对NF-κB信号通路的激活,并且Nsp2可以激活NF-κB产生下游炎症因子IL-6、Mx1和IFN-1从而引起炎症反应,阐明了Nsp2激活NF-κB信号通路的传导途径。IFN-1具有抑制SAV病毒的复制的能力。Nsp2通过与宿主DDX3蛋白互作激活NF-κB信号通路,参与病毒蛋白的翻译和复制的过程,推测病毒利用宿主细胞合成自身病毒元件,进一步表明Nsp2蛋白与病毒复制相关。Nsp2在SAV复制和致病机制中均发挥重要作用,为研究抗病毒的基因靶向药物及抗病育种提供理论依据。
刘小花[3]（2021）在《猪源TRIMs遗传特性分析及猪TRIM21影响PCV2感染的机制研究》文中研究表明三重基序（Tripartite motif,TRIM）基因家族是一组主要作用于翻译后修饰的中等规模的亚家族,其N端基本上都具有较为保守的RING、B-Box和Coiled-coil结构域（即RBCC结构域）。TRIMs具有多种功能,如参与免疫应答反应、细胞应激反应和影响病毒复制等。研究表明TRIM蛋白可直接调控病毒生命周期中的不同步骤,或通过先天性免疫感受器介导的信号转导途径,诱导抗病毒细胞因子的产生。猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是一种极小的无包膜、单链环状DNA病毒。PCV2对宿主的免疫系统产生抑制甚至损害,且可与其他猪源病毒共同感染,进而导致多种疾病的发生。该病毒依赖于口鼻、分泌物和排泄物进行群体间的水平传播,还可通过胎盘或精液进行垂直传播,传播性较强。但是,目前并没有关于猪源TRIMs参与PCV2调控的相关研究。文献报道,人源和鼠源的三重基序蛋白21（Tripartite motif-containing protein 21,TRIM21）具有广谱抗病毒作用,且猪源TRIM21可能对猪源病毒PRRSV和PEDV的感染存在抑制作用。本研究通过对61种猪源TRIM基因（porcine TRIMs,p TRIMs）绘制系统进化树发现,猪源TRIM21与猪源TRIM5、TRIM6、TRIM34和TRIM38的亲缘关系更近,其中TRIM6、TRIM21和TRIM38均具有RBCC-PRY/SPRY结构域,暗示猪源TRIM6、TRIM21和TRIM38可能有相似的抗病毒活性,可作为抗病毒基因的靶向选择。用PCV2感染PK-15细胞并经RNA-seq分析筛选发现,有10种p TRIMs表达差异显着。m RNA表达水平检测结果表明,TRIM21在PCV2感染的PK-15细胞中显着表达。故而本研究后续以TRIM21为主要研究对象。用PCV2感染TRIM21过表达及敲除细胞株发现,TRIM21过表达可促进PCV2的增殖,而TRIM21敲除后产生相反结果。此外,利用免疫印迹、荧光定量PCR以及ELISA等方法证明,TRIM21在PCV2感染后促进IFNβ和IFNγ以及促炎因子IL-6和TNFα的表达。骨髓细胞核分化抗原样蛋白（Myeloid cell nuclear differentiation antigen-like protein,MNDAL）是IFI200家族成员的一员。我们实验室前期研究发现,MNDAL可能参与PCV2感染诱导的细胞凋亡。本研究发现,PCV2感染PK-15细胞后,TRIM21通过促进MNDAL和BCL-2的表达、抑制P53的产生,进而抑制PCV2感染诱导的细胞凋亡,最终促进PCV2的增殖。此外,用免疫共沉淀和激光共聚焦分析发现,TRIM21与PCV2的Rep蛋白存在相互作用,且主要分布在细胞核周。综上所述,本研究证实猪源宿主因子TRIM21促进PCV2的感染,可为今后抗猪源病毒的研究提供新的靶点和思路。
谭妮[4]（2021）在《苹果树腐烂病菌CAP蛋白VmPR1c功能域研究及作用靶标鉴定》文中提出苹果树腐烂病是由黑腐皮壳属真菌Valsa mali（Vm）引起的一种枝干性病害,可造成树干枯死、果品产量及质量大幅下降,严重制约着我国苹果产业的发展。然而,V.mali致病机理目前仍不够明确,深入挖掘、解析该病菌致病因子对腐烂病科学防治具有重要指导意义。CAP超家族蛋白是一类广泛存在于不同生物界中的保守蛋白,包括富含半胱氨酸的分泌蛋白（Cysteine-rich secretory proteins,CRISP）、抗原5（Antigen 5）、病程相关蛋白1（Pathogenesis-related 1 proteins,PR1）,该类蛋白在多种植物病原真菌致病过程中发挥着重要作用。前期研究发现,腐烂病菌中的一个CAP基因VmPR1c敲除后致病力显着下降,说明VmPR1c是一个重要的致病因子。序列分析发现,VmPR1c从N端到C端分别含有信号肽、NTE（N-terminal extension）、CAP结构域和CTE（Cterminal extension）区域。那么,VmPR1c的信号肽能否指导外泌?不同结构域与功能的关系是什么?其在植物中的作用靶标又是什么?围绕上述问题,本研究综合应用生物信息学和分子生物学方法开展了研究。主要结果和结论如下:（1）VmPR1c的信号肽具有分泌功能。通过Signal P 5.0线上预测分析发现VmPR1c蛋白N端含有一段17个氨基酸的信号肽,将VmPR1c的信号肽序列构建载体并转化至酵母营养缺陷型菌株YTK12中,进行TTC显色鉴定,发现转入含有VmPR1c信号肽序列质粒的酵母菌液与TTC反应后溶液变红,证明VmPR1c的信号肽具有分泌功能。此外,采用本氏烟（Nicotiana benthamiana）异源表达的方法发现VmPR1c的信号肽整合到INF1蛋白缺失信号肽的部分后,可以回复INF1引发烟草叶片坏死的功能,说明VmPR1c的信号肽可以指导蛋白的外泌;（2）VmPR1c的NTE段、CAP段、160-224段、H211对于该蛋白激发植物免疫功能具有重要作用。在本氏烟叶片上瞬时表达VmPR1c后发现,相比于GFP对照处理,本氏烟抗性标志基因Nb PR1a、Nb PR2、Nb PR4、Nb LOX相对表达量分别上调21.16、6.66、13.52、13.06倍,说明VmPR1c可以激发烟草免疫反应。对VmPR1c蛋白NTE、CAP、CTE段分别进行缺失,相比于GFP对照处理,VmPR1c蛋白全长、NTE段缺失突变体、CAP段缺失突变体、CTE段缺失突变体处理后Nb PR1a的相对表达量分别为8.84、1.87、1.26、9.84,Nb PR4的相对表达量分别为10.94、0.66、0.50、10.21,说明NTE段、CAP段对该蛋白激发免疫功能至关重要。对VmPR1c蛋白CAP段进行逐段缺失发现,160-224段缺失后Nb PR1a基因的相对表达量为0.96,Nb PR4基因的相对表达量为0.40,H211突变后,Nb PR1a基因的相对表达量为0.77,说明160-224段、H211对该蛋白激发烟草免疫反应的功能十分重要;（3）VmPR1c与苹果（Malus domestica）E3泛素连接酶MdRFP141互作。双分子荧光互补与免疫共沉淀试验均表明VmPR1c与MdRFP141在烟草叶片中存在互作关系;对MdRFP141进行蛋白功能注释及功能域分析,该蛋白在154-202位含有一段RING（Really Interesting New Gene）Finger功能域,具有E3泛素连接酶活性,为泛素化修饰中重要的酶类之一。系统进化分析表明MdRFP141与其在白梨（Pyrus bretschneideri）中的同源蛋白聚在一支,亲缘关系最近。测定本氏烟中抗性基因的相对表达量表明,MdRFP141可以激发烟草叶片的免疫反应;瞬时表达MdRFP141后接种核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）,与对照相比,核盘菌病斑面积显着减小,表明MdRFP141可以增强烟草叶片对核盘菌的抗性。综上所述,VmPR1c是一个外泌蛋白,其能够激发烟草叶片免疫反应,且该蛋白中的NTE区域、CAP功能域中的160-224段、H211对于蛋白的免疫功能至关重要。此外,经鉴定发现,苹果E3泛素连接酶MdRFP141是VmPR1c的一个互作靶标,MdRFP141可以增强烟草叶片对核盘菌的抗性,推测VmPR1c通过靶向MdRFP141干扰寄主的免疫反应并发挥毒性功能。
张君[5]（2021）在《Na+/K+ ATPaseβ3亚基对乙型肝炎病毒抑制作用及机制的研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（HBV）感染导致全世界超过2.5亿人罹患多种肝病。每年有140万人死于与HBV相关的疾病,包括肝硬化,肝衰竭和肝细胞癌。目前,仅核苷酸类似物和干扰素（IFN）被批准用于治疗HBV感染的患者。HBV的基因组是一个3.2kb的部分双链松弛环状DNA基因组（rc DNA）,感染后,HBV基因组被传递到细胞核中并转化为共价闭合的环状DNA（ccc DNA）。ccc DNA依次形成一个微染色体,并用作转录不同病毒转录本的模板,包括3.5kb pre C mRNA和前基因组RNA（pg RNA）,两个包膜mRNA（2.4kb和2.1kb）和X mRNA（0.7kb）。在病毒转录物中,pre C mRNA编码前核心蛋白。pg RNA可翻译为病毒HBc和Pol蛋白,也可作为HBV基因组复制的模板。2.4kb和2.1kb的包膜mRNA编码LHBs,MHBs和SHBs蛋白。此外,0.7kb X mRNA可翻译产生HBx蛋白。四个启动子S1P,S2P,XP和CP调节和控制病毒前基因组RNA和蛋白质的转录。在宿主细胞质中发生病毒RNA转化为HBV蛋白后,病毒pg RNA被封装到核心颗粒中。在核心颗粒内部,pg RNA进一步逆转录为病毒DNA（ss DNA和ds DNA）。然后,将含有HBV DNA的成熟病毒颗粒包裹起来并从宿主细胞中释放出来。乙肝病毒颗粒和亚病毒颗粒是乙肝病毒复制过程中产生的主要病毒颗粒。乙型肝炎e抗原（HBe Ag）是HBc Ag的另一种形式,易位进入内质网腔进行蛋白水解加工,并以可溶性蛋白的形式分泌。虽然目前HBe Ag的功能仍然不明确,但是HBs Ag和HBe Ag被认为对HBV传播和临床诊断很重要。ATP1B3（也称为CD298）,是Na+/K+ATPase的三个调节性β亚基之一,于1998年被首次发现和鉴定。先前的研究表明,ATP1B3不仅参与了Na+/K+泵的活性,还可以调节T细胞活化的独立Na+/K+ATPase活性。近期研究表明Na+/K+ATPase的β亚基与某些病毒感染有关。例如ATP1B1被鉴定为人类巨细胞病毒（HCMV）UL136蛋白以及甲型和乙型流感病毒的M2蛋白的伴侣。此外,ATP1B3还可以减少Hela细胞中BST-2介导的人类免疫缺陷病毒1产生的限制。并且近期研究表明ATP1B3与肠病毒71（EV71）的3A蛋白相互作用,并通过增强I型干扰素的产生来抑制EV71复制。与此同时,BST-2被鉴定为是一种可诱导IFN的抗病毒蛋白,它阻止了各种包膜病毒的释放,例如HIV,Lassa,Marburg和埃博拉病毒。现有研究证明BST-2将新生的HBV病毒粒子束缚在质膜上。同时,通过酵母双杂交筛选鉴定了ATP1B3和BST-2存在相互作用。那么ATP1B3是否参与HBV的传播?以及ATP1B3和BST-2之间的关系是否与HBV的传播有关?本研究探讨ATP1B3对HBV复制的影响,并得出了以下的实验结果及结论:1.ATP1B3能够抑制HBV抗原的分泌。本研究将HBV感染性克隆质粒转染进Hep G2细胞中,同时转染ATP1B3表达质粒,通过ELISA的方法检测上清中HBs Ag的含量。通过与对照组对比,实验组HBs Ag含量明显减少。在Hep G2.2.15和Hep AD38细胞中过表达ATP1B3,同样能够减少细胞培养上清中HBs Ag的产生。相对地,在细胞中使用小干扰RNA和短发夹RNA介导ATP1B3的沉默,能够增加上清中HBs Ag的含量。同时,ATP1B3并未下调细胞内HBV复制中间体（HBV DNA）和转录本（HBV RNA）的含量。它表明ATP1B3能损害病毒蛋白的表达,但不能损害病毒复制和转录。以上结果说明,ATP1B3能够抑制HBV抗原的分泌。2.ATP1B3激活Hep G2细胞中的NF-κB信号传导通路。通过双萤光素酶报告基因检测Hep G2细胞中ATP1B3对NF-κB活化的影响。观察到ATP1B3以剂量依赖性方式激活NF-κB信号通路。核质分离实验证实ATP1B3诱导NF-κB亚基P65转运进核内。TAK1蛋白可以激活NF-κB。将TAK1转染到sh RNA介导的ATP1B3沉默的Hep G2中,NF-κB的激活受到强烈抑制。使用NF-κB抑制剂Bay11-7082证实了抑制NF-κB活性能显着降低HBs Ag的表达。推测ATP1B3可以通过激活NF-κB以抑制HBV。3.ATP1B3诱导IFN-α/ISGs和IL-6抑制HBV。ATP1B3上调Hep G2细胞中IFN-α和IL-6的表达。实时定量PCR的结果表明ATP1B3可以明显诱导OAS2和BST-2,但不能诱导ISG-15和ISG-56的表达。这些研究结果表明ATP1B3诱导的BST-2的表达可有助于对HBV抗原的抑制功能。进一步研究发现,与HEK293T细胞相比,Hep G2细胞中BST-2的表达被IFN-α显着上调。因此,以上研究表明,ATP1B3可以通过NF-κB/IFNs诱导BST-2,从而促进肝细胞对HBV的抑制。4.ATP1B3与BST-2合作促进HBs Ag限制抑制HBV。为了证明ATP1B3和BST-2在限制HBV方面的协同作用,我们研究了ATP1B3在BST-2阴性细胞HEK293T中对HBV的抑制作用。结果显示ATP1B3对BST-2阳性细胞Hep G2的HBs Ag产生的抑制作用强于BST-2阴性HEK293T细胞,表明BST-2可能是ATP1B3限制肝细胞中HBs Ag的合作者。5.ATP1B3促进蛋白酶体依赖的细胞内HBs Ag的降解。蛋白质印迹显示ATP1B3的过表达显着降低了LHBs,MHBs的细胞内蛋白水平,SHBs略有减少,Core蛋白则没有显示出任何下降。CHX追踪分析证实了ATP1B3的表达加速了细胞中HBs的降解。蛋白酶体抑制剂MG132能够明显抑制ATP1B3诱导的降解,并且呈剂量依赖性。6.ATP1B3与LHBs和MHBs在细胞中相互作用并共定位。通过免疫荧光分析研究了ATP1B3与HBV蛋白的共定位。作为跨膜蛋白,ATP1B3单独位于细胞膜上。当与LHBs和MHBs共表达时,ATP1B3在核周区域周围呈点状分布,并与LHBs和MHBs一起在细胞质中扩散,而HBc表现出聚集的胞质分布并且几乎与ATP1B3共定位。我们推测,ATP1B3由于与HBs相互作用将其从膜扩散到细胞质,从而被强力降解。ATP1B3跨膜区的缺失几乎导致ATP1B3不再与LHBs,MHBs和SHBs共定位。我们推测跨膜区域可能是负责HBs结合和降解的功能域。通过免疫共沉淀进一步确认了ATP1B3与HBs之间存在相互作用。7.ATP1B3诱导LHBs和MHBs的多聚泛素化。用泛素或靶向蛋白抗体染色时,当存在ATP1B3时,LHBs和MHBs的多泛素化程度要强于不存在ATP1B3的情况。我们还发现了在48位（K48）仅包含一个赖氨酸的泛素突变体足以用于ATP1B3介导的HBs泛素化。在使用阴性的泛素突变体后,完全阻断了ATP1B3介导的LHBs和MHBs的降解,这进一步证实ATP1B3介导的HBV包膜蛋白降解是蛋白酶体依赖性方式。综上所述,本研究运用分子生物学、病毒学等研究手段,证明了ATP1B3对HBV的抑制作用,并揭示了ATP1B3通过核因子κB（NF-κB）/IFN-α和NF-κB/白介素-6（IL-6）途径成为HBV复制的新型宿主限制子。此外,本研究证明了ATP1B3诱导其结合蛋白BST-2拮抗Hep G2细胞中的HBs Ag。同时,ATP1B3促进了蛋白酶体依赖性的HBV包膜蛋白的降解,并且通过第48位赖氨酸泛素化促使HBs加速降解。我们得出结论,ATP1B3作为一种新型抗病毒因子,可以采用多种机制来对抗HBV。我们的工作突出了ATP1B3可以作为HBV感染的潜在治疗靶标。
顾天天[6]（2021）在《鸭TRIM25泛素化介导RLR信号通路调控IFN-β的产生》文中指出禽流感病毒是危害当前养禽业的重要病原,它不仅给家禽业造成巨大的经济损失,还由于人畜共患引发一些公共卫生安全事件,因此有效防控禽流感发生已成为家禽业健康生产中迫切需要解决的问题之一。研究已发现鸭对流感病毒敏感性显着低于鸡,主要原因在于鸭可依托体内特有的RIG-I信号通路的激活发挥抗病毒效应。在免疫信号通路中泛素化修饰广泛存在,其不仅调节细胞内多项生理功能,还参与调控多种病毒的复制与增殖过程。TRIM25（tripartitemotifcontaining25）作为E3泛素连接酶,鸭TRIM25泛素化可否介导RIG-I信号通路参与抗病毒效应调控,其作用机理尚不清楚。基于此,本研究利用5’pppdsRNA体外模拟禽流感病毒感染鸭胚胎成纤维细胞（DEFs）,通过泛素化蛋白质组学技术结合免疫共沉淀（Co-IP）对鸭TRIM25介导泛素化对RIG-I信号通路调控机制研究,旨在揭示鸭RIG-I信号通路关键分子调控免疫应答的分子机制及其作用机理,为揭开鸭病毒特异性清除机制和禽流感防控提供新的思路。主要研究内容如下:1.禽流感病毒模拟物体外感染对鸭RIG-I信号通路蛋白泛素化修饰的影响为探明鸭感染禽流感病毒对RIG-I信号通路蛋白泛素化修饰的影响,采用5’ppp dsRNA模拟禽流感病毒体外感染,Western Blot检测发现5’ppp dsRNA刺激后总泛素化水平发生显着变化,同时RT-qPCR结果显示RLRs（RIG-I、MDA5、LGP2）和免疫炎症因子（包括IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-2）mRNA水平显着上调。为进一步筛选5’ppp dsRNA感染DEFs的泛素化修饰关键蛋白,利用Label-free技术,结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）筛选到943个差异表达的泛素化蛋白（446个泛素化蛋白显着上调,497个泛素化蛋白显着下调）和1566个差异表达的泛素化位点（754个泛素化位点修饰显着上调,812个泛素化位点修饰显着下调）,含35种泛素化修饰的motif元件。通过生物信息学技术对存在显着差异修饰蛋白进行亚细胞定位、生物学功能、KEGG代谢通路等分析,发现修饰显着差异蛋白与蛋白酶体降解、蛋白定位以及能量代谢等多种生物进程相关,其中5’ppp dsRNA激活的参与RIG-I信号通路有8种蛋白（TRIM25、MAVS、USP14、UBE2N、DDX3X、RAD23A、MEX3C、EFTUD2）发生显着泛素化修饰改变,包含17个泛素化修饰位点。进一步采用TMT技术验证5’ppp dsRNA感染后上述蛋白表达水平变化,发现这8种泛素化修饰蛋白均未发生显着表达变化,表明在鸭抗病毒感染中泛素化修饰而不是蛋白本身表达的改变发挥了关键作用。2.鸭TRIM25泛素化介导RIG-I信号通路调控抗病毒作用为探讨鸭TRIM25泛素化调控抗病毒作用,在获取鸭TRIM25的cDNA全长序列（GenBank登录号:KY974316）基础上,并对duTRIM25组织表达谱进行了检测。结果发现duTRIM25包含一个RING结构域,2个B-Box结构域和1个SPRY结构域。组织表达谱结果显示duTRIM25在肾脏、肝脏和肌肉中高度表达,而在十二指肠和卵巢中表达量相对较低。为进一步探讨TRIM25泛素化介导RIG-I信号通路调控抗病毒作用,通过构建TRIM25真核表达载体及合成TRIM25干扰小RNA,分别检测了过表达和敲低TRIM25对RIG-I信号通路调控的影响。免疫共沉淀结合Western Blot检测TRIM25泛素化水平变化,结果表明,在5’ppp dsRNA刺激下,过表达duTRIM25,其泛素化水平显着提高,同时采用双荧光素酶报告基因系统和ELISA发现IRF1和NF-κB的含量及IFN-β的转录活性显着增强,而敲低duTRIM25则表现出相反趋势。RT-qPCR检测结果发现,过表达 duTRIM25 能介导 RIG-I 信号通路上的 IFN-β、IRF1、NF-κB、RIG-I、MAVS、FADD、TRAF2及TBK1基因表达量显着上调,而内源性敲低duTRIM25则下调上述基因的表达。因此说,在5’pppdsRNA刺激下,鸭TRIM25可介导泛素化调节RIG-I信号通路抗病毒作用。3.鸭TRIM25泛素化介导RIG-I信号通路调控抗病毒作用机制为了进一步阐明TRIM25泛素化激活RIG-I信号通路中的抗病毒作用机制,鉴于泛素化连接存在K48-连接（蛋白酶体降解）和K63-连接（DNA损伤修复、NF-κB通路调节等过程）两种形式,我们首先发现5’ppp dsRNA刺激能够促进TRIM25发生K63-连接的泛素化修饰,提示TRIM25泛素化修饰可激活下游信号传导。为了进一步证实TRIM25泛素化修饰的激活机制,利用定点突变技术对前期泛素化蛋白质组学结果中TRIM25泛素化修饰差异显着的赖氨酸位点（K263、K2 76、K281和K293）进行突变,分别构建TRIM25不同突变位点的表达载体（K263R、K276R、K281R和K293R）,免疫共沉淀结合Western Blot检测发现经5’ppp dsRNA刺激TRIM25 K276R和K293R显着降低其泛素化水平。因此说,在5’pppdsRNA刺激下,鸭TRIM25可通过K276和K293位点泛素化激活RIG-I信号通路参与抗病毒作用调控。综上,在5’pppdsRNA刺激下,鸭TRIM25泛素化可介导RIG-I信号通路促进IFN-β表达,并依托TRIM25 K276和K293位点泛素化激活发挥了抗病毒作用,研究结果阐明了鸭TRIM25泛素化介导的RIG-I信号通路调控分子机制。
刘晓柱,张远林,李银凤,于志海,黄名正[7]（2021）在《高产β-葡萄糖苷酶酵母菌的诱变选育及对刺梨果酒香气特性的影响》文中研究说明为分析β-葡萄糖苷酶对刺梨果酒香气特性的影响,以一株产β-葡萄糖苷酶异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus, W.anomalus）C4菌株为出发菌株,采用化学诱变剂甲基磺酸乙酯对其进行化学诱变,以进一步提高其β-葡萄糖苷酶活性。将W.anomalus C4菌株、突变菌株W.anomalus E3菌株纯种或与酿酒酵母以混合发酵形式发酵刺梨果酒。对硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷显色法（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG）检测刺梨果酒发酵过程中β-糖苷酶活性变化;顶空固相微萃取-气相质谱联用法测定各组刺梨果酒挥发性香气成分。甲基磺酸乙酯诱变得到一株产β-葡萄糖苷酶性能稳定,酶活为（55.05±0.74）U/L的突变菌株W.anomalus E3。与W.anomalus C4菌株相比,W.anomalus E3菌株的酶活提高了31.70%。在刺梨果酒发酵过程中,W.anomalusβ-葡萄糖苷酶活性逐渐增大,第10 d达到最大值,然后迅速降低。接种W. anomalus C4、及其突变菌株E3可降低刺梨果酒包括总酸、挥发酸、pH在内的酸度值以及总糖含量;同时还可增加刺梨果酒中挥发性酯类、醇类物质的种类和含量以及主要香气成分风味活性值（OAV）。因此,接种产β-葡萄糖苷酶W.anomalus菌株有助于调节刺梨果酒的香气特性,增加刺梨果酒的复杂性和丰富度。
金冬雪[8]（2021）在《转BpGLK1白桦生长、叶色变异分析及环境安全性初步评价》文中研究说明GLK是一类在植物中广泛存在的转录因子,参与调控叶绿体发育和调控光合作用相关的核基因表达。研究证明,35S::转BpGLK1-RNAi抑制表达株系苗期叶色呈现亮黄绿色,观赏价值较高,在园林绿化方面前景广阔。为了后续转BpGLK1基因白桦的产业化推广应用,实验以获得的35S::BpGLK1过表达白桦、35S::转BpGLK1-RNAi抑制表达白桦为材料,开展生长、叶色变异分析及环境安全性评价,具体研究结果如下:（1）1年生及2年生的转BpGLK1基因白桦中（我们把当年移栽的转基因白桦称为1年生,到了第二年称为2年生）,导入的目标基因仍整合于转基因株系的基因组中,且过表达转基因株系中BpGLK1显着上调,抑制表达转基因株系中BpGLK1显着下调。（2）BpGLK1基因的抑制表达提高了白桦纤维素含量。BpGLK1基因的低表达对2年生苗高生长无影响,7个抑制表达株系中有6个株系在整个生长期叶绿素含量低于WT株系,叶色亮度及黄色程度高于WT株系,其中RE1、RE7株系上述性状均优于其他株系,是后续城市园林绿化应用推广的首选株系。（3）采用PCR及qRT-PCR技术对目标基因及抗性基因进行分子检测,结果表明,转基因株系中插入的目标基因及Bar抗性基因表达稳定,且未检测到外源基因及Bar抗性基因漂移,也未发现其逸生为杂草现象。（4）采用二代测序技术鉴定了 7个株系的T-DNA插入位点,RE1转基因株系共检测到1个候选T-DNA插入位点（表3-2）,RE2转基因株系共检测到20个候选T-DNA插入位点,RE3转基因株系共检测到2个候选T-DNA插入位点,RE4转基因株系共检测到2个候选T-DNA插入位点,RE5转基因株系共检测到1个候选T-DNA插入位点,RE6转基因株系共检测到1个候选T-DNA插入位点,RE7转基因株系共检测到1个候选T-DNA插入位点。（5）在细菌群落丰度方面:转BpGLK1的过表达和抑制表达株系与WT白桦的根际土壤细菌群落丰度和多样性方面均无显着差异。真菌群落丰度方面:RE株系与WT株系的根际土壤真菌群落丰度和多样性均有显着差异（P<0.05）;OE株系与WT株系的根际土壤真菌群落丰度和多样性则无显着差异。（6）在植物生长旺盛的7月中旬BpGLK1抑制表达植株（RE4除外）土壤蔗糖酶活性均高于WT株系;土壤纤维素酶酶活在6月中旬-7月中旬OE及RE株系均显着高于WT株系（OE1例外）;土壤脲酶活性在6月中旬转BpGLK1株系（除OE3、RE4、RE6外）均显着高于WT株系;多数BpGLK1抑制表达株系的过氧化氢酶活性在7月中旬至9月中旬均显着高于WT株系;中性蛋白酶活性在9月中旬最高,且OE及RE株系均显着高于WT株系。
秦志远[9]（2021）在《尿液细胞外囊泡中miR-224-5p通过抑制cyclin D1调控PD-L1表达的机制研究》文中研究说明肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）是泌尿生殖系统最常见的癌症之一。尽管靶向PD-1/PD-L1免疫检查点的抑制剂已被批准用于RCC临床治疗,但是目前多数患者仍无法从该疗法中获益,且多伴随不同程度的不良反应,其具体机制仍有待阐明。另外,影响PD-L1表达水平变化的潜在因素也多是未知。因此,有必要深入探究RCC中调控PD-L1表达的分子机制并探寻相关的生物标志物。近些年许多学者关注到细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）在癌症发生发展中的重要作用。人们意识到包含多种生物活性内容物的EVs在体液中具有高度稳定性,因而是理想的肿瘤生物标志物库。特别是对于RCC来说,阐明尿液EVs内容物与免疫检查点抑制剂疗效的相关性,揭示其在肿瘤免疫等过程中的生物学功能,将为发现相关非侵入式生物标志物提供关键线索。但是目前我们对RCC患者尿液EVs中绝大多数内容物,尤其是含量丰富的微小RNA（microRNA,miRNA）的表达水平及其具体功能知之甚少,鲜有研究者尝试从中筛选参与PD-L1表达调控的潜在生物标志物。在本课题中我们首先通过差速超速离心法提取了RCC细胞系培养基上清液、人血浆和人尿液中EVs,并从形态、粒径和蛋白标志物等多个角度进行了鉴定,明确了提取方法的可行性。随后我们提取了6位RCC患者和6位健康志愿者尿液EVs的RNA,通过smallRNA测序技术筛选出差异表达miRNA,利用实时定量PCR检测了RCC患者癌和配对癌旁组织中的miRNA水平,同时挖掘公共数据库并结合文献报道的结果,鉴定所筛选的miRNA在癌组织中的表达水平。接着设计了一系列体外细胞实验对miRNA在RCC细胞中的生物学功能进行了多方面考察。我们进一步利用数据库预测了miRNA的靶基因和具体结合位点并进行了实验验证。最后通过功能缺失性和获得性实验着重对其作用机制进行了深入探究。实验结果表明,本课题成功建立了RCC细胞系和人尿液EVs的提取方法,且所得EVs能满足后续的RNA测序、与受体细胞共培养等相关实验的需求。同时我们还从EVs形态和标志蛋白表达两方面对尿液样本的保存温度进行了条件优化。通过smallRNA测序共鉴定出34条在RCC患者和健康志愿者尿液EVs中异常表达的miRNA,并进一步对比RCC患者组织中的表达趋势,明确了在RCC患者尿液EVs和癌组织中显着高表达的miR-224-5p作为后续研究对象。体外细胞实验结果表明miR-224-5p在RCC细胞中能抑制增殖、引起细胞周期阻滞于G1期、以及增强细胞的迁移和侵袭能力。接着阐明了编码cyclin D1蛋白的CCND1基因是miR-224-5p的靶基因,其3’非翻译区存在miR-224-5p的结合位点。同时,我们还发现miR-224-5p能在RCC细胞中通过抑制cyclin D1的表达,影响cyclin D-CDK4和E3泛素连接酶cullin 3接头蛋白SPOP介导的泛素化/蛋白酶体途径统对PD-L1的降解作用,最终抑制T细胞对RCC细胞的杀伤作用。有意思的是,该机制还能通过EVs的形式在RCC细胞间传递。总之,本课题建立了人尿液EVs的提取方法,检测到miR-224-5p在RCC患者尿液EVs和癌组织中呈现显着高表达,并发现miR-224-5p在RCC细胞中能够靶向cyclin D1而抑制细胞增殖并导致细胞周期阻滞。本文还阐明了miR-224-5p通过抑制cyclin D1进而调控PD-L1蛋白表达的具体机制,且证实该机制能经EVs在细胞间传递。本课题确证了RCC患者尿液EVs中的miR-224-5p是能反映PD-L1蛋白水平的潜在生物标志物,为相关研究提供了参考方法和重要线索。
李晓飞[10]（2021）在《MGRN1启动子区异常甲基化在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和预后中的研究》文中研究指明上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）是女性生殖道肿瘤中常见的恶性肿瘤,在妇科恶性肿瘤中死亡率最高,其中浆液性囊腺癌是最常见的病理类型。大多数上皮性卵巢癌患者的治疗是采用肿瘤减灭术辅以术后铂类药物化疗。这虽然改善了上皮性卵巢癌患者的预后,但是上皮性卵巢癌患者总体生存率无明显改善,5年生存率只有30%左右。原发性或获得性化疗耐药是成功治疗上皮性卵巢癌的主要障碍。因此,攻克化疗耐药是上皮性卵巢癌研究的主要目标。化疗耐药的发生是由多种调控机制共同作用的结果,但是目前仍有很多潜在分子机制尚不明确。越来越多的证据表明异常的DNA甲基化是与化疗耐药相关的最常见的分子机制之一。本课题组在前期实验中通过简化甲基化测序（reduced representation bisulfite sequencing,RRBS）技术对卵巢浆液性囊腺癌化疗敏感患者癌组织及卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织进行全基因组甲基化水平测序及数据分析。结果显示卵巢浆液性囊腺癌化疗敏感患者和化疗耐药患者之间存在明显的基因甲基化差异,其中化疗耐药组中 MGRN1（Mahogunin Ring Finger 1）启动子区甲基化水平明显高于化疗敏感组。因此,本研究选取MGRN1进行深入研究,探索MGRN1基因启动子区异常甲基化参与卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药发生的可能机制。第一部分 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系目的:为进一步明确前期RRBS测序结果,探讨MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系。方法:1.采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF Sequenom Mass ARRAY）检测卵巢浆液性囊腺癌患者癌组织MGRN1启动子区甲基化水平,分析MGRN1甲基化水平与化疗耐药之间的关系;采用RT-qPCR及免疫组织化学染色方法检测卵巢浆液性囊腺癌癌组织MGRN1 mRNA及蛋白表达水平,分析MGRN1 mRNA及蛋白表达水平与化疗耐药之间的关系;2.Spearman分析明确MGRN1异常甲基化与mRNA表达的相关性。结果:1.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组MGRN1启动子区甲基化水平明显高于化疗敏感组;2.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中MGRN1 mRNA表达水平明显低于化疗敏感组;3.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中MGRN1蛋白表达水平明显低于化疗敏感组;4.Spearman分析显示:MGRN1启动子区甲基化水平与mRNA表达水平呈负相关关系。结论:MGRN1启动子区甲基化水平与MGRN1表达呈负性调控关系,MGRN1启动子区高甲基化通过下调MGRN1表达参与了卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药的发生。第二部分 MGRN1基因在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药过程中的作用及机制目的:为了明确MGRN1在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药中的作用及机制,本研究将探讨MGRN1表达下调对浆液性卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨敲低MGRN1表达引起卵巢癌细胞化疗耐药的机制。方法:1.通过稳定转染技术在SKOV3细胞株中敲低MGRN1的表达,用RT-qPCR和Western Bolt方法检测MGRN1表达水平;2.采用CCK-8实验和细胞凋亡实验观察MGRN1表达下调对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响;3.采用RT-qPCR及免疫组织化学染色方法检测卵巢浆液性囊腺癌癌组织HSP70 mRNA及蛋白表达水平,分析HSP70 mRNA及蛋白表达水平与化疗耐药之间的关系;采用Spearman分析MGRN1 mRNA表达与HSP70 mRNA表达的相关性,并利用TCGA数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中MGRN1 mRNA表达及HSP70mRNA表达水平的相关性分析进行验证。结果:1.敲低MGRN1表达后,顺铂诱导SKOV3细胞株的细胞活力明显升高（P<0.05）,顺铂诱导SKOV3细胞株的细胞凋亡率明显下降（P<0.05）;2.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中HSP70 mRNA及蛋白表达水平明显高于化疗敏感组;Spearman分析显示:MGRN1 mRNA表达水平与HSP70 mRNA表达水平呈负相关关系。联合TCGA数据库信息明确了 MGRN1与 HSP70的 mRNA水平存在显着相关性（r=-0.5,P=1E-13）。结论:下调MGRN1表达后会引起SKOV3卵巢癌细胞系顺铂敏感性下调;MGRN1可能通过调控HSP70的表达进而调节卵巢癌细胞的化疗耐药。第三部分 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系目的:依据患者临床资料以及随访资料分析MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系。方法:1.运用Kaplan-Meier方法以及Cox回归模型方法分析MGRN1基因甲基化水平和mRNA表达水平与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系;2.运用Kaplan-Meier方法分析HSP70基因mRNA表达水平与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系。利用Kaplan-Meier plotter数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中HSP70 mRNA表达及卵巢浆液性囊腺癌患者的总生存期的相关性进行验证。结果:1.MGRN1基因启动子区高甲基化和MGRN1 mRNA低表达与卵巢浆液性囊腺癌患者预后不良有关（P<0.05）;2.MGRN1 mRNA低表达是预测患者无疾病进展生存期和总生存期的独立危险因素（HR=2.18,95%CI:1.07-4.11,P=0.028;HR=1.92,95%CI:0.99-3.79,P=0.045）;3.HSP70 mRNA低表达与卵巢浆液性囊腺癌患者预后不良有关（P<0.05）;利用Kaplan-Meier plotter数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中HSP70 mRNA表达及1207例卵巢浆液性囊腺癌患者的总生存期的相关性进行分析,结果发现HSP70 mRNA高表达组患者总生存期明显低于低表达组患者（P=0.013）。结论:MGRN1基因高甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后相关;MGRN1 mRNA低表达是预测卵巢浆液性囊腺癌患者无疾病进展生存期和总生存期的独立危险因素;MGRN1启动子区高甲基化可能是通过下调HSP70基因表达参与了卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后的发生。综上所述,本研究首次探讨了 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系,为DNA甲基化调控基因表达参与卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和不良预后提供了新的实验依据。MGRN1研究表明:1)卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织中MGRN1启动子区甲基化水平明显低于化疗敏感组;2)MGRN1基因甲基化升高导致的mRNA水平下调与卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后相关;3)敲低MGRN1表达可下调卵巢癌细胞株对顺铂敏感性;4)下调卵巢癌细胞MGRN1表达HSP70 mRNA表达水平明显降低;5)卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织中HSP70 mRNA表达水平明显高于化疗敏感组;MGRN1启动子区高甲基化可能是通过上调HSP70基因表达参与了卵巢浆液性囊腺癌的不良预后和化疗耐药的发生。
二、E-3胶技术鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、E-3胶技术鉴定（论文提纲范文）
（1）山茱萸化学成分的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 1 仪器与材料 |
| 2 提取与分离 |
| 3 结构鉴定 |
| 4 讨论 |
（2）激活NF-κB信号通路鲑甲病毒蛋白的筛选及致病机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 SAV的流行危害及临床症状 |
| 1.1.1 SAV的流行危害 |
| 1.1.2 SAV的临床症状及组织病理 |
| 1.2 SAV的病原学 |
| 1.2.1 SAV的分类及特性 |
| 1.2.2 SAV的基因组结构 |
| 1.2.3 SAV的结构与非结构蛋白及功能 |
| 1.2.4 SAV的基因型 |
| 1.3 TLRS的概述 |
| 1.3.1 TLRs种类、结构与功能 |
| 1.3.2 TLRs识别病原相关分子模式 |
| 1.3.3 TLRs在病毒感染中引起免疫反应的作用 |
| 1.3.4 TLRs信号转导途径 |
| 1.3.5 TLRs与病毒识别 |
| 1.4 NF-κB信号转导途径 |
| 1.4.1 NF-κB系统 |
| 1.4.2 NF-κB激活的分子机制 |
| 1.5 病毒与NF-κB信号通路的关系 |
| 1.5.1 NF-κB在病毒感染中的作用 |
| 1.5.2 NF-κB和炎症反应 |
| 1.5.3 NF-κB与炎性细胞因子 |
| 1.6 研究蛋白质与蛋白质互作的方法 |
| 1.6.1 噬菌体展示技术 |
| 1.6.2 酵母双杂交系统 |
| 1.6.3 免疫共沉淀技术 |
| 1.7 本试验研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞、抗体 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 主要试剂和耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SAV的增殖及紫外灭活 |
| 2.2.2 SAV的 E1、E2、E3、6K、cp、Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4基因的扩增 |
| 2.2.3 重组质粒的获得 |
| 2.2.4 重组真核表达质粒的转染与表达 |
| 2.2.5 Nsp2截短蛋白的构建 |
| 2.2.6 仙台病毒的繁殖与滴度检测 |
| 2.2.7 双荧光素酶检测NF-κB的活性 |
| 2.2.8 SAV激活NF-κB信号通路的检测 |
| 2.2.9 SYBR Green实时定量PCR |
| 2.2.10 Nsp2对SAV复制的影响 |
| 2.2.11 DAPI染色 |
| 2.2.12 激光共聚焦 |
| 2.2.13 免疫共沉淀 |
| 2.2.14 PAGE胶考染实验 |
| 2.2.15 质谱分析和鉴定 |
| 2.2.16 宿主蛋白的生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SAV激活NF-κB信号通路的研究结果 |
| 3.1.1 SAV的增殖及紫外灭活的结果 |
| 3.1.2 SAV感染CHSE-214细胞对NF-κB活性的影响 |
| 3.1.3 SAV激活NF-κB上游信号通路 |
| 3.2 激活NF-κB信号通路的SAV关键蛋白的筛选结果 |
| 3.2.1 SAV各段基因的真核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.2.2 细胞表达SAV E1、E2、E3、6k、cp、Nsp1、Nsp2、Nsp3和Nsp4蛋白的鉴定结果 |
| 3.2.3 仙台病毒的滴度测定结果 |
| 3.2.4 激活NF-κB的 SAV蛋白的筛选结果 |
| 3.3 SAV NSP2激活NF-κB信号通路的分子机制 |
| 3.3.1 过表达Nsp2蛋白对NF-κB活性的影响 |
| 3.3.2 Nsp2对IκBα降解、NF-κB核转移及p65磷酸化影响 |
| 3.3.3 Nsp2激活NF-κB信号通路下游的细胞因子的检测结果 |
| 3.3.4 Nsp2激活下游细胞因子依赖于NF-κB信号通路的检测结果 |
| 3.3.5 Nsp2激活NF-κB上游信号通路的检测结果 |
| 3.3.6 Nsp2激活NF-κB信号通路的转导途径的检测结果 |
| 3.4 NSP2对SAV病毒复制的影响 |
| 3.5 SAV NSP2激活NF-κB的功能域的确定 |
| 3.5.1 SAV Nsp2截短突变体的构建及鉴定结果 |
| 3.5.2 Nsp2截短突变体真核表达质粒的转染与表达结果 |
| 3.5.3 激活NF-κB信号通路的Nsp2截短功能域的筛选结果 |
| 3.6 与NSP2相互作用的宿主蛋白的筛选结果 |
| 3.6.1 免疫共沉淀及考染的结果 |
| 3.6.2 质谱分析的结果 |
| 3.6.3 与Nsp2互作的宿主细胞蛋白的GO功能分析结果 |
| 3.6.4 与Nsp2互作的宿主细胞蛋白的KEGG通路分析结果 |
| 3.6.5 与Nsp2互作的宿主蛋白的RIG-Ⅰ信号通路 |
| 3.6.6 与Nsp2互作的宿主蛋白的分析 |
| 3.7 NSP2与DDX3相互作用激活NF-κB的试验结果 |
| 3.7.1 CO-IP验证Nsp2与DDX3的相互作用的结果 |
| 3.7.2 激光共聚焦验证Nsp2与DDX3的相互作用 |
| 3.7.3 Nsp2与DDX3 的互作对NF-κB的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 SAV激活NF-κB信号通路关键蛋白的分析 |
| 4.2 SAV通过TLRS依赖的信号通路激活NF-κB信号通路 |
| 4.3 NSP2激活NF-κB下游细胞因子对病毒复制影响的分析 |
| 4.4 NSP2激活NF-κB的信号途径分析 |
| 4.5 NSP2与宿主蛋白的相互作用及其生物学活性分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）猪源TRIMs遗传特性分析及猪TRIM21影响PCV2感染的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 TRIM家族基因与MNDAL的研究进展 |
| 1.1 TRIM家族基因研究进展 |
| 1.2 MNDAL简介 |
| 第二章 PCV2 的研究进展 |
| 2.1 PCV2 研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 pTRIM家族成员结构和进化分析 |
| 1.1 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 TRIM21对PCV2 增殖影响的研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师介绍 |
| 作者简介及在学期间所发表的学术成果 |
| 致谢 |
（4）苹果树腐烂病菌CAP蛋白VmPR1c功能域研究及作用靶标鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苹果树腐烂病研究概况 |
| 1.1.1 苹果树腐烂病的发生及危害 |
| 1.1.2 苹果树腐烂病病原菌 |
| 1.1.3 苹果树腐烂病菌致病机理 |
| 1.1.4 苹果树腐烂病的防治 |
| 1.2 病原微生物与寄主植物互作的研究进展 |
| 1.2.1 基因对基因假说 |
| 1.2.2 植物与病原菌互作的“Z”字形模式 |
| 1.2.3 入侵模型 |
| 1.2.4 植物免疫系统的最新模型 |
| 1.3 CAP蛋白研究进展 |
| 1.3.1 CAP蛋白结构研究进展 |
| 1.3.2 CAP蛋白功能研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 VmPR1c信号肽功能验证 |
| 2.1 试验材料、试剂及仪器 |
| 2.1.1 试验材料及载体 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 信号肽预测分析 |
| 2.2.2 载体构建 |
| 2.2.3 酵母异源表达 |
| 2.2.4 TTC显色 |
| 2.2.5 农杆菌介导的本氏烟基因瞬时表达 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 TTC显色试验显示VmPR1c的信号肽具有分泌功能 |
| 2.3.2 烟草异源表达显示VmPR1c的信号肽具有分泌功能 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 VmPR1c功能域研究 |
| 3.1 试验材料、试剂及仪器 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验仪器 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 载体构建 |
| 3.2.2 农杆菌介导的本氏烟基因瞬时表达 |
| 3.2.3 本氏烟叶片的RNA提取 |
| 3.2.4 反转录cDNA提取 |
| 3.2.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 VmPR1c能够激发本氏烟叶片免疫反应 |
| 3.3.2 NTE段、CAP段对于VmPR1c激发免疫功能具有重要作用 |
| 3.3.3 C端区域中122-229 段对于VmPR1c激发免疫具有一定作用 |
| 3.3.4 NTE段18-39、45-53 段影响VmPR1c激发免疫 |
| 3.3.5 CAP段160-224 段对于VmPR1c激发免疫具有重要作用 |
| 3.3.6 H211对VmPR1c蛋白激发免疫具有重要作用 |
| 3.3.7 各功能域不影响VmPR1c的细胞核定位 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 VmPR1c作用靶标的鉴定 |
| 4.1 试验材料、试剂及仪器 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 生物信息学分析 |
| 4.2.2 载体构建 |
| 4.2.3 农杆菌介导的本氏烟基因瞬时表达 |
| 4.2.4 双分子荧光互补(BiFC) |
| 4.2.5 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 4.2.6 蛋白质免疫印迹检测(Western blotting) |
| 4.2.7 本氏烟叶片的RNA提取 |
| 4.2.8 反转录cDNA提取 |
| 4.2.9 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 4.2.10 核盘菌接种 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 BiFC验证VmPR1c与苹果E3 泛素连接酶蛋白MdRFP141 互作 |
| 4.3.2 Co-IP验证VmPR1c与苹果E3 泛素连接酶蛋白MdRFP141 互作 |
| 4.3.3 MdRFP141 功能注释及多序列比对分析 |
| 4.3.4 MdRFP141 进化分析 |
| 4.3.5 MdRFP141 能够激发本氏烟叶片免疫反应 |
| 4.3.6 MdRFP141 能够增强本氏烟对核盘菌的抗性 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 本研究所使用试剂及培养基配方 |
| 附录B 本研究中所使用引物序列 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）Na+/K+ ATPaseβ3亚基对乙型肝炎病毒抑制作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 背景知识 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1.2 ATP1B3与BST-2 |
| 1.1.3 NF-κB信号通路 |
| 1.1.4 泛素化降解 |
| 1.2 论文设计 |
| 1.2.1 论文目的和意义 |
| 1.2.2 实验思路及方案设计 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要试剂与材料 |
| 2.1.3 质粒与细胞系 |
| 2.1.4 引物合成及测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒过表达载体构建 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞复苏、传代与转染 |
| 2.2.4 稳转细胞系的构建 |
| 2.2.5 短干扰RNA(si RNA)的化学合成及转染 |
| 2.2.6 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR(q PCR) |
| 2.2.8 Southern blot检测HBV核心颗粒DNA |
| 2.2.9 Northern blot检测HBV RNA |
| 2.2.10 核质分离 |
| 2.2.11 免疫印迹(Western Blot) |
| 2.2.12 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation) |
| 2.2.13 免疫荧光共定位 |
| 2.2.14 Luciferase双荧光报告实验 |
| 2.2.15 统计学方法 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 ATP1B3 抑制HBV的表达 |
| 3.1.1 HepG2 细胞中外源ATP1B3 抑制HBV抗原的产量 |
| 3.1.2 HepG2 细胞中梯度过表达的外源ATP1B3使HBV抗原的产量梯度减少 |
| 3.1.3 HepG2 细胞中过表达ATP1B3对HBV抗原的产量减少不存在非特异性 |
| 3.1.4 HepG2 细胞中下调内源ATP1B3 的表达能够增加HBV抗原的分泌 |
| 3.1.5 HepG2.2.15和Hep AD38 细胞中外源ATP1B3 抑制HBV抗原的产量 |
| 3.1.6 HepG2.2.15和Hep AD38 细胞中下调内源ATP1B3 的表达增加HBV抗原的分泌 |
| 3.1.7 过表达ATP1B3 不影响HBV的 DNA和 RNA |
| 3.1.8 小结 |
| 3.2 ATP1B3 激活HepG2 细胞中的NF-κB信号通路 |
| 3.2.1 过表达ATP1B3 以剂量依赖性的方式激活NF-κB信号通路 |
| 3.2.2 过表达ATP1B3 促进磷酸化p65 向核内转移 |
| 3.2.3 ATP1B3 的敲低减弱了TAK1对NF-κB的激活 |
| 3.2.4 抑制NF-κB信号通路会削弱ATP1B3对HBV的抑制作用 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 ATP1B3 通过诱导IFN-α/ISG和 IL-6 的产生抑制HBV |
| 3.3.1 过表达ATP1B3 诱导IFN-α和 IL-6 的产生 |
| 3.3.2 过表达ATP1B3 诱导ISGs表达增加 |
| 3.3.3 IFN-α诱导BST-2 的表达 |
| 3.3.4 敲低 ATP1B3使BST-2 的表达降低 |
| 3.3.5 小结 |
| 3.4 ATP1B3与BST-2 协作促进对HBs Ag的限制 |
| 3.4.1 ATP1B3 独立于BST-2 抑制HBV |
| 3.4.2 使用NF-κB抑制剂能够减弱ATP1B3 诱导的BST-2 表达 |
| 3.4.3 过表达BST-2 促进了ATP1B3对HBs Ag的抑制 |
| 3.4.4 敲低BST-2使ATP1B3对HBs Ag的抑制减弱 |
| 3.4.5 小结 |
| 3.5 ATP1B3 促进蛋白酶体依赖的细胞内HBs Ag降解 |
| 3.5.1 鉴定ATP1B3 限制HBV需要的功能区 |
| 3.5.2 ATP1B3对HBV的抑制不依赖于其Na~+/K~+ATP酶的活性 |
| 3.5.3 ATP1B3 影响HBV蛋白水平 |
| 3.5.4 ATP1B3使HBV的 S蛋白表达减少 |
| 3.5.5 ATP1B3 加速HBs的降解 |
| 3.5.6 ATP1B3 通过蛋白酶体途径降解HBs |
| 3.5.7 ATP1B3 突变体降解HBs |
| 3.5.8 小结 |
| 3.6 ATP1B3与LHBs和 MHBs在细胞中相互作用并共定位 |
| 3.6.1 ATP1B3与HBs共定位 |
| 3.6.2 ATP1B3与HBS存在相互作用 |
| 3.6.3 HBs与 ATP1B3 存在相互作用 |
| 3.6.4 小结 |
| 3.7 ATP1B3 诱导LHBs和 MHBs的多聚泛素化 |
| 3.7.1 ATP1B3 诱导HBs的多聚泛素化 |
| 3.7.2 ATP1B3 通过K48 诱导HBs的泛素化 |
| 3.7.3 ATP1B3 降解HBs需要泛素化 |
| 3.7.4 小结 |
| 3.8 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）鸭TRIM25泛素化介导RLR信号通路调控IFN-β的产生（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 抗病毒天然免疫概述 |
| 1.1.1 天然免疫简介 |
| 1.1.2 抗病毒天然免疫及模式识别受体 |
| 1.2 天然免疫中的泛素化与去泛素化 |
| 1.2.1 泛素化修饰简介 |
| 1.2.2 泛素化修饰参与调控抗病毒天然免疫 |
| 1.2.3 泛素化酶参与调控抗病毒天然免疫 |
| 1.3 TRIM家族蛋白在抗病毒天然免疫中的作用 |
| 1.3.1 TRIM家族蛋白的种类和结构 |
| 1.3.2 TRIM家族蛋白的抗病毒作用 |
| 1.3.3 TRIM蛋白在抗病毒天然免疫中的修饰作用 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 第2章 禽流感病毒模拟物感染对鸭RIG-I信号通路蛋白泛素化修饰的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 5'ppp dsRNA模拟病毒感染DEFs后炎症因子及泛素水平的变化 |
| 2.2.2 5'ppp dsRNA模拟病毒感染DEFs泛素化组学研究 |
| 2.2.3 5'ppp dsRNA模拟病毒感染DEFs蛋白质组学研究 |
| 2.2.4 差异蛋白质组学与泛素化修饰组学关联分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 5'ppp dsRNA感染前后免疫基因的变化 |
| 2.3.2 5'ppp dsRNA感染前后泛素化肽段基序与其他物种的差异 |
| 2.3.3 5'ppp dsRNA感染前后泛素化修饰组中蛋白酶体相关蛋白质高度泛素化 |
| 2.3.4 5'ppp dsRNA感染前后泛素化修饰组在蛋白质代谢上的影响 |
| 2.3.5 5'ppp dsRNA感染前后对RIG-I信号通路的影响 |
| 2.3.6 蛋白质组与泛素化组的相关性 |
| 第3章 鸭TRIM25泛素化介导RIG-I信号通路的功能研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 鸭TRIM25的基因克隆和序列分析 |
| 3.2.2 鸭TRIM25基因不同组织表达规律分析 |
| 3.2.3 鸭TRIM25泛素化介导RIG-I信号通路的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 鸭TRIM25泛素化介导RIG-I信号通路调控抗病毒作用机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 鸭TRIM25的泛素化修饰形式 |
| 4.2.2 5'ppp dsRNA诱导的鸭TRIM25泛素化修饰的影响 |
| 4.2.3 5'ppp dsRNA诱导下,泛素化修饰关键位点对鸭TRIM25泛素化修饰的影响 |
| 4.2.4 5'ppp dsRNA诱导下,泛素化修饰关键位点对NF-κB和IRF1激活及IFN-β转录的影响 |
| 4.2.5 鸭TRIM25泛素化介导的信号转导的假设图构建 |
| 4.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 主要创新点 |
| 进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（8）转BpGLK1白桦生长、叶色变异分析及环境安全性初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 白桦基因工程育种研究概况 |
| 1.2 GLK基因研究概况 |
| 1.3 植物根系与根际土壤微生物的关系 |
| 1.4 转基因植物环境安全性 |
| 1.5 研究的目的意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 1.6.1 技术路线 |
| 2 转BpGLK1白桦叶色、生长及材性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 叶片叶绿素含量的测定 |
| 2.1.4 叶片光合和荧光参数的测定 |
| 2.1.5 材性分析 |
| 2.1.6 生长性状调查 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 转BpGLK1白桦叶色变异 |
| 2.2.2 转BpGLK1基因白桦叶绿素相对含量时序变化 |
| 2.2.3 转BpGLK1基因白桦光合参数分析 |
| 2.2.4 转BpGLK1基因白桦生长变异分析 |
| 2.2.5 转BpGLK1基因白桦材性变异分析 |
| 2.3 小结 |
| 3 转BpGLK1基因白桦外源基因稳定性及T-DNA插入位点的鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 转基因白桦分子检测 |
| 3.1.4 转基因株系T-DNA插入位点鉴定 |
| (1) 基因组重测序 |
| (2)数据分析 |
| 3.1.5 插入位点的验证 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 转基因白桦的分子检测 |
| 3.2.2 T-DNA插入位点分析 |
| 3.2.3 插入位点的验证 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 4 转BpGLK1白桦的生态环境安全性评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转基因植物对遗传多样性及物种多样性的影响 |
| 4.2.2 转基因植物对土壤生态系统的影响 |
| 4.2.3 转BpGLK1外源基因水平转移可能性评价 |
| 4.2.4 转BpGLK1白桦对土壤酶活的影响 |
| 4.3 小结 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学硕士学位论文修改情况确认表 |
（9）尿液细胞外囊泡中miR-224-5p通过抑制cyclin D1调控PD-L1表达的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 肾癌和免疫检查点 |
| 1.1.1 免疫检查点 |
| 1.1.2 ICB疗法在肾癌中的应用 |
| 1.1.3 PD-L1 表达的调控机制 |
| 1.2 细胞外囊泡在RCC发生发展中的作用 |
| 1.2.1 增殖和转移 |
| 1.2.2 免疫逃逸和耐药 |
| 1.2.3 EVs中的潜在生物标志物 |
| 1.3 miR-224-5p和细胞周期调控蛋白 |
| 1.4 本文研究内容 |
| 2 RCC患者尿液EVs的提取、鉴定和miRNA测序 |
| 2.1 实验仪器与材料 |
| 2.1.1 实验细胞系 |
| 2.1.2 临床样本 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 EVs的提取 |
| 2.2.3 TEM鉴定EVs形态 |
| 2.2.4 NTA测定EVs粒径和浓度 |
| 2.2.5 EVs蛋白的提取和测定 |
| 2.2.6 Western blot鉴定EVs标志蛋白 |
| 2.2.7 RNase A处理EVs |
| 2.2.8 RCC组织和EVs中RNA的提取 |
| 2.2.9 miRNA的逆转录 |
| 2.2.10 实时定量PCR |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 EVs的提取、鉴定和样本保存方法的优化 |
| 2.3.2 RCC患者尿液EVs中差异表达的miRNA |
| 2.3.3 miRNA在RCC组织中的表达水平 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 miR-224-5p抑制RCC细胞中cyclin D1 的表达 |
| 3.1 实验仪器与材料 |
| 3.1.1 实验细胞系 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 miRNA瞬时转染 |
| 3.2.3 细胞增殖检测 |
| 3.2.4 细胞周期检测 |
| 3.2.5 细胞迁移和侵袭检测 |
| 3.2.6 细胞RNA的提取 |
| 3.2.7 RNA逆转录 |
| 3.2.8 RT-qPCR |
| 3.2.9 细胞总蛋白的提取和测定 |
| 3.2.10 Western blot |
| 3.2.11 荧光报告基因 |
| 3.2.12 T淋巴细胞与RCC细胞共孵育 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 miR-224-5p对RCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响 |
| 3.3.2 miR-224-5p抑制RCC细胞中CCND1 表达 |
| 3.3.3 miR-224-5p调控RCC细胞中PD-L1 表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 miR-224-5p通过cyclin D1 调控PD-L1 蛋白表达 |
| 4.1 实验仪器与材料 |
| 4.1.1 实验细胞系 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞培养和给药 |
| 4.2.2 靶向CCND1的siRNA的转染 |
| 4.2.3 稳定表达miR-224-5p的RCC细胞系的构建 |
| 4.2.4 组织和细胞RNA的提取 |
| 4.2.5 RNA逆转录 |
| 4.2.6 RT-qPCR |
| 4.2.7 组织和细胞总蛋白的提取和测定 |
| 4.2.8 Western blot |
| 4.2.9 稳定表达miR-224-5p的RCC细胞EVs的提取 |
| 4.2.10 RCC细胞对荧光标记EVs的摄取 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 miR-224-5p通过cyclin D1 调控PD-L1 表达 |
| 4.3.2 miR-224-5p调控PD-L1 蛋白的翻译后修饰 |
| 4.3.3 EVs传递miR-224-5p对 PD-L1 的调控作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 总结和展望 |
| 5.1 总结和创新点 |
| 5.2 不足和展望 |
| 综述:细胞外囊泡在癌症发生发展中的作用和应用 |
| 1 引言 |
| 2 EVs的生物学特征与研究手段 |
| 2.1 EVs的生成、分泌和摄取机制 |
| 2.2 EVs的组成 |
| 2.3 EVs的研究手段 |
| 3 EVs在肿瘤中的作用 |
| 3.1 肿瘤生成 |
| 3.2 肿瘤迁移 |
| 3.3 免疫逃逸 |
| 3.4 耐药 |
| 4 EVs在癌症诊疗中的潜在应用 |
| 4.1 肿瘤生物标志物的发现 |
| 4.2 抗肿瘤药物载体和靶标 |
| 4.3 基于人工智能的潜在应用 |
| 5 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 用于smallRNA测序的尿液EVs样本供体信息 |
| 2 用于RT-qPCR的肾癌组织样本供体信息 |
| 3 实验相关试剂的配制 |
| 3.1 用于细胞培养的PBS缓冲液 |
| 3.2 Western blot相关试剂 |
| 3.3 逆转录RT-qPCR相关引物序列 |
| 作者简介 |
（10）MGRN1启动子区异常甲基化在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和预后中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 MGRN1 启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MGRN1 基因在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药过程中的作用及机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MGRN1 启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 泛素连接酶在肿瘤化疗和预后中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、E-3胶技术鉴定（论文参考文献）
- [1]山茱萸化学成分的分离与鉴定[J]. 彭中灿,赫军,潘雪格,叶贤胜,李昕昕,殷伟峰,张维库,续洁琨. 中草药, 2021(15)
- [2]激活NF-κB信号通路鲑甲病毒蛋白的筛选及致病机制的研究[D]. 高帅. 东北农业大学, 2021
- [3]猪源TRIMs遗传特性分析及猪TRIM21影响PCV2感染的机制研究[D]. 刘小花. 吉林大学, 2021(01)
- [4]苹果树腐烂病菌CAP蛋白VmPR1c功能域研究及作用靶标鉴定[D]. 谭妮. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [5]Na+/K+ ATPaseβ3亚基对乙型肝炎病毒抑制作用及机制的研究[D]. 张君. 吉林大学, 2021(01)
- [6]鸭TRIM25泛素化介导RLR信号通路调控IFN-β的产生[D]. 顾天天. 扬州大学, 2021
- [7]高产β-葡萄糖苷酶酵母菌的诱变选育及对刺梨果酒香气特性的影响[J]. 刘晓柱,张远林,李银凤,于志海,黄名正. 食品工业科技, 2021(19)
- [8]转BpGLK1白桦生长、叶色变异分析及环境安全性初步评价[D]. 金冬雪. 东北林业大学, 2021(08)
- [9]尿液细胞外囊泡中miR-224-5p通过抑制cyclin D1调控PD-L1表达的机制研究[D]. 秦志远. 浙江大学, 2021(01)
- [10]MGRN1启动子区异常甲基化在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和预后中的研究[D]. 李晓飞. 河北医科大学, 2021