一、伊氏锥虫不同株的表面变异糖蛋白分离、纯化及特性比较（论文文献综述）
郑丽莉[1]（2020）在《伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）全基因组的深入分析及抑制剂靶向关键酶的初步研究》文中进行了进一步梳理伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）是一种真核的单细胞血液鞭毛虫,寄生于几乎所有的脊椎动物体内,能通过蝇、虻作为媒介（vector）在动物之间传播,也可通过生食感染动物的肉和血经破损的黏膜组织直接传播。伊氏锥虫感染野生动物和家畜引起动物锥虫病,又称苏拉病（Surra）,该病广泛分布于热带和亚热带地区。近年来,也有伊氏锥虫感染人的报道,提示伊氏锥虫具有成为人兽共患寄生虫病病原的可能性。目前对该病的有效防治手段较少,其对畜牧业和野生动物的危害仍然严重。伊氏锥虫利用其体表变异的表面糖蛋白（VSG）逃避宿主的免疫识别,深入解析该病原的分子生物学特性是建立有效防治措施的理论依据。伊氏锥虫的近缘物种布氏锥虫（Trypanosoma brucei）的基因组数据为伊氏锥虫和布氏锥虫的比较基因组学研究提供了良好的基础。伊氏锥虫的20 S蛋白酶体（20 S Proteasome）和磷酯酰肌醇3-激酶（PI3K）参与蛋白质降解途径和PI3K-AKT信号通路,抑制这两种酶的活性能够影响虫体生长发育和凋亡,二者有望成为潜在的新药靶标。本研究利用三代PacBio SMART测序平台,构建伊氏锥虫的270 bp和20 Kb两个文库,进行了伊氏锥虫全基因组测序,同时利用二代Illumina HiSeq 4000平台进行伊氏锥虫转录组测序和小RNA测序以辅助基因组数据分析。随后对伊氏锥虫的基因组进行深入分析与解析,从基因组共线性分析、基因的表达调控和其他与病原性相关的重要基因的角度分别进行深入阐述。最后以组学分析结果为基础,通过添加酶的抑制剂PS-341和AS-605240,研究20 S Proteasome和PI3K蛋白质对伊氏锥虫的生长发育和虫体凋亡的影响,以筛选出适宜新药物开发的靶向关键酶。分析结果表明,伊氏锥虫组装基因组大小为35.2 Mb,基因组GC含量为45.2%,Scaffold N50为608 Kb,预测到8636个基因,其中蛋白质编码基因为8617个;所有基因中,6511个基因为单外显子基因,其余2125个基因仅含有一个内含子。共线性分析表明,伊氏锥虫有96.57%的scaffold与布氏锥虫的88.97%相一致,表明二者基因序列具有很大的相似性;伊氏锥虫具有11条巨大染色体,与布氏锥虫的基因组相比,在5号、11号染色体端粒区域有部分序列缺失,主要为VSG基因和ESAG基因。与布氏锥虫不同,伊氏锥虫共有820个基因发生了共1641个可变剪接事件,其中绝大多数为内含子保留形式（intron retention）,说明其蛋白质的多态性主要通过基因表达后的选择性剪接来实现。另外,伊氏锥虫编码的变异表面糖蛋白VSG的基因数量为399个,远少于布氏锥虫的1496个,缺乏的部分为数量庞大的假基因,而布氏锥虫基因组中的假基因能够通过拼接重组的方式形成功能性的嵌合VSG基因,以增加抗原变异的种类,伊氏锥虫这部分VSG假基因的缺失说明其缺乏在抗原变异中通过假基因嵌合形成的更多功能性VSG。在其他方面,伊氏锥虫的miRNA和参与GPI锚定位点通路的基因都相对保守,伊氏锥虫和布氏锥虫在二者上没有明显差异。与其他锥虫不同的是,伊氏锥虫的转录因子TF和RNA结合蛋白质RBP都更加保守。对伊氏锥虫的20 S蛋白酶体α6亚基和PI3K蛋白质进行生物信息学分析,发现伊氏锥虫的20 S蛋白酶体参与Proteasome途径,氨基酸序列在锥虫属中相对保守,且含有保守的蛋白酶体识别标志和功能域;PI3K参与PI3K-Akt信号通路,氨基酸序列内无跨膜区和信号肽,具有典型的PI3K C 2 domain保守功能域,两种蛋白质的功能均与虫体生长、发育和凋亡相关。在体外培养的伊氏锥虫中添加20 S蛋白酶体抑制剂PS-341和PI3Kγ抑制剂AS-605240,结果发现虫体活力在48 h即被明显抑制,72 h后虫体基本死亡;信号通路中两种酶的下游基因表达量均有所降低;通过流式细胞仪检测发现两种抑制剂能够诱导虫体凋亡,且对虫体早期凋亡影响较大。总之,利用三代基因组测序技术结合多组学生物信息学分析,研究获得了完整的伊氏锥虫基因组数据,鉴定出大量基因转录前和转录后的表达调控因子。通过大规模的共线性分析和比较基因组学分析,发现了伊氏锥虫和布氏锥虫某些重要的生物学特征。以组学分析为依据,鉴定到两个能够诱导虫体凋亡的关键酶20 S Proteasome和PI3K,并进行了以二者作为药物靶点的初步研究。该基因组信息的发布为研究寄生虫的致病机制提供了坚实的分子基础,两个抑制剂靶向关键酶的初步探索为开发锥虫病新药物和疗法提供了新思路。
张凯[2]（2018）在《伊氏锥虫TatD-like DNase功能研究》文中进行了进一步梳理伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）是一种常见的通过虫媒传播的寄生原虫,是家畜伊氏锥虫病（或苏拉病）的病原。该寄生虫主要寄生于马、骡、骆驼、牛等多种动物的血液当中,能引起动物的消瘦、贫血、神经症状,严重的会引起动物死亡,给畜牧养殖业带来巨大的经济损失。此外,也有伊氏锥虫感染人的报道,表明伊氏锥虫是一种潜在的人兽共患病病原。伊氏锥虫有比较完备的免疫逃避机制,最典型的是通过不断的改变体表的主要毒力因子变异表面糖蛋白（variable surface glucoprotein,VSG）从而逃避宿主的特异性免疫。也正因为这种免疫逃避机制的存在,导致现有的针对伊氏锥虫病的特异性疫苗效果欠佳,亟待我们发现一种新的途径防治伊氏锥虫病。近几年在细菌学研究方面发现,很多病原菌通过分泌DNA酶降解宿主免疫细胞（如巨噬细胞、嗜中性粒细胞等）释放出来的DNA外捕网达到在宿主体内扩散的目的。本课题组以往研究发现,寄生虫感染的宿主能产生细胞外捕网（Extracellular Traps,ETs）捕获侵染的寄生虫,而寄生虫通过分泌脱氧核糖核酸水解酶（deoxyribonuclease,DNase）起到水解DNA外捕网的作用。更为重要的是,以疟原虫DNA水解酶作为抗原免疫动物可以达到很好的免疫保护效果。我们推测伊氏锥虫同样能够产生DNA水解酶逃避宿主的天然免疫。本课题的目的是通过分析伊氏锥虫DNA酶的生物学特征及表达的时空特征,确定其在虫体与宿主相互作用中发挥的功能。我们首先利用生物信息学对伊氏锥虫潜在的水解宿主DNA的靶序列进行了分析,得到了两个与TatD脱氧核糖核酸酶（TatD-like DNase）相关的DNA酶序列,即:TatD-like DNase1005及TatD-like DNase-1155。其次,利用qPCR方法比较分析了伊氏锥虫T.evansi 805和T.evansi YNB虫株在体外培养条件下和在动物体内,两个目的基因的转录水平。结果表明,在动物体内寄生的虫株TatD-like DNase 1155和TatD-like DNase 1005基因的转录水平显着高于在体外培养的虫株,而且这两个基因在T.evansi 805虫株的转录水平显着高于T.evansi YNB虫株的转录水平。其次,运用间接免疫荧光（IFA）定位出这两种蛋白质主要分布于虫体鞭毛及细胞膜周围。最后,对这两种重组蛋白质的生物化学特性分析发现这两种蛋白质都是具有水解功能的二价金属依赖性的脱氧核糖核酸酶。本实验已经初步验证了伊氏锥虫TatD-like DNase的分布及体外水解功能,为进一步研究伊氏锥虫通过水解细胞外捕网实现免疫逃避的机制提供实验依据。
黄甜[3]（2015）在《牛伊氏锥虫病胶体染料免疫层析诊断试纸条的研制及初步应用》文中研究指明伊氏锥虫病是由伊氏锥虫（Trypanosoma evnsi）寄生在家畜血液内而引起的一种原虫病,宿主范围很广,对宿主的危害很大,如有引起宿主死亡的急性经过,有致使宿主生育能力下降、身体条件普遍亏损、神经病变、免疫抑制、贫血和最终的死亡的慢性感染,这给畜牧业的发展带来严重影响。出现第一例人类感染此病的报道后,伊氏锥虫病不仅给畜牧业带来危害和经济损失,而且也给人类健康带来了隐患。目前,临床上常规诊断伊氏锥虫病的方法很多,如分血计离心技术（HCT）、卡片凝集试验（CATT）和ELISA等,但这些方法操作复杂、费时费力,还需要特殊的仪器设备,不适合用于现场诊断和大规模的临床检测。随着胶体金标记的发展,出现了免疫胶体金快速诊断试纸条的方法,弥补了这些缺陷。然而,胶体染料在免疫标记方面得到应用后,展现出了比胶体金更好的选择优势,如成本更低,更易获得,稳定性更好,保存期限更长等。本研究尝试应用胶体染料标记技术及免疫层析技术,建立了一种新的检测伊氏锥虫病抗原的胶体染料免疫层析试纸条法。用国产分散艳蓝2BLN染料制备胶体染料,在最适染料溶液环境下,来标记纯化过的抗伊氏锥虫OB6单抗,在NC膜的检测区（T线）和质控区（C线）分别包被抗伊氏锥虫的单抗TB7或OB6和羊抗鼠IgG二抗,经过多次试验测试及各方面条件优化,成功建立了伊氏锥虫病胶体染料免疫层析诊断试纸条的方法。经敏感性试验,该试纸条对伊氏锥虫VSG抗原的最低检出限1.05 μg/ml;与弓形虫抗原,巴贝斯虫抗原,衣原体抗原、大片吸虫ES抗原之间均无抗原交叉反应;用胶体染料试纸条、胶体金试纸条和夹心ELISA法对25份阳性血清和50份阴性血清进行检测,其准确率依次为88%、86.7%、96%,胶体染料试纸条与胶体金试纸条两者之间的符合率达98.5%,胶体染料试纸条与夹心ELISA法两者之间的符合率为91.7%。应用本研究研制的胶体染料试纸条,对来自广西百色和河池地区共344份牛血清进行初步检测,阳性率为11.63%,与胶体金试纸条和夹心ELISA的阳性符合率分别是90.70%和83.33%。由此表明建立的胶体染料试纸条法可靠、灵敏、特异,而且还简便、快速、稳定性很好、适用于大规模的临床检测。本方法的建立为牛伊氏锥虫病的诊断和防治提供了另一种低成本的、更稳定的、新的有效方法。
李三强,席守民,马灵筠[4]（2009）在《锥虫疫苗研究的现状及展望》文中进行了进一步梳理
熊丽[5]（2009）在《伊氏锥虫优势变异体ShTat1.2VSG基因的表达和在诊断上的应用》文中进行了进一步梳理伊氏锥虫是一种寄生于脊椎动物造血脏器和血液中的血鞭毛原虫,广泛流行于我国江苏、浙江、安徽、云南、贵州、广东、广西、新疆等20多个省、市、自治区,动物血清学调查平均阳性率高达5%～20%,有的地方耕牛感染率高达64.47%,急性者死亡率很高。严重危害家畜健康和影响畜牧业发展。目前,以虫体可溶性抗原为诊断抗原的免疫学检测技术,由于受到伊氏锥虫抗原变异的影响,检测结果不稳定,容易出现假阴性,亟待发展结果重复性好、灵敏高效新型免疫学检测诊断技术。研究表明,ShTat1.2是伊氏锥虫安徽株优势抗原变异体,在不同地理株以及不同宿主的感染早期出现,作为主要表面抗原,其表面变异糖蛋白（VSG）在免疫诊断上潜力还没有研究。本研究成功构建了伊氏锥虫ShTat1.2的VSG的重组表达质粒p GEX-4T-1/ShTat1.2VSG,并转化到表达菌BL21中,经IPTG诱导后,表明ShTat1.2 VSG可以在原核表达系统中高效表达,应用GST融合蛋白纯化系统,可获得纯化的目的蛋白。Westten blot分析显示,表达的重组蛋白可被十二株伊氏锥虫血清识别,表明重组蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。比较了重组表达的VSG和ShTat1.2变体锥虫粗抗原,作为间接ELISA包被抗原对12份不同地理株伊氏锥虫阳性血清、12份阴性血清检测结果。经显着性差异分析,结果表明,重组ShTat1.2 VSG蛋白具有较好的免疫诊断特异性和敏感性,具有应用于ELISA诊断伊氏锥虫病的价值。伊氏锥虫安徽株变异表面糖蛋白ShTat1.2 VSG的成功表达,以及伊氏锥虫重组蛋白ShTat1.2 VSG间接ELISA诊断技术的建立,为优势变异体的VSG作为伊氏锥虫病免疫诊断抗原的应用提供了依据。
何木荣,曾小飞,陈汉忠,李晓栩,唐大运,白波,吴桂贤[6]（2009）在《水牛伊氏锥虫间接ELISA检测方法的建立》文中研究指明利用伊氏锥虫的优势变异型虫体作为可溶性抗原,通过试验研究和条件优化,建立了一种水牛伊氏锥虫间接ELISA方法。测试结果表明,该法灵敏度高,特异性强,对实验感染样本的检测获得了较好的效果,为一种有效的ELIAS方法,为广西水牛伊氏锥虫病的诊断奠定了技术基础。
何木荣,王祥生,陈汉忠,曾小飞,李晓栩,张居作[7]（2008）在《伊氏锥虫抗原变异型及其优势代表变异体的分离鉴定》文中认为以连续克隆分离的方法,从1株水牛伊氏锥虫中分离到40个克隆群体,从中分离鉴定出18个抗原变异型。经间接免疫荧光试验检测,发现其中2个抗原变异型（即HbTat1.18和HbTat1.15）分别能与约80%和60%克隆群体的血清发生较强的阳性反应,初步确定这2个抗原变异型为该虫株的优势代表变异体。这为伊氏锥虫免疫预防、免疫诊断、分子诊断以及遗传进化等的研究奠定了良好的基础。
王玺[8]（2008）在《建立于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学研究》文中进行了进一步梳理利用18S rRNA基因序列分析方法,对我国的湖北、广西、新疆和浙江四省的伊氏锥虫及一株布氏锥虫进行分子分类学研究。用分离的锥虫感染实验动物,自感染小鼠的全血中提取基因组DNA,根据GenBank中己发表的锥虫18S rRNA序列设计一对锥虫通用引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pGEM-Teasy载体中,经酶切PCR确定,进行序列测定,结果显示锥虫七个分离株的18S rRNA基因大小为2188bp左右。利用DNAStar对实验所获得的七株锥虫18SrRNA基因序列与GenBank中部分锥虫的18S rRNA基因进行比较分析,建立两个进化系统发生树。结果发现自我国湖北省、广西省、新疆省以及浙江省分离的伊氏锥虫和一株布氏锥虫病原的18S rRNA基因序列有着明显一致性,核苷酸同源性比较及系统发生树显示:自我国上述四省分离的伊氏锥虫来源于同一株系。布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株核苷酸碱基与其他分离的锥虫株仅有较小差异。与国外的6株锥虫的同源性为99%～100%,与另外7株的同源性为62%。
何木荣[9]（2007）在《伊氏锥虫ELISA方法的建立及广西水牛伊氏锥虫感染的初步调查》文中研究表明伊氏锥虫病是一种有广泛寄主的动物原虫病，所有哺乳动物都易感。在我国南方主要感染牛（特别水牛），大多数牛感染伊氏锥虫后能直接引起个体的急性死亡或隐性感染，造成贫血，进行性消瘦、死胎、流产，泌乳减少等。是我国畜牧业特别是养牛业的一大障碍。由于虫体频繁的抗原变异，至今没有成功的疫苗问世。所以该病的控制还是以药物为主。但由于该病在牛体内大多呈慢性经过，虫血症起伏，难于及早发现。所以采用合适的监测方法及早进行诊断和对畜群进行血清学预测，才能及早用药，及时控制该病的扩散。本试验首先用伊氏锥虫湖北水牛单克隆虫株107条耳静脉感染1只新西兰大白兔，每三天采血分离一个锥虫群体并进行单虫克隆，最后一个未克隆群体再感染另一只兔子，同上方法收集变异体，依次感染四只兔子，共收集到40个锥虫克隆群体。同时制备相应的40个抗锥虫单价血清。将40个克隆群体与40个抗血清进行IFA交叉血清学检测，鉴定为19个不同的抗原变异型。经IFA试验检测筛选到两个变异体HbTat1.18和HbTat1.15能与多数异源克隆锥虫血清反应产生较强的蓝绿色荧光。利用混合蛋白酶抑制剂结合超高速逐级离心的方法成功分离、纯化了一株变异体HbTat1.18的表面糖蛋白（VSG）。经SDS-PAGE电泳分析所提VSG较纯，分子大小约为63.5KD。利用经IFA鉴定的变异型HbTat1.18潜在的特殊抗原性，提取HbTat1.18的可溶性抗原作为包被抗原，建立了检测伊氏锥虫抗体的间接ELISA方法，并对ELISA的反应条件进行了探索，确定抗原的最适包被浓度为2.59μg／ml，检测血清稀释为400倍稀释，血清与抗原的最佳反应时间为1.5h，酶标二抗最佳作用时间为1h，底物的最佳显色时间为20min。采用已确立的ELISA反应条件，检测了26份已检测判定为阴性的水牛血清。依据阴阳临界值=阴性血清OD平均值+3SD，确定阴阳临界值为0.227。用此方法检测包被的抗原不与在牛感染率高的片形吸虫的阳性血清发生交叉反应，对实验感染的水牛抽测的16份血清多次测定100％呈阳性，对8份阴性血清多次测定100％呈阴性，初步认为该ELISA方法具有良好的特异性。应用建立的ELISA方法观察了实验感染伊氏锥虫水牛的抗体消长情况以及对广西部分地区的水牛进行了血清流行病学的初步调查。对采自广西部分地区的79份水牛血清的检测，结果有23份呈阳性，阳性率达29.1％。本试验筛选到有特殊抗原性的变异体HbTat1.18和HbTat1.15，其中用变异型HbTat1.18的可溶性蛋白作包被抗原成功建立了检测伊氏锥虫抗体的间接ELISA方法。应用该法对广西部分地区水牛伊氏锥虫血清进行流行病学的初步调查，证明伊氏锥虫病在广西仍然流行，而且水牛伊氏锥虫感染率较高，应引起有关部门的注意，做好我区水牛伊氏锥虫病的检测和防控工作，以确保我区水牛生产的健康快速发展。
顾泽茂[10]（2007）在《鱼类锥虫分类与系统发育研究》文中提出锥虫是一类寄生于所有脊椎动物血液中的鞭毛类原生动物。在自然条件下,锥虫经吸血水蛭传播广泛寄生于各种海水和淡水鱼类,但鱼类锥虫的分类和系统发育关系并不清楚。本论文以中国鱼类锥虫为主要研究对象,采用形态学和分子数据相结合的方法,厘定了我国部分鱼类锥虫,研究了鱼类锥虫的分类及系统发育关系。为获得纯净的虫体用于分子系统学研究,本论文还探索了鱼类锥虫的分离技术。其主要研究结果和结论如下:1.含锥虫黄鳝血液在pH7.4的51%Percoll分离液作用下,经2.9×103 rpm离心15 min后,除去大部分血细胞,然后通过DEAE-纤维素层析柱,获得纯化的鳝锥虫。此法具有较高的灵敏性,还可以作为鳝锥虫病诊断和流行病学研究的手段之一。2.首次采用重组气溶素蛋白分离血液内锥虫。分离的锥虫用PGSS重悬,在4°C可存活3-4天,与未用气溶素作用的血液中锥虫存活时间相当,表明重组气溶素蛋白对锥虫没有毒害作用。3.选用13个形态特征值对寄生乌鳢和沙塘鳢的锥虫进行了光学显微镜的形态学分析,通过与相似种比较鉴定,将这些锥虫暂定为鳢锥虫。沙塘鳢作为新记录寄主第一次被发现和报道。4.通过光学显微镜观察了寄生牛山湖鳜鱼的锥虫。这种锥虫与前人描述的鳜锥虫具有很大的形态学相似性,暂定为鳜锥虫。选用13个形态特征值对鳜锥虫进行了形态学再描述及与相似种的比较。同时,比较了鳜锥虫与相似种18S rRNA基因序列的相似性,并在构建的分子系统系统发育树中确定了鳜锥虫的位置。5.寄生黄颡鱼和鲤鱼的锥虫都被认为是黄颡锥虫。通过现行形态学标准分析发现,寄生牛山湖黄颡鱼的锥虫有两种形态:Trypanosoma sp Pseudobagri和T. sp,寄生鲤鱼的有一种形态T. sp Carpio,而且三形态种的形态特征值差异很大。T. sp Carpio与鳜锥虫不仅形态学特征十分相似,而且18S rDNA序列的相似性也极高（99.99%）,在分子系统发育树中,二者聚成一枝,形成姊妹群,因此,二者可能是同一种类。T. sp Pseudobagri为第一次发现的形态种,与Marv克隆株锥虫的18S rDNA序列相似性为99.8%,在系统树中聚成姊妹群,怀疑二者可能是同一基因种。T. sp处于在系统发育树中处于鱼类锥虫枝的最底部,且与其他鱼类锥虫的18S rDNA序列差异达到3.5-5.8%,暂定为黄颡锥虫。以上结果也表明鱼类锥虫没有严格的宿主特异性。6.利用透射电镜观察了黄颡锥虫的超微结构,发现锥虫表膜是一种三层结构的单位膜,外覆盖着一层糖蛋白的外套。鞭毛、鞭毛与身体黏附区及外周微管与其他锥虫的相似。在电镜图片中,动核、胞核、线粒体及空泡等细胞内含物均被观察到。但超微结构的异同在锥虫的进化关系研究是否具有重要意义并不确定。7.以18S rRNA基因为分子标记进行了鱼类锥虫的系统发育分析,系统树中引入了7个我国鱼类锥虫的18S rDNA序列。所有的鱼类锥虫聚成一枝,海水鱼类锥虫与淡水鱼类锥虫形成姊妹关系。我国鱼类锥虫内分两个群。
二、伊氏锥虫不同株的表面变异糖蛋白分离、纯化及特性比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、伊氏锥虫不同株的表面变异糖蛋白分离、纯化及特性比较（论文提纲范文）
（1）伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）全基因组的深入分析及抑制剂靶向关键酶的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 伊氏锥虫概述 |
| 1.1.1 伊氏锥虫的病原学和流行病学 |
| 1.1.2 锥虫的基因组学研究进展 |
| 1.1.3 伊氏锥虫与布氏锥虫生物学特征的差异 |
| 1.2 伊氏锥虫的基因表达调控 |
| 1.2.1 可变剪接 |
| 1.2.2 RNA结合蛋白质 |
| 1.3 伊氏锥虫针对宿主特异性免疫的逃避机制 |
| 1.4 伊氏锥虫蛋白质降解的关键酶——20 S蛋白酶体 |
| 1.4.1 20S蛋白酶体CP的结构和功能 |
| 1.4.2 19S蛋白酶体RP的结构和功能 |
| 1.4.3 锥虫的20 S蛋白酶体 |
| 1.4.4 蛋白酶体抑制剂 |
| 1.5 磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K) |
| 1.5.1 PI3K的分类 |
| 1.5.2 IA型 PI3K信号通路 |
| 1.5.3 PI3K抑制剂的研究进展 |
| 第二章 伊氏锥虫的基因组、转录组和小RNA测序初步分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫株和小鼠 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 伊氏锥虫克隆群体的建立 |
| 2.2.2 虫体纯化 |
| 2.2.3 基因组DNA的抽提 |
| 2.2.4 总RNA的提取 |
| 2.2.5 基因组测序及基因组大小Survey评估 |
| 2.2.6 基因组组装与二代数据的评估分析 |
| 2.2.7 基因组注释 |
| 2.2.8 基因家族鉴定和系统发育树构建 |
| 2.2.9 二代转录组测序 |
| 2.2.10 小RNA测序和注释 |
| 2.2.11 荧光定量PCR验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 基因组survey结果 |
| 2.3.3 转录组测序结果及qPCR验证 |
| 2.3.4 小RNA测序结果及qPCR验证 |
| 2.3.5 基因组测序,组装和注释结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 伊氏锥虫全基因组的深入分析与解析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 基因组共线性分析 |
| 3.2.2 可变剪接的鉴定 |
| 3.2.3 转录因子的鉴定 |
| 3.2.4 病原学相关基因的鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 伊氏锥虫与布氏锥虫具有基因组共线性 |
| 3.3.2 伊氏锥虫基因表达受转录前和转录后调控 |
| 3.3.3 病原学相关基因的鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 伊氏锥虫Proteasomeα6和PI3K的生物信息学分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.2 基因和蛋白质序列 |
| 4.1.3 伊氏锥虫DNA |
| 4.1.4 引物序列 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.1.6 试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 蛋白质序列的获取 |
| 4.2.2 氨基酸保守功能域的分析 |
| 4.2.3 信号肽和跨膜区预测 |
| 4.2.4 蛋白质三级结构预测 |
| 4.2.5 多序列比对 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Proteasomeα6和PI3K氨基酸功能域的分析结果 |
| 4.3.2 Proteasomeα6和PI3K蛋白质结构预测结果 |
| 4.3.3 Proteasomeα6和PI3K氨基酸保守性分析结果 |
| 4.3.4 Proteasome和 PI3K/AKT信号通路分析结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 伊氏锥虫的20 S蛋白酶体 |
| 4.4.2 PI3K蛋白质 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 靶向关键酶的筛选及相关酶的抑制剂对伊氏锥虫的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验虫株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 试剂配制 |
| 5.2.2 伊氏锥虫的体外培养 |
| 5.2.3 虫体活力检测 |
| 5.2.4 收集虫体 |
| 5.2.5 c DNA制备 |
| 5.2.6 qPCR检测通路下游基因的表达 |
| 5.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 5.2.8 数据统计与分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 PS-341和AS-605240 降低虫体活力 |
| 5.3.2 PS-341和AS-605240 下调通路下游基因的表达量 |
| 5.3.3 PS-341和AS-605240 诱导细胞凋亡 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 抑制剂PS-341 对伊氏锥虫的影响 |
| 5.4.2 抑制剂AS-605240 对伊氏锥虫的影响 |
| 5.4.3 展望 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（2）伊氏锥虫TatD-like DNase功能研究（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 伊氏锥虫病概述 |
| 1.1.1 伊氏锥虫病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 致病机制 |
| 1.1.4 临床症状及病理变化 |
| 1.1.5 诊断治疗 |
| 1.2 伊氏锥虫免疫逃避机制 |
| 1.2.1 针对特异性免疫的逃避机制 |
| 1.2.2 针对非特异性免疫的逃避机制 |
| 1.3 TatD脱氧核糖核酸酶 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 TatD-like DNase蛋白质的生物信息学分析 |
| 2.1 方法 |
| 2.1.1 目的基因的序列分析 |
| 2.1.2 目的基因的分子进化分析 |
| 2.1.3 目的蛋白质的结构预测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 TatD-like DNase蛋白质的结构 |
| 2.2.2 锥虫属及其它病原DNase蛋白质进化关系分析 |
| 2.2.3 不同物种TatD-like DNase氨基酸序列比较 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 伊氏锥虫TatD-like DNase基因的原核表达、重组蛋白质的纯化及多克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 虫株、质粒及实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 伊氏锥虫纯化及cDNA的制备 |
| 3.2.2 原核表达载体的构建 |
| 3.2.3 TatD-like DNase重组蛋白质的表达及纯化 |
| 3.2.4 动物免疫 |
| 3.2.5 特异性抗体检测 |
| 3.2.6 多克隆抗体纯化及特异性检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 虫体总RNA的鉴定结果 |
| 3.3.2 TatD-like DNase基因重组质粒的鉴定结果 |
| 3.3.3 TatD-like DNase重组蛋白质纯化及检测结果 |
| 3.3.4 免疫血清及特异性IgG的纯化结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Tat D-like DNase蛋白质在伊氏锥虫的表达及定位 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要溶液的配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 TatD-like DNase基因转录水平分析 |
| 4.2.2 全虫蛋白质中TatD-like DNase的Westernblot鉴定 |
| 4.2.3 TatD-like DNase蛋白质在虫体的表达定位 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 TatD-like DNase基因转录水平结果 |
| 4.3.2 TatD-like DNase蛋白质的表达及定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 TatD-like DNase蛋白质的生物化学特性及功能分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 小鼠DNA的提取 |
| 5.2.2 Tat D-like DNase蛋白质的体外功能实验 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 小鼠DNA纯化结果 |
| 5.3.2 重组TatD-like DNase蛋白质的生物化学特性及功能分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间文章发表情况 |
（3）牛伊氏锥虫病胶体染料免疫层析诊断试纸条的研制及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 伊氏锥虫病 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 致病作用 |
| 1.1.5 临床症状 |
| 1.1.6 伊氏锥虫病的诊断 |
| 1.2 胶体染料免疫层析技术研究进展 |
| 1.2.1 胶体染料 |
| 1.2.2 胶体染料试纸条层析原理 |
| 1.2.3 胶体染料免疫诊断技术的优劣 |
| 1.2.4 胶体染料免疫技术的临床应用 |
| 1.2.5 胶体染料免疫技术在诊断伊氏锥虫病上的应用 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 伊氏锥虫VSG抗原及抗伊氏锥虫单克隆抗体的制备 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 伊氏锥虫虫株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂配制方法 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法步骤 |
| 2.2.1 伊氏锥虫VSG抗原的制备 |
| 2.2.2 VSG抗原的SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.2.3 VSG抗原的免疫胶体金试纸条鉴定 |
| 2.2.4 抗伊氏锥虫单抗的制备 |
| 2.2.5 单抗的质量鉴定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 VSG抗原及纯化后的单抗OB6、TB7的浓度 |
| 2.3.2 VSG抗原的鉴定 |
| 2.3.3 单抗亚型鉴定 |
| 2.3.4 单抗纯度鉴定 |
| 2.3.5 单抗效价测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 伊氏锥虫VSG抗原的制备 |
| 2.4.2 细胞培养 |
| 2.4.3 单抗的纯化 |
| 第三章 伊氏锥虫病胶体染料免疫层析诊断试纸条的研制 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 试剂配制 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法步骤 |
| 3.2.1 玻璃器皿的处理 |
| 3.2.2 胶体染料的制备 |
| 3.2.3 胶体染料的光密度测定 |
| 3.2.4 胶体染料稳定性试验 |
| 3.2.5 胶体染料标记抗体的条件选择 |
| 3.2.6 胶体染料标记单抗的制备 |
| 3.2.7 染料标记单抗活性鉴定 |
| 3.2.8 胶体染料试纸条的制备 |
| 3.2.9 试纸条质量检测 |
| 3.2.10 试纸条检测效果的评价与初步应用 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 胶体染料的光密度测定 |
| 3.3.2 胶体染料稳定性试验 |
| 3.3.3 胶体染料标记抗体的条件优化 |
| 3.3.4 染料标记单抗活性的鉴定 |
| 3.3.5 胶体染料试纸条的制备 |
| 3.3.6 试纸条的质量检测 |
| 3.3.7 胶体染料试纸条与胶体金试纸条、夹心ELISA法三者准确率、阳性符合率的评估 |
| 3.3.8 胶体染料试纸条的初步应用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 胶体染料免疫层析诊断试纸条的研制 |
| 3.4.2 胶体染料的制备 |
| 3.4.3 胶体染料标记抗体 |
| 3.4.4 胶体染料标记抗体活性鉴定 |
| 3.4.5 试纸条材料的选择 |
| 3.4.6 标记用单抗和检测线单抗的选择 |
| 3.4.7 胶体染料检测液的稀释倍数和检测样品的用量确定 |
| 3.4.8 胶体染料试纸条的结构 |
| 3.4.9 胶体染料试纸条与胶体金试纸条、夹心ELISA法准确率的评估及原因分析 |
| 3.4.10 胶体染料免疫层析诊断试纸条的初步应用 |
| 3.4.11 胶体染料试纸条存在的缺陷 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）锥虫疫苗研究的现状及展望（论文提纲范文）
| 1 锥虫表面抗原变异 |
| 2 不同类型的锥虫疫苗 |
| 2.1 减毒疫苗 |
| 2.2 虫体疫苗 Herbert |
| 2.3 亚细胞成分疫苗 |
| 2.3.1 利用锥虫变异表面糖蛋白制备疫苗 |
| 2.3.2 利用锥虫非变异抗原制备疫苗 |
| 2.4 其他类型的疫苗 |
| 3 展 望 |
（5）伊氏锥虫优势变异体ShTat1.2VSG基因的表达和在诊断上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 引言 |
| 1.1 锥虫和锥虫病的简介 |
| 1.2 锥虫的变异表面糖蛋白(VSG) |
| 1.3 目前伊氏锥虫病诊断研究进展 |
| 1.3.1 病原学检查 |
| 1.3.2 免疫学诊断 |
| 1.3.3 分子生物学诊断 |
| 1.4 优势变异体基因重组抗原作为伊氏锥虫病诊断抗原的研究进展与应用前景 |
| 1.5 伊氏锥虫病诊断技术展望 |
| 第二章 伊氏锥虫pGEX-4T-ShTat1.2VSG重组质粒的构建与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料和试剂 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 试验材料 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引入双酶切位点 |
| 1.2.1.1 引物的设计 |
| 1.2.1.2 PCR引入酶切位点 |
| 1.2.1.3 PCR产物的回收 |
| 1.2.2 表达重组质粒的构建 |
| 1.2.2.1 ShTat1.2VSG基因的双酶切 |
| 1.2.2.2 pGEX-4T-1空质粒双酶切 |
| 1.2.2.3 酶切产物的纯化 |
| 1.2.2.4 ShTat1.2VSG与pGEX-4T-1的连接 |
| 1.2.2.5 重组质粒阳性克隆的PCR鉴定 |
| 1.2.2.6 序列测定 |
| 1.2.2.7 重组质粒的提取 |
| 1.2.2.8 双酶切鉴定 |
| 1.2.3 重组质粒转入宿主菌BL21 |
| 1.2.4 SDS-PAGE电泳分析 |
| 1.2.5 诱导实相表达 |
| 1.2.5.1 蛋白表达形式分析 |
| 1.2.6 蛋白质纯化 |
| 1.2.7 特异性抗血清的制备 |
| 1.2.8 Western-blot分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 伊氏锥虫ShTat1.2基因序列全长测序结果 |
| 2.2 基因的原核表达 |
| 2.3 在大肠杆菌中的表达与其表达产物的纯化 |
| 2.4 蛋白浓度的测定 |
| 2.5 重组蛋与伊氏锥虫抗血清的Western-blot分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 伊氏锥虫ShTat1.2VSG基因 |
| 3.2 外源基因在E.coli中的表达 |
| 第三章 优势变异体重组抗原ShTat1.2VSG在诊断上的应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料和试剂 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 虫体复苏 |
| 1.2.2 伊氏锥虫ShTat1.2VSG的分离和纯化 |
| 1.2.3 ELISA方法和步骤 |
| 1.2.4 ELISA试验最佳试验条件的摸索与确定 |
| 1.2.4.1 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度选择 |
| 1.2.4.2 封闭时间的确定 |
| 1.2.4.3 血清样本作用时间的确定 |
| 1.2.4.4 酶标抗体工作浓度的选择和作用时间的确定 |
| 1.2.4.5 底物显色时间的确定 |
| 1.2.5 兔阴阳性血清阈值的确定 |
| 1.2.6 ShTat1.2VSG可溶性抗原与重组抗原ELISA检测十二株不同地理株系兔伊氏锥虫阳性血清 |
| 2 结果 |
| 2.1 可溶性抗原的浓度测定 |
| 2.2 ELISA试验最佳试验条件的摸索与确定 |
| 2.2.1 最佳抗原浓度和血清稀释度的选择 |
| 2.2.2 最佳封闭时间的确定 |
| 2.2.3 血清样本作用时间的确定 |
| 2.2.4 HRP-IgG工作浓度和时间的确定 |
| 2.2.5 底物作用时间的确定 |
| 2.3 临界值判定标准的确定 |
| 2.4 十二份不同地理株兔基因型伊氏锥虫的检测分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 可溶性VSG抗原的提纯 |
| 3.2 ELISA方法检测锥虫 |
| 3.3 伊氏锥虫优势变异体重组抗原检测伊氏锥虫病 |
| 第四章 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 附录D |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）伊氏锥虫抗原变异型及其优势代表变异体的分离鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 虫株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 单虫克隆虫株的制备 |
| 1.5 伊氏锥虫克隆虫株连续克隆群体的采集 |
| 1.6克隆群体的间接免疫荧光检测[10-11] |
| 1.6.1 伊氏锥虫的纯化 |
| 1.6.2 纯虫抗原涂片的制备 |
| 1.6.3 抗锥虫特异性抗血清的制备 |
| 1.6.4 间接免疫荧光试验 (IFA) |
| 2 结果 |
| 2.1 单虫克隆 |
| 2.2 抗原变异型的鉴定 |
| 2.3 优势代表变异体的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于单虫克隆 |
| 3.2 伊氏锥虫抗原变异体的数量 |
| 3.3 伊氏锥虫的抗原变异频率 |
| 3.4 伊氏锥虫的优势代表变异体 |
（8）建立于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 一 前言 |
| 二 文献综述 |
| (一)、国内外锥体科寄生原虫的分子分类学研究进展 |
| 1 我国主要锥虫虫种 |
| 1.1 伊氏锥虫 |
| 1.2 马媾疫锥虫 |
| 2 目前国内外针对于锥虫分类学的研究方法 |
| 3 锥虫的起源 |
| 4 锥虫的系统发育方式 |
| 5 锥虫的进化 |
| 6 国内以18S rDNA作为锥虫分类关系标准的研究进展 |
| 7 存在的问题及展望 |
| (二)、伊氏锥虫的诊断研究进展 |
| 1 病原学诊断 |
| 2 血清学诊断 |
| (三)、锥体科寄生原虫赖以生存的机制及其应用前景 |
| 1 免疫逃避机制 |
| 2 耐药性机制 |
| 3 抑制宿主细胞凋亡机制 |
| 4 锥体科寄生原虫生存机制的应用前景 |
| (四)、锥虫的疫苗研究进展 |
| 三 实验部分 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 虫体、菌种和质粒 |
| 1.1.2 酶和试剂 |
| 1.1.3 仪器与设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 虫体的分离 |
| 1.2.2 虫体总DNA的提取 |
| 1.2.2.1 虫体细胞的裂解 |
| 1.2.2.2 RNase的处理 |
| 1.2.2.3 蛋白质沉淀 |
| 1.2.2.4 DNA沉淀 |
| 1.1.2.5 DNA的水合作用 |
| 1.2.3 浓度与纯度的测定 |
| 1.3 目的片段的扩增与回收 |
| 1.3.1 引物的设计与合成 |
| 1.3.2 PCR扩增 |
| 1.3.2.1 PCR扩增体系 |
| 1.3.2.2 PCR扩增程序 |
| 1.3.3 PCR产物的回收 |
| 1.4 目的基因的克隆 |
| 1.4.1 目的片段与pGEM-T Easy载体的连接 |
| 1.4.2 感受态细胞的制备 |
| 1.4.3 连接产物的转化 |
| 1.5 重组质粒的提取与鉴定 |
| 1.5.1 重组质粒的提取 |
| 1.5.2 重组质粒的鉴定 |
| 1.5.3 重组质粒的测序确证 |
| 2 结果 |
| 2.1 锥虫18s rRNA的扩增及鉴定结果 |
| 2.1.1 锥虫18s rRNA PCR扩增结果 |
| 2.1.2 重组质粒的PCR鉴定结果 |
| 2.2 目标基因片段核苷酸序列对接及进化关系分析 |
| 2.3 论文涉及的锥虫18S rRNA基因在GanBank中的序号 |
| 3 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（9）伊氏锥虫ELISA方法的建立及广西水牛伊氏锥虫感染的初步调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文文摘 |
| 目录 |
| 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 病原学 |
| 3 伊氏锥虫变异规律 |
| 4 伊氏锥虫病的诊断学 |
| 实验研究之一 伊氏锥虫连续多变体的采集及IFA检测 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 虫株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 单虫克隆虫株的制备 |
| 2.2 伊氏锥虫单虫克隆虫株在4只兔子体内连续克隆群体的采集 |
| 2.3 伊氏锥虫的冷冻保存 |
| 2.4 伊氏锥虫特异抗血清及抗原涂片的制备 |
| 2.5 纯虫抗原涂片的制备 |
| 2.6 抗锥虫特异抗血清的制备 |
| 2.7 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 3 结果 |
| 3.1 单虫克隆 |
| 3.2 伊氏锥虫的冷冻保存 |
| 3.3 连续多变体的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 单虫克隆 |
| 4.2 伊氏锥虫冷冻保存 |
| 4.3 伊氏锥虫的抗原变异 |
| 实验研究之二 伊氏锥虫VSG的提纯与鉴定 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 虫株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 虫体的复苏 |
| 2.2 虫体的增殖 |
| 2.3 虫体的纯化 |
| 2.4 伊氏锥虫VSG抗原的提纯 |
| 2.5 牛源抗伊氏锥虫血清的制备 |
| 2.6 VSG的SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.7 Western-blot半干法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验研究之三 水牛伊氏锥虫间接ELISA诊断方法的建立 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 虫株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 伊氏锥虫纯化主要试剂及材料 |
| 1.4 ELISA材料与试剂 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 伊氏锥虫可溶性抗原的制备 |
| 2.2 伊氏锥虫可溶性蛋白浓度的测定 |
| 2.3 间接ELISA方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 可溶性抗原蛋白浓度的测定 |
| 3.2 可溶性抗原最佳稀释工作浓度的确定 |
| 3.3 阴阳参考血清与二抗的最佳稀释度的确定 |
| 3.4 阴阳性血清反应时间的确定 |
| 3.5 酶标二抗的作用时间 |
| 3.6 底物显色时间的确定 |
| 3.7 间接ELISA方法阴阳临界值的确定 |
| 3.8 间接ELISA特异性试验 |
| 3.9 血清样本的的初步检测 |
| 4 讨论 |
| 实验研究之四 水牛实验感染伊氏锥虫的抗体消长规律及广西水牛伊氏锥虫血清流行病学的初步调查 |
| 引言 |
| 1. 材料 |
| 1.1 伊氏锥虫克隆群体: |
| 1.2 KM小鼠 |
| 1.3 水牛 |
| 1.4 受检血清 |
| 1.5 ELISA相关试剂 |
| 1.6 主要设备仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 伊氏锥虫实验感染水牛 |
| 2.2 不同时期虫量计数 |
| 2.3 水牛实验感染血清的采集 |
| 2.4 临床样本的采集 |
| 2.5 间接ELISA检测方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同时间段伊氏锥虫虫体数量的监测 |
| 3.2 水牛实验感染伊氏锥虫的抗体消长 |
| 3.3 临床血清样本的检测 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间发表的论文情况 |
| 附录 |
（10）鱼类锥虫分类与系统发育研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 锥虫的形态特征 |
| 1.1.1 表膜（pellicle） |
| 1.1.2 细胞核（nucleus） |
| 1.1.3 动基体（kinetoplast） |
| 1.1.4 鞭毛（flagellum）和波动膜（undulating membrane） |
| 1.1.5 表面变异糖蛋白（variant surface glycoprotein 简称VSG） |
| 1.2 锥虫的生活史 |
| 1.3 鱼类锥虫的同质异形现象（pleomorphism) |
| 1.4 锥虫形态学研究历史及分类地位 |
| 1.5 分子系统发育及其方法 |
| 1.5.1 分子系统学诞生的背景 |
| 1.5.2 分子系统发育学的分子标记 |
| 1.5.3 分子系统发育学的研究方法 |
| 1.5.4 系统发育推断方法 |
| 1.6 锥虫分子系统发育的研究进展 |
| 1.6.1 锥虫的起源 |
| 1.6.2 锥虫的系统发育方式 |
| 1.6.3 锥虫的进化 |
| 1.7 鱼类锥虫分子系统发育研究现状 |
| 1.8 国内鱼类锥虫的研究现状 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 第二章 鱼类锥虫的分离 |
| 第一节 用Percoll 试剂和DEAE-纤维素层析柱分离纯化鳝锥虫 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.2.1 实验鱼 |
| 2.1.2.2 锥虫稀释缓冲液（PGSS） |
| 2.1.2.3 Percoll 分离液 |
| 2.1.2.4 层析洗脱缓冲液（PSG） |
| 2.1.2.5 含虫血样品制备 |
| 2.1.2.6 离心 |
| 2.1.2.7 过柱、洗脱 |
| 2.1.2.8 红细胞和锥虫计数 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.3.1 不同转速、不同时间离心对红细胞去除和锥虫存留的影响 |
| 2.1.3.2 用Percoll 试剂和DEAE-纤维素52 从自然感染鳝锥虫的黄鳝血液中分离锥虫 |
| 2.1.3.2.1 镜检结果 |
| 2.1.3.2.2 分离锥虫回收率 |
| 2.1.3.2.3 过柱锥虫回收率 |
| 2.1.4 讨论 |
| 第二节 重组气溶素分离鱼类锥虫 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.2.1 实验鱼 |
| 2.2.2.2 锥虫稀释缓冲液（PGSS） |
| 2.2.2.3 含虫血样品制备 |
| 2.2.2.4 离心 |
| 2.2.2.5 重组气溶素蛋白的制备 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 第三章 形态学再描述鳢锥虫（Trypanosoma ophiocephali Chen，1964)和在沙塘鳢的新记录 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 用形态学和分子数据再描述鳜锥虫（Trypanosoma siniperca Chang，1964） |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 样品采集 |
| 4.2.2 薄血片制作 |
| 4.2.3 虫体纯化 |
| 4.2.4 DNA 提取 |
| 4.2.5 185 rRNA 基因片段的扩增及回收 |
| 4.2.6 PCR 产物的连接和转化 |
| 4.2.7 阳性克隆检测和测序 |
| 4.2.8 185 rDNA 序列分析和排序 |
| 4.2.9 系统发育关系分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 形态学观察及种的鉴定 |
| 4.3.2 序列特征和系统发育分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 形态学和分子数据厘定黄颡锥虫（Trypanosoma pseudobagri Dogiel et Achmerov, 1959） |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 样品采集 |
| 5.2.2 薄血片制作 |
| 5.2.3 虫体纯化 |
| 5.2.4 DNA 的提取、185 rDNA 序列的扩增和测定 |
| 5.2.5 185 rDNA 序列分析和排序 |
| 5.2.6 系统发育关系分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 分类描述 |
| 5.3.2 分子鉴定 |
| 5.3.2.1 序列分析 |
| 5.3.2.2 系统发育分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 黄颡锥虫（Trypanosoma pseudobagri）超微结构的研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 样本收集 |
| 6.2.2 薄血片制作 |
| 6.2.3 虫体纯化 |
| 6.2.4 电镜样品制作 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 光镜观察 |
| 6.3.2 电镜观察 |
| 6.3.2.1 表膜、鞭毛及相关附属结构 |
| 6.3.2.2 动基体-线粒体 |
| 6.3.2.3 细胞核 |
| 6.3.2.4 细胞质内含物 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 鱼类锥虫的分子系统发育研究 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 样品采集 |
| 7.2.2 薄血片制作和形态学观察 |
| 7.2.3 虫体纯化及基因组DNA 的提取 |
| 7.2.4 18S rRNA 基因序列的扩增、纯化及测序 |
| 7.2.5 18S rRNA 基因序列分析和比对 |
| 7.2.6 系统发育分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 形态学描述 |
| 7.3.2 18S rRNA 基因部分序列 |
| 7.3.3 系统发育分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.4.1 形态学鉴定 |
| 7.4.2 鱼类锥虫的系统发育关系 |
| 7.4.3 中国淡水鱼类锥虫的系统发育位置 |
| 7.4.4 宿主特异性问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、伊氏锥虫不同株的表面变异糖蛋白分离、纯化及特性比较（论文参考文献）
- [1]伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）全基因组的深入分析及抑制剂靶向关键酶的初步研究[D]. 郑丽莉. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [2]伊氏锥虫TatD-like DNase功能研究[D]. 张凯. 沈阳农业大学, 2018(04)
- [3]牛伊氏锥虫病胶体染料免疫层析诊断试纸条的研制及初步应用[D]. 黄甜. 广西大学, 2015(01)
- [4]锥虫疫苗研究的现状及展望[J]. 李三强,席守民,马灵筠. 中国人兽共患病学报, 2009(08)
- [5]伊氏锥虫优势变异体ShTat1.2VSG基因的表达和在诊断上的应用[D]. 熊丽. 湖南农业大学, 2009(S1)
- [6]水牛伊氏锥虫间接ELISA检测方法的建立[J]. 何木荣,曾小飞,陈汉忠,李晓栩,唐大运,白波,吴桂贤. 动物医学进展, 2009(03)
- [7]伊氏锥虫抗原变异型及其优势代表变异体的分离鉴定[J]. 何木荣,王祥生,陈汉忠,曾小飞,李晓栩,张居作. 中国兽医科学, 2008(03)
- [8]建立于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学研究[D]. 王玺. 甘肃农业大学, 2008(09)
- [9]伊氏锥虫ELISA方法的建立及广西水牛伊氏锥虫感染的初步调查[D]. 何木荣. 广西大学, 2007(05)
- [10]鱼类锥虫分类与系统发育研究[D]. 顾泽茂. 中国科学院研究生院（水生生物研究所）, 2007(03)