一、肾型鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定（论文文献综述）
张琳婧[1]（2019）在《两株鸡传染性支气管炎病毒的分离、全基因组测序及其S1基因的克隆表达》文中研究指明鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）感染引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。由于IBV基因组易发生变异和重组,IBV的基因型和血清型复杂多样,且不同血清型间交叉保护性效果不理想。新基因型甚至新血清型不断出现,给IBV的有效防控带来了巨大困难。本研究从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群分离鉴定出2株IBV,并对其全基因组进了测序分析以及克隆表达了S1基因。为进一步了解丰富国内IBV流行株的重组变异情况,潜在的免疫逃逸机制以及疫苗毒株筛选依据等积累了数据。1、两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定本研究首先从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群采集发病鸡脏器进行鸡胚接种病毒分离。5天后发现接种两个肾脏样品的鸡胚出现典型的卷曲侏儒胚。但其尿囊液不具有血凝现象,以尿囊液提取的RNA反转录的cDNA为模版。用IBV的S基因特异性引物进行了 PCR扩增鉴定,PCR扩增以及序列测序表明能从两个尿囊液样品中扩增出IBV的S基因特异性片段,同时将分离到的这两个毒株分别命名为IBV34以及IBV216。应用DNAStar分析软件的Clustal W将克隆到的IBV34以及IBV216毒株S1基因分别与Gen Bank中国内外IBV参考毒株的S1基因进行序列比较和同源性分析发现IBV34以及IBV216毒株均属于QX型IBV。IBV34以及IBV 216毒株的S1基因与QX型的LX4毒株同源性分别高达95.5%以及95.4%。值得注意的是,与IBV34毒株以及Gen Bank中其它国内外IBV的S1基因不同,IBV 216毒株的S1基因缺了 12个碱基。从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV 216毒株对进一步探究IBV免疫逃逸机制提供了材料。2、两株鸡传染性支气管炎病毒的全基因组测序与分析为进一步分析从从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV 216毒株可能存在的变异以及重组现象。本研究利用21对引物,通过PCR扩增,TA克隆以及序列测序对分离株IBV34及IBV216的全基因组进行了解析。结果发现分离株IBV34以及IBV216全基因组全长分别为27647bp与27654bp（不包括5’端帽子和3’端polyA尾巴）。基因组结构符合IBV的基因组基本特征。IBV34以及IBV 216毒株的全基因组序列与QX型的YXI0毒株的全基因组序列同源性分别高达96.6%以及96.7%。重组事件分析进一步发现,IBV34毒株基因组中鉴定出2个重组事件。分别位于IBV 34基因组5567-8121片段、8672-11925片段。IBV216毒株基因组中同样鉴定出2个重组事件。分别位于5564-7886片段、8402-11923片段。重组来源分析显示IBV34和IBV216来源于QX型与TC07-2型基因型IBV重组。3、两株鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆为进一步探究这两株来自IBV免疫鸡群的IBV毒株的S1蛋白的抗原性。本研究将IBV34以及IBV 216毒株的S1基因分别克隆至线性化载体pGEX-6p-I和pcDNA3.1上。成功构建了 S1原核表达载体pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-1-IBV216-S1及真核表达载体 pcDNA3.1-IBV34-S1、pcDNA3.1-IBV216-SI。将重组子 pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-I-IBV216-S1分别转化至BL-21感受态中。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现GST-S1蛋白不仅可以以包涵体形式表达,而且还可以以可溶性形式表达。利用抗QX型IBV血清对真核表达载体pcDNA3.1-IBV34-S1以及pcDNA3.1-IBV216-S1的表达进行了验证。结果发现,所用的抗QX型IBV血清能很好的识别转染pcDNA3.1-IBV34-S1的LMH细胞。可见亮绿色荧光;而在转染pcDNA3.1-IBV216-S1的LMH细胞以及转染对照载体pcDNA3.1的DF-1细胞中未见亮绿色特异性荧光。这一结果提示IBV216毒株S1蛋白中缺失的4个氨基酸（62-65aa）可能影响S1蛋白的抗原性以及血清的免疫反应性。
沈元朝[2]（2019）在《鸡传染性支气管炎人工模型及病症观察》文中研究说明鸡传染性支气管炎（Avian infectious bronchitis disease,IB）是一种由鸡传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）引起的急性、高传染性的病毒性疾病。该疾病临床上一般以呼吸道症状为主,还可导致蛋鸡的产蛋数量与质量下降,部分毒株还会导致肾脏、肠道等组织的损伤。目前,IBV在世界上众多国家与地区流行,在国内,该病毒主要的流行株为肾型,M41血清型是其中之一。本研究中选用的IBVJS株与M41型的S1基因同源性达到了 99.2%,两者之间可能存在亲缘关系。因此,选用IBV JS毒株建立鸡传染性支气管炎的人工感染模型将为国内鸡传染性支气管炎的致病机理研究提供有力的理论依据。1.鸡传染性支气管炎人工感染模型攻毒途径及剂量筛选:选用IBVJS为攻毒毒株,10日龄SPF雏鸡为试验动物,随机平均分为7组,分别为气管高、中、低剂量组、胸肌高、中、低剂量组和空白对照组,每组10只;采用喉头气管接种和胸肌注射两种攻毒途径,以浓度106EID50/mL,通过0.2 mL/只、0.1 mL/只、0.05 mL/只3个攻毒剂量进行人工模型的建立。攻毒后144h内,早晚各一次对各组试验鸡的精神、采食、饮水、粪便、呼吸等临床表现进行观察,记录病死率,对死亡鸡剖检观察病变。并于攻毒后120 h各组鸡泄殖腔棉拭子进行IBV的PCR测定。结果显示,空白对照组鸡在精神、采食、饮水、运动、呼吸和排泄等方面均正常;感染模型组雏鸡于攻毒24 h后陆续出现体温上升症状,攻毒72 h后相继出现精神沉郁、食欲减退至废绝、羽毛松乱、伸颈张口呼吸并伴有啰音、喉头有黏液、白色或水样拉稀等IB典型临床症状;病死剖检可见喉头气管环出血,管腔中有黄色或黄褐色栓塞物,部分雏鸡出现肾脏肿胀等典型病变;其中0.2 mL/只喉头气管接种组,发病率为100%,死亡率为20%,且PCR检测IBV 阳性率最高,为感染动物的最佳感染模型。2.鸡传染性支气管炎人工模型病症的观察:取15日龄SPF雏鸡70只平均随机分为攻毒模型组和空白对照组,依据上述结果,采用106EID50/mL,0.2mL/只喉头气管攻毒。于攻毒后24 h起,在全面观察临床症状的基础上,各组每48 h扑杀7只雏鸡,进行病理学、脏器组织病理学、免疫组化各组织内病毒含量、血清生化及炎性因子的荧光定量PCR检测。结果显示:攻毒组雏鸡在攻毒后24 h至264 h内均有体温升高,典型临床症状和喉头气管黏膜肿胀、出血等典型病变于攻毒72 h后开始逐渐出现。其中喉头气管环出血最早出现于攻毒72 h后,而气管黏液栓塞物在攻毒120 h最为明显;其他脏器组织病变如肝、肾、肺、脾、十二指肠等在72 h后随时间的推移先后出现充血、出血、细胞变性及坏死等渐进性病变,且与各组织内的IBV含量、IL-1、IL-6、iNOS、IFN-α、IFN-γ等因子的mRNA表达量呈现一定的相关性。本研究建立了鸡传染性支气管炎的人工感染模型,并对模型从病理学的角度进行了较为深入的探究,为鸡传染性支气管炎的中兽医学辩证分型提供了科学有效的数据,为研发疗效好、毒副作用低的中兽药奠定了基础。
苗立中[3]（2018）在《鸡传染性支气管炎病毒山东株分离鉴定及其灭活疫苗制备与评价》文中研究指明鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis,IB）是一种有重大经济影响且呈全球分布的家禽疾病。它由鸡传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）引起,是危害我国养禽业健康养殖的重要疫病。目前已有多种商品化疫苗用于IB的免疫预防,但由于IBV的高变异性、不同血清型之间缺乏交叉保护等原因,IB并未得到有效控制,IBV的综合防控仍然存在着大量难题。鉴于此,本研究对流行病学检测阳性样品进行IBV野毒株分离鉴定及其主要蛋白遗传变异性分析;并基于分离毒株建立IBV快速检测方法,包括荧光定量PCR检测方法和间接ELISA抗体检测方法,利用建立的检测方法对山东地区开展流行病学调查;对分离鉴定的部分毒株进行细胞培养条件的优化,确立最佳培养方法;利用细胞培养的病毒液配制灭活疫苗,探讨灭活疫苗的免疫效果,以期为IBV的早期诊断、流行病学调查、致病机制研究、遗传变异趋势研究、疫苗的制备和检验技术研究奠定基础,为山东地区IBV综合防控措施的制定提供科学依据。为对山东地区疑似IBV感染临床病例进行病原的分离与鉴定,并掌握分离毒株的生物学特性和遗传特征,本研究进行了病毒分离、血凝实验、鸡胚致病性、动物回归等系列试验。结果共获得分离毒株48株,对SPF鸡胚的EID50为10-5.0/0.1m L10-5.83/0.1 m L,均能引起SPF雏鸡表现典型的IBV感染症状,对SPF雏鸡的致死性介于30%60%,遗传进化分析显示48株分离毒株中有46株QX基因型,2株Mass基因型,表明QX基因型已成为山东地区IBV流行的优势基因型。基于分离QX基因型毒株建立IBV荧光定量PCR检测方法并组装试剂盒,检测分离毒株的器官嗜性和疫苗攻毒保护试验的排毒量,同时为IBV感染的早期诊断和流行病学调查提供新的检测方法。结果显示:该检测方法的标准曲线线性关系良好,相关系数R2为0.9988,可检测到7.5×103 copies/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;特异性检测结果显示检测MDV、NDV、IBDV、ILTV等其他禽源类病毒均为阴性;批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于3%;利用该试剂盒检测192份临床送检病料,检测出阳性样品48份,阳性率达25.0%（48/192）,显着高于普通PCR检测方法。以上结果表明IBV Real-time PCR试剂盒敏感性高、特异性强、重复性好,可用于IBV的定量检测和IBV感染的早期诊断和流行病学调查。参照IBV S1基因序列,RT-PCR扩增分离毒株长约867 bp的S1基因主要抗原区域,将其克隆到p ET30α原核表达载体,转化Rossetta表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的IBV重组S1蛋白。在此基础上,将S1重组蛋白经纯化后作为抗原,建立了IBV间接ELISA抗体检测方法并组装了试剂盒,该试剂盒相对于IDEXX ELISA试剂盒的符合率、敏感性、特异性分别为94.55%,95.42%和92.96%,为后续疫苗抗体检测提供了技术支持,同时为临床野毒感染快速诊断和流行病学调查提供新的血清学诊断技术。为了确定分离毒株适于增殖的细胞系,本研究首先将IBV GQ/2015株、WF/2015株、M41株与M491株分别接种Vero、Vero-E6、BHK-21、Macr-145与DF-1细胞,并盲传至F5代,通过EID50的测定,确定最佳细胞系及其最适毒株;在此基础上,对细胞密度、增殖曲线等培养条件、病毒增殖促进剂的作用及小型生物反应器的应用进行了探索。结果显示,5种细胞中,仅Vero细胞适于4株IBV的增殖培养,且GQ/2015株与M491株增殖效果最佳,其毒价分别为10-4.83/0.1 m L与10-4.5/0.1 m L;而Marc-145、BHK-21与DF-1细胞只适于IBV某个毒株的增殖,且其毒价显着低于Vero细胞培养物。另一方面,对GQ/2015株与M491株增殖培养条件的优化的研究显示,GQ/2015株与M491株最适接毒量为细胞培养液的1%、最佳血清浓度为2%、最适接毒方式为分步接毒、最佳收毒时间为60 h72 h。最后应用固定床纸片载体生物反应器对GQ/2015与M491株进行增殖培养,结果显示,GQ/2015株与M491株的EID50可显着提高至10-6.375/0.1 m L与10-5.83/0.1 m L。因此本研究必将为实现应用细胞系增殖培养IBV的规模化生产提供参考。为开发针对IBV流行毒株的新型疫苗,本研究以IBV GQ/2015株为疫苗株,采用细胞培养方法制备病毒液,以白油为佐剂,研制了IBV油乳剂灭活疫苗,该疫苗安全性好;疫苗免疫0.1 m L和0.3 m L后21 d间接ELISA抗体水平（S/P值）达到峰值,免疫0.5 m L后30 d间接ELISA抗体水平（S/P值）达到峰值;不同分离毒株交叉保护性试验显示该灭活疫苗对当前流行的IBV毒株具有非常好的交叉保护效果。表明IBV GQ/2015株油乳剂灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性,为研发具有自主知识产权的针对流行毒株的IBV疫苗奠定了基础。
王晶钰[4]（2006）在《鸡肾型传染性支气管炎病毒陕西分离株N、M和S1基因的分子遗传变异研究》文中指出传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是鸡的一种急性、高度传染性的病毒性呼吸疾病,以气管啰音、咳嗽和打喷嚏为特征畛跞衔狪B主要是幼鸡的一种疾病,但后来发现该病在育成鸡和产蛋鸡群中也普遍存在。IB可引起鸡的增重和饲料报酬降低,参与混合感染引起气囊炎使肉鸡在加工过程中被淘汰,引起产蛋鸡的产蛋率和蛋品质量下降,该病的高度传染性和传染性支气管炎病毒众多的血清型,使免疫预防复杂化并增加了防控成本。因此具有重要的经济意义。传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是冠状病毒科（Coronariyidae）冠状病毒属（Coronavirus）的成员,其基因组RNA由大约27 600个核甘酸组成,全序列已被克隆和测序。IBV粒子含有纤突糖蛋白（S）、膜糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N） 3种主要结构蛋白。S蛋白由S1和S2两种糖蛋白组成,血凝抑制（HI）抗体和大部分病毒中和（VN）抗体由S1诱导产生。20世纪60年代和70年代,美国和澳大利亚就报道了明显不同于已知Mass血清型的几种IBV血清型。此后,在亚洲和欧洲也发现了多个新的IBV血清型。近年来,我国IBV分离株大多为肾变型,主要分离株为肾型变异株,给免疫防控带来了很大困难。因此,对肾型IBV分离株的致病性和分子生物学特性进行测定,特别是对肾型IBV分离株的主要结构基因N、M、S1的遗传变异进行研究,将对我国IB的免疫预防等起到推动作用。作者针对肾型IBV分离株,主要进行了以下研究:1.对陕西省流行的肾型IBV进行了分离鉴定。从陕西省20个发生呼吸道疾病的病鸡场中分离到18株病毒。通过鸡胚感染,HA试验,干扰NDV试验,耐酸碱试验,电镜观察,血清学鉴定,证明其中13株是鸡传染性支气管炎病毒（IBV）。动物感染试验及EID50试验发现,8个IBV分离株（BJ2、FF2、YL2、B01、G5、YX、WH、WG）具有很强的嗜肾性,可引起感染鸡肾肿大,呈花斑样,肾小管和输尿管有尿酸盐沉积。血清中和试验表明,IBV分离株的血清型与W118毒株相同,而与IBV H120、H52和W93株有一定的差异。2.用RT-PCR对8个肾型IBV分离株的N基因进行了扩增,均获得1160bp左右的目的条带,与预期相符。8个分离株的N基因测序后与GenBank登录的7个IBV参考毒株的N基因比较发现,部分IBV陕西分离株N基因与参考毒株的同源性在85.5%～87.3%,差异性较大,说明我国IBV地方分离株N基因变异有不断加大的趋势,氨基酸推导序列表明,N蛋白突变以散在的点突变形式为主,其变异特点与组织嗜性无明显相关性。系统进化分析表明,WH、YX、YL株与参考毒株Ark99及Gray在同一进化分支上,差异较小;BJ、WG、G株3个毒株则形成一个独立的进化分支,与我国疫苗毒株W93、H120及其他参考
周海生[5]（2017）在《2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究》文中研究说明传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要引起鸡群呼吸道与肾脏疾病,是影响养禽业重要的病毒性病原之一。虽然IBV疫苗广泛使用,但IB仍然频繁爆发,特别是以引起肾脏损伤的肾型IBV分离报道较多,给我国养禽业造成巨大的经济损失。由于IBV血清型众多,且各血清型间交叉保护作用较低,同时IBV很容易发生基因突变和同源重组,导致新基因型甚至新血清型不断出现,这给养禽业IB的防控带来巨大的困难。提示我们在防控IB中对病毒进行流行病学监测,并对新型病毒或变异株的流行病学特点进行分析,从而为制定IB有效的免疫防控策略提供重要的理论依据。目前IBV临床分型包括呼吸型、肾型、生殖道型和腺胃型等,其中肾型IBV是近年来我国主要的IB病变型。肾型IBV主要引起鸡肾脏肿大,尿酸盐沉积,进而引起鸡群死亡率增加。病毒S蛋白在IBV的血清学分型、基因分型、病毒组织嗜性及致病性中发挥了决定性的作用,而S蛋白中中和抗原位点、受体结合区域都是位于S1亚基上。因此,研究IBVS1蛋白与宿主之间相互作用,可以为病毒组织嗜性与致病性方面的机理提供一定参考。本研究主要内容包括以下4个部分。1、2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学分析2010～2016年间,本研究共从华东地区疑似IB发病鸡群分离到IBV 36株,其中从肉鸡分离毒株35株,从蛋鸡分离毒株1株。在所有分离株中,我们发现1例IB与H9亚型AIV混合感染。对36株IBV S1基因序列进行测定,发现S1基因长度存在4种:1620/540（28 株）、1617/539（4 株）、1611/537（3 株）及 1638/546（1 株）。S 蛋白裂解位点存在 5种:HRRRR（25 株）、RRFRR（6 株）、RRSRR（3 株）、RRLRR（1 株）及 HRRKR（1株）。序列比对显示本研究分离的36株IBV之间的S1基因核苷酸序列同源性在65.2%～99.9%,分离株与参考株之间S1基因核苷酸序列同源性在65.0%～99.9%。S1基因分型结果表明,36株IBV可划分为七个基因型:QX型（26株）、Mass型（3株）、4/91型（3 株）、tl/CH/LDT3/03 型（1 株）、TW-Ⅰ型（1 株）、TC07-2 型（1 株）和新发现的 New-Ⅰ型（1株）。结合GenBank中2001～2016年中国分离的396株IBV毒株S1基因序列,S1基因分型结果显示,2001～2016年间我国流行的432株IBV可以分为13个基因型,包括QX（321 株）、tl/CH/LDT3/03（25 株）、TW-I（20 株）、4/91（18 株）、Mass（18 株）、CK/CH/LSC/99I（7 株）、TC07-2（4 株）、TW-II（2 株）、Ck/CH/LDL/97I（1 株）、Arkansas（1株）、Vis S（1株）、及新鉴定的基因分支New-Ⅰ（8株）与New-Ⅱ（3株）。值得注意的是,属于美国相关基因分支的ck/CH/LSD/110712已在我国出现。重组分析显示,新出现的New-Ⅰ基因型IBV S1基因来源于4/91与tl/CH/LDT3/03型毒株之间的重组,基因分支New-Ⅱ病毒S1基因来源于tl/CH/LDT3/03型与QX型毒株重组。研究结果表明我国华东地区2001～2016年间流行的IBV基因型众多,基因重组导致IBV新的基因型或变异株出现。本研究为今后IBV疫苗的研发和IB的防控提供一些参考。2、2001～2016年间我国IBV基因组序列重组分析为了解我国IBV分离株基因组重组特点,特别是疫苗株基因参与IBV基因重组情况,本研究对分离株 CK/CH/2010/JT-1、CK/CH/2014/FJ14 及 CK/CH/2014/QL1403 全基因组序列进行测定,同时收集2001～2016年间分离于我国的55株全基因组序列,并与参考株进行了序列重组分析。序列分析显示分离株CK/CH/2010/JT-1与CK/CH/2014/QL1403基因组中共鉴定出4个重组事件,分别位于CK/CH/2010/JT-1基因组24709-365、17160-19811、21136-21770片段及CK/CH/2014/QL1403基因组20395-24840片段。进一步对基因组序列重组来源分析显示 CK/CH/2010/JT-1 来源于 QX、CK/CH/LSC/99I、tl/CH/LDT3/03 及 4/91基因型IBV重组,CK/CH/2014/QL1403来源于QX与TC07-2型毒株重组,而CK/CH/2014/FJ14是一株典型的QX型IBV。应用RDP4对我国2001～2016年间分离的55株IBV基因组序列进行重组分析,结果显示我国2001～2016年间流行的55株IBV中有52株IBV基因组存在重组事件,其中25个IBV分离株基因组中发现有疫苗型（Mass,tl/CH/LDT3/03及4/91型等）病毒基因组片段的重组,这一结果在SimPlot分析中进一步得到确认。根据生物信息学分析结果,证明流行于我国的IBV基因组序列存在许多基因重组事件,而且疫苗毒株基因频繁参与了 IBV基因重组,导致IBV新的基因型或变异株出现,提示在防控IB时注意合理使用IBV疫苗。3、我国IBV分离株致病性分析及交叉保护研究为了探究分离株 CK/CH/2010/JT-1、CK/CH/2014/FJ14 及 CK/CH/2014/QL1403 致病特点及不同毒株间抗原关系,本研究对分离株进行动物攻毒、交叉中和及交叉保护实验。动物攻毒实验结果显示CK/CH/2010/JT-1与CK/CH/2014/FJ14可引起雏鸡严重的呼吸道症状、肾脏病变及高死亡率（43.75%与50%）,而CK/CH/2014/QL1403不引起雏鸡产生明显的临床症状与病理变化。中和实验结果表明现有抗H120与4/91疫苗株鸡多抗血清不能有效中和 IBV 分离株 CK/CH/2010/JT-1 与 CK/CH/2014/FJ14,而抗 QX 型毒株 CK/CH/2014/FJ14鸡多抗血清能够有效中和TC07-2型IBV CK/CH/2014/QL1403。交叉保护实验结果表明CK/CH/2014/QL1403免疫雏鸡后能为鸡群提供有效保护来抵抗QX型毒株CK/CH/2014/FJ14 攻击。本研究结果显示 CK/CH/2010/JT-1 与 CK/CH/2014/FJ14 属于 IBV强毒株,且目前常用H120与4/91疫苗株不能有效防控该毒株,而CK/CH/2014/QL1403是一株天然弱毒株,而且可以作为疫苗候选株来防控QX型IBV。4、IBV S1蛋白的天然免疫应答研究为了探究IBV S1蛋白引起鸡胚肾细胞（Chickenembryokidneycell,CEKC）天然免疫应答反应,特别是肾型与呼吸型毒株S1蛋白引起CEKC天然免疫应答差异,本研究成功构建了肾型毒株CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14与呼吸型IBVM41株S1基因真核表达载体,通过转染CEKC研究其在细胞中的天然免疫应答。结果表明IBV S1基因在CEKC中成功获得了瞬时表达,而且S1蛋白主要表达于细胞浆中。在mRNA水平上,转染后12 h,IBV 肾型毒株 CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 S1 蛋白引起 TLR3、MDA5 的表达明显高于呼吸型M41;转染后24h,肾型毒株CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 S1蛋白引起TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6的表达显着高于呼吸型M41。在蛋白水平上,S1蛋白在 CEKC 中瞬时表达后 24h,肾型毒株 CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 引起 TLR3、IFN-β及IL-6的表达显着高于经典株M41。重组质粒转染CEKC 24 h时,使用配体poly（I:C）和LPS刺激后,IBV不同致病性毒株S1蛋白引起肾细胞天然免疫没有产生进一步放大作用。本研究结果表明肾型与呼吸型毒株S1蛋白引起CEKC天然免疫应答中TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6的表达存在差异,暗示IBV对肾脏致病性差异可能与毒株S1蛋白引起肾细胞天然免疫中TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6表达差异相关。
黄梦姣,张芸,薛春宜,曹永长[6]（2019）在《应对日益严峻的挑战:中国禽传染性支气管炎研究》文中研究指明自1937年禽传染性支气管炎病毒在美国被首次分离以来,该病毒的传播给世界养禽业带来了严重的经济损失。中国地域辽阔、气候多样,国内该病毒的流行情况十分复杂。本文就传染性支气管炎在国内的病原分离、分子流行病学、检测技术、疫苗及综合防控技术等方面的研究与实践进行总结。目前,该病毒在中国多种类型毒株并存,优势流行毒株为QX基因型毒株。除广泛使用的H120等Mass血清型疫苗外,4/91血清型疫苗和LDT3-A株疫苗也被逐步使用,多采用弱毒疫苗和灭活疫苗联合免疫的方法有效控制了其对养禽业造成的经济损失。
董志华[7]（2019）在《四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究》文中研究说明鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是鸡的一种急性、高度传染性的呼吸道疾病,广西养禽业由该病造成的经济损失非常大。鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）基因组十分容易发生变异,不同国家或地区IBV流行株的基因组存在很大的差异。为了进一步阐明广西IBV分子致病变异机制和致病机理,有效控制该病,促进广西养禽业健康发展,非常有必要对广西IBV流行株进行全基因组测序分析和致病性研究。因此,本研究对四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列进行测定,并对获取的全基因组序列进行生物信息学分析,最后对该四株IBV变异株进行SPF鸡和樱桃谷肉鸭的动物回归试验,对其进行致病性研究,旨在为本地区IB防控提供依据。第一,采用高通量测序技术对IBV变异株GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株进行全基因组序列测定,分别对四株样品进行RNA提取、反转录、文库构建、测序和数据分析。研究结果显示:（1）GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株全基因组核苷酸序列长度分别为27477 bp、27751 bp、27674 bp和27663 bp;（2）四株IBV基因组结构均符合经典的结构:5’-UTR-Pol-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’。第二,对获得的四株IBV全基因组序列进行生物信息学分析,包括全基因组序列碱基插入和缺失分析、相似性分析、系统发育分析、重组分析、S1蛋白裂解位点分析、糖基化位点分析和RNA茎环结构预测。结果显示:（1）四株代表性IBV变异株主要在基因组核苷酸2928～3428位、20490～20930位、21330～21550位、24180～24740位和27370～27440位存在明显的碱基插入和缺失现象;GX-N160421株在高度保守的N基因505～507bp处连续缺失3个碱基（aa:S）,为本地区首次发现的N基因连续缺失毒株。（2）GX-NN130048株与GX-YL9、YX1010和DY07株相似度较高,均在95.0%以上;GX-NN160421株与CKCHHB2016和GX-NN09032株相似度较高,均在96.4%以上;GX-QZ170728、GX-QZ171023株和YX10株相似度较高,分别为95.2%和95.3%。（3）GX-NN130048、GX-QZ170728和GX-QZ171023株主要与YX10和DY07株位于较近的发育分支树上;GX-NN160421株主要与GX-NN09032和CK株位于较近的发育分支树上。GX-NN130048和GX-QZ170728株S1基因均属于4/91-type,GX-NN160421和GX-QZ171023株S1基因分别属于New-type和CK/CH/LSC/991-type。（4）GX-NN130048和GX-QZ170728株是来源于疫苗株4/91和LX4型野毒株的重组株,GX-NN130048株重组片段断点为1～20444和26981～27477,GX-QZ170728株重组片段断点为1～19046和26821～27674。（5）S1基因型为4/91-type的GX-NN130048和GX-QZ170728株的S1蛋白裂解位点为RRSRR,GX-NN160421和GX-QZ171023株S1蛋白裂解位点分别为HRRKR和RRFRR。（6）GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和 GX-QZ171023株S1基因N-糖基化位点分别为18、10、17和16个,N基因均为1个。（7）以基因组5’端前导序列为模板预测出3个RNA茎环结构,主要与4/91、M41、CQ04-1、SAIBK和SC021202株存在突变位点;以基因组ORF1b融合区为模板预测出2个茎环结构,主要与BJ和California株存在突变位点;其中茎环结构I是主要的核苷酸突变位点。本部分研究结果表明本地区IBV变异株主要由点突变和基因重组引起,基因组5’端前导序列和ORF1b融合区茎环结构可能对于基因重组具有重要作用,IB的防控面临更严峻的挑战。第三,为进一步了解四株代表性IBV变异株的致病性,本课题进行了G X-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株对SPF鸡以及鸭源GX-QZ170728株对樱桃谷肉鸭的致病性试验。将SPF鸡随机分为4组攻毒组和对照组,樱桃谷肉鸭随机分为攻毒组和对照组。7日龄所有攻毒组的动物分别点眼滴鼻1×106 EID50的病毒液,对照组采用等量PBS替代。攻毒后每日观察各组临床症状,及时剖检死亡鸡,记录发病率和死亡率。采集0、1、7、11、14和21 dpi血清进行IBV特异抗体的检测;采集1、3、5、7、11、14和21 dpi气管、肺脏和肾脏制作组织切片及观察病理学变化,并使用荧光定量PCR检测气管、肾脏和肛拭子的病毒载量。结果表明:（1）攻毒24 h以后,攻毒鸡出现精神沉郁、羽毛松乱、体重下降、喘气、气管啰音和饮水量增加等临床症状;剖检鸡出现气管粘液和出血、肾肿大苍白和花斑肾等病变。对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭无异常变化。（2）四株IBV攻毒鸡发病率为53.33%～100%,死亡率为2.22%～28.89%,GX-QZ171023组发病率和死亡率最高。鸭源GX-QZ170728株攻毒的樱桃谷肉鸭死亡率为0%。（3）0～21 dpi时攻毒组鸡的抗体水平逐渐升高,21 dpi时抗体滴度均大于试剂盒阳性判定值;整个试验期间对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭抗体水平一直较低且无变化。（4）组织病理学观察显示:四株病毒均导致气管黏膜结构混乱、上皮细胞变性坏死和大量炎细胞浸润,肺脏上皮细胞变性坏死、大量炎细胞浸润、局部肺淤血和肺房受压萎缩。GX-QZ171023组肾小管大量坏死、个别肾小球细胞坏死、萎缩,GX-NN130048组肾脏有少量淋巴细胞浸润,其余两组攻毒鸡肾脏无异常变化;对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭病理切片无异常变化。（5）荧光定量PCR检测结果显示:1～21 dpi时4组攻毒组鸡气管、肾脏和肛拭子均可检测到IBV;GX-NN130048组和GX-NN160421组气管病毒载量明显高于肾脏病毒载量;GX-QZ170728组和GX-QZ171023组肾脏病毒载量明显高于气管病毒载量。对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭均未检测到IBV。本部分研究结果表明,四株IBV变异株对SPF鸡均具有致病性,其中GX-QZ171023株致病性最强;鸭源GX-QZ170728株对SPF鸡具有致病性,对樱桃谷肉鸭不具有致病性。本研究结果表明,广西IBV仍然不断变异,IBV变异株主要由点突变和基因重组引起;四株IBV变异株对SPF鸡均具有致病性,其中GX-QZ171023株致病性最强;鸭源GX-QZ170728分离株对SPF鸡具有致病性,对樱桃谷肉鸭不具有致病性。本课题丰富了 IBV以及冠状病毒的全基因组生物信息库,为致病性研究提供依据,对广西乃至全国IB的防控具有重要的参考价值。
潘力[8]（2019）在《传染性支气管炎病毒SD/04/18株感染鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律研究》文中研究说明禽传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis,AIB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种高度接触性传染病。IBV可引起鸡呼吸道、肾脏和生殖道等部位病变,并造成死亡,给养鸡业造成巨大经济损失。IBV不同血清型之间交叉保护性低,新IBV血清型的不断出现给本病的防控带来困难。目前,国内外还没有制定统一的IBV分型标准,但众多学者多采用IBV的S1基因序列分型法。由于不同基因型的IBV在组织嗜性和致病性方面有着较大的差异,因此需要对新分离株进行系统研究,为该病的防控提供依据。本试验从山东某地疑似患鸡传染性支气管炎（IB）的送检病死鸡中分离到一株病毒,经RT-PCR鉴定及测序分析,确定为IBV并命名为SD/04/18株。根据测序结果,对其S1基因进行遗传分析,发现该毒株与我国主要流行的QX基因型IBV同源性最高。经胰蛋白酶消化液处理的SD/04/18株测得了血凝效价;将SD/04/18株接种8日龄SPF鸡,复制出了与自然感染病例相同的临床症状。为系统性研究IBV SD/04/18株,首先,根据GenBank中已发表的IBV的N基因序列设计引物,建立IBV Real-TimePCR检测方法,该方法最低能检测到39.7 copies/μL的病毒核酸;其次,将经典呼吸型IBV-M41标准株与分离的SD/04/18株先通过SPF鸡胚连续传代,再经鸡胚肾原代细胞（CEK）和非洲绿猴肾细胞（Vero）盲传至引起细胞明显病变,同时定量检测每一代次病毒。结果显示,IBV-M41株在CEK原代细胞和Vero细胞上分别传至第4代、第5代时出现明显病变;而SD/04/18株在上述两种细胞上分别传至第5代、第6代时出现明显病变;经连续传代,最终获得能稳定增殖的IBV-M41标准株和SD/04/18分离株。为探讨SD/04/18株在不同感染阶段对宿主相关器官的病理损伤、组织嗜性、动态分布、排毒规律及宿主抗体水平的影响,进行了下列试验。首先建立IBV SD/04/18株雏鸡感染模型,并在感染后的3 d、7 d、30 d采集气管、肺、肾、脾、胸腺、法氏囊制作病理切片及免疫组化分析;其次,在感染后不同时间点采集12种组织器官进行病毒动态分布检测,同时定期检测感染鸡只的呼吸道和泄殖腔的排毒情况、统计体重及抗体水平。结果显示,不同感染阶段的相同器官病理变化存在差异,感染发病30 d时,气管、肺、脾、胸腺得到了很好的恢复,但肾脏和法氏囊病变依然严重;免疫组化法检测到上述器官均有可见抗原聚集;感染后6 h,在气管、喉头、肺等部位首先检测到相应载量的病毒,整个过程中,脑、胰脏病毒载量较为稳定,其余各器官的病毒载量整体呈现先增多后减少的趋势;人工感染第1 d和第3 d分别在呼吸道和泄殖腔检测到病毒核酸,30 d时仍能从上述两个部位检出病毒核酸;5 d时在被感染鸡群中检测到IBV抗体阳性,抗体滴度峰值出现在感染后27 d;感染发病鸡临床症状明显,两组试验鸡体重差异显着。总之,通过对分离到的QX基因型IBV SD/04/18株的系统性研究,确定了SD/04/18株在临床分型上属肾型IBV。该毒株主要引起发病鸡肾脏病变,对宿主的免疫器官也具有不同程度的损伤,发病鸡排毒时间长,增重慢;靶器官带毒时间长、病毒载量高,各器官病毒载量与宿主抗体水平整体呈现负相关。经过鸡胚、细胞盲传后,SD/04/18株能在体外稳定增殖。以上实验结果,将为抗IBV药物的研究提供理想的动物模型并为后续IBV的相关机制研究提供理论依据和实验素材。
王月欣[9]（2019）在《QX型传染性支气管炎病毒抗体检测方法建立与亚单位疫苗研制》文中研究表明鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV易发生变异,血清型众多,不同血清型毒株之间交叉保护性弱,研制与流行毒株血清型一致的疫苗并建立配套的免疫效果评价方法非常重要。近年来,QX型已成为当前亚洲和欧洲流行的优势血清型,在我国分离鉴定的流行毒株中占比超过70%。因此,本研究的目的就是研制一种针对QX型IBV亚单位疫苗,建立起与之相配套的检测QX型IBV抗体的间接ELISA方法,并与本实验室研制的鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗（La Sota株+QXL87株）配合,为QX型IBV的免疫防控提供全面的解决方案。1 QX型IBV抗体的间接ELISA方法建立通过Protean软件对QX型IBV CK/CH/JS/2010/12毒株（以下简称QXL株）的S1蛋白抗原性进行分析,选取该蛋白抗原性较强的5个部位,对应的基因片段分别命名为S1-A（61-525bp）、S1-B（454-933bp）、S1-C（835-1299bp）、S1-D（1453-1620bp）、S1-E（277-882bp）。S1蛋白氨基酸序列与IBV血清型分型密切相关,S1-A～S1-E5个多肽均位于S1蛋白高变区,利用Megalign软件将多肽氨基酸序列分别与6个疫苗毒株（H120、H52、MA5、M41、W93、4/91）的S1蛋白氨基酸序列进行比对,以S1-E多肽的变异率最高,与Mass型疫苗株及4/91疫苗株相比,变异率分别达到25%、20.3%,推测S1-E多肽是建立ELISA方法的最佳包被抗原。利用PCR方法扩增这5个基因片段,将5个基因片段分别克隆至pET-32a（+）载体进行原核表达,SDS-PAGE鉴定结果显示S1-A～S1-E这5个多肽均成功表达,大小与预期相符,分别为36.9kD、37.7kD、37.2kD、26.4kD、42.2kD。利用Ni-NTA亲和层析介质分别纯化出这5种多肽作为包被抗原,同时检测QX型IBV阳性血清与阴性血清,比较P/N值,结果显示S1-E多肽与阳性血清反应的灵敏度最高。以S1-E多肽作为ELISA包被抗原,经过一系列条件优化,包被抗原按1μ/mL稀释、HRP标记的兔抗鸡抗体按1:10000稀释为最佳工作浓度,除抗原需4℃孵育12 h,显色需37℃避光孵育10min,其余步骤按37℃孵育1 h为最佳工作条件。经测定,该方法与新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病毒等阳性血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于12%,表明该方法的重复性和特异性良好,可进一步用于QX型IBV疫苗抗体水平的监测。2 QX型IBV S1亚单位疫苗的研制利用PCR扩增QXL株的S1基因,截去信号肽部分,将该基因克隆到pET-32a（+）载体进行原核表达,SDS-PAGE鉴定结果显示蛋白表达形式主要为包涵体且大小与预期相符为70kD,将融合蛋白命名为S1。利用Ni-NTA亲和层析介质纯化变性条件下的S1蛋白,并经过蛋白透析液复性,以纯化复性后的S1蛋白为疫苗水相,白油为佐剂制成油包水剂型亚单位疫苗,每毫升疫苗含100 μg蛋白。3日龄SPF雏鸡随机分为四组:S1亚单位疫苗组、QXL87活疫苗组、QXL87+S1亚单位疫苗组和非免疫攻毒对照组,每组15只。于7日龄时以滴鼻点眼方式免疫QXL87活疫苗,免疫剂量为1羽份（103.5EID50）,于21日龄以胸部肌肉注射方式免疫S1亚单位疫苗,免疫剂量为0.5 mL。亚单位疫苗免疫1周后,QXL87+S1亚单位疫苗组抗体水平显着上升且高于其他组。只免疫亚单位疫苗组的抗体水平在免疫21 d后明显上升。所有试验鸡于49日龄以滴鼻点眼的方式攻毒,所攻毒株为QXL毒株,攻毒剂量为104.0EID5C0/0.1mL。攻毒后观察10日,每日统计各试验组发病和死亡情况。结果显示S1亚单位疫苗组、QXL87活疫苗组和QXL87+S1亚单位疫苗组对QXL株的临床保护效力分别为70%、90%和90%。分别于攻毒后第2d、5 d、7d采取咽喉拭子及泄殖腔拭子,应用实时荧光定量PCR的方法测定各试验组排毒量,结果显示QXL87+S1亚单位疫苗组的排毒量最低,S1亚单位疫苗组的排毒量相较另外两个免疫组较高。攻毒后第10 d将所有试验鸡处死并剖检,分别取气管上中下三段制备成气管环,观察各试验组鸡气管的纤毛活力,结果显示免疫试验组鸡的气管纤毛活力基本在67%～100%之间,纤毛脱落少且活力较好,临床观察结果显示各免疫组试验鸡的气管和肾脏未见明显病变。综合临床保护效力、排毒量和气管纤毛活力这3个指标,单独免疫S1亚单位疫苗对QXL毒株的攻击可提供一定的保护;QXL87活疫苗和S1亚单位疫苗联合免疫时效果最佳,对QXL株的攻击能够达到足够的免疫保护效力。
叶焕春[10]（2011）在《鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis, IB）是由冠状病毒科、冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus, IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病。此病在世界各地均有发生,给全球养禽业造成了巨大的经济损失。IBV是单股RNA病毒,该病毒基因可由于点突变和重组而发生变异,因此IBV的血清型较多,已达30余种之多。不同血清型毒株之间仅有部分或无交叉保护作用,从而给本病的防治带来困难。我国目前虽然已广泛使用IB疫苗,但由于IBV的易变异型,IB仍然呈高度流行趋势,尤其是在已免疫鸡群中也常常爆发IB,造成严重的经济损失。因此,对IB的发生、流行和病原变异的分析和研究,将为该病的综合防控提供有用的参考依据。本研究对江苏地区疑似鸡传染性支气管炎的病料进行了实验室病毒分离和鉴定。结果表明,四株分离株均能引起胚体发育不良,个体小,头、爪合抱,呈蜷缩现象；其尿囊液不能凝集鸡红细胞,但经2%胰酶处理后能凝集鸡红细胞；在鸡胚内对NDV LaSota株有干扰作用；动物回归试验复制出的病例表现出的临床症状、病理变化与自然发病的病例相同。所以可初步断定所分离的四株病毒为鸡传染性支气管炎病毒。应用RT-PCR方法扩增出四株IBV分离株的S1基因和N基因,将其进行了克隆、序列测定及分析。构建了系统进化树,分析了四株IBV分离株与参考毒株之间的系统进化关系。四株IBV分离株S1基因的长度分别由1611、1611、1650、1641个核苷酸组成,分别编码537、537、550、547个氨基酸。四株分离株之间S1基因核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分别为80.0%～97.4%、82.9%～95.9%。分离株JS3、JS4与其它参考毒株同源性较低,在72.9%～81.8%之间,基因序列内有大量的碱基突变、插入和缺失。系统进化树分析表明,分离株JS1、JS2与呼吸型毒株归属于一个分支,分离株JS3、JS4与国内分离的肾型毒株归于一个分支。四株分离株的S蛋白裂解位点均为RRFRR,与标准呼吸型毒株裂解位点一致。四株IBV分离株N基因的长度均为1230bp,编码409个氨基酸。四株分离株之间N基因核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分别为86.7%～96.1%、88.0%～98.3%。N基因系统进化树也显示分离株JS1、JS2与JS3、JS4位于两个分支。N基因序列内没有碱基的插入与缺失,但是大量的点突变造成氨基酸的替代,氨基酸的替代也出现在N蛋白的三个保守碱性氨基酸区内。以上分析结果表明,本实验分离的IBV分离株存在较为广泛的基因突变、插入和缺失,同时,IBV毒株间的基因重组也可能是IBV变异株产生的另一主要原因。本实验中分离株JS1、JS2属于呼吸型毒株；分离株JS3、JS4属于肾型毒株。本研究将IBV N基因定向插入原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-N,并转化至表达菌BL21 （DE3）,通过IPTG的诱导表达,将表达蛋白进行SDS-PAGE检测,重组质粒得到高效表达。Western blot分析显示,N基因表达产物能够与IBV多抗血清IgG反应,具有较好的抗原性。
二、肾型鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肾型鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定（论文提纲范文）
（1）两株鸡传染性支气管炎病毒的分离、全基因组测序及其S1基因的克隆表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 第一节 鸡传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎病毒概况 |
| 1.2 IBV病毒的形态结构与理化特性 |
| 1.3 IBV的流行病学 |
| 1.4 IBV的致病性 |
| 1.5 IBV主要蛋白及其功能 |
| 1.5.1 S蛋白 |
| 1.5.2 M蛋白 |
| 1.5.3 N蛋白 |
| 1.5.4 E蛋白 |
| 1.5.5 非结构蛋白 |
| 1.6 IBV的变异与重组 |
| 1.7 IBV分型 |
| 1.8 IBV的免疫防控 |
| 1.8.1 弱毒疫苗 |
| 1.8.2 灭活疫苗 |
| 1.8.3 核酸疫苗 |
| 第二节 研究目的及意义 |
| 研究内容一 两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的繁殖 |
| 2.2 引物的设计 |
| 2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.4 cDNA的制备 |
| 2.5 目的片段的扩增 |
| 2.6 PCR纯化产物的连接和转化 |
| 2.7 连接反应产物转化涂板 |
| 2.8 菌落PCR鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 病毒鸡胚接种结果 |
| 3.2 两株IBV病毒与20株IBV参考毒株S1基因序列比较 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 两株鸡传染性支气管炎病毒的全基因组测序与分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的增殖 |
| 2.2 引物的设计 |
| 2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.4 cDNA的制备 |
| 2.5 目的片段的扩增 |
| 2.6 PCR纯化产物的连接和转化 |
| 2.7 连接反应产物转化涂板 |
| 2.8 全基因组测序分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 IBV34与IBV216两株病毒各个基因片段扩增结果 |
| 3.2 IBV34和IBV216毒株全基因组结构 |
| 3.3 分离株IBV 34基因组的同源重组分析 |
| 3.4 分离株IBV216基因组的同源重组分析 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 两株鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 RNA的提取 |
| 2.3 cDNA的制备 |
| 2.4 目的片段的扩增 |
| 2.5 RT-PCR产物的胶回收 |
| 2.6 重组质粒的构建 |
| 2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.8 重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 两株IBV病毒S1基因片段的扩增及重组子构建 |
| 3.2 重组蛋白GST-S1表达的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.3 重组蛋白GST-S1表达的Western-blot鉴定 |
| 3.4 间接免疫荧光鉴定S1蛋白真核表达 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）鸡传染性支气管炎人工模型及病症观察（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 前言 |
| 1 鸡传染性支气管炎的研究现状 |
| 1.1 IBV病原学 |
| 1.2 IBV流行病学 |
| 1.3 IB的临床分型 |
| 1.4 IB诊断方法 |
| 1.5 防治措施 |
| 2 鸡传染性支气管炎人工感染模型研究进展 |
| 3 研究目的与意义 |
| 第二章 鸡传染性支气管炎人工模型建立与病症观察 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 病毒复壮 |
| 1.4 人工造模攻毒途径及剂量筛选 |
| 1.5 人工模型病症的观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 人工造模攻毒途径及剂量筛选结果 |
| 2.2 人工模型病症的观察结果 |
| 2.3 模型病症的组织病理切片观察 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 血清生化结果 |
| 2.6 荧光定量PCR检测组织中炎性因子结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 临床症状和剖检病变讨论 |
| 3.2 组织病理及免疫组化切片结果讨论 |
| 3.3 血清生化结果讨论 |
| 3.4 组织中炎性因子结果讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（3）鸡传染性支气管炎病毒山东株分离鉴定及其灭活疫苗制备与评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1.1 IBV的病原学特征 |
| 1.1.1 IBV的历史 |
| 1.1.2 IBV的分类 |
| 1.1.3 IBV的形态 |
| 1.1.4 IBV的理化特征 |
| 1.1.5 IBV的培养特性 |
| 1.1.6 IBV的致病性 |
| 1.2 IBV分子生物学特性 |
| 1.2.1 IBV的基因组 |
| 1.2.2 IBV的主要编码蛋白 |
| 1.2.3 IBV毒株分类 |
| 1.3 IB发病机理 |
| 1.3.1 宿主易感性 |
| 1.3.2 年龄和品种倾向 |
| 1.3.3 受体和进入 |
| 1.3.4 感染和传播 |
| 1.3.5 潜伏期 |
| 1.3.6 临床病程和临床表现 |
| 1.3.7 剖检及组织病理学 |
| 1.3.8 病理变化 |
| 1.3.9 发病率和死亡率 |
| 1.4 IBV变异机制 |
| 1.4.1 点突变 |
| 1.4.2 基因缺失或插入 |
| 1.4.3 同源重组 |
| 第二章 IBV诊断技术概况 |
| 2.1 临床诊断 |
| 2.2 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.1 鸡胚培养 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 器官培养 |
| 2.3 电镜检查 |
| 2.4 免疫组织化学法 |
| 2.5 血清学诊断方法 |
| 2.6 分子生物学诊断方法 |
| 2.6.1 RT-PCR |
| 2.6.2 RFLP |
| 2.6.3 荧光定量RT-PCR |
| 2.6.4 序列分析 |
| 第三章 IB疫苗研究概况 |
| 3.1 常规疫苗 |
| 3.2 新型疫苗 |
| 第二篇 实验研究部分 |
| 第一章 山东地区IBV分离鉴定及遗传变异分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 病料来源 |
| 1.1.2 菌(毒)株、血清、试验动物 |
| 1.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 1.1.4 病毒分离 |
| 1.1.5 分离毒株生物学特性鉴定 |
| 1.1.6 分离毒株毒价(EID50)测定 |
| 1.1.7 分离毒株的致病性试验 |
| 1.1.8 遗传变异分析 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 病毒分离结果 |
| 1.2.2 分离毒株生物学特性鉴定结果 |
| 1.2.3 分离毒株毒价(EID50)测定结果 |
| 1.2.4 分离毒株的致病性试验结果 |
| 1.2.5 分离毒株S1基因RT-PCR扩增结果 |
| 1.2.6 克隆质粒的鉴定结果 |
| 1.2.7 S1基因遗传变异分析结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 IBV鸡胚分离的准确性 |
| 1.3.2 山东地区IBV遗传变异分析及疫苗研发方向 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 IBVReal-timePCR检测试剂盒的研究与应用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌毒株与试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂、试剂盒及仪器设备 |
| 2.1.3 引物设计与合成 |
| 2.1.4 病毒RNA的提取和cDNA合成 |
| 2.1.5 E基因的扩增及质粒标准品的制备 |
| 2.1.6 RealtimeRT-PCR方法的建立 |
| 2.1.7 试剂盒的组装及保存期试验 |
| 2.1.8 临床应用 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 E基因的扩增及质粒标准品的制备结果 |
| 2.2.2 RealtimeRT-PCR方法的建立 |
| 2.2.3 敏感性试验结果 |
| 2.2.4 特异性试验结果 |
| 2.2.5 重复性试验结果 |
| 2.2.6 试剂盒的组装及保存期试验 |
| 2.2.7 临床应用结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 荧光定量PCR引物的设计 |
| 2.3.2 荧光定量PCR的优点与先进性 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 IBV间接ELISA抗体检测试剂盒研究与应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 生物性材料 |
| 3.1.2 所需试剂 |
| 3.1.3 设计引物 |
| 3.1.4 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.1.5 pET30a-S1诱导表达与可溶性鉴定 |
| 3.1.6 重组蛋白的纯化 |
| 3.1.7 重组蛋白的活性鉴定 |
| 3.1.8 ELISA反应条件的优化 |
| 3.1.9 间接ELISA判断标准的确定 |
| 3.1.10 特异性试验 |
| 3.1.11 敏感性试验 |
| 3.1.12 重复性试验 |
| 3.1.13 符合率试验 |
| 3.1.14 试剂盒的组装及保存期试验 |
| 3.1.15 试剂盒的临床应用 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RT-PCR扩增与表达质粒的鉴定 |
| 3.2.2 表达质粒的鉴定结果 |
| 3.2.3 重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.4 重组蛋白的活性鉴定 |
| 3.2.5 ELISA最佳反应条件的确定 |
| 3.2.6 ELISA判定标准的确定 |
| 3.2.7 特异性试验结果 |
| 3.2.8 敏感性试验结果 |
| 3.2.9 重复性试验结果 |
| 3.2.10 符合率试验结果 |
| 3.2.11 试剂盒的组装 |
| 3.1.12 试剂盒的保存期试验结果 |
| 3.2.13 临床应用结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 ELISA方法检测IBV抗体的优势 |
| 3.3.2 间接ELISA包被抗原的选择 |
| 3.3.3 间接ELISA判定标准的选择 |
| 3.3.4 间接ELISA应用前景 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 IBV病毒增殖优化研究与生产应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株、细胞 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 IBV不同毒株增殖培养最适细胞系的确定 |
| 4.1.4 应用细胞增殖培养IBV毒株培养条件的优化 |
| 4.1.5 应用小型生物反应器增殖培养IBV毒株 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 IBV不同毒株增殖培养最适细胞系的确定 |
| 4.2.2 应用Vero细胞增殖培养IBV培养条件的优化 |
| 4.2.3 应用小型生物反应器增殖培养GQ/2015株与491株 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 细胞系的选择 |
| 4.3.2 病毒增殖条件的优化 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 IBVGQ/2015株灭活疫苗的研制与免疫效果研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 毒株、细胞 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.1.3 IBVGQ/2015株基础种子标准的优化与制定 |
| 5.1.4 IBVGQ/2015株生产种子标准的优化与制定 |
| 5.1.5 IBVGQ/2015株制苗用毒液的制备 |
| 5.1.6 半成品检验 |
| 5.1.7 油乳剂灭活疫苗制备 |
| 5.1.8 成品检验 |
| 5.1.9 灭活疫苗的免疫效果试验 |
| 5.1.10 灭活疫苗的保存期试验 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 IBVGQ/2015株基础种子标准的制定 |
| 5.2.2 IBVGQ/2015株生产种子标准的制定 |
| 5.2.3 半成品检验结果 |
| 5.2.4 成品检验结果 |
| 5.2.5 灭活疫苗的免疫效果试验结果 |
| 5.2.6 灭活疫苗的保存期试验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 IB疫苗毒株的选择 |
| 5.3.2 IB疫苗毒株的细胞培养优点及疫苗效力评价 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）鸡肾型传染性支气管炎病毒陕西分离株N、M和S1基因的分子遗传变异研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述 |
| 第一章 鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展 |
| 1.1 IBV 基因组结构 |
| 1.2 IBV 的非结构域 |
| 1.3 IBV 的S 基因及其编码的S 蛋白 |
| 1.4 IBV M 基因及其编码的M 蛋白 |
| 1.5 IBV N 基因及其编码的N 蛋白 |
| 1.6 结语 |
| 第二章 鸡传染性支气管炎病毒分子遗传变异和免疫机制研究进展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 IBV 基因组 |
| 2.3 IBV 的分子变异机制 |
| 2.4 IBV 遗传变异的研究近况 |
| 2.5 IBV 的免疫机制 |
| 2.6 小结 |
| 试验研究 |
| 第三章 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 鸡肾型传染性支气管炎病毒分离株部分生物学特性测定 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 鸡肾型IBV 陕西分离株N 基因的克隆及分子遗传变异分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 鸡肾型IBV 分离株M 基因的克隆与特性分析 |
| 6.1 材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 鸡肾型IBV 陕西分离株51 基因分子遗传变异分析 |
| 7.1 材料 |
| 7.2 方法 |
| 7.3 结果 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英对照缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现、命名与分类 |
| 1.2 生物学特性 |
| 1.3 基因组结构与主要功能蛋白 |
| 1.4 生活周期 |
| 1.5 致病机理 |
| 1.6 毒株分型 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 自然宿主 |
| 2.2 实验室宿主 |
| 2.3 传播方式 |
| 3 临床症状及病理变化 |
| 3.1 呼吸道 |
| 3.2 肾脏 |
| 3.3 生殖道 |
| 3.4 消化道 |
| 3.5 其它 |
| 4 诊断 |
| 4.1 病原的分离鉴定 |
| 4.2 血清学诊断技术 |
| 4.3 分子生物学检测技术 |
| 5 防治 |
| 5.1 免疫预防 |
| 5.2 治疗 |
| 综述二 传染性支管炎病毒在世界范围内流行现状 |
| 1 亚洲国家IBV流行现状 |
| 2 欧洲国家IBV流行现状 |
| 3 非洲国家IBV流行现状 |
| 4 北美洲国家IBV流行现状 |
| 5 南美洲国家IBV流行现状 |
| 6 大洋洲国家IBV流行现状 |
| 综述三 禽冠状病毒纤突蛋白研究进展 |
| 1 禽冠状病毒S蛋白概述 |
| 1.1 结构特点 |
| 1.2 序列多样性 |
| 1.3 其它禽类冠状病毒S蛋白 |
| 2 禽冠状病毒S蛋白功能 |
| 2.1 组织吸附中的作用 |
| 2.2 细胞亲和性中的作用 |
| 2.3 体内组织嗜性与致病性中的作用 |
| 3 病毒吸附中宿主影响因素 |
| 3.1 唾液酸 |
| 3.2 蛋白受体 |
| 3.3 凝集素 |
| 3.4 硫酸肝素 |
| 3.5 宿主蛋白酶 |
| 4 禽冠状病毒S蛋白引起宿主天然免疫反应 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 2001～2016年间华东地区传染性支气管炎病毒分子流行病学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 病毒增殖 |
| 2.3 病毒总RNA提取 |
| 2.4 S1基因扩增与序列测定 |
| 2.5 S1基因序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒分离结果 |
| 3.2 分离株S1蛋白长度与裂解位点的多样性 |
| 3.3 分离株S1基因分型的多样性 |
| 3.4 新分支New-Ⅰ与New-Ⅱ基因型IBV S1基因的来源 |
| 4 讨论 |
| 第二章 2001～2016年间我国传染性支气管炎病毒基因组序列重组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 分离株全序列扩增引物设计 |
| 2.2 分离株全基因组序列RT-PCR |
| 2.3 病毒基因组5'与3'端序列扩增 |
| 2.4 分离株基因组序列测定与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离株基因组结构 |
| 3.2 分离株CK/CH/2010/JT-1基因组的重组来源 |
| 3.3 分离株CK/CH/2014/QL1403基因组的重组来源 |
| 3.4 我国2001～2016年间IBV基因组重组现象普遍 |
| 4 讨论 |
| 第三章 我国鸡传染性支气管炎病毒分离株致病性分析及交叉保护研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒扩增 |
| 2.2 SPF鸡致病性实验 |
| 2.3 病毒中和实验 |
| 2.4 交叉保护实验 |
| 2.5 鸡IBV血清抗体ELISA |
| 3 结果 |
| 3.1 IBV分离株致病性 |
| 3.2 交叉中和实验结果 |
| 3.3 天然弱毒CK/CH/2014/QL1403对QX型IBV交叉保护实验 |
| 4 讨论 |
| 第四章 传染性支气管炎病毒S1蛋白的天然免疫应答研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 真核表达载体的构建 |
| 2.3 CEKC的制备 |
| 2.4 CEKC的质粒转染 |
| 2.5 共聚焦显微镜荧光分析 |
| 2.6 Western-blot |
| 2.7 荧光定量PCR方法检测相关因子 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 S1基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒转染CEKC后S1蛋白的表达 |
| 3.4 IBV S1蛋白引起CEKC天然免疫相关因子表达差异 |
| 3.5 配体刺激后IBV S1蛋白引起CEKC天然免疫相关因子表达差异 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间所获成果 |
（6）应对日益严峻的挑战:中国禽传染性支气管炎研究（论文提纲范文）
| 1 禽传染性支气管炎病毒 |
| 2 中国IBV毒株分离与鉴定 |
| 3 IBV分子流行病学研究 |
| 4 IBV检测技术研究 |
| 5 IBV疫苗开发 |
| 6 IBV免疫程序研究 |
| 7 IBV综合防控措施 |
| 8 结语 |
（7）四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写、符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎病毒病原学的研究概论 |
| 1.1.1 鸡传染性支气管炎病毒的分类和形态 |
| 1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒的理化和生物特性 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎发病机理和流行病学 |
| 1.2.1 鸡传染性支气管炎的临床症状和病理变化 |
| 1.2.2 鸡传染性支气管炎的国外流行情况 |
| 1.2.3 鸡传染性支气管炎的国内流行情况 |
| 1.2.4 IBV变异株的研究进展 |
| 1.3 鸡传染性支气管炎病毒的致病性研究 |
| 1.3.1 鸡传染性支气管炎病毒对呼吸器官的致病性 |
| 1.3.2 鸡传染性支气管炎病毒对生殖器官的致病性 |
| 1.3.3 鸡传染性支气管炎病毒对泌尿器官的致病性 |
| 1.3.4 鸡传染性支气管炎病毒对其他组织器官的致病性 |
| 1.4 鸡传染性支气管炎病毒基因组 |
| 1.4.1 鸡传染性支气管炎病毒基因组结构 |
| 1.4.2 鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白与生物学功能 |
| 1.4.3 鸡传染性支气管炎病毒非结构蛋白与生物学功能 |
| 1.4.4 鸡传染性支气管炎病毒非编码区与生物学功能 |
| 1.5 鸡传染性支气管炎病毒全基因组生物信息学研究现状 |
| 1.5.1 鸡传染性支气管炎病毒全基因组测定分析的研究进展 |
| 1.5.2 生物信息学分析的理论基础 |
| 1.5.3 糖基化位点与蛋白裂解位点的理论基础 |
| 1.5.4 基因重组研究与RNA茎环结构研究 |
| 1.5.5 蛋白质立体结构研究与分子遗传变异研究 |
| 1.6 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 IBV分离株背景 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的选择及合成 |
| 2.2.2 病毒的增殖及纯化 |
| 2.2.3 病毒RNA的抽提及cDNA的合成 |
| 2.2.4 S1、E、M和N结构基因的克隆及序列测定 |
| 2.2.5 高通量测序IBV全基因组序列 |
| 2.2.6 一代测序与高通量测序的对比分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒的纯化 |
| 2.3.2 IBV S1、E、M和N结构基因序列 |
| 2.3.3 IBV全基因组序列 |
| 2.3.4 一代测序与高通量测序的对比 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 四株广西代表性IBV变异株的生物信息学分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 生物信息学分析数据 |
| 3.1.2 生物信息学分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 全基因组序列的碱基插入和缺失分析 |
| 3.2.2 全基因组序列相似性分析 |
| 3.2.3 全基因组序列及结构蛋白基因的系统发育分析 |
| 3.2.4 全基因组序列的重组分析 |
| 3.2.5 S1蛋白裂解位点分析 |
| 3.2.6 糖基化位点分析 |
| 3.2.7 RNA茎环结构预测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 全基因组序列的碱基插入和缺失分析结果 |
| 3.3.2 全基因组序列相似性分析结果 |
| 3.3.3 全基因组序列及结构蛋白基因的系统发育分析结果 |
| 3.3.4 全基因组序列的重组分析结果 |
| 3.3.5 S1蛋白裂解分析结果 |
| 3.3.6 糖基化位点分析结果 |
| 3.3.7 RNA茎环结构预测结果 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 四株代表性IBV变异株的致病性试验 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验用SPF鸡胚、SPF鸡及樱桃谷肉鸭 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定 |
| 4.2.2 SPF鸡及樱桃谷肉鸭分组与攻毒 |
| 4.2.3 病料的采集与处理 |
| 4.2.4 试验动物外周血血清抗体水平的检测 |
| 4.2.5 试验动物组织切片的制作与观察 |
| 4.2.6 试验动物组织器官病毒载量检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定结果 |
| 4.3.2 临床症状与剖检症状 |
| 4.3.3 试验动物外周血血清抗体水平检测结果 |
| 4.3.4 试验动物组织病理变化结果 |
| 4.3.5 试验动物组织器官病毒载量检测结果 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况及参与的科研项目 |
（8）传染性支气管炎病毒SD/04/18株感染鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.引言 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎病毒病原学研究进展 |
| 1.2.1 IBV的病原学简介 |
| 1.2.2 IBV的结构蛋白及功能 |
| 1.2.3 IBV的非结构蛋白及功能 |
| 1.3 IBV的基因型和血清型研究进展 |
| 1.3.1 国外的IBV基因型和血清型研究进展 |
| 1.3.2 国内的IBV基因型和血清型研究进展 |
| 1.4 IBV的分子遗传变异机制研究进展 |
| 1.5 IBV诱导的天然免疫应答研究进展 |
| 1.6 鸡传染性支气管炎病毒体外培养研究概况 |
| 1.7 鸡传染性支气管炎的诊断技术简介 |
| 1.8 鸡传染性支气管炎的防控措施简介 |
| 1.9 研究目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 常用试剂的配制 |
| 2.4.1 抗生素的配制 |
| 2.4.2 不同浓度氯化钠溶液的配制 |
| 2.4.3 胰蛋白酶-EDTA溶液的配制 |
| 2.4.4 不同浓度胰蛋白酶溶液的配制 |
| 2.4.5 PBS的配制 |
| 2.4.6 LB液体培养基的配制 |
| 2.4.7 LB固体培养基的配制 |
| 2.4.8 氨苄西林固体培养基的配制 |
| 2.4.9 细胞培养基的配制 |
| 2.4.10 1×TE电泳液的配制 |
| 2.4.11 琼脂糖凝胶的制作 |
| 2.4.12 1%红血球的制备 |
| 2.4.13 4%甲醛组织固定液的配制 |
| 2.5 试验方法 |
| 2.5.1 引物设计 |
| 2.5.2 病料的处理 |
| 2.5.3 病毒核酸的提取 |
| 2.5.4 目的基因的RT-PCR扩增 |
| 2.5.5 RT-PCR产物的纯化回收 |
| 2.5.6 目的基因的连接、转化 |
| 2.5.7 重组质粒的提取、鉴定与测序分析 |
| 2.5.8 SD/04/18 株的S1 基因遗传进化分析 |
| 2.5.9 重组质粒的浓度测定与稀释 |
| 2.5.10 标准质粒Real-TimePCR扩增 |
| 2.5.11 IBV实时定量PCR检测标准曲线的建立 |
| 2.5.12 SD/04/18 株的EID50 测定 |
| 2.5.13 SD/04/18 株的血凝效价测定 |
| 2.5.14 细胞复苏 |
| 2.5.15 细胞传代 |
| 2.5.16 鸡胚肾原代细胞的制备 |
| 2.5.17 动物回归试验 |
| 2.5.18 SD/04/18 株体外增殖与细胞病变情况 |
| 2.5.19 病毒定量检测 |
| 2.5.20 SD/04/18 株多克隆抗体的制备与特异性验证 |
| 2.5.21 人工感染发病 |
| 2.5.22 病料采集与处理 |
| 2.5.23 病理组织切片制作 |
| 2.5.24 免疫组织化学法分析 |
| 2.5.25 病毒动态分布检测 |
| 2.5.26 排毒检测 |
| 2.5.27 人工感染SD/04/18 株的抗体水平检测 |
| 2.5.28 数据处理与分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 病毒分离鉴定结果 |
| 3.2 SD/04/18 株的S1 基因测序分析结果 |
| 3.3 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.4 IBV实时定量PCR检测标准曲线的建立 |
| 3.4.1 标准曲线的灵敏度 |
| 3.4.2 扩增曲线的重复性 |
| 3.4.3 标准曲线的特异性 |
| 3.4.4 标准曲线相关参数 |
| 3.5 SD/04/18 株的EID50 测定与胚胎发育情况 |
| 3.6 SD/04/18 株的血凝效价测定 |
| 3.7 动物回归试验与临床症状 |
| 3.8 SD/04/18 株致细胞病变结果 |
| 3.9 两株IBV体外培养增殖情况 |
| 3.10 SD/04/18 株多克隆抗体特异性验证 |
| 3.11 人工感染后的临床症状与剖检变化 |
| 3.12 病理组织变化 |
| 3.13 免疫组织化学法分析结果 |
| 3.14 两组试验鸡的体重差异 |
| 3.15 各器官不同时间点病毒载量的动态变化 |
| 3.16 相同时间点各器官病毒载量的比较 |
| 3.17 SD/04/18 株的排毒规律 |
| 3.18 抗体水平检测结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 SD/04/18 株分离鉴定与遗传进化分析 |
| 4.2 IBV实时定量PCR检测方法建立与应用 |
| 4.3 SD/04/18 株和M41 株的体外增殖分析 |
| 4.4 SD/04/18 株的致病性与排毒规律 |
| 4.5 SD/04/18 株在各组织器官的动态分布与宿主抗体水平的关系 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间的主要学术成果 |
（9）QX型传染性支气管炎病毒抗体检测方法建立与亚单位疫苗研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 IB病原学 |
| 1.1 病原分类 |
| 1.2 病毒形态与结构 |
| 1.3 病毒基因组结构特征 |
| 1.4 IBV编码的结构蛋白及生物学功能 |
| 1.4.1 S蛋白 |
| 1.4.2 M蛋白 |
| 1.4.3 N蛋白 |
| 1.4.4 E蛋白 |
| 1.5 病毒分型 |
| 2 IBV流行病学 |
| 2.1 美洲 |
| 2.2 亚洲 |
| 2.3 欧洲 |
| 3 传染性支气管炎疫苗的研究进展 |
| 3.1 弱毒疫苗 |
| 3.2 灭活疫苗 |
| 3.3 基因工程疫苗 |
| 3.3.1 亚单位疫苗 |
| 3.3.2 核酸疫苗 |
| 3.3.3 重组疫苗 |
| 4 疫苗免疫评价方法研究进展 |
| 4.1 ELISA在IBV抗体检测技术应用的研究进展 |
| 4.1.1 国内外研究进展 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第一章 QX型传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA方法建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与菌株 |
| 1.1.2 病毒和血清样品 |
| 1.1.3 主要生物试剂 |
| 1.1.4 主要试剂的配制 |
| 1.1.5 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 S1-A～S1-E多肽的原核表达 |
| 1.2.2 间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 2 结果 |
| 2.1 S1-A～S1-E氨基酸序列分析结果 |
| 2.2 S1-A～S1-E重组蛋白的表达鉴定 |
| 2.2.1 S1-A～S1-E基因的扩增鉴定 |
| 2.2.2 S1-A～S1-E表达重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.2.3 S1-A～S1-E重组质粒的诱导表达鉴定 |
| 2.2.4 S1-A～S1-E多肽的纯化鉴定 |
| 2.3 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.3.1 包被抗原的筛选 |
| 2.3.2 间接ELISA最佳反应条件的确定 |
| 3 讨论 |
| 第二章 QX型鸡传染性支气管炎病毒亚单位疫苗的研制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与菌株 |
| 1.1.2 病毒、试验动物 |
| 1.1.3 主要生物试剂 |
| 1.1.4 主要试剂的配制 |
| 1.1.5 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 S1蛋白的原核表达 |
| 1.2.2 S1亚单位疫苗的制备 |
| 1.2.3 油乳剂亚单位疫苗的性状检验 |
| 1.2.4 攻毒保护实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 S1蛋白的原核表达 |
| 2.1.1 S1基因的体外扩增鉴定 |
| 2.1.2 S1重组表达质粒的鉴定 |
| 2.1.3 S1重组质粒的诱导表达鉴定 |
| 2.2 油乳剂亚单位疫苗的性状检验 |
| 2.2.1 粘度检验结果 |
| 2.2.2 稳定性检验结果 |
| 2.3 S1亚单位疫苗对QX型流行毒株的免疫保护实验 |
| 2.3.1 试验鸡抗体消长规律 |
| 2.3.2 试验鸡攻毒后临床表现 |
| 2.3.3 气管和肾脏病理变化 |
| 2.3.4 纤毛病理变化及评分 |
| 2.3.5 试验鸡气管及肾脏组织病理学分析 |
| 2.3.6 试验鸡排毒检测 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡传染性支气管炎的研究进展 |
| 1. 鸡传染性支气管炎概述 |
| 2. IB病原学研究进展 |
| 3. IBV的分子生物学研究进展 |
| 4. IB疫苗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验部分 |
| 第二章 四株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 四株IBV分离株S1、N基因的克隆和序列分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的原核表达 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录:常用试剂的配制 |
| 致谢 |
四、肾型鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定（论文参考文献）
- [1]两株鸡传染性支气管炎病毒的分离、全基因组测序及其S1基因的克隆表达[D]. 张琳婧. 扬州大学, 2019
- [2]鸡传染性支气管炎人工模型及病症观察[D]. 沈元朝. 扬州大学, 2019(02)
- [3]鸡传染性支气管炎病毒山东株分离鉴定及其灭活疫苗制备与评价[D]. 苗立中. 吉林大学, 2018(12)
- [4]鸡肾型传染性支气管炎病毒陕西分离株N、M和S1基因的分子遗传变异研究[D]. 王晶钰. 西北农林科技大学, 2006(05)
- [5]2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究[D]. 周海生. 扬州大学, 2017(05)
- [6]应对日益严峻的挑战:中国禽传染性支气管炎研究[J]. 黄梦姣,张芸,薛春宜,曹永长. 微生物学通报, 2019(07)
- [7]四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究[D]. 董志华. 广西大学, 2019(01)
- [8]传染性支气管炎病毒SD/04/18株感染鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律研究[D]. 潘力. 山东农业大学, 2019(01)
- [9]QX型传染性支气管炎病毒抗体检测方法建立与亚单位疫苗研制[D]. 王月欣. 扬州大学, 2019(06)
- [10]鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析[D]. 叶焕春. 南京农业大学, 2011(06)