一、大肠杆菌tktA基因的克隆表达（论文文献综述）
孟帅帅[1]（2020）在《大肠杆菌生产L-色氨酸重组菌株的改造及发酵条件优化》文中进行了进一步梳理L-色氨酸作为人和动物所必须的20种氨基酸之一,在人和动物的生长发育、生命活动和新陈代谢等方面起着关键性的作用。目前,随着合成生物学、系统生物学以及代谢工程的不断发展与进步,L-色氨酸被广泛应用于医药、食品和饲料等行业,利用微生物发酵生产L-色氨酸已经越来越受到重视。本研究以大肠杆菌菌株FJN010为出发菌株,利用代谢工程的技术手段构建高产的L-色氨酸生产菌株。主要研究内容如下:（1）以L-色氨酸生产菌株FJN010为出发菌株,L-色氨酸合成途径中的关键酶基因pckA和tktA为研究对象,采用外源质粒高效表达的方式和无缝克隆的技术对关键酶基因实施单个或双基因的串联表达,考察含有不同外源基因的菌株对L-色氨酸产量的影响。摇瓶发酵结果显示,共表达pckA和tktA基因的菌株FJN010/TE-3产L-色氨酸水平最高,可达3.71 g/L,较出发菌株FJN010产酸能力提高了39.0%,PckA和TktA酶活性分别提高了3.7倍和3.4倍。（2）以质粒pBV-pckA-pL-tktA为基础,继续引入邻氨基苯甲酸合酶基因trp ED。采用易错PCR技术对邻氨基苯甲酸合酶进行定向进化改造,构建能够抗L-色氨酸反馈抑制的菌株FJN010/TE-5(pBV-pckA-pL-tktA-pL-trp EDfbr)。结果显示,新获得的邻氨基苯甲酸合酶的突变酶其氨基酸序列中第465位半胱氨酸残基突变为了酪氨酸,菌株FJN010/TE-5产酸水平大幅提高,最终L-色氨酸产量可达4.80 g/L,相较于对照菌株FJN010/TE-3提高了29.4%,邻氨基苯甲酸合酶酶活性提高了4倍。（3）以菌株FJN010/TE-5为出发菌株,采用Red同源重组技术分别对丙氨酸转氨酶编码基因alaA、alaC及avtA进行单、双以及三基因敲除,考察不同丙氨酸转氨酶基因缺失后对L-色氨酸产量的影响。摇瓶结果显示,同时敲除丙氨酸转氨酶基因alaA和alaC的菌株FJN010/TE-9产L-色氨酸能力最高,可达6.08 g/L,较菌株FJN010/TE-5产酸提高了26.7%,且丙氨酸含量仅0.16 g/L,降低了91%。（4）在原培养基的基础上,以L-苯丙氨酸提取后的残液替代初始发酵培养基中的L-苯丙氨酸粉末,通过摇瓶及50 L罐发酵考察L-苯丙氨酸残液对菌株FJN010/TE-9的生长和产L-色氨酸水平的影响。摇瓶结果显示,发酵液中添加0.50 g/L的L-苯丙氨酸残液能够有效增加L-色氨酸的产量,可达7.40 g/L,菌体浓度也有所升高。而在50 L罐中添加一定量的L-苯丙氨酸残液,菌株FJN010/TE-9最终L-色氨酸积累量仅为20.01 g/L,这可能由于L-苯丙氨酸提取后的残液中含有过多有害物质抑制了菌体生长及产酸水平。（5）在原培养基的基础上,对菌株FJN010/TE-9的发酵条件及培养基配方进行优化,获得最适L-色氨酸发酵培养的培养条件和培养基配方。结果表明,优化后的培养基配方能够显着提升菌株的产酸能力。50 L罐补料分批发酵结果显示,菌株FJN010/TE-9产L-色氨酸水平可达49.30 g/L,较原始配方提高了17.7%。
门佳轩[2]（2020）在《大肠杆菌L-苯丙氨酸工程菌株的构建》文中研究说明L-苯丙氨酸作为一种食品化学品及药品的中间体,在食品、医药、化工等多个领域均有广泛应用。由于目前多数L-苯丙氨酸工程菌株携带质粒,导致发酵过程需要添加抗生素或诱导剂维持细胞生产,大幅增加了工业生产成本。因此,本实验在现有研究的基础上,通过代谢工程手段对野生大肠杆菌L-苯丙氨酸合成途径中的相关基因进行了基因组层面的改造,构建了一株无质粒的L-苯丙氨酸高产菌株。双功能酶（chorismate mutase/prephenate dehydratase,PheA）与 DAHP 合酶（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphte synthase,AroG）是L-苯丙氨酸合成途径中最关键的两个限速酶,受L-苯丙氨酸严格调控。为解除关键酶受到的反馈抑制,提高L-苯丙氨酸积累能力,本实验将缺失R区的pheA基因与转氨酶基因（aromatic-amino-acid transaminase,tyrB）串联成操纵子,由trc启动子控制,通过Crispr/Cas9技术将该操纵子分别在PHE1（为E.coli W3110）基因组上进行了单、双、三拷贝的整合,构建了 PHE2、PHE3及PHE4菌株。摇瓶结果显示,PHE2的L-苯丙氨酸产量由微量提升至6.1 g/L;PHE3的L-苯丙氨酸产量为8.8 g/L,较PHE2相比提高35.4%,PHE4的L-苯丙氨酸产量较PHE3相比下降25%。随后通过在PHE3的基因组中整合trc启动子控制的aroG点突变基因及双拷贝,构建了 PHE5和PHE6,摇瓶发酵结果显示,PHE5的L-苯丙氨酸产量为13.1 g/L,较PHE3相比提高了 46.9%;PHE6L-苯丙氨酸产量为12.8 g/L,较PHE5有所降低,表明关键酶反馈抑制的解除有利于L-苯丙氨酸的积累,适度强化解除反馈抑制的关键酶能够显着提高L-苯丙氨酸的产量。为减少上游代谢流下行的阻滞及有毒中间产物的积累,本实验依次对莽草酸途径中的aroC、aroA、aroL、aroE、aroD、aroB等六种基因的表达量进行不同程度的强化。摇瓶发酵结果显示,过表达aroA基因与aroD基因可有效增加L-苯丙氨酸的产量,其中 PHE8-2（gapC::ParoA-aroA）L-苯丙氨酸产量为 15.1 g/L,较 PHE5 提高 11.1%;PHE11-1（aroD::PBBaj23106-aroD）L-苯丙氨酸产量为19.3 g/L,较对照PHE8-2提高36.9%;其余四种基因的改造对L-苯丙氨酸的生产及菌体生长均未表现出正向效果,表明AroA与AroD为莽草酸途径的两种限速酶,可通过适度强化aroA与aroD基因的表达提高L-Phe的生产能力。通过敲除PHE11-1中的pykF基因构建了 PHE13,摇瓶结果显示PHE13L-苯丙氨酸产量为23.7 g/L,较PHE11-1提高24.1%,且菌体生长并未受到影响,表明pykF基因的敲除能够增加PEP供应,有利于L-苯丙氨酸的合成。随后向PHE13中引入了不同强度启动子控制的pps基因与tktA基因,结果显示,强化两种基因的表达后L-苯丙氨酸产量较PHE13呈不同程度的降低,表明敲除pykF基因后过表达pps基因与tktA基因对提高L-苯丙氨酸产量意义不大。PheP于AroP是大肠杆菌中的两种L-苯丙氨酸转运蛋白,负责将胞外L-苯丙氨酸转运至胞内供应菌体生长所需。本研究通过在PHE13上分别敲除pheP基因与aroP基因构建了 PHE16和PHE17,摇瓶发酵结果表明,PHE16L-苯丙氨酸产量为18.1 g/L,较PHE13降低19.9%;PHE17L-苯丙氨酸产量为19.8 g/L,较PHE13下降16.1%,且菌体量也有一定下降,表明pheP基因与aroP基因的敲除不利于L-苯丙氨酸的积累。利用PHE13进行5 L发酵罐分批补料发酵实验,结果显示,发酵48 h L-苯丙氨酸产量达81.8 g/L,平均生产强度达1.7 g/L/h,较文献报道最高产量（72.9 g/L,1.4 g/L/h）提高12.2%及21.4%,糖酸转化率为24%,具有良好的工业化潜力。
张君奇[3]（2019）在《类球红细菌高效合成辅酶Q10代谢机制研究》文中研究指明辅酶Q10（Coenzyme Q10）,又称泛醌,是一种脂溶类的化合物,与细胞氧化呼吸密切相关。近年来研究发现辅酶Q10与其它药物结合使用在临床治疗心脑血管等疾病方面潜力巨大。因此在微生物中如何提高辅酶Q110的产量一直是研究的热点。在原核生物中辅酶Q10合成主要由侧链合成途径（MEP或MVA途径）,分支酸合成途径和醌环修饰途径三部分组成。其中侧链主要合成十聚异戊烯二烯焦磷酸（DPP）;分支酸代谢途径主要合成对羟基苯甲酸（pHBA）;这两个代谢产物是辅酶Q10合成的重要的前体物质。因此本论文以类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1为研究模型,通过改造类球红细菌的代谢流,旨在增加前体物质的供应,提高辅酶Q10的产量。主要研究结果如下:（1）通过敲除pykA、RSP-1848,以及双敲除pykA/RSP-1848后,摇瓶发酵96 h结果显示:单敲除RSP-1848后辅酶Q10的产量相比野生菌株提高了 45.8%左右,而敲除pykA和pykA/RSP-1848使得辅酶Q10产量分别下降了 33.63%、40.60%。（2）通过在敲除RSP-1848的菌株基础上分别过表达丙酮酸磷酸双激酶ppdk,转酮酶基因tktA、3-脱氧-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶基因RSP-2921、莽草酸激酶基因arok进一步研究了分支酸代谢途径中相关基因对辅酶Q10合成的影响。结果发现过表达3-脱氧-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶RSP-2921能够提高菌体生物量17%,但是辅酶Q10的产量却降低24.8%。过表达莽草酸激酶arok使得单位辅酶Q10的产量提高了 17%,但生物量没有提高。（3）为进一步研究分支酸代谢途径过程相关基因对影响辅酶Q10合成的影响,后期通过异源表达分支酸裂解酶基因ubic和4-轻苯甲酸八聚异戊二烯转移酶基因ubiA,以及自身的ubiA基因。研究发现过表达ubic基因使得菌体生物量相对野生型提高了30%左右,但是单位辅酶Q10产量却降低了 15%,而异源过表达ubic-ubiAEcoli基因后,辅酶Q10产量较S491提高了 14.18%,单位菌体辅酶Q10产量较S491提高了 10%。综合以上实验结果可知,类球红细菌中强化分支酸代谢途径碳代谢流对辅酶Q10的合成影响明显;arok基因是调控分支酸代谢途径的关键基因;异源过表达ubic-ubiAEcoli基因可以增强PHB与DPP的催化合成进而提高辅酶Q10的合成。
刘开泉[4]（2016）在《基因工程改造Pseudomonas chlororaphis GP72以提高2-羟基吩嗪产量》文中研究说明绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）GP72是一株从青椒根际分离得到的植物根际促生菌株,它能够分泌吩嗪-1-羧酸（PCA）、2-羟基-吩嗪-1-羧酸（2-OH-PCA）、2-羟基-吩嗪（2-OH-PHZ）三种具有抗真菌作用的吩嗪类化合物,其中PCA与2-OH-PHZ均是有效的杀菌剂。PCA由于其广谱而良好的抗菌效果和环境友好等特点,在2011年被中国农业部授予农药证书,并将其正式命名为“申嗪霉素”。相对于PCA,2-OH-PHZ在拮抗某些病菌时显示出更好的效果,如防治引起小麦全蚀病的病源真菌。小麦全蚀病是一种严重影响小麦产量的全球性病害,目前尚没有特效农药,2-OH-PHZ则是很好的潜在候选,具有良好的应用前景。由于吩嗪类物质的化学合成产量不高,并产生氧化铅、苯胺、苯二胺等有毒有害物质,阻碍了其生产应用,因此利用微生物发酵生产以PCA、2-OH-PHZ为代表的吩嗪类物质是一个必选方案。目前,利用微生物发酵生产2-OH-PHZ的菌株主要来自绿针假单胞菌,GP72便是其中一株,但其野生株的2-OH-PHZ产量仅仅只有4.5 mg/L。因此提高GP72菌株中2-OH-PHZ的产量成为我们目前迫切需要完成的任务。为了提高绿针假单胞菌GP72中2-OH-PHZ的产量,我们采取了敲除负调控基因;增强吩嗪合成的前体途径-莽草酸途径;删除吩嗪合成的竞争途径;优化phzO基因的密码子提高PCA转化2-OH-PHZ的效率等措施,虽然后两种尝试没有得到理想结果。首先,我们通过敲除负调控基因的方法提高GP72中2-OH-PHZ的产量。GP72中吩嗪类物质的合成是以分支酸为前体的,而分支酸的合成则是由4-磷酸-赤藓糖（E4P）与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）经由莽草酸途径合成的。PEP作为中心代谢重要的中间产物,参与了一系列代谢反应,其中由丙酮酸激酶催化的PEP转化为丙酮酸的反应是重要的PEP消耗反应,阻断这一反应可以增强莽草酸途径。因此我们尝试将GP72中的丙酮酸激酶基因pykF敲除从而部分阻断PEP向丙酮酸的转化（GP72中含有pykA与pykF两个丙酮酸激酶合成基因）,经过HPLC检测,pykF敲除株的2-OH-PHZ的产量相对于野生株GP72增长了6.7倍,由4.5 mg/L增加到35 mg/L。在实验室的前期研究中,我们通过插入失活负调控因子rpeA的方法大大提高了2-OH-PHZ的产量。我们在GP72Δpyk的基础上敲除了基因rpeA,获得了突变株GP72ND-1,经HPLC检测发现,2-OH-PHZ的产量由35 mg/L增长到239.8 mg/L。经研究发现负调控因子RpeA是双元调控系统RpeA/RpeB的组成部分,双元调控系统是细菌中重要的全局调控系统,而在假单胞菌中被研究最多的双元调控系统则是GacS/GacA系统。最近的研究表明,在绿针假单胞菌30-84中,通过GacS/GacA发挥作用的rsmE的过表达抑制了包括吩嗪在内的某些次级代谢产物的产生,因此我们在GP72ND-1菌株中敲除了rsmE基因获得了菌株GP72ND-2,2-OH-PHZ产量由239.8 mg/L提高到273.5 mg/L。同样的,有报道表明,在Pseudomonas protegens中,ATP依赖的蛋白水解酶LON可以通过降低GacA蛋白的稳定性来影响GacS/GacA的稳定性,在Pseudomonas protegens中敲除lon可以提高某些抗生素的活性,因此我们在菌株GP72ND-2上敲除了lon获得了菌株GP72ND-3,经检测发现菌株的2-OH-PHZ产量由273.5 mg/L上升到300.5 mg/L。我们通过在GP72基因组中连续敲除了pykF、rpeA、rsmE、lon四个基因使GP72的2-OH-PHZ的产量由4.5 mg/L提升到300.5mg/L。其次,为了增强GP72中2-OH-PHZ的产量,我们选择强化吩嗪合成底物-分支酸的合成途径--莽草酸途径。莽草酸途径的强化大致有以下几个策略:增加强化合成底物E4P与PEP,通过过表达转酮酶（由tktA编码）,磷酸烯醇式丙酮酸合成酶（由ppsA编码）;解除或减轻限制途径或反馈抑制,如大肠杆菌中通常会通过点突变改造DHAP合成酶基因（由aroG、aroF、aroH等基因等编码,在假单胞菌中则是主要由phzC等基因编码）;增强限制途径的催化酶的活性,如过表达DHQ合成酶（由aroB编码）、DHQ脱水酶（由aroD编码）、莽草酸脱氢酶（由aroE编码）等。我们选取了GP72中存在的ppsA、tktA、phzC、aroB、aroD和aroE六个莽草酸途径关键酶,利用模块化质粒pBbB5K在菌株GP72ND-3中进行过表达,而六个基因的排列顺序则与他们在反应途径中的顺序相反,菌株2-OH-PHZ的产量由300.5 mg/L上升到了450.4 mg/L。同时菌株的吩嗪类物质（包括PCA、2-OH-PHZ、2-OH-PCA）的总产量也达到了1520 mg/L。此外,我们通过删除吩嗪合成途径的竞争途径,优化吩嗪修饰酶PhzO等方法试图提高菌株2-OH-PHZ的产量。在GP72中,以分支酸为底物的合成途径不仅仅只有吩嗪合成途径一条,至少还包括叶酸合成途径、色氨酸合成途径、辅酶Q合成途径、酪氨酸与苯丙氨酸合成途径等,因此我们通过敲除GP72中的对氨基苯甲酸合成酶基因pabB/pabC、分支酸-苯丙酸裂合酶合成基因ubiC、邻氨基苯甲酸合成酶基因trpE、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶合成基因pheA等来阻断吩嗪合成的竞争途径,但遗憾的是基因敲除后严重影响菌株的生长。先前研究发现在GP72中吩嗪合成途径首先合成PCA,PCA在修饰酶PhzO的催化下形成2-OH-PCA,2-OH-PCA再自发脱羧形成2-OH-PHZ。PCA、2-OH-PCA、2-OH-PHZ三种吩嗪类化合物中以PCA为主,说明PhzO的转化效率并不高,而且经分析发现,phzO基因中存在大量的稀有密码子。为了获得高产量的2-OH-PHZ,我们按照GP72密码子的使用情况对phzO基因进行密码子优化,获得了优化基因phzOO将其置换进GP72,经检测发现替换菌株的2-OH-PHZ产量并没有提高,说明稀有密码子并非PhzO催化效率低下的原因。本论文首先通过在GP72基因组中连续敲除了pykF、rpeA、rsmE、lon四个具有负调控作用的基因,使2-OH-PHZ的产量提高了60多倍,达到300.5 mg/L,接着通过过表达ppsA、tktA、phzC、aroB、aroD和aroE等六个莽草酸途径相关基因来强化莽草酸途径,最终获得了一株2-OH-PHZ产量为450.4 mg/L,吩嗪类物质总产量为1520 mg/L的突变株,为吩嗪类物质的工业化生产与农业上推广应用打下了坚定基础。
路丽君[5]（2015）在《中心代谢途径改造对L-色氨酸合成的碳流偏转研究》文中研究表明L-色氨酸是人及动物必需的氨基酸,在生物体内可以转化为5-羟色胺、褪黑素、烟酸等多种生理活性物质,在食品和医药行业具有广泛的应用价值。提高微生物生产L-色氨酸的性能是目前研究的重点和热点。本研究运用分子手段强化中心代谢途径中芳香族前体物质磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的合成,考察其对芳香族氨基酸合成的碳流的偏转,旨在减少过程中的碳流消耗,增强合成L-色氨酸的碳流。为了增强合成L-色氨酸的碳流,分别选择了中心代谢途径中作用于PEP的非编码RNA csr B和PEP合酶pps A,以及作用于E4P的转醛醇酶基因tal B和转酮醇酶基因tkt A,构建相应的重组质粒并导入E.coli KT1306中,发酵结果显示过表达pps A重组菌L-色氨酸产量仅为对照的92.3%,而csr B、tkt A和tal B过表达的重组菌L-色氨酸产量分别提高了15%,14.7%和30.5%。表明csr B、tkt A、tal B的过表达能够增加中心碳流向芳香族途径偏转。为考察csr B、tkt A和tal B共表达效果,分别构建了csr B-tkt A、csr B-tal B基因共表达工程菌,发酵结果显示重组菌株E.coli KT1306/p RSF-tac-csr B-tac-tkt A对L-色氨酸累积提高了38.7%,且质粒稳定,具有较好的发酵性能。20 g·L-1葡萄糖,10 g·L-1硫酸铵,20 m L/250 m L的装液量更符合该重组菌对碳氮源及溶氧的需求,在此基础上重组菌的生物量和L-色氨酸产量分别提高至原来的2.3和2.69倍,为7.26 g·L-1和2.35 g·L-1。与出发菌株相比,csr B和tkt A过表达与共表达的重组菌的生物量相似,都能减少菌体消耗葡萄糖的速率,提高L-色氨酸的产量。此外,重组菌中乙酸、琥珀酸、乳酸等均有不同程度的减少,其中csr B过表达重组菌有机酸含量最少,分别为对照的88%、6.3%和53%,表明csr B加强糖异生的作用能减少糖酵解（EMP）途径中碳代谢流的剩余。csr B和tkt A基因的存在均能够提升单位碳源对L-色氨酸的转化率,当葡萄糖浓度为0.1%时,共表达csr B-tkt A重组菌的L-色氨酸转化率为0.21 g·g-1,接近于大肠杆菌非生长状态下的最大理论产率。3 L罐中E.coli KT1306/p RSF-tac-csr B-tac-tkt A发酵显示L-色氨酸产量为40.1 g·L-1,较出发菌株提高了15.7%;单位碳源对L-色氨酸的转化率为15.4%;乙酸、乳酸等副产物始终处于较低水平,最高仅为对照的12.5%和46.5%;L-phe和L-tyr的累积低于2 g·L-1。研究结果提供了一种通过中心代谢改造强化芳香族途径的碳流流向,提高菌株L-色氨酸生产性能的新思路。
冯莹莹[6]（2015）在《生物酶法合成芳香族氨基酸研究》文中研究说明凡具有芳香环的氨基酸都属于芳香族氨基酸,例如酪氨酸、苯丙氨酸等。L-酪氨酸作为一种重要的生化试剂,是合成多肽类激素、抗生素、L-多巴等药物的主要原料;医药上用作治疗甲状腺功能亢进的药物,也作饮料添加剂和配制人工昆虫饲料。D-苯丙氨酸是一种重要手性化合物,作为多种药物的中间体,参与合成短杆菌肽等环肽类抗生素。本研究的重点是生物酶法合成两种芳香族氨基酸L-酪氨酸和D-苯丙氨酸。1.采用双酶偶联体系制备L-酪氨酸,利用天冬氨酸转氨酶全细胞催化L-天冬氨酸转氨至苯丙酮酸,生成L-苯丙氨酸,同时得到中间产物丙酮酸;反应体系中的酪氨酸酚裂解酶全细胞催化丙酮酸、苯酚和氨酶法合成L-酪氨酸。经考察确定了双酶偶联反应的最佳条件为:温度40℃,pH 8.5,底物苯丙酮酸质量浓度为25 g/L,苯丙酮酸与L-天冬氨酸摩尔比1:1.2,天冬氨酸转氨酶与酪氨酸酚裂解酶细胞质量比1:1,4mmol/LPLP,0.1 g/L吐温80。30g/L的氯化铵对双酶偶联反应有促进作用,转化12 h L-酪氨酸最大产量达12 g/L。双菌双酶偶联生物法合成L-酪氨酸,充分利用了反应中间产物丙酮酸得到附加值较高的L-酪氨酸,对资源合理利用及绿色合成工艺具有参考意义。2.将天冬氨酸转氨酶与酪氨酸酚裂解酶在大肠杆菌中共表达,构建共表达基因工程菌[pETDuet-TPL-AspAT/BL21（DE3）],实现一菌双酶酶法制备L-酪氨酸。反应体系中只投入一种酶细胞,简化了实验操作,经考察此工程菌反应最佳条件同双酶偶联反应,转化12 h得到L-酪氨酸最大产量为6.7 g/L,L-酪氨酸产率降低。3.本文将乳酸氧化酶与酪氨酸酚裂解酶共表达,构建共表达基因工程菌[pETDuet-LOD-TPL/BL21（DE3）],经考察反应最佳条件为温度 45℃,pH 9.0,L-乳酸质量浓度为10 g/L,底物苯酚与L-乳酸摩尔比1.2:1;为减轻底物抑制,苯酚在反应8 h后加入,且4 h/次方式流加苯酚,使底物及产物都能达到最大效果,最终L-酪氨酸产量为5.2 g/L。本方法拓展了丙酮酸来源,为酶法合成L-Tyr工业化进行了有益探索。4.本文采用氨基酸消旋酶与苯丙氨酸解氨酶级联催化制备D-苯丙氨酸。将来源于粘红酵母的苯丙氨酸解氨酶密码子优化后进行全基因合成,与载体pETDuet-1重组,成功构建基因工程菌[pETDuet-1-PAL/BL21（DE3）]。酶学性质研究确定最佳转化条件:温度45℃,pH 9.0。表面活性剂对酶活有一定影响,质量分数0.2%的Tween-80增效最好。另外,金属离子也会不同程度地影响酶活,其中Mg2+、Ca2+对苯丙氨酸解氨酶酶活有促进作用。质量浓度为40g/L底物L-苯丙氨酸,在氨基酸消旋酶作用下转化为DL-苯丙氨酸,再经苯丙氨酸解氨酶作用,得到D-苯丙氨酸和副产物肉桂酸,L-苯丙氨酸转化率达86%。
丁锐[7]（2014）在《大肠杆菌L-苯丙氨酸工程菌株的构建及代谢调控研究》文中研究指明为了保障粮食安全,粮食在收获后将有部分被贮存起来作为储备粮。粮食在储存过程中由于进行新陈代谢,品质不断下降的同时经济价值也会降低。如果储存条件控制不当更会加速这一过程造成粮食变质。对这类粮食进行深加工,提升其附加值具有重大的经济价值及社会意义。利用粮食中的淀粉为原料生产葡萄糖并联产L-苯丙氨酸可以大幅提高变质粮食的经济效益。L-苯丙氨酸属芳香族氨基酸,是人体八种必需氨基酸之一。由于其重要的生物学功能,L-苯丙氨酸被广泛应用于食品、医药、化工等领域,在世界市场的年销售额超过10亿美元。L-苯丙氨酸最主要的用途是作为保健型甜味剂阿斯巴甜的原料。该甜味剂具有甜度高、热量低、口味纯正等优点,深受世界各国消费者的青睐,消费量巨大。由于国内L-苯丙氨酸生产工艺落后、产能不足,我国在每年出口阿斯巴甜的同时需要从国外进口L-苯丙氨酸。基于L-苯丙氨酸的巨大市场价值及国内市场存在的供需缺口,本研究以L-苯丙氨酸专利菌NST74为出发菌株。在系统分析大肠杆菌NST74 L-苯丙氨酸合成途径的前提下,以代谢工程和现代分子生物学技术为手段,从细胞整体水平出发设计改造策略。分别对前体物质供应、合成限速步骤、L-苯丙氨酸转运系统等进行改造。并针对研究中遇到的实际问题进行理论探究。以期为获得L-苯丙氨酸高产菌株奠定基础。并为开发利用陈化变质粮食提供一条高附加值的途径。主要研究内容及结果如下：（1）克隆并共表达了负责莽草酸途径前体物质PEP及E4P供应的ppsA及tktA基因,构建共表达质粒pQST （pQH-ppsA-tktA）。 SDS-PAGE及酶活测定结果表明,共表达后的PpsA及TktA酶活性分别达到了NST74的7.4倍和8.1倍,并且两种酶的酶活提升幅度较为同步。pQST质粒的构建为莽草酸途径前体物质的充足供应提供了保障。（2）在共表达质粒pQST的基础上,克隆并共表达了NST74菌株中抗反馈抑制型的关键酶基因aroGfbr和pheAfbr以及转氨酶编码基因tyrB,构建了五基因共表达质粒pQSTERO （pQH-ppsA-tktA-pheAfbr-tyrB-aroGfbr）。酶活测定结果表明,与NST74相比,共表达后的AroG酶活性达到NST74的8.7倍,CM活性达到NST74的8.2倍,PD活性达到NST74的7.4倍,TyrB活性达到NST74的6.3倍。抗反馈抑制检测显示,在10mmol/LL-苯丙氨酸的压力下,AroGfbr保留了68.3%的酶活性,而CMtbr和pDfbr分别保留了87.4%和84.3%的酶活性。AroGfbr和PheAfbr均表现出明显的抗L-苯丙氨酸反馈抑制能力。共表达这两个酶的编码基因,可以有效破除莽草酸途径中的限速步骤,pQSTERO质粒的构建保障了莽草酸途径的畅通。（3）利用无痕敲除系统将NST74菌株的aroP基因进行敲除,限制菌体对环境中L-苯丙氨酸的摄取；在共表达质粒pQSTERO的基础上,克隆并共表达了L-苯丙氨酸外运蛋白的编码基因yddG,构建了六基因共表达质粒pQSTEROD （pQH-ppsA-tktA-pheAfbr-tyrB-aroGfbr-yddG）。利用摇瓶培养和硅胶层析对工程菌的L-苯丙氨酸生产能力进行初步检测,结果显示工程菌NST74△P （pQSTEROD）的L-苯丙氨酸产量与NST74相比提升最大。利用发酵罐对NST74△P （pQSTEROD）菌株的实际发酵能力进行了检测。经过48 h发酵,NST74△P （pQSTEROD）的L-苯丙氨酸产量达到了36.48 g/L,产率（L-Phe yield on glucose）达到了0.26 mol/mol。工程菌较对照菌NST74L-苯丙氨酸生产能力有了大幅度的提升。该菌株不仅拥有极大的生产潜力,并且为获得更高产的L-苯内氨酸工程菌株奠定了基础。（4）利用定点突变技术对有文献报道的三种抗反馈抑制型单位点突变aroGfbr进行了复原,并且在此基础上对三种单突变位点进行两两组合,创造出三种新的双位点突变aroGfbr。酶活性及抗反馈抑制能力检测结果说明,除AroG15/29外的双位点AroGfbr突变体与其相对应的单位点AroGfbr突变体相比,具有更高的初始酶活性以及更强的抗反馈抑制能力；实际发酵测试结果表明,除AroG15/29外的双位点AroGfbr突变体与其相对应的单位点AroGfbr突变体相比,对工程菌的L-苯丙氨酸产量及产率提升作用更为显着。双位点突变体AroG8/15在所有突变体中表现出了最高的初始酶活（8.39 U/mg）以及最强的抗反馈抑制能力（96.6%）。并且在实际发酵中W3110 （pQSERG8/15）的L-苯丙氨酸生产能力为所有工程菌中最高,产量和产率分别比对照菌W3110（pwtQSERG）提高了116%和31%,表明aroG8/15对于L-苯丙氨酸生产具有很高的应用价值。同时也说明组合已知突变位点并利用定点突变导入同一aroG基因是一种快速、有效构建抗反馈抑制型aroGfbr的方法。
陈荣庆[8]（2014）在《大肠杆菌高产色氨酸菌株的构建》文中认为色氨酸是一种重要的营养必需氨基酸。色氨酸主要存在三种异构体：L型,D型,DL型。L-色氨酸是人和动物体所必需的8种氨基酸之一,由于L-色氨酸只能够在绿色植物和微生物体内合成,人和动物体内的色氨酸摄取只能是从外界中的食物来获取。在这三种构型的色氨酸中,动物体内几乎不含有D-色氨酸,而且D-色氨酸也没有任何代谢作用,不过也没有毒性。所以目前有关色氨酸的研究主要是针对L-色氨酸的研究进展来进行的。随着色氨酸研究的越来越深入,其应用也逐步涉及到医药,食品,饲料添加剂等各个方面。本研究以现有的大肠杆菌芳香族氨基酸代谢通路为理论基础基础,引入Red重组酶系统敲除大肠杆菌基因组上trpR基因,目的是解除了基因组上大肠杆菌内色氨酸合成过程中的反馈阻遏,调整色氨酸合成限制性步骤基因拷贝数量等方法,改造色氨酸合成过程中的调控网络,以期提高色氨酸的发酵水平。另一方面,将通过改造生产菌株底盘细菌色氨酸代谢通路入手,敲除底盘细菌色氨酸代谢通路的基因,重新构建表达色氨酸操纵子基因的质粒,在大肠杆菌体内高效表达。本文主要内容如下：（1）Red重组法构建trpR基因的缺失突变株。色氨酸在大肠杆菌内的代谢过程的关键步骤在于中心途径之后的共同途径和分支途径。分支途径中所需要的酶主要由色氨酸操纵子基因来编码合成,其中trpE、trpD编码邻氨基苯甲酸合成酶（AS）,此酶的活性主要受到反馈抑制的调控。大肠杆菌中,邻氨基苯甲酸合成酶是色氨酸合成过程中的关键酶之一,对活性的调控主要由trpR蛋白实现,当trpR蛋白表达并与色氨酸结合后,会转录阻遏色氨酸操纵子基因。所以理论上讲,如果敲除大肠杆菌基因组上的trpR基因,这样就能够解除色氨酸合成过程中的反馈抑制,从而达到提高色氨酸产量的目的。（2）重新改造现有的质粒mc33。现有质粒已将色氨酸操纵子trpABCDE串联表达,在此基础上,本研究构建重组质粒pSU18-trp operon和pUC19-serA/aroG,转化导入大肠杆菌,摇瓶发酵检测色氨酸发酵水平,15h左右最高产酸量可达0.1mg/L。（3）建立合适的HPLC测定发酵液中L-色氨酸的方法。测定L-色氨酸的传统方法主要有纸层析法、薄层分析法、比色法、高效液相色谱法、氨基酸分析仪测定法等。在实验室研究中最常用的方法主要是对二氨基苯甲醛法和柱前衍生HPLC法。但是这两种方法都有其局限性和不足之处。主要是因为此两种方法都需要浓硫酸作为显色剂,而且操作步骤复杂,实验危险性较大。另外其测量精度也不如HPLC法。所以目前在L-色氨酸含量测定研究中人们已经逐步采用HPLC法来替代这两种方法。因为在紫外光区278nm处L-色氨酸有特异性光吸收,HPLC法测定色氨酸含量的理论依据是利用光电二极管阵列（DAD）检测器来检测在此波长下吸收峰的面积变化来确定L-色氨酸的含量。本次研究采取的HPLC运行条件：以SunFireTM18柱（5μm,150mm×4.6mm）为分离柱,流动相比例是V（0.03%KH2PO4溶液）：V（甲醇）=90：10,流量为1mL/min,在278nm处检测-色氨酸。柱温39℃,进样量20ul。4、对工厂提供原始菌株质粒mc33测序结果以及原始菌株基因组扫描框架图的分析。根据和工厂签订的保密协议,该部分结果没有放在本论文中。
赵志军[9]（2011）在《L-色氨酸生产菌株的构建及代谢调控研究》文中认为L-色氨酸（L-tryptophan, L-Trp）作为人体内的一种必需氨基酸,广泛应用于医药、食品、饲料等行业。而微生物发酵法生产L-Trp由于具有原料廉价、产物纯度高、易提取等优点受到了越来越多的关注。近年来,国外通过代谢工程的手段,逐渐培育出一批高产的L-Trp生产菌株,但其在发酵过程中仍存在发酵后期L-Trp生产速率下降明显,副产物积累等问题,此外,上述工程菌的构建过程均涉及多轮的化学诱变,很难确认诱变过程中次级突变对菌株的影响,进而阻碍了菌种的进一步改良。而在国内,利用代谢工程手段选育L-Trp生产菌株的研究在2000年以后才逐渐得到展开,已构建菌株的L-Trp生产能力与国外同类菌株相比差距较大,直接限制了我国L-Trp生产行业的快速发展。针对以上国内外的研究现状,本论文运用代谢工程的研究策略,以E. coli W3110为出发菌株,在不涉及化学诱变的情况下,通过一系列的基因操作构建L-Trp的生产菌株,同时通过直接测定菌株20余种胞内代谢产物的浓度,分析了L-Trp合成代谢的流量分布特征,为进一步菌种改良提供了依据。主要的研究内容及结果如下:（1）通过定点突变删除3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）合酶AroF第11位氨基酸残基Ile11,获得抗反馈抑制突变体AroFfbr;通过置换邻氨基苯甲酸（ANTA）合酶第40位氨基酸残基Ser40为Phe,获得抗反馈抑制突变体TrpEfbrD;利用Red重组技术,通过敲除E. coli W3110基因组上的trpR基因,解除了TrpR蛋白对trp操纵子转录的反馈阻遏调控;将基因aroFfbr和trpEfbrD克隆至低拷贝、具有PR、PL双启动子的原核表达载体pSV中,构建重组质粒pSV04,并转化至trpR敲除菌,获得工程菌FB-01/pSV04。发酵结果表明,发酵30 h,L-Trp产量为2.8 g/L,同时发酵液中有副产物积累,分别为:L-Phe 1.8 g/L,L-Tyr 1.4 g/L和ANTA 2.3 g/L。（2）在基因trpR敲除的基础上,通过敲除tnaA基因,切断菌体内的L-Trp分解途径,构建trpR.tnaA双基因敲除菌FB-02,获得工程菌FB-02/pSV04,发酵结果表明L-Trp产量大幅上升至7.8 g/L,但同时积累了较多的副产物,分别为L-Phe 5.3 g/L,L-Tyr 3.6 g/L,ANTA 5.4 g/L;为了阻止副产物L-Phe的积累,在菌株FB-02的基因组上敲除L-Phe分支途径的关键酶基因pheA,构建trpR.tnaA.pheA多基因敲除菌FB-03,工程菌FB-03/pSV04的发酵结果表明,发酵液中L-Phe积累量不足1 g/L,达到预期目的,但同时L-Tyr的积累量上升至5.1 g/L,而L-Trp产量提高至10.8 g/L;在菌株FB-03的基因组中进一步敲除L-Tyr分支途径中的关键酶基因tyrA,构建trpR.tnaA.pheA.tyrA多基因敲除菌FB-04,获得工程菌FB-04/pSV04;在基因pheA和tyrA均被敲除以后,需要在培养基中添加适量的L-Phe（2 g/L）和L-Tyr（3 g/L）,菌体FB-04/pSV04才能正常发酵,发酵结果表明L-Trp产量上升至13.3 g/L,而副产物ANTA的积累量在pheA和tyrA基因敲除前后基本没有变化。（3）以菌株FB-03为出发菌株,分别构建L-Trp吸收系统调控基因mtr、tnaB和aroP的缺失突变菌FB-T1、FB-T2和FB-T3;L-Trp吸收活性的测定分析表明,mtr、tnaB和aroP三个基因敲除菌的L-Trp吸收活性与对照菌FB-03相比,分别降低了48%、34%和17%;将重组质粒pSV04转化至上述三个突变菌株中,发酵结果表明,mtr、tnaB和aroP三个敲除菌的L-Trp产量分别为14.7、13.1、和12.3 g/L,与对照菌FB-03/pSV04相比分别提高了34%,19%和12%;此外,吸收基因mtr、tnaB和aroP的敲除,还有利于减少副产物的积累,其中, L-Tyr的积累量与对照菌相比,分别下降了40%、21%、15%; ANTA的积累量与对照菌相比,分别下降了25%、11%、6%;通过测定mtr敲除菌FB-T1/pSV04胞内的L-Trp浓度,发现在发酵过程中,mtr敲除菌胞内L-Trp浓度的增长速率远小于对照菌FB-03/pSV04,在发酵中期的16 h和24 h,mtr敲除菌的胞内L-Trp浓度分别为27.4和50.9μmol/L,与对照菌相比分别下降了42%和35%,由此探讨了L-Trp吸收系统基因敲除促进L-Trp生产的作用机理。（4）在大肠杆菌里,trp操纵子结构基因trpEDCBA的转录受到操纵子内部前导肽trpL中的一段衰减子序列的调控,利用RNA structure软件对前导肽trpL序列的RNA二级结构进行预测分析,表明在利用Red重组系统敲除trpL内部的10-118位核苷酸序列后, trpL的RNA二级结构自由能下降了32%,但trpL 10-118位序列敲除菌FB-L1/pSV04的发酵结果表明,在trpL 10-118位序列敲除前后,L-Trp的产量以及副产物的积累量均没有明显变化,分析原因可能是相对于借助重组质粒pSV04增强trpED的表达量而言,通过削弱衰减子对结构基因trpEDCBA的转录调控,增加结构基因表达量的作用有限;利用DNAMAN软件对结构基因trpEDCBA内部的限制性酶切位点进行分析,选择Eag I、Sca I和Hpa I三个酶切位点将基因trpDCBA分割成trpD*C*、trpC*B*和trpB*A（“*”表示为相应基因的部分序列）三个DNA片段,并按先后次序将其克隆至重组质粒pSV04中,完成结构基因trpEfbrDCBA的克隆,获得重组质粒pSV05;对工程菌FB-T1/pSV05进行发酵,结果表明,L-Trp产量为17.7 g/L,与菌株FB-T1/pSV04相比提高了21%,葡萄糖转化率为0.13;同时发酵液中ANTA的积累量为1.9 g/L,与菌株FB-T1/pSV04相比下降了51%。（5）将菌株E.coli FB-02/pSV04、FB-03/pSV04和FB-T1/pSV04分别发酵培养至稳定期中期,借助三重四级杆串联质谱仪LC-MS-MS分别测定三个菌株胞内20余种代谢产物的浓度,同时通过RP-HPLC测定三个菌株主要胞外代谢产物L-Trp、L-Phe、L-Tyr和ANTA在发酵液中的浓度;根据KEGG网站（http://www.genome.jp/kegg/）上的微生物代谢网络信息绘制大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成L-Trp的代谢网络图谱,根据测定的胞内代谢物浓度,计算三个菌株L-Trp合成代谢的流量分布,并在此基础上分别对菌体的葡萄糖吸收速率、主途径碳流量和关键中间产物的碳流量进行分析,确定提高前体物E4P和L-Ser的合成量,是菌株FB-T1/pSV05进一步改良的重点。
刘艳华[10]（2010）在《大肠杆菌苯丙氨酸生物合成的调控研究》文中提出研究目的1构建苯丙氨酸高产菌株,使之适用于工业化生产,降低甜味剂阿斯巴甜原料苯丙氨酸的成本,进而降低阿斯巴甜的成本。2搭建大肠杆菌合成代谢基因调控技术平台,为今后改造大肠杆菌芳香族氨基酸代谢通路打下基础,不仅可以用来提高天然产生的芳香代谢物苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸生产的产率和产量,还可以利用代谢工程的手段导入外源基因,用来合成其它芳香族化合物如靛蓝、吲哚乙酸、儿茶酚和奎尼酸及其衍生物等。材料和方法以大肠杆菌MG1655为受体菌,以pZE12为载体,对大肠杆菌苯丙氨酸合成代谢通路进行修饰。1敲除编码酪氨酸分支代谢通路上的关键酶基因tyrA;同时敲除对pheA功能有抑制作用的基因pheL;为了基因调控的方便及消除pheA、aroF的本底表达,同时敲除基因pheA、aroF。2从E.coli中克隆DAHP合成酶基因aroF、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheA,并将这两个基因串联起来,克隆到pZE12中,再把质粒转入基因敲除菌中进行表达。3从E.coli中克隆脱氢奎宁酸合成酶基因aroB和莽草酸激酶基因aroL,并将这两个基因串联起来,克隆到表达载体pET22b质粒中,再用酶切连接的手段将串联起来的基因整合到pZE12 pheA-aroF中,再把重组质粒转入基因敲除菌中进行表达。4从E.coli中克隆磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因ppsA和转酮酶A基因tktA,并将其串联起来,克隆到表达载体pET22b质粒中,再用酶切连接的手段将串联起来的基因整合到pZE12 pheA-aroF中,再把重组质粒转入基因敲除菌中进行表达。结果1 PCR鉴定结果显示pheL、pheA、tyrA、aroF这四个基因敲除成功。2 PCR及酶切结果显示：重组质粒pZE12 AF、pZE12 AFLB和pZE12 AFPT构建成功,即pheA和aroF、ppsA和tktA、aroL和aroB基因,两两串联并被成功克隆进质粒pZE12中。3SDS-PAGE电泳显示：本实验实现了pheA和aroF基因编码蛋白质的高表达,araB、aroL、ppsA和tktA基因编码的蛋白质表达较低。4与野生型MG1655相比,含有pZE12 AF的工程菌苯丙氨酸的产量提高了13倍,含有pZE12 AFPT的工程菌苯丙氨酸的产量提高了10.3倍,含有pZE12AFLB的工程菌苯丙氨酸的的产量提高了5.1倍。结论大肠杆菌苯丙氨酸代谢通路上关键酶基因pheA、aroF, aroL、aroB、ppsA和tktA的过表达,可以显着提高大肠杆菌苯丙氨酸产量,其中以pheA和aroF基因最为明显,ppsA和tktA基因次之。过表达的基因对提高工程菌苯丙氨酸产量影响的关键在于基因所编码的酶蛋白质表达水平要高,且各关键酶基因表达量之间要保持平衡,才能达到碳流的最有效利用,提高苯丙氨酸的产量。
二、大肠杆菌tktA基因的克隆表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠杆菌tktA基因的克隆表达（论文提纲范文）
（1）大肠杆菌生产L-色氨酸重组菌株的改造及发酵条件优化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 L-色氨酸的基本概述 |
| 1.1 L-色氨酸的理化性质 |
| 1.2 L-色氨酸的应用 |
| 1.3 L-色氨酸的生产方法 |
| 第二节 大肠杆菌生产L-色氨酸的合成途径及调控机制 |
| 2.1 大肠杆菌生产L-色氨酸的主要合成途径 |
| 2.2 大肠杆菌生产L-色氨酸调控机制 |
| 第三节 大肠杆菌生产L-色氨酸的育种思路 |
| 3.1 解除关键酶的反馈抑制作用 |
| 3.2 阻断支路代谢 |
| 3.3 提高前体物的水平 |
| 3.4 降低副产物的积累 |
| 3.5 转运途径的改造 |
| 3.6 阻断L-色氨酸的降解途径 |
| 第四节 论文的研究内容及意义 |
| 4.1 本论文的研究意义 |
| 4.2 本论文的研究内容 |
| 第二章 关键酶基因pckA和 tktA的共表达对L-色氨酸合成的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 pPA、pTA及pPT重组表达载体的构建 |
| 2.2 pPA、pTA及pPT重组表达载体PCR验证 |
| 2.3 PckA和TktA酶活性检测 |
| 2.4 重组菌株摇瓶发酵结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第三章 邻氨基苯甲酸合酶的改造对L-色氨酸合成的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 pPTT及突变重组载体的构建 |
| 2.2 pPTT重组载体PCR扩增验证 |
| 2.3 耐高浓度色氨酸类似物突变菌株的筛选 |
| 2.4 高产L-色氨酸突变菌株的筛选 |
| 2.5 邻氨基苯甲酸合酶突变位点分析与结构模拟 |
| 2.6 邻氨基苯甲酸合成酶酶活性测定结果 |
| 2.7 重组菌株摇瓶发酵结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第四章 丙氨酸转氨酶的修饰对L-色氨酸合成的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 基因alaA、alaC和avtA与抗性基因的交换 |
| 2.2 L-丙氨酸转氨酶各基因缺失菌株的构建 |
| 2.3 L-丙氨酸转氨酶各单基因敲除后摇瓶发酵验证结果 |
| 2.4 L-丙氨酸转氨酶各双基因及全部敲除后摇瓶发酵验证结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第五章 摇瓶发酵条件及培养基优化 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 质粒稳定性检测 |
| 2.2 L-苯丙氨酸残液替代L-苯丙氨酸粉末效果 |
| 2.3 发酵条件优化 |
| 2.4 发酵培养基的优化 |
| 2.5 50L罐补料分批发酵验证 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）大肠杆菌L-苯丙氨酸工程菌株的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 基因符号说明 |
| 1 前言 |
| 1.1 L-苯丙氨酸简介 |
| 1.1.1 L苯丙氨酸的性质 |
| 1.1.2 L-苯丙氨酸的应用 |
| 1.2 L-苯丙氨酸的生产方法与研究进展 |
| 1.3 L-苯丙氨酸的生物合成途径及代谢调控 |
| 1.4 代谢工程育种策略 |
| 1.4.1 去除关键酶反馈抑制,强化关键酶表达 |
| 1.4.2 优化莽草酸途径通量 |
| 1.4.3 增加前体物供应 |
| 1.4.4 改造L-苯丙氨酸转运系统 |
| 1.5 Crispr/Cas9编辑技术在大肠杆菌中的应用 |
| 1.6 立题背景和研究内容 |
| 1.6.1 立题背景 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 本论文的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒及引物 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 常用溶液的配制 |
| 2.2.4 培养基配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 分子生物学操作方法 |
| 2.3.2 感受态的制备及转化 |
| 2.4 大肠杆菌的Crispr/Cas9基因编辑方法 |
| 2.4.1 pGR/B质粒构建 |
| 2.4.2 DNA重组片段的制备 |
| 2.4.3 质粒和重组DNA片段的电转化 |
| 2.4.4 大片段DNA整合的方法 |
| 2.5 大肠杆菌发酵培养方法及发酵液分析测定方法 |
| 2.5.1 摇瓶发酵培养 |
| 2.5.2 发酵罐分批补料发酵 |
| 2.5.3 pH的测定 |
| 2.5.4 菌体生物量的测定 |
| 2.5.5 葡萄糖浓度测定 |
| 2.5.6 HPLC测定发酵液中L-苯丙氨酸浓度 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 大肠杆菌L-苯丙氨酸分支途径的改造 |
| 3.1.1 pheA-tyrB基因的整合 |
| 3.1.2 摇瓶发酵验证pheA-tyrB整合效果 |
| 3.1.3 pheA-tyrB基因双拷贝及三拷贝的整合 |
| 3.1.4 不同pheA-tyrB基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.2 关键酶基因aroG的改造 |
| 3.2.1 aroG点突变基因的整合 |
| 3.2.2 摇瓶发酵验证aroG改造效果 |
| 3.2.3 不同aroG基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3 优化莽草酸途径代谢通量 |
| 3.3.1 不同aroC基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.2 不同aroA基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.3 不同aroL基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.4 不同aroE基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.5 不同aroD基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.6 不同aroB基因表达水平对L苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.7 莽草酸途径的改造对L-苯丙氨酸产量影响的讨论 |
| 3.4 增加前体物供应 |
| 3.4.1 pykF基因的敲除 |
| 3.4.2 不同pps基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.4.3 不同tktA基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.5 转运蛋白的改造 |
| 3.5.1 pheP基因的敲除 |
| 3.5.2 aroP基因的敲除 |
| 3.6 L-苯丙氨酸工程菌株E.coli PHE13的5L发酵罐验证 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（3）类球红细菌高效合成辅酶Q10代谢机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 辅酶Q_(10)的化学结构 |
| 1.3 辅酶Q_(10)的生化功能及应用 |
| 1.3.1 辅酶Q_(10)的生化功能 |
| 1.3.2 辅酶Q_(10)的应用 |
| 1.4 辅酶Q_(10)的发酵生产 |
| 1.5 辅酶Q_(10)的生产应用 |
| 1.5.1 辅酶Q_(10)的高产菌株筛选 |
| 1.5.2 微生物合成辅酶Q_(10) |
| 1.5.3 类球红细菌产辅酶Q_(10) |
| 1.5.4 类球红细菌分支酸代谢途径优化 |
| 1.6 本课题的研究思路 |
| 1.6.1 本课题的研究背景及意义 |
| 1.6.2 本课题的研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用菌株及质粒 |
| 2.1.2 药品与酶试剂 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 |
| 2.1.4 试验所需培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 R.sphaeroides2.4.1 DNA提取 |
| 2.2.2 JM109、S17-1感受态制备 |
| 2.2.3 pBBR1MCS2::tac过表达载体和pK18mobsacB敲除载体 |
| 2.2.4 pykA敲除载体pK18mobsacB::pykA-LR的构建 |
| 2.2.5 RSP-1848敲除载体pK18mobsacB::RSP-1848-LR的构建 |
| 2.2.6 过表达载体pLH457 (pLH315::tktA)的构建 |
| 2.2.7 过表达载体pLH458 (pLH315::RSP-2921)的构建 |
| 2.2.8 过表达载体pLH459 (pLH315::arok)的构建 |
| 2.2.9 过表达载体pLH460 (pLH315::ppdK)的构建 |
| 2.2.10 过表达载体pLH512 (pLH315::ubic_(E.coli))的构建 |
| 2.2.11 过表达载体pLH513 (pLH315::ubiA)的构建 |
| 2.2.12 过表达载体pLH514 (pLH315::ubicE.coli::ubiAE.coli)的构建 |
| 2.2.13 类球红细菌中质粒结合转移方法 |
| 2.2.14 基因敲除菌株的筛选鉴定 |
| 2.2.15 过表达菌株的筛选鉴定 |
| 2.2.16 类球红细菌代谢分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 分支酸代谢途径相关基因的生物学信息 |
| 3.2 类球红细菌(R.sphaeroides 2.4.1)基因组提取 |
| 3.3 过表达载体pLH315保有率 |
| 3.4 敲除载体构建 |
| 3.4.1 载体pLH431的构建 |
| 3.4.2 载体pLH432的构建 |
| 3.5 敲除菌株筛选 |
| 3.5.1 基因敲除原理 |
| 3.5.2 pykA基因敲除菌株筛选 |
| 3.5.3 RSP-1848基因敲除菌株筛选 |
| 3.5.4 RSP-1848、pykA基因双敲除菌株筛选 |
| 3.6 过表达菌株构建 |
| 3.6.1 tktA基因过表达载体pLH457构建 |
| 3.6.2 RSP_2921基因过表达载体pLH458构建 |
| 3.6.3 arok基因过表达载体pLH459构建 |
| 3.6.4 ppdK基因过表达载体pLH460构建 |
| 3.6.5 大肠杆菌ubiC过表达载体pLH512构建 |
| 3.6.6 ubiA基因过表达载体pLH513构建 |
| 3.6.7 大肠杆菌ubiC-ubiA过表达载体pLH514构建 |
| 3.7 过表达菌株筛选 |
| 3.7.1 tktA基因过表达菌株的筛选 |
| 3.7.2 RSP-2921基因过表达菌株的筛选 |
| 3.7.3 arok基因过表达菌株的筛选 |
| 3.7.4 ppdK基因过表达菌株的筛选 |
| 3.7.5 ubiC基因过表达菌株的筛选 |
| 3.7.6 ubiA基因过表达菌株的筛选 |
| 3.7.7 ubiC-ubiA_(Ecoli)基因过表达菌株的筛选 |
| 3.8 类球红细菌产辅酶Q_(10)发酵分析 |
| 3.8.1 pykA和RSP-1848敲除菌株表型分析 |
| 3.8.2 pykA和RSP-1848敲除菌株摇瓶生长分析 |
| 3.8.3 pykA和RSP-1848敲除菌株产辅酶Q_(10)分析 |
| 3.9 类球红细菌中过表达菌株产辅酶Q_(10)分析 |
| 3.9.1 强化分支酸代谢途径菌株表型对比 |
| 3.9.2 过表达菌株摇瓶生长分析 |
| 3.9.3 过表达菌株产辅酶Q_(10)分析 |
| 3.10 分支酸代谢途径下游的强化 |
| 3.10.1 ubiA、ubiC_(Ecoli)、ubiC_(Ecoli)-ubiA_(Ecoli)过表达菌株表型分析 |
| 3.10.2 ubiA、ubiC_(Ecoli)、ubiC_(Ecoli)-ubiA_(Ecoli)过表达菌株摇瓶生长分析 |
| 3.10.3 过表达菌株产辅酶Q_(10)分析 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（4）基因工程改造Pseudomonas chlororaphis GP72以提高2-羟基吩嗪产量（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 吩嗪类化合物 |
| 1.1.1 吩嗪类物质简介 |
| 1.1.2 吩嗪的生物学功能及其应用 |
| 1.1.2.1 在细菌生存竞争中的作用 |
| 1.1.2.2 作为信号分子 |
| 1.1.2.3 作为电子传递载体 |
| 1.1.2.4 在生物技术中的应用 |
| 1.2 吩嗪类化合物生产菌属 |
| 1.2.1 假单胞菌 |
| 1.2.1.1 机会致病假单胞菌 |
| 1.2.1.2 植物根际促生假单胞菌 |
| 1.2.2 链霉菌属 |
| 1.2.3 其它吩嗪生产菌属 |
| 1.3 吩嗪的生物合成 |
| 1.3.1 吩嗪合成的前体途径—莽草酸途径 |
| 1.3.2 吩嗪的生物合成途径 |
| 1.4 吩嗪化合物生物合成的调控 |
| 1.4.1 环境因素调控 |
| 1.4.2 双元调控系统 |
| 1.4.3 菌群传感 |
| 1.4.4 转录后调控 |
| 1.5 2-OH-PHZ研究现状 |
| 1.5.1 绿针假单胞菌GP |
| 1.5.2 2-羟基吩嗪 |
| 1.5.3 2-OH-PHZ的合成机理 |
| 1.5.4 单加氧酶PhzO |
| 1.5.5 绿针假单胞菌GP72中2-OH-PHZ的研究现状 |
| 1.6 本课题研究目的、内容及意义 |
| 第二章 敲除负调控基因提高GP72中2-OH-PHZ产量 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 培养基及菌体培养方法 |
| 2.2.2 实验所用菌株、质粒及引物 |
| 2.2.3 基因的无痕敲除 |
| 2.2.3.1 pykF基因敲除质粒的构建 |
| 2.2.3.2 pykF敲除株的构建 |
| 2.2.4 生长曲线及吩嗪产量的测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 pykF、rpeA、rsmE、lon等基因的无痕敲除 |
| 2.3.1.1 体外重组质粒的构建 |
| 2.3.1.2 GP72 pykF突变株的获得 |
| 2.3.2 pykF敲除后GP72 菌株吩嗪产量及生长状况的变化 |
| 2.3.3 rpeA、rsmE、lon等双元调控基因缺失对GP72 吩嗪产量和生长的影响. |
| 2.3.4 GP72 中双元调控系统对吩嗪类物质合成的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 过表达关键基因强化莽草酸途径以提高2-OH-PHZ产量 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 培养基及菌体培养方法 |
| 3.2.2 实验所用菌株、质粒及引物 |
| 3.2.3 六个关键基因的克隆 |
| 3.2.4 aroD、ppsA及 tktA基因的定点突变 |
| 3.2.5 单基因过表达质粒的构建 |
| 3.2.6 多基因过表达质粒的构建 |
| 3.2.7 pBbB5K系列质粒在绿针假单胞菌GP72 的过表达 |
| 3.2.8 过表达菌株的发酵将待发酵的菌株 |
| 3.2.9 吩嗪物质的检测发酵样品提取及检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 基因的克隆 |
| 3.3.2 各基因中所含有的限制性酶识别位点 |
| 3.3.3 各个基因的定点突变 |
| 3.3.3.1 aroD基因的定点突变 |
| 3.3.3.2 tktA基因的定点突变 |
| 3.3.3.3 ppsA基因的定点突变 |
| 3.3.4 过表达载体的构建 |
| 3.3.5 莽草酸强化基因的过表达 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 利用优化phzO提高2-OH-PHZ的产量 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 培养基及菌体培养方法 |
| 4.2.2 实验所用菌株、质粒及引物 |
| 4.2.3 phzO基因的分析 |
| 4.2.4 phzO基因敲除 |
| 4.2.4.1 phzO敲除质粒的构建 |
| 4.2.4.2 phzO基因的敲除 |
| 4.2.4.3 测序验证 |
| 4.2.5 phzO优化基因的合成及替换 |
| 4.2.5.1 phzO优化基因phzO~O的获得 |
| 4.2.5.2 phzO~O基因替换重组质粒的获得 |
| 4.2.5.3 phzO~O基因替换株的获得 |
| 4.2.6 GP72ANΔphzO回补实验 |
| 4.2.7 菌株的发酵及样品检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 phzO基因密码子使用情况分析及优化 |
| 4.3.2 GP72AN中 phzO基因的敲除 |
| 4.3.3 GP72ANΔphzO的简单发酵 |
| 4.3.4 phzO优化基因phzO~O的替换 |
| 4.3.5 GP72AN phzO~O菌株的发酵 |
| 4.3.6 GP72ANΔphzO菌株回补 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 phz基因簇对P.chlororaphis GP72AN的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 培养基及菌体培养方法 |
| 5.2.2 实验所用菌株、质粒及引物 |
| 5.2.3 phz基因簇及吩嗪合成竞争途径相关基因的敲除 |
| 5.2.4 菌株转录组分析 |
| 5.2.5 生长曲线及吩嗪产量的测定 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 绿针假单胞菌GP72AN中 phz基因簇的敲除 |
| 5.3.2 转录组结果初步分析 |
| 5.3.3 trpE、pabB、pheA、ubiC等基因的无痕敲除 |
| 5.3.4 吩嗪合成竞争途径相关敲除株的发酵 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文的主要内容和结论 |
| 6.2 课题的创新点 |
| 6.3 工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 :试验中所用的仪器设备 |
| 附录2 :试验中所用的试剂 |
| 附录3 :绿针假单胞菌GP72 相关基因序列 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间研究成果 |
（5）中心代谢途径改造对L-色氨酸合成的碳流偏转研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 L-色氨酸概述 |
| 1.2 L-色氨酸的应用 |
| 1.2.1 在医学上的应用 |
| 1.2.2 在食品上的应用 |
| 1.2.3 在饲料行业的应用 |
| 1.3 L-色氨酸的生产方法 |
| 1.3.1 酶促转化法 |
| 1.3.2 微生物发酵法 |
| 1.4 大肠杆菌L-色氨酸合成途径及调控机制 |
| 1.5 中心代谢途径改造在L-色氨酸合成中的运用 |
| 1.5.1 增加E4P的合成的方法 |
| 1.5.2 增加PEP的合成的方法 |
| 1.6 本课题的立题意义与研究内容 |
| 1.6.1 立题意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 工具酶 |
| 2.1.3 主要试剂及药品 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 Escherichia coli K12 染色体的提取 |
| 2.2.3 csrB和tktA基因以及tac启动子的扩增 |
| 2.2.4 质粒的提取 |
| 2.2.5 感受态的制备及转化 |
| 2.2.6 质粒的构建 |
| 2.2.7 重组菌的构建 |
| 2.2.8 质粒稳定性研究 |
| 2.2.9 目的蛋白表达鉴定 |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR检测csrB基因的表达 |
| 2.2.11 培养方法 |
| 2.2.12 生物量的测定方法 |
| 2.2.13 L-色氨酸的测定 |
| 2.2.14 葡萄糖浓度的测定 |
| 2.2.15 副产物的测定 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 中心代谢途径中强化PEP或E4P合成的分子改造 |
| 3.1.1 PEP合成相关csrB、ppsA基因的克隆及表达 |
| 3.1.2 csrB与ppsA的表达对L-色氨酸合成的影响 |
| 3.1.3 E4P合成基因tktA与tal B的克隆及表达 |
| 3.1.4 tktA与talB的表达对L-色氨酸合成的影响 |
| 3.2 共强化PEP和E4P重组菌构建及其发酵特性 |
| 3.2.1 重组质粒pRSF-tac-csrB-tac-tktA、pRSF-tac-csrB-tac-talB的构建及表达 |
| 3.2.2 重组菌的选择及质粒稳定性分析 |
| 3.2.3 碳源对重组菌L-色氨酸合成的影响 |
| 3.2.4 氮源对重组菌L-色氨酸合成的影响 |
| 3.2.5 溶氧对重组菌L-色氨酸合成的影响 |
| 3.3 重组菌碳流代谢分析 |
| 3.3.1 重组菌代谢分析 |
| 3.3.2 重组菌的转化率分析 |
| 3.3.3 3L罐中重组菌的代谢分析 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（6）生物酶法合成芳香族氨基酸研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 L-酪氨酸研究意义及制备方法 |
| 1.1.1 L-酪氨酸概述 |
| 1.1.2 L-酪氨酸制备方法 |
| 1.2 D-苯丙氨酸研究意义及制备方法 |
| 1.2.1 D-苯丙氨酸概述 |
| 1.2.2 D-苯丙氨酸制备方法 |
| 1.3 苯丙氨酸解氨酶 |
| 1.3.1 苯丙氨酸解氨酶来源 |
| 1.3.2 苯丙氨酸解氨酶作用机理 |
| 1.3.3 苯丙氨酸解氨酶应用 |
| 1.4 天冬氨酸转氨酶 |
| 1.4.1 天冬氨酸转氨酶来源 |
| 1.4.2 天冬氨酸转氨酶作用机理 |
| 1.4.3 天冬氨酸转氨酶应用 |
| 1.5 酪氨酸酚裂解酶 |
| 1.5.1 酪氨酸酚裂解酶来源 |
| 1.5.2 酪氨酸酚裂解酶作用机理 |
| 1.5.3 酪氨酸酚裂解酶应用 |
| 1.6 多酶偶联反应体系研究和应用 |
| 1.6.1 自偶联反应体系 |
| 1.6.2 种间偶联反应体系 |
| 1.7 共表达系统 |
| 1.7.1 多质粒共转化模式 |
| 1.7.2 多顺反子单质粒共表达模式 |
| 1.7.3 共表达系统的应用 |
| 1.8 丙酮酸概述 |
| 1.8.1 丙酮酸的制备方法 |
| 1.8.2 丙酮酸的应用 |
| 1.9 研究目的及主要研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 天冬氨酸转氨酶与酪氨酸酚裂解酶双酶偶联制备L-酪氨酸 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果与讨论 |
| 2.2.1 酶学性质 |
| 2.2.2 最优条件追踪实验 |
| 2.3 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 天冬氨酸转氨酶和酪氨酸酚裂解酶共表达基因工程菌构建 |
| 3.1 实验部分 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果与讨论 |
| 3.2.1 pETDuet-AspAT-TPL构建 |
| 3.3 单菌单酶法与单菌双酶法合成L-酪氨酸比较 |
| 3.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 乳酸氧化酶和酪氨酸酚裂解酶共表达制备L-酪氨酸 |
| 第一节 共表达乳酸氧化酶和酪氨酸酚裂解酶基因工程菌构建 |
| 1.1 实验部分 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果与讨论 |
| 第二节 共表达乳酸氧化酶和酪氨酸酚裂解酶基因工程菌酶学性质研究 |
| 2.1 DM216酶学性质研究 |
| 2.2 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 氨基酸消旋酶与苯丙氨酸解氨酶双酶偶联制备D-苯丙氨酸 |
| 第一节 重组苯丙氨酸解氨酶构建及其酶学性质研究 |
| 1.1 实验材料与方法 |
| 1.2 实验方法及结果讨论 |
| 1.3 小结 |
| 第二节 苯丙氨酸解氨酶与氨基酸消旋酶级联制备D-苯丙氨酸 |
| 2.1 氨基酸消旋酶概述 |
| 2.2 AAR与PAL级联催化反应 |
| 2.3 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结 |
| 攻读硕士期间发表论文及专利 |
| 致谢 |
（7）大肠杆菌L-苯丙氨酸工程菌株的构建及代谢调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 L-苯丙氨酸的概述 |
| 1.1.1 L-苯丙氨酸的性质 |
| 1.1.2 L-苯丙氨酸的应用及市场 |
| 1.1.3 L-苯丙氨酸的生产技术发展情况 |
| 1.2 L-苯丙氨酸工程菌研究概况 |
| 1.3 大肠杆菌中L-苯丙氨酸合成途径及其调节 |
| 1.3.1 中心代谢途径及其调节分析 |
| 1.3.2 共同途径及其调节分析 |
| 1.3.3 分支途径及其调节分析 |
| 1.4 增强大肠杆菌中L-苯丙氨酸合成的策略 |
| 1.4.1 增加前体物质PEP和E4P的供应 |
| 1.4.2 破除共同途径及分支途径的限速瓶颈 |
| 1.4.3 改造L-苯丙氨酸转运系统 |
| 1.4.4 去除竞争途径,避免碳代谢流分流 |
| 1.4.5 整体水平优化代谢网络 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 L-苯丙氨酸合成中心代谢途径的分子改造 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 菌株、质粒与引物 |
| 2.2.2 试剂与仪器 |
| 2.2.3 培养基配制 |
| 2.2.4 基因克隆 |
| 2.2.5 共表达质粒pQST(pQH-ppsA-tktA)的构建 |
| 2.2.6 酶活性检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 pQS及pQT质粒构建流程 |
| 2.3.2 共表达质粒pQST的构建流程 |
| 2.3.3 重组质粒的鉴定结果 |
| 2.3.4 SDS-PAGE蛋白电泳结果 |
| 2.3.5 酶活性测定结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 L-苯丙氨酸合成限速步骤的分子改造 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 菌株、质粒与引物 |
| 3.2.2 试剂与仪器 |
| 3.2.3 培养基配制 |
| 3.2.4 基因克隆 |
| 3.2.5 共表达质粒pQSTE(pQH-ppsA-tktA-pheA~(fbr))的构建 |
| 3.2.6 共表达质粒pQSTER(pQH-ppsA-tktA-pheA~(fbr)-tyrB)的构建 |
| 3.2.7 共表达质粒pQSTERO(pQH-ppsA-tktA-pheA~(fbr)-B-aroG~(fbr))的构建 |
| 3.2.8 酶活性检测 |
| 3.2.9 AroG~(fbr)及PheA~(fbr)抗反馈抑制能力检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 pQO、pQE及pQR质粒构建流程 |
| 3.3.2 共表达质粒pQSTE、pQSTER及pQSTERO的构建流程 |
| 3.3.3 重组质粒的鉴定结果 |
| 3.3.4 酶活性测定结果 |
| 3.3.5 AroG~(fbr)及PheA~(fbr)抗反馈抑制能力检测结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 L-苯丙氨酸转运系统的分子改造及工程菌发酵 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 菌株、质粒与引物 |
| 4.2.2 试剂与仪器 |
| 4.2.3 培养基配制 |
| 4.2.4 NST74菌株aroP基因的敲除 |
| 4.2.5 pQD(pQH-yddG)质粒的构建 |
| 4.2.6 共表达质粒pQSTEROD(pQH-ppsA-tktA-pheA~(fbr)-tyrB-aroG~(fbr)-yddG)的构建 |
| 4.2.7 工程菌的筛选 |
| 4.2.8 工程菌NST74△P(pQSTEROD)的发酵 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 aroP基因的敲除流程 |
| 4.3.2 NST74△P敲除菌鉴定结果 |
| 4.3.3 pQD质粒构建流程 |
| 4.3.4 共表达质粒pQSTEROD的构建流程 |
| 4.3.5 重组质粒的鉴定结果 |
| 4.3.6 工程菌的筛选结果 |
| 4.3.7 工程菌株NST74△P(pQSTEROD)的发酵结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 高抗反馈抑制能力aroG基因的构建 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 菌株、质粒与引物 |
| 5.2.2 试剂与仪器 |
| 5.2.3 培养基配制 |
| 5.2.4 pwtAG(pMD18T-aroG~(wt))质粒的构建 |
| 5.2.5 aroG~(fbr)单位点突变体的复原 |
| 5.2.6 aroG~(fbr)双位点突变体的构建 |
| 5.2.7 pQG系列质粒的构建 |
| 5.2.8 pQSTERG系列共表达质粒的构建 |
| 5.2.9 AroG~(fbr)突变体表达情况检测 |
| 5.2.10 突变体酶活性检测 |
| 5.2.11 突变体抗反馈抑制能力检测 |
| 5.2.12 突变体实际发酵能力检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 aroG~(fbr)突变体构建流程 |
| 5.3.2 aroG~(fbr)突变体的测序验证及序列分析结果 |
| 5.3.3 aroG~(fbr)突变体表达情况检测结果 |
| 5.3.4 不同突变体酶活性和抗反馈抑制能力的比较 |
| 5.3.5 不同突变体实际发酵能力的比较 |
| 5.4 本章小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
（8）大肠杆菌高产色氨酸菌株的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 L-色氨酸的理化性质 |
| 1.2 L-色氨酸的应用 |
| 1.3 L-色氨酸的生产方法 |
| 1.4 L-色氨酸的产业现状及其发展前景 |
| 1.5 大肠杆菌中L-色氨酸的合成路径及调节机制 |
| 1.6 L-色氨酸高产工程菌的构建策略 |
| 1.7 L-色氨酸发酵液中氨基酸的含量测定 |
| 1.8 论文的立题意义 |
| 第二章 利用Red重组法构建大肠杆菌trpR基因敲除菌 |
| 2.1 基因敲除方式 |
| 2.2 基因敲除的选择标记 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.4 试验方法 |
| 2.5 结果及讨论 |
| 第三章 大肠杆菌突变体库菌株的发酵 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.4 摇瓶发酵 |
| 3.5 结果及讨论 |
| 结论 |
| 第四章 操纵子trpABCDE和aroG、serA基因的共表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.4 摇瓶发酵 |
| 4.5 结果及讨论 |
| 论文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文目录 |
（9）L-色氨酸生产菌株的构建及代谢调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 L-色氨酸的理学性质和应用 |
| 1.2 L-色氨酸的生产方法 |
| 1.3 L-色氨酸的微生物合成机制 |
| 1.3.1 微生物合成L-色氨酸的代谢途径 |
| 1.3.2 微生物合成L-色氨酸的调控机制 |
| 1.4 增强L-色氨酸合成的代谢调控策略 |
| 1.4.1 抗反馈抑制作用酶的筛选 |
| 1.4.2 共同途径及色氨酸分支途径的改造 |
| 1.4.3 中心代谢途径的改造 |
| 1.4.4 转运途径的改造 |
| 1.5 L-Trp 前体物合成的代谢调控策略 |
| 1.6 本论文的主要研究内容 |
| 1.6.1 立题依据和研究意义 |
| 1.6.2 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 AroF 和TrpED 抗反馈抑制突变体的构建及阻遏蛋白基因trpR 的敲除 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 |
| 2.2.4 分子生物学操作 |
| 2.2.5 表达载体pSV 的构建 |
| 2.2.6 AroF 抗反馈调节突变体的构建 |
| 2.2.7 TrpED 抗反馈调节突变体的构建 |
| 2.2.8 trpR 基因的敲除 |
| 2.2.9 酶活性检测 |
| 2.2.10 SDS-PAGE 分析 |
| 2.2.11 质粒稳定性验证 |
| 2.2.12 发酵参数的测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 原核表达载体pSV 的构建 |
| 2.3.2 aroF 抗反馈调节突变基因的构建及表达 |
| 2.3.3 trpED 抗反馈调节突变基因的构建及表达 |
| 2.3.4 重组质粒对大肠杆菌发酵生产色氨酸的影响 |
| 2.3.5 trpR 基因敲除菌FB-01 的构建 |
| 2.3.6 工程菌FB-01/pSV04 的补料分批发酵 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 大肠杆菌色氨酸分解途径和竞争途径的改造 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 试剂与仪器 |
| 3.2.3 重组大肠杆菌的培养 |
| 3.2.4 分子生物学操作 |
| 3.2.5 发酵参数的测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 tnaA 基因敲除菌FB-02 的构建 |
| 3.3.2 工程菌FB-02/pSV04 的补料分批发酵 |
| 3.3.3 pheA 基因敲除菌FB-03 的构建 |
| 3.3.4 工程菌FB-03/pSV04 的补料分批发酵 |
| 3.3.5 tyrA 基因敲除菌FB-04 的构建 |
| 3.3.6 工程菌FB-04/pSV04 的补料分批发酵 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 大肠杆菌色氨酸转运系统的改造 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 试剂与仪器 |
| 4.2.3 重组大肠杆菌的培养 |
| 4.2.4 分子生物学操作 |
| 4.2.5 发酵参数的测定 |
| 4.2.6 色氨酸吸收活性的测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 mtr 基因敲除菌FB-T1 的构建 |
| 4.3.2 tnaB 基因敲除菌FB-T2 的构建 |
| 4.3.3 aroP 基因敲除菌FB-T3 的构建 |
| 4.3.4 色氨酸吸收系统基因敲除对大肠杆菌色氨酸吸收活性的影响 |
| 4.3.5 色氨酸吸收系统基因敲除对菌体生长的影响 |
| 4.3.6 色氨酸吸收系统基因敲除对菌体发酵生产色氨酸的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 大肠杆菌色氨酸操纵子的改造及表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 试剂与仪器 |
| 5.2.3 重组大肠杆菌的培养 |
| 5.2.4 分子生物学操作 |
| 5.2.5 重组质粒pSV-aroF~(fbr)-trpE~(fbr)DCBA 的构建 |
| 5.2.6 发酵参数的测定 |
| 5.2.7 菌株传代稳定性验证 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 色氨酸操纵子的结构分析 |
| 5.3.2 前导肽trpL 10-118 位序列敲除菌 FB-L1 的构建 |
| 5.3.3 菌株 FB-L1 的前导肽trpL1 的二级结构分析 |
| 5.3.4 工程菌FB-L1/pSV04 的补料分批发酵 |
| 5.3.5 色氨酸操纵子trpEDCBA 的酶切位点分析 |
| 5.3.6 色氨酸操纵子trpE~(fbr)DCBA 的克隆 |
| 5.3.7 色氨酸操纵子trpE~(fbr)DCBA 在pSV04 中的表达 |
| 5.3.8 工程菌FB-T1/pSV05 的补料分批发酵 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 色氨酸合成代谢中间产物浓度的测定及代谢流分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株与质粒 |
| 6.2.2 试剂与仪器 |
| 6.2.3 重组大肠杆菌的培养 |
| 6.2.4 样品预处理 |
| 6.2.5 胞内代谢物的检测 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 大肠杆菌合成色氨酸的代谢网络 |
| 6.3.2 大肠杆菌色氨酸合成代谢胞内代谢物浓度的测定 |
| 6.3.3 大肠杆菌色氨酸合成代谢胞外代谢物浓度的测定 |
| 6.3.4 大肠杆菌色氨酸合成途径的代谢流量分布 |
| 6.3.5 大肠杆菌色氨酸合成代谢网络的流量分析 |
| 6.4 本章小结 |
| 6.5 附录：代谢产物的缩写及化学计量关系式 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（10）大肠杆菌苯丙氨酸生物合成的调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 图表清单 |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 质粒的构建 |
| 3.2 基因敲除 |
| 3.3 工程菌的构建 |
| 3.4 苯丙氨酸浓度测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基因敲除 |
| 4.2 重组质粒和工程菌的构建 |
| 4.3 苯丙氨酸产量分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、大肠杆菌tktA基因的克隆表达（论文参考文献）
- [1]大肠杆菌生产L-色氨酸重组菌株的改造及发酵条件优化[D]. 孟帅帅. 福建师范大学, 2020(12)
- [2]大肠杆菌L-苯丙氨酸工程菌株的构建[D]. 门佳轩. 天津科技大学, 2020(08)
- [3]类球红细菌高效合成辅酶Q10代谢机制研究[D]. 张君奇. 天津科技大学, 2019(07)
- [4]基因工程改造Pseudomonas chlororaphis GP72以提高2-羟基吩嗪产量[D]. 刘开泉. 上海交通大学, 2016
- [5]中心代谢途径改造对L-色氨酸合成的碳流偏转研究[D]. 路丽君. 江南大学, 2015(12)
- [6]生物酶法合成芳香族氨基酸研究[D]. 冯莹莹. 南京大学, 2015(01)
- [7]大肠杆菌L-苯丙氨酸工程菌株的构建及代谢调控研究[D]. 丁锐. 沈阳农业大学, 2014(08)
- [8]大肠杆菌高产色氨酸菌株的构建[D]. 陈荣庆. 浙江师范大学, 2014(02)
- [9]L-色氨酸生产菌株的构建及代谢调控研究[D]. 赵志军. 江南大学, 2011(06)
- [10]大肠杆菌苯丙氨酸生物合成的调控研究[D]. 刘艳华. 郑州大学, 2010(06)