一、植物血凝素皮肤试验检测病毒性肝炎非特异性细胞免疫功能——222例观察报导（论文文献综述）
马慧敏[1]（2021）在《结核分枝杆菌抗原特异性细胞免疫反应鉴别诊断潜伏性结核感染和活动性结核病》文中研究指明背景:结核病（Tuberculosis,TB）由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）感染引起。据估计,全球约1/4的人感染MTB,包括活动性结核病（Activetuberculosis,ATB）和潜伏性结核感染（Latenttuberculosis infection,LTBI）。中国普通人群中约20%为LTBI,其一生中约5%-10%的可能进展为ATB。因此,快速准确地鉴别ATB和LTBI,以达到精准治疗,对降低结核病的发病率至关重要。目前结核病诊断困难,能否通过增加新的抗原,或检测多种的细胞因子鉴别ATB和LTBI,具有重要的临床意义。研究目的:本研究拟通过荧光免疫斑点法（FluoroSpot）检测经MTB潜伏相关抗原Rv1733c、Rv1733c SLP和MTB特异性抗原ESAT-6、CFP-10刺激后分泌的特异性T细胞频数和比例,评价MTB抗原特异性细胞免疫反应鉴别ATB和LTBI的准确性。研究方法:本研究分两部分,均为病例对照研究。第一部分纳入2017年1至12月北京协和医院和北京胸科医院门诊和住院的病原学确诊ATB患者为病例组,LTBI为对照组。Fluorospot检测MTB潜伏相关抗原Rv1733c和Rv1733c SLP刺激下IFN-γ/IL-2的分泌,评价鉴别ATB与LTBI的准确性。第二部分纳入2020年4月至2021年4月北京协和医院和北京胸科医院门诊和住院的病原学确诊和临床诊断的ATB患者为病例组,LTBI和未感染者为对照组,Fluorospot检测经MTB特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激下特异性T细胞IFN-γ/IL-2/TNF-α的分泌,评价鉴别ATB与LTBI的准确性。研究结果:第一部分纳入ATB患者57例,LTBI患者36例。以Rv1733c SLP刺激下产生的单分泌IL-2的T细胞频数绘制ROC曲线,AUROC最大为0.766（95CI 0.662-0.870）,界值为 1（SFCs/2.5×105 PBMCs）时,鉴别 ATB 和 LTBI 的灵敏度为 72.2%（95CI 54.8%-85.8%）,特异度为和 73.7%（95CI 60.3%-84.5%）。ESAT-6&CFP-10-FluoroSpot 检测单分泌IFN-γ的T细胞频数和比例,鉴别诊断ATB和LTBI的灵敏度和特异度分别为 82.5%（95CI 70.1%-91.3%）和 66.7%（95CI 49.0%-81.4%）。在 ESAT-6&CFP-10-FluoroSpot的基础上,联合Rv1733c SLP刺激后单分泌IL-2的T细胞频数,可提高灵敏度至 84.2%（95CI 72.1%-92.5%）,特异度提高至 83.3%（95CI 67.2%-93.4%）。第二部分共纳入病原和临床诊断ATB患者50例、LTBI者87例,未感染者71例。FluoroSpot（IFN-γ/IL-2/TNF-α）和 T-SPOT.TB检测MTB 特异性抗原（ESAT-6/CFP-10）刺激下总分泌IFN-γ的T细胞频数之间有显着相关性（p<0.0001）。以FluoroSpot检测经ESAT-6&CFP-10刺激下产生的分泌IFN-γ+或IL-2+的任一阳性T细胞频数绘制ROC曲线,AUROC 最大为 0.980（95CI 0.963-1.003）,界值为 7（SFCs/2.5×105 PBMCs）时,鉴别ATB和未感染者的灵敏度为100%,特异度为87.3%。在50例ATB的患者中,T-SPOT.TB阳性率为82%,FluoroSpot可提高至90%。在病原确诊25例ATB患者中,T-SPOT.TB 阳性率为92%,FluoroSpot可提高至100%。在临床诊断的25例ATB患者中,T-SPOT.TB 阳性率为 72%,FluoroSpot 可提高至 80%。T-SPOT.TB 鉴别 ATB 和 LTBI的灵敏度和特异度为 48.8%和 85.7%。以 Fluorospot（IFN-γ/IL-2/TNF-α）检测 ESAT-6&CFP-10 刺激下产生的分泌 IFN-γ+/IL-2-/TNF-α-、IFN-γ-/IL-2+/TNF-α-、IFN-γ-/IL-2-/TNF-α+、IFN-γ+/IL-2+/TNF-α-、IFN-γ+/IL-2-/TNF-α+、IFN-γ-/IL-2+/TNF-α+的特异性T细胞频数和比例为自变量进行二分类logistic回归分析并绘制ROC曲线,AUROC为0.858（95CI 0.787-0.929）,鉴别ATB 和 LTBI 的灵敏度和特异度为 76.7%和 84.3%。结论:Rv1733c SLP与ESAT-6&CFP-10联合,有助于辅助鉴别ATB和LTBI。应用Fluorospot（IFN-γ/IL-2/TNF-α）检测结核分枝杆菌特异性抗原多细胞因子应答免疫反应与T-SPOT.TB相比具有更好的鉴别ATB和LTBI的准确性。
张艳红[2]（2013）在《从免疫应答、氧化损伤及中药干预机理探讨上呼吸道病毒感染温病证型特点》文中研究指明研究背景温病是外感疾病中具有温热性质的一类疾病,根据感邪的性质分为温热类温病和湿热类温病,以卫气营血和三焦辨证贯穿整个辨证论治纲领。温病学理论则专门研究温病的发生发展规律和诊治方法,现代中医多将温病学术应用于指导临床上急性传染病、急性感染性疾病等治疗,如流行性感冒、登革热、乙型脑炎,逐步形成了一套针对急性外感热病的诊疗方法。岭南地区特别是珠三角一带,经济繁荣,人口稠密,对外交往密切,容易形成细菌、病毒等病原微生物滋生和繁殖的温床,在日常接触中也容易造成人与人之间疾病传播流行,故在广东、东南沿海等地是感染性疾病尤其是病毒感染性疾病的高发区。岭南温病就是近代医家在辨治无数病毒感染性疾病后积累了丰富的临床经验和学术思想,结合地域性特点而形成的理论学说。急性上呼吸道感染在世界及广东也是发病率最高的呼吸系统疾病,数据显示80%以上的上呼吸道感染是由病毒引起,临床上可表现为鼻炎、咽炎、扁桃体炎、腮腺炎等局部症状及发热、恶寒、头痛、口渴、心烦、倦怠乏力、脘痞纳呆、恶心呕吐、便溏等程度不同的全身症状,根据病毒种类的不同和机体免疫力不同,病情的轻重有个体差异。由于病毒侵袭人体后除直接损害局部呼吸道粘膜外,还启动一系列免疫病理损伤,目前西医对上感的治疗无特效抗病毒药物,以对症支持治疗为主或加抗生素辅助抗菌治疗,这种较被动且可能导致菌群失调而加重病情的方法具有局限性。中医药防治上呼吸道感染在历史上显示出特有的优势,现代药理学已证明中药可以通过多途径、多靶点,对致病微生物、对人体功能系统均起作用,病毒性呼吸道感染性疾病中医药治疗取得满意效果。然而在不同地区,引起上呼吸道感染的病毒种类、流行季节、流行规模及临床症状可能有差异。众多医家认为,岭南地处亚热带,属海洋季风气候,终年温暖炎热、多雨潮湿,沿海居住人群贪凉喜冷、嗜食鱼鲜,肥脂厚腻,容易酿成湿热体质,岭南温病就是根据这种地理、气候、环境、体质特点,认识到广东地区病毒性上呼吸道感染临床表现“多热”、“多湿”,可按照温热病、湿热病辨治。对于温热证、湿热证的现代研究表明,其病因与病毒、细菌等感染有关,其证候实质及致病机理均与炎症、内毒素血症、血液流变学改变、免疫失衡、细胞因子分泌紊乱、氧化应激损伤、自由基增多、微量元素变化、水液代谢及细胞代谢障碍等多因素作用密切相关,与多数病毒感染性疾病发病机制相似,而用清热、祛湿类方剂治疗能起到直接抑制、杀灭病原体,双向调节机体免疫,调动器官组织抗病能力的作用。关于以上结论的文献、临床、实验研究为临床上辨治各种病毒性疾病提供了理论基础,如常见报道流行性感冒、病毒性肝炎、病毒性肺炎、流行性出血热、登革热、乙型脑炎等中医药治疗取得较满意疗效。故病毒性上呼吸道感染综合其发病地区及临床表现特征,可按照温热病、湿热病的卫气营血及三焦辨证纲领论治。本研究是在已有的岭南温病理论临床经验及前期研究成果的基础上,以整体观念、辨证论治、三因制宜,结合现代医学知识手段的思路,探讨病毒性上呼吸道感染的温病证型特点。目的选取病毒性上呼吸道感染患者作为研究对象,以证候分型、病原学、发病机理、中药治疗机理、疗效评价为切入点展开临床研究,通过观察上呼吸道病毒感染辨证属外感湿热证、温热证患者的咽拭子病毒抗原种类、外周血T淋巴细胞亚群CD3*%、CD4+%、CD8+%、CD4+/CD8*,NK%活性,细胞因子IL-2、IL-12、IFN-α水平,氧化反应指标SOD、GSH-Px、MDA、NO水平等指标的变化,以及用清热祛湿法、清热透邪法方剂治疗后各指标的变化与临床表现的相关性,探讨岭南上呼吸道病毒感染温病不同证型的证候实质和发病机制的病理物质基础,并阐释药物作用机理。方法选取2007年7月-2010年8月来自广州中医药大学第一附属医院、广州中西医结合医院、广东省中医院门诊、急诊的确诊为上呼吸道病毒感染患者作为病例组共285例,经辨证分为外感湿热证组175例及外感温热证组110例,其中外感湿热证组随机分为湿热治疗组（IA）114例、湿热对照组（IB）61例,外感温热证组随机分为温热治疗组（IIA）57例及温热对照组（IIB）53例。另外选取同期广东长住健康志愿者,作为正常对照组30例。分别检测他们的外周血T淋巴细胞亚群CD3+%、CD4+%、CDS+%、CD4+/CD8+及NK%活性,细胞因子IL-2、IL-12、IFN-α水平,氧化反应指标SOD、GSH-Px.MDA、NO水平,病例组在入组时取咽拭子检测呼吸道病毒抗原,比较湿热组、温热组患者与正常对照组健康人在上述指标的差异,并且湿热治疗组给予蒿芩清胆合剂干预,湿热对照组给予利巴韦林干预,温热治疗组给予麻杏石甘合剂干预,温热对照组给予利巴韦林干预,治疗时间为3日,第4天复诊用同样的方法复查上述外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞激活率,细胞因子,氧化反应指标水平。比较治疗前后及组间退热时间,中医证候、西医症状前后变化情况,有效率,安全性,外周血各指标的变化及与证候轻重的相关性,分析病原学特点,观察清热祛湿类、清热透邪类方药的干预作用,比较湿热证、温热证的证型特点。结果1.病原学特点：①285例患者中呼吸道病毒总阳性率为21.75%,温热组的病毒阳性率（33.64%）高于湿热组（14.29%）（P<O.05）；②五种病毒的阳性率以流感病毒最高,并以其中的普通甲型流感病毒（FluA）与甲型H1N1流感病毒（H1N1）的阳性率最高；③五种病毒阳性率由高到低排列依次为：FluA> H1N1> ADV> FluB> RSV;④五种病毒在两组之间的分布无统计学差异（P>0.05）。2.退热时间：①湿热治疗组的平均退热时间显着少于对照组（P<0.01）,温热治疗组的平均退热时间少于对照组（P<O.05）；②同样用利巴韦林治疗的湿热对照组和温热对照组在退热时间上差异无统计学意义（P>O.05）。3.中医证候、西医症状改善情况：①各组治疗后的中医证候、西医症状评分均比治疗前有明显下降（P<0.01）；②对于中医证候、西医症状评分的下降量方面,湿热、温热的治疗组优于对照组（P<O.05）,但两对照组之间无统计学差异（P>0.05）。4.总有效率：湿热治疗组的疾病、证候总有效率高于对照组（P<0.05）,温热治疗组与对照组、利巴韦林两对照组的总有效率无统计学差异（P>0.05）。5.安全性及不良反应：①以血分析及肝肾功能作为安全性评价指标,各组治疗后与治疗前相比,各指标均有不同程度的变化,但均在正常范围内；②各组治疗后与治疗前相比,淋巴细胞百分数均明显升高、中性粒细胞百分数均明显下降（P<0.01）；③服药观察期间,治疗组有3例和对照组有2例发生恶心或胃脘部不适等,未经特殊处理,均自行缓解,未见其他与服药有关之不良反应发生。6.免疫功能指标：①与正常对照组相比,湿热组和温热组CD3+%、CD4+%水平均下降（P<0.05）,CD8+%、CD4+/CD8+显着下降（P<0.01）,NK%水平则无明显变化（P>O.05）,而两组相比在各免疫指标水平均无统计学差异（P>O.05）；②与治疗前相比,治疗后各组T细胞亚群比例均有不同程度升高,NK%均有不同程度下降,其中湿热治疗组CD3+%升高,CD4+%、CD4+/CD8+显着升高,NK%下降,湿热对照组CD3+%、CD4+%升高,温热治疗组CD3+%、CD4+%升高,NK%显着下降,温热对照组NK%下降（P<0.05,P<0.01）；③较治疗前,湿热对照组CD3+%、CD4+%升高,NK%无变化,温热对照组NK%下降,T细胞比例无变化（P<O.05,P>0.05）；④对于各指标的调节量比较,湿热两组、温热两组、利巴韦林两组均无统计学差异（P>0.05）。7.细胞因子指标：①与正常对照组相比,湿热组和温热组IL-2显着下降、IFN-α显着升高（P<O.01）,IL-12轻度下降,但无统计学差异（P>0.05）,两组相比无差异（P>0.05）；②与治疗前相比,治疗后湿热治疗组和对照组IL-2、IFN-α有所升高,IL-12有所下降,温热治疗组和对照组IL-2有所下降,但温热治疗组IL-12有所下降、IFN-α有所升高,温热对照组则相反,而这种变化均无统计学差异（P>O.05）；③较治疗前,利巴韦林治疗后湿热对照组IL-2、IFN-α有所升高,IL-12有所下降,而温热对照组则相反,但这种变化无统计学意义（P>0.05）。8.氧化反应指标：①与正常对照组相比,湿热组与温热组SOD均显着下降,GSH-Px均下降,但两组无差异,MDA两组均升高,并以湿热组升高显着（P<0.01,P<O.05）,比温热组处于显着更高水平（P<O.01）,两组NO轻度低于正常水平,但差异无统计学意义（P>0.05）；②与治疗前相比,治疗后只有湿热治疗组GSH-Px升高、MDA下降有统计学差异（P<0.05）,其余各组氧化指标变化均无统计学差异（P>0.05）；③对于各指标前后变化多少的比较分析,湿热两组均能升高GSH-Px、降低MDA,但治疗组优于对照组（P<O.05）,另外治疗组能升高SOD、N0,而对照组则相反,但这种改变无统计学意义（P>0.05）；④温热两组均使SOD升高,GSH-Px、MDA、NO下降,但治疗组升高SOD优于对照组（P<0.05）,而对照组降低NO比治疗组明显（P<O.01）；⑤较治疗前,利巴韦林治疗后湿热、温热对照组MDA、NO均有所下降,但湿热对照组SOD有所下降、GSH-Px有所上升,而温热对照组则相反,但两组差异无统计学意义（P>0.05）。9.证候相关性研究：①IL-2在治疗后与湿热证候轻重在低评分范围内负相关（r=-0.41,P<O.05）,与温热证候轻重不相关；②T淋巴细胞亚群及NK%,细胞因子IL-12、IFN-α,氧化酶SOD、GSH-Px,自由基MDA、NO等指标在治疗前后均与湿热证、温热证证候轻重不相关（P>0.05）。结论1.岭南地区常见成人上呼吸道病毒为流感病毒与腺病毒,其中普通甲型流感病毒与甲型H1N1流感病毒的阳性率最高,可能与2009年甲型H1N1流感爆发后引起流行有关,温热证的患者病毒检出率高于湿热证者,但两组的病毒种类无差异,提示呼吸道病毒可能是一种“热邪”、“毒邪”2.退热时间比较：蒿芩清胆汤治疗上呼吸道病毒感染湿热证平均退热时间短于利巴韦林,麻杏石甘汤治疗上呼吸道病毒感染温热证平均退热时间短于利巴韦林,提示中药治疗病毒性上呼吸道感染发热性疾病有优势。而湿热证与温热证的退热时间无差异,说明温热证的特点虽是热象偏重,易化燥伤阴,湿热证的特点虽是湿遏热伏,热蒸湿动,缠绵难愈,但不能以热势的差别、体温的高低来衡量二证的区别,湿热证中也可以有热重于湿,发生从阳化热的转归。3.改善症状比较：蒿芩清胆汤、麻杏石甘汤、利巴韦林均有效改善上呼吸道感染临床症状,并且蒿芩清胆汤、麻杏石甘汤优于利巴韦林,利巴韦林对于湿热证及温热证的症状改善方面无差异。4.总有效率比较：蒿芩清胆汤治疗上呼吸道病毒感染湿热证的总有效率高于利巴韦林,麻杏石甘汤治疗上呼吸道病毒感染温热证的总有效率与利巴韦林相当,利巴韦林治疗湿热证与温热证的总有效率无区别。5.安全性评价：蒿芩清胆汤、麻杏石甘汤、利巴韦林三种药物安全性较好。6.免疫功能变化：上呼吸道病毒感染湿热证与温热证均有免疫功能紊乱,而两种证型无差别,表现为CD3+%、CD4+%水平均下降,CD8+%、CD4+／CD8+显着下降,表明是以CD4+%下降为主,才导致总体CD3+%下降,CD4+/CD8+下降,与既往临床报道结果基本一致。湿热与温热的证候特点可能导致湿热证与温热证有不同免疫应答类型。蒿芩清胆汤及麻杏石甘汤有调节免疫作用,但这种免疫调节作用跟量化无关,不能以增强免疫或抑制免疫而论中药的作用机理,而是双向调节使免疫应答功能达到平衡。7.细胞因子变化：上呼吸道病毒感染属湿热证、温热证患者较正常IL-2水平下降,IFN-α水平升高,存在免疫失衡,这种变化在两种证型之间是普遍的,不是特异的,说明上呼吸道病毒感染者Th1/Th2平衡失调,呈现Th2优势。在复查的指标中,湿热证与温热证IL-2的变化方向可能不同,提示湿热证与温热证病理变化的实质及传变规律区别,可能体现在细胞因子变化的种类上。蒿芩清胆汤、麻杏石甘汤及利巴韦林对细胞因子水平均无明显影响。8.氧化指标变化：上呼吸道病毒感染湿热证和温热证均存在氧化损伤,说明两者机体清除自由基的能力下降,血中自由基水平升高,且两种证型中以湿热证的自由基损伤更显着,可能反映了湿热证的病因是同时感受湿、热二邪。蒿芩清胆汤有确切抗氧化,纠正自由基失衡的作用,这方面比利巴韦林有优势,而麻杏石甘汤及利巴韦林均未见明显抗氧化效应,但麻杏石甘汤可能对机体重新建立抗氧化机制作用优于利巴韦林。在复查的指标中,湿热证与温热证MDA、NO均有所下降,但湿热证SOD有所下降、GSH-Px有所上升,而温热证则相反,这种氧化酶活性和自由基水平变化的方向差异,可能反映了湿热证与温热证的病情发生发展变化和转归不同。9.初步可认为病毒感染、中医辨证属湿热证时,外周血细胞因子IL-2活性降低,但至于是否与证候轻重负相关需进一步验证。而T淋巴细胞亚群及NK细胞激活率,其余细胞因子,氧化反应等指标均与湿热证、温热证证候轻重无关,其变化只反映病理状态,而不反应病情轻重。
王炳祥[3]（2011）在《山羊胎盘肽的分离和初步鉴定及营养、免疫、抗氧化作用的研究》文中研究说明自1985年刘月新首次采用“匀浆-透析法”提取人胎盘肽以来,广大科研工作者对胎盘肽进行了大量的理化分析与生物活性测定的研究,发现其在临床用于治疗病毒性肝炎、白细胞减少症、重症肌无力等免疫性疾病以及恶性肿瘤等,有较为理想的疗效。山羊胎盘的结构和功能与人的胎盘有许多相似之处,近几年来已有报道,从羊的胎盘中也可以提取出羊胎盘肽,并且具有与人胎盘肽类似的生物学活性,但是目前对于羊胎盘肽生物活性的研究还不全面,胎盘肽中活性组分的具体研究更是非常缺乏,而山羊胎盘来源有限,如用于临床,规模化生产胎盘肽需通过基因工程,活性组分的研究是基因工程的前提。本试验通过超滤制得胎盘肽,通过层析和电泳对其进行了初步分离和鉴定,对胎盘肽粗提物从营养学方面进行了分析,对胎盘肽粗提物和各分离出的组分从免疫和抗氧化方面进行了研究,旨在揭示羊胎盘肽在营养、免疫和抗氧化方面的作用,以及为活性组分的进一步研究提供参考。整个研究包括以下部分:一、山羊胎盘肽的分离提纯和初步鉴定取冷冻的山羊胎盘子叶,解冻后生理盐水冲洗,然后剪碎,经过反复冻融三次、高速组织匀浆机匀浆（12000r,3min,10次）、冷冻离心（4℃,8000r,20min）、取上清液微滤（0.22μm）、超滤（10KD）得到胎盘肽粗提物,粗提物为无色透明液体,为具有可透析可超滤性无热原的小分子多肽,PH6.6-6.9。粗提物经Superdex75层析得到四个组分,分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,冷冻干燥均为白色粉末,四组分经加脲和甘油Tricine-SDS-PAGE电泳显示分子量分别为10.139KDa、8.166KDa、7.447KDa、6.761KDa。二、胎盘肽提取液的氨基酸分析和矿物元素测定山羊胎盘肽提取液中,共检出17种氨基酸,其中必需氨基酸7种,含量占总氨基酸的34.56%,对于儿童而言（儿童另需要精氨酸和组氨酸）,含必需氨基酸9种,占总含量的42.59%,含有Fe、Zn、Cu等微量元素,重金属种类很少且含量非常低,不存在临床使用中重金属中毒的威胁。由此可见,山羊胎盘肽提取液具有极高的营养价值,是安全理想的氨基酸补充营养品。三、山羊胎盘肽对小鼠免疫功能的影响将小鼠随机分成6组,其中5组为试验组（分别腹腔注射组分:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、和粗提物）;每个试验组又分为高中低三种剂量小组（分别为18mg/kg、9mg/kg、4.5mg/kg）,每小组10只;对照组10只,仅注射生理盐水。每天注射一次,连续注射一周。通过对各组分试验组小鼠外周血血清中IL-2含量同对照组相比可见,各组分均具有提高小鼠血液中IL-2含量的作用,其中组分Ⅲ、Ⅳ及粗提物试验组IL-2含量比对照组提高了15.3%～30.1%,差异达到显着（p<0.05）,组分Ⅳ的活性较强,但与组分Ⅲ和粗提物相比差异并不显着（p>0.05）。通过对各组分试验组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能同对照组相比可见,组分Ⅲ、Ⅳ及粗提物有促进小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用,同对照组相比,差异极显着（p<0.01）。本实验结果提示组分Ⅲ、Ⅳ及粗提物可显着提高小白鼠的免疫功能,在胎盘小肽这类混合小肽中有免疫活性的主要成分是组分Ⅲ、Ⅳ。四、山羊胎盘肽对小鼠抗氧化能力的影响通过对各组分试验组小鼠SOD、MDA含量及SOD/MDA值同对照组相比显示,中高剂量的胎盘肽Ⅳ和粗提物能显着提高小鼠血清SOD含量（P<0.05）,显着降低MDA含量（P<0.05）,显着提高SOD/MDA值（P<0.05）,提高小鼠的抗氧化能力,高剂量组比中剂量组更明显,但没有出现差异极显着的情况（P>0.01）,说明山羊胎盘肽和粗提物提高小鼠的抗氧化能力具有剂量相关性且在一定的限度内。粗提物的活性最高,与组分Ⅳ相比差异不显着（p>0.05）。组分Ⅳ的作用不及粗提物可能与分离过程胎盘肽活性的丧失有关,在胎盘肽粗提物中起增强小鼠抗氧化能力作用的是组分Ⅳ。
赛福丁·阿不拉[4]（2011）在《黄精多糖和牛膝多糖及其硫酸化产物的抗病毒和增强免疫活性的研究》文中指出近年来研究发现,对多糖进行分子修饰可以大大提高其生物活性,并能产生许多新的药用价值。为了提高多糖的生物活性,可以选择合适的方法对多糖进行分子修饰。黄精多糖和牛膝多糖分别是中药黄精和牛膝的主要有效成分,具有增强免疫、抗病毒、抗肿瘤、抗应激、抗氧化等多方面的生物活性。为了追踪两种多糖抗病毒和增强免疫的活性部位和硫酸化修饰进一步提高两种多糖抗病毒和增强免疫活性的可能性,本研究选择黄精多糖和牛膝多糖为研究对象,首先用一步醇沉法和分步醇沉法提取总多糖和分级多糖,比较它们的体外抗病毒和增强免疫活性,筛选出效果较好的活性部位,并进一步进行硫酸化修饰,比较了硫酸化多糖的抗病毒和增强免疫活性。试验分为以下九个部分：试验I、黄精多糖和牛膝多糖的提取分别用水煎一步醇沉和分步醇沉法从黄精和牛膝饮片中提取黄精总多糖（SRPSt）和4个分级黄精多糖（SRPS30、SRPS50、SRPS70、SRPS80）、牛膝总多糖（ARPSt）和4个分级牛膝多糖（ARPS30、ARPS50、ARPS60、ARPS70）,分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝G-250法测定多糖和蛋白含量。结果表明,黄精多糖的提取率以SRPSt最高,达13.84%；分级多糖的得率以SRPS50最高、为4.88%,SRPS30最低、仅为0.38%；黄精多糖的糖含量以SRPS50最高、达77.43%；蛋白含量以SRPS30最高、为4.8%,SRPS50最低、为0.83%。牛膝多糖的提取率以ARPSt最高,为2.48%；糖含量以ARPS70最高、达32.89%,ARPS30最低,仅为10.55%；蛋白含量以ARPS70最高、为1.84%, ARPSt 和 ARPS40最低、微量。试验Ⅱ、两种多糖体外对新城疫病毒感染细胞能力的影响为了筛选两种多糖抗病毒的活性部位,首先用MTT法测定上述黄精总多糖和4个分级多糖、牛膝总多糖和4个分级多糖对鸡胚成纤维细胞（CEF）的安全浓度,取安全浓度范围内5种浓度的各多糖与鸡新城疫病毒（NDV）以3种加药方式（先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加）加入到长成单层CEF的培养体系中,用MTT法测定NDV感染CEF能力的变化。结果表明,在先加多糖时SRPS50、SRPS70、SRPS80、 SRPSt、 SRPS30和SRPS70在1.94～31.25μg·mL-1、 SRPS50在3.92～31.25μg·mL-1、ARPS70 和 ARPSt在19.53～156.25μg·mL-1、显着抑制NDV感染CEF。后加多糖时,SRPS30和SRPS70在1.94～31.25μg·mL-1、SRPS50在3.92～31.25μg·mL-1、SPSP80在3.92～7.84 μg·mL-1、SRPSt 在31.25 μg·mL-1、ARPS30在19.53～39.06 μg·mL-1、ARPS60在19.53μg·mL-1、 ARPSt在39.06μg·mL-1、显着抑制NDV感染CEF。多糖和病毒感作后加时SRPS30、SRPS50、SRPS70、SRPS80在1.94～31.2μg·mL-1显着抑制NDV感染。综合比较以SRPS30、SRPS50、SRPS70、ARPSt的抗病毒活较好,可能是黄精多糖和牛膝多糖抗病毒活性的最佳部位。试验Ⅲ、两种多糖体外对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响为了筛选两种多糖增强免疫的活性部位,将安全浓度范围内5个浓度的上述黄精总多糖和4个分级多糖、牛膝总多糖和4个分级多糖分别单独或与PHA加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,SRPS单独加入时,SRPS50.SRPS70和SRPS80在1.953～31.25μg·mL-1、SRPS30在31.25μg·mL-1-‘显着刺激淋巴细胞增殖,SRPS70组的增殖率最高；SRPS与PHA一起加入时,SRPS30和sRPS70在31.25 μg·mL-1、SRPs50在1.953～31.25 μg·mL-1、SRPS80在1.953 μg·mL-1、显着刺激淋巴细胞增殖,SRPS50组的增殖率最高；ARPS单独加入时,ARPS30. ARPs70在19.53l～312.5μg·mL-1、ARPSt在78.12～312.5μg·mL-1显着促进淋巴细胞的增殖,ARPSt组的增殖率最高；ARPS与PHA一起加入时,ARPS50在312.5μg·mL-1、ARPS60在19.531μg·mL-1、ARPS70在19.531～312.5μg·mL-1、ARPSt在39.0625～312.5μg·mL-1显着促进淋巴细胞增殖,ARPSt组的增殖率最高。综合评价以RPS50.SRPS70.ARPSt的效果最好,可能是黄精多糖和牛膝多糖增强免疫活性的最佳部位。试验Ⅳ、两种多糖的纯化及硫酸化修饰条件的优选将SRPSt和ARPSt分别用三氯乙酸法除蛋白、过氧化氢去色素、DEAE-Sephadex A-50或SepradexG-100柱层析纯化。然后以产物量、硫酸基取代度（DS）和糖含量为指标,用正交设计法对两种多糖的硫酸化修饰条件（氯磺酸-吡啶比例、反应温度和反应时间）进行优选,用氯化钡-明胶法测定DS,红外光谱鉴定硫酸化多糖的结构。结果表明,黄精多糖经DEAE-Sephadex A-50柱层析显示1个糖峰、纯多糖得率为10%；牛膝多糖经Sephadex G-100柱层析显示两个糖峰,第二个峰糖含量及得率较高、得率达30%。反应温度对取代度的影响较大,氯磺酸与吡啶的体积比对产物量和糖含量影响均较大。综合考虑黄精多糖适宜的修饰条件为反应温度为70℃、氯磺酸与吡啶的体积比在1：4、反应时间2 h；牛膝多糖适宜的修饰条件为反应温度为85℃、氯磺酸与吡啶的体积比在1：4,反应时间1h。硫酸化多糖的红外光谱显示有两个特征性吸收峰,证明了硫酸基已经和多糖结合成酯。试验Ⅴ、两种硫酸化多糖体外对新城疫病毒感染细胞能力的影响 为了比较两种硫酸化多糖的抗病毒作用,按照上一试验对4个多糖进行纯化和硫酸化修饰,得到4个纯化多糖（SRPS50p、SRPS70p、SRPStp、 ARPStp）和4个硫酸化多糖（sSRPS50、sSRPS70、sSRPSt和sARPSt）,用MTT法测定8个多糖和2个粗多糖（sARPStc、ARPStc）对CEF的安全浓度,然后将安全浓度内5种浓度的10个多糖与鸡新城疫病毒（NDV）以3种方式（先加多糖,后加多糖,多糖和病毒感作后）加入到CEF的培养体系中,用MTT法比较它们对新城疫病毒感染细胞能力的影响。结果显示,先加多糖时, sSRPS50、 sSRPS70、sARPSt、 sSRPSt在0.9775 μg·mL-1、其余多糖在3.91μg·mL-1时显着抑制NDV感染CEF；在后加多糖时sSRPS50、sSRPS70在0.2444～0.9775 μg·mL、ARPStp、SRPS50p和SRPS70p在0.2444～1.955μg·mL-1、sARPSt在0.2444μg·mL-1时显着抑制NDV感染CEF；多糖和病毒感作后加时,除了ARPStc外其余多糖均显着抑制NDV感染CEF。综合比较以SRPS50p和sARPSt制NDV感染细胞的作用较强,表明硫酸化修饰能够提高牛膝多糖的抗病毒活性。试验Ⅵ、两种硫酸化多糖体外对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响 为了比较两种多糖的增强免疫作用,将安全浓度范围内5种浓度的上述10个多糖分别单独或与PHA一起加入到鸡外周血液淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,多糖单独加入时,sSRPS50、sSRPS70、sARPSt在0.2444～3.91 μg·mL-1, sSRPSt在0.2444～0.9775 μg·mL-1、SRPS70p在0.2444～1.955 μg·mL-1、ARPStp和 SRPStp在0.4887-1.955 μg·mL-1、SRPS50p在0.4887～0.9775 μg·mL-1, ARPStc在0.2444μg·mL-1显着促进淋巴细胞增殖,sARPS,组的增殖率最高（91.7%）、其次是sSRPS50（75.59%）、sSRPS70 （68.3%）。与PHA一起加入时, sSRPS50在0.9775～1.955 μg·mL-1、sARPSt在0.2444～3.91μg·mL-1、SRPS70p在0.2444 μg·mL-1、SRPS50p在 0.4887～0.9775 μg·mL-1、ARPStp在0.2444～0.4887μg·mL-1协同PHA显着促进淋巴细胞增殖,sARPSt组的淋巴细胞增殖率最高,其次为SSRPS50和sSRPS70o综合比较以sSRPS50、sSRPS70和sARPSt的作用较强,表明硫酸化修饰能够提高黄精多糖和牛膝多糖的增强免疫活性。试验Ⅶ、两种硫酸化多糖对新城疫疫苗免疫应答的影响 为了比较两种硫酸化多糖的体内增强免疫作用,取14日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡360羽,随机均分为12组,除空白对照（BC）组外均用新城疫Ⅳ系苗免疫,28日龄时二免。在首次免疫的同时,10个多糖组分别同时注射各种上述各多糖,无佐剂对照（NA）组和空BC组注射等量生理盐水,每天1次,连续3d。分别于首免后第7 （D7）、14 （D14）、21 （D21）和28（D28）d每组随机抽取4羽心脏采血,用MTT法测定外周血淋巴细胞增殖,每组随机抽取6只翼静脉采血,用p-微量法测定血清抗体效价。结果显示,sSRPS70、sSRPSt、sARPSt和SRPS50p组在D7、sSRPS50、sSRPS70、sARPSt、SRPS70p、SRPS50p、SRPStp和SRPStc组在D14. sSRPS 50、sARPSt.SRPS70p、SRPStp、SRPS50p组在D21、sARPSt和SRPS50p组在D28的淋巴细胞增殖显着高于NA组,4个时间点的平均淋巴细胞增殖率以SRPS50p组率最高（86.63%）,其次为sARPSt（62.2%）,两组显着高于NA组；各多糖组在免疫后各时间点的抗体效价均高于、在D14和D21显着高于NA组。综合比较以sARPSt、SRPS50p增强细胞免疫和体液免疫的作用均较强,表明硫酸化修饰能显着提高牛膝多糖的增强免疫活性。试验Ⅶ、两种硫酸化多糖对鸡新城疫的疗效的比较为了比较两种硫酸化多糖的体内抗病毒作用,取27日龄蛋公鸡420只,随机均分为12组,空白对照组隔离饲养,不作任何处理,其余11组均用新城疫强毒攻毒,攻毒6h后10个多糖组分别开始注射上述10个多糖,每天1次,连续3d,病毒对照组和空白对照组注射生理盐水。每天观察各组鸡的临床症状及死亡情况,对死亡鸡只及时剖检,于攻毒后第12d所有存活鸡全部剖检,统计临床疗效；分别于攻毒前1 d、攻毒后第3、7、14 d采血测定血清抗体效价。结果显示,各多糖组的死亡率均低于、总有效率均高于病毒对照组,sARPSt和sSRPS50组的死亡率和总有效率与病毒对照组的差异显着；各多糖组在攻毒后各时间点的抗体效价均高于攻毒对照组,sARPSt和sSRPS50组均高于病毒对照组。结果表明,各多糖对鸡人工感染新城疫有一定的疗效,sARPSt和sSRPS50的疗效最为显着。试验Ⅸ、两种硫酸化多糖对新城疫病毒NP基因mRNA表达的影响为了验证两种硫酸化多糖的抗病毒作用和机理,测定了sSRPS50.sARPSt和SRPS50p对感染CEF的NDV NP基因mRNA表达的影响。培养鸡胚成纤维细胞,待细胞长成单层后,吸出细胞培养液,加入NDV液2 mL,4℃作用30 min,吸出病毒液,分别加入2种浓度的sSRPS50.sARPSt和SRPS50p 2 mL,培养72 h后收集细胞,提取总RNA。用Primer Premier软件设计了一对特异性NDV的NP基因引物,扩增出176 bp的NP蛋白基因片段,用荧光定量RT.PCR方法测定NDVNP基因mRNA的相对表达量。结果显示,各多糖组的NDVNP基因mRNA的相对表达量均显着小于病毒对照组,sARPSt高剂量组最低,其次为sSRPS50高剂量组。结果表明,3种多糖均能显着抑制NDV在CEF中增殖,sARPSt的作用最强。
刘菲[5]（2011）在《天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究》文中进行了进一步梳理我国是水禽生产大国,天府肉鹅具有良好的遗传特性,在整个西南地区的占有率很高,养殖规模较大,社会和经济效益显着。随着集约化养鹅业的发展,研究开发出能有效增强鹅疫苗的免疫力和对鹅病毒具有抑制或杀灭作用的生物制剂,对鹅病的有效防治具有重要的意义。IFN-α干扰素具有良好的广谱抗病毒活性和有效的免疫调节功能。本研究采用基因工程及相关技术,借鉴相关研究,对天府肉鹅IFN-α（tf-GoIFNα）进行克隆、表达及其功能与应用研究。1天府肉鹅干扰素-α基因的克隆及生物信息学分析采用RT-PCR法从天府肉鹅外周血单核细胞中扩增出其IFN-α基因（tf-GoIFNα）;并将上述扩增片段克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。用生物信息学软件及在线分析方法对tf-GoIFNα基因的核酸及氨基酸序列进行分析,同时分析13个与其相关的基因序列的相似性及进化情况。实验结果表明,tf-GoIFNα克隆成功,完整的ORF基因全长576个核苷酸,编码191个氨基酸,表达蛋白分子质量为21670.7Da,潜在的信号肽切割部位位于第28位的A（丙氨酸）和第29位的F（苯丙氨酸）氨基酸之间,二级结构主要由0-螺旋（H）和无规则卷曲组成,大致包括10个抗原表位；tf-GoIFNα基因编码的氨基酸序列含有2个潜在的N-糖基化位点,9个潜在的O-糖基化位点,含有5个潜在的磷酸化位点,第一个疏水区同信号肽位置一致,提示信号肽引导蛋白分泌到胞外作用,没有跨膜区,亚细胞定位预测,tf-GoIFNα表达的蛋白大约会有55.6%在细胞外,22.2%在细胞质,l 1.1%在线粒体,11.1%在细胞核；序列分析及比较结果显示tf-GoIFNα与同类的水禽（鸭、鹅）有90%之上的相似性,在进化树中位于同一分支。与狮头鹅的同源性最近,其中核酸相似性达到99.3%,氨基酸相似性达到97.9%；基因密码子特征分析表明,本研究所克隆的tf-GoIFNα为高表达、密码子偏性较高的基因,其密码子偏爱性情况与鸭IFN-α相近,与鸡IFN-α基因的密码子偏爱性有所不同,提示可以参照和借鉴已经开展的鸭IFN-α基因的表达,开展tf-GoIFN-α的表达及进一步的深入研究。2 tf-GoIFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性检测参照已克隆的tf-GoIFNα完整ORF基因序列设计引物,克隆到了成熟肽基因,基因全长486bp。将成熟肽基因与原核表达载体pET32a连接,构建原核表达载体pET32-mtf-GoIFN-α,并于表达菌Rosetta中表达,成功表达大小为38kDa的蛋白。表达蛋白经过Ni-IMAC亲和层析纯化以及稀释透析复性后,SDS-PAGE显示蛋白己纯化为单一条带。采用微量细胞病变抑制法分析测定IFN的抗病毒活性,纯化复性的重组质粒pET32-mtf-GoIFN-α表达蛋白抗VSV活性为104U/mL,比活性为5.5×103U/mmg。并且在GEF和DEF中检测到鹅IFN-α重组蛋白抗VSV效果是一致的。SYBR Green real-time PCR检测,复性后的tf-GoIFNα重组蛋白进行抗GPV,IFN保护组以及GPV组病毒拷贝数之间存在显着性差异（P<0.05）,tf-GoIFNα重组蛋白具有抗GPV的活性作用,对GPV病毒的相对抑制率达89.4%。3鹅IgG的提取纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备为了研究兔抗鹅IgG酶标抗体的制备,试验采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提,透析除盐,DEAE50纤维素层析相结合的方法提取鹅卵黄IgG,经核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG浓度,制备兔抗鹅IgG酶标抗体。结果表明：粗提的IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度可达到94.5%；免疫扩散得出兔抗鹅IgG抗血清效价约1：32,抗体酶标后效价为1：3000,具有应用价值。4 tf-GoIFN-α真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达为了进一步研究tf-GoIFNα基因的特性和功能,将tf-GoIFNα基因克隆到pcDNA3.1-（+）真核表达载体上,构建重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α,脂质体介导将其转入COS-7细胞,应用间接免疫荧光、ELISA和Western-blot法检测GoIFN-α基因在COS-7细胞中的转录和表达情况,并对COS-7细胞表达上清液进行抗病毒活性检测。结果表明,真核表达载体pcDNA3.1-GoIFN-α构建成功,目的蛋白在转染12h后就可以被检测出,36h前目的蛋白在上清液中快速增加,之后增加速度变慢；重组质粒能够在COS-7细胞内得到高效表达,表达的蛋白分子量为38kDa,比预测的分子质量（约21kDaA）大；间接免疫荧光显示,tf-GoIFNα基因产物由细胞核向细胞浆发散；表达产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒（VSV）及小鹅瘟病毒（GPV）的活性。5tf-GoIFN-α真核表达质粒对GPV-VP3基因疫苗的免疫佐剂效应为检测tf-GoIFN-α真核表达质粒（pcDNA-GoIFN-α）对GPV-VP3基因疫苗的佐剂作用,将pcDNA-GoIFN-α以每只50、100、200μg三个剂量与GPV-VP3基因疫苗一起用肌肉注射法分别免疫28日龄鹅,同时设分子佐剂gIL2对照组、分子佐剂GoIFN-α与gIL2联合免疫佐剂组、空载体质粒pcDNA3.1（+）对照组、小鹅瘟弱毒对照组和空白对照组,接种后第3、7、14、21、28、35、49d采抗凝血用淋巴细胞增殖试验（MTT法）测定鹅外周血T淋巴细胞转化；第3、7、14、21、28、35、49、63、77 d采凝血用间接ELISA法以及中和试验检测血清抗体水平。结果显示：（]）淋巴细胞对ConA的反应能力（OD值）pcDNA-GoIFN-a以不同剂量与GPV-VP3基因疫苗一起免疫鹅后,各实验组的T淋巴细胞增殖反应在第3d基本维持同一水平,从第3d到第28d稳步上升,在28 d达到了最高峰,而pcDNA-VP3免疫组在第35d达到高峰。在第28d,佐剂组的OD值均极显着（P≤0.01）高于pcDNA-VP3基因疫苗组、GPV弱毒组、pcDNA3.1 （+）和生理盐水对照组。GoIFN-α佐剂组只在第21d显着（P<0.05）高于gIL2佐剂组,其他时间点差异不显着。联合佐剂组在第14d、第28d到第49d均显着高于GoIFN-α或gIL2佐剂组（P<0.05）。（2）外周血抗体IgG水平（OD值）佐剂免疫组的ELISA抗体水平从第3d的增长趋势为先慢后快,至第35d到达最大值,之后逐渐下降,但仍明显高于pcDNA-VP3基因疫苗组和GPV弱毒组。gIL2佐剂组在第28d到第42d和63d到第77d显着高于GoIFN-α佐剂免疫组（P≤0.05）,GoIFN-α和gIL2联合佐剂免疫组在第21d到第77d极显着高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂免疫组（P≤0.01）。在GoIFN-α佐剂组中,佐剂作用呈一定的剂量相关性。（3）外周血中和抗体效价在免疫后第60d和第75d,GoIFN-α/gIL2联合佐剂组极显着（P≤0.01）高于GoIFN-α或gIL2佐剂组（表8-5）。佐剂组的中和抗体效价在第45d到第75d期间均显着（P≤0.05）或极显着（P<0.01）高于pcDNA-VP3组。GPV弱毒组在第45d显着高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂组诱导的中和抗体水平（P≤0.05）,与GoIFN-α和gIL2联合佐剂组所诱导的中和抗体水平差异不显着。整个检测过程中,注射pcDNA3.1（+）和生理盐水的鹅对照血清不能保护细胞对抗病毒的感染。实验证明,pcDNA-GoIFN-α能使GPV-VP3基因疫苗诱导的T淋巴细胞转化能力增强,血清抗体IgG水平和中和抗体效价升高,是一种良好的增强GPVVP3基因疫苗的分子佐剂,分子佐剂goIFN-α和golL2联合免疫组效果最佳,pcDNA-goIFN-α肌肉注射200μg/只的效果次之。6 tf-GoIFNα在毕赤酵母中的分泌表达及其活性检测为了更好的利用基因工程技术来开发重组鹅IFN-α制剂,应用PCR技术从含有tf-GoIFNα完整ORF的重组质粒pMD18-T-GoIFN-α中扩增鹅α干扰素的成熟肽基因,亚克隆于穿梭载体pPICZαA上,构建重组酵母表达质粒pPICZαA-GoIFN-α;重组质粒经sacⅠ线性化后,电转化入酵母表达菌X33；1%的甲醇诱导表达3株不同的菌72小时后,斑点杂交筛选出高拷贝的转化子,Elisa法鉴定筛选最佳表达时间和甲醇浓度。重组子经诱导表达,TCA浓缩后,SDS-PAGE和Western-blot分析,并采用微量细胞病变抑制法分析研究其生物活性。结果表明,成功构建了重组鹅IFN-α的酵母表达质粒,并实现了其在毕赤酵母中的分泌表达；SDS-PAGE和Western-blot分析显示获得分子量约为22kDa的表达蛋白,比预测的蛋白分子量（18.7kDa）略大,估计是糖基化的原因；表达产物对水泡型口炎病毒在鹅胚成纤维细胞中可起抑制作用,抗病毒活性为1.79×103U/mL。
马兴亮[6]（2008）在《奶山羊胎盘肽的分离提纯及其对小白鼠免疫功能的影响》文中认为自1985年,刘月新首次采用“匀浆-透析法”提取胎盘肽以来,广大科研工作者对胎盘肽进行了大量的理化分析与生物活性测定的研究,发现其在临床用于治疗病毒性肝炎、白细胞减少症、重症肌无力等免疫性疾病以及恶性肿瘤等,有较为理想的疗效。奶山羊胎盘的结构和功能与人的胎盘有许多相似之处,近几年来已有报道,从羊的胎盘中也可以提取出羊胎盘肽并且具有与人胎盘肽类似的生物学活性。但是对奶山羊胎盘肽的研究还没有,测定其理化性质和生物活性,看其与人胎盘肽的活性是否一致。可以为奶山羊胎盘肽的研究和将其用于治疗动物或人疾病方面提供一定的依据。以前的报道多集中于经透析或超滤制的的混合小肽的活性的研究。本试验将经过超滤和superdex75层析对混合小肽进行分离,通过检测各个组分的生物学活性来筛选有活性的组分,为下一步的生物合成或化学合成提供一定的依据。整个研究包括两大部分:一奶山羊胎盘肽的分离提纯和含量测定将冷冻的奶山羊胎盘常温解冻,洗净血液后用生理盐水冲洗胎盘,取胎盘的子叶,将子叶剪碎,经过反复冻融,经高速组织捣碎匀浆机匀浆,高速冷冻离心机离心沉淀,取上清液分别用0.45μm、0.22μm的滤器进行微滤,以除去不溶物质;微滤液经Millopor YM-10型超过滤器过滤得到粗样品,粗样品是无色透明液体,具有可透析性,可超滤性,无热原的小分子多肽,pH值为6.6～6.9;粗样品经superdex75层析得到四个组分肽类,分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,冷冻干燥后均为白色的粉末;四组分经加脲和甘油Tricine-SDS-PAGE电泳法电泳。结果显示组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的分子量分别为10.139KDa、8.166KDa、7.447KDa和6.761KDa;由考马斯亮蓝G-250法测定组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的含量分别为:0.96mg/g、1.2mg/g、1.32mg/g、1.8mg/g。二奶山羊胎盘肽对小白鼠免疫功能的影响本实验将小白鼠随机分为6大组,其中5组为实验组（分别腹腔注射组分:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和粗提物）;每个实验组又分为高中低三种剂量小组（分别为0.1mL、0.2mL、0.4mL）,每小组5只;对照组5只,仅注射生理盐水。每天注射一次,连续注射一周。通过对小鼠外周血血清白介素2含量、脾脏T淋巴细胞增殖反应、脾脏NK细胞活性和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响来考察奶山羊胎盘肽的免疫活性作用。1.通过放射性免疫法测定小鼠外周血中IL-2的含量,结果显示,组分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以显着提高小鼠外周血中IL-2的含量,比对照组提高了15.3%～30.1%（p<0.05）。2.通过MTT法测定脾脏T淋巴细胞增殖反应,结果显示,组分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以在体内能极显着协同ConA刺激脾脏淋巴细胞增殖（p<0.01）。3.通过MTT法测定脾脏NK细胞的杀伤活性,结果显示,组分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以极显着提高小白鼠脾脏NK细胞的杀伤活性（p<0.01）。4.通过腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验可知,组分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以极显着提高小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能（p<0.01）。由以上奶山羊胎盘肽对小鼠免疫功能影响的4个实验结果中,发现存在剂量关系,随着浓度的能加而增强,但是差异不显着;在奶山羊胎盘肽中有免疫活性的是组分Ⅲ和Ⅳ。
谢世平[7]（2007）在《爱康胶囊治疗HIV/AIDS脾肺虚弱证的临床研究》文中研究说明现代医学通过高效抗逆转录病毒疗法（highly active antiretroviral treat，HAART）治疗艾滋病，可以抑制病毒的复制，保存和恢复免疫功能，降低病死率和HIV相关性疾病的发病率，提高患者的生活质量。但在治疗过程中发现，抗病毒治疗存在着以下不足：（1）毒副作用大，部分患者不能耐受，不能坚持长期服用；（2）易产生耐药性，甚至出现变异毒株；（3）造价较高，价格昂贵等。近年来，中医药在治疗艾滋病机会性感染、改善患者生活质量、提高机体免疫功能、减轻和缓解化学药物治疗上的毒副作用等方面都起到了一定的作用。但在辨证治疗艾滋病方面，尚未取得突破性进展。辨证论治是中医理论的精髓，因此，开展HIV／AIDS的临床研究，有必要在辨病的前提下进行中医药辨证施治，以发挥中医药的优势。本课题对中药爱康胶囊治疗艾滋病常见证候脾肺虚弱证开展临床研究。目的：对爱康胶囊治疗HIV／AIDS脾肺虚弱证患者进行临床随机对照研究，并初步进行药效学、毒理学及药学试验，旨在客观评价爱康胶囊的疗效以及安全性，以期为艾滋病的临床治疗提供有效药物。方法：本课题采用单盲、随机平行对照的研究方法，纳入唐河县城郊乡、上屯乡等五个乡镇99例符合诊断标准和证候标准的患者作为临床治疗研究对象，按照治疗组：对照组=2∶1的比例，随机对患者进行分组。最终完成研究97例，其中治疗组65例、对照组32例。治疗组服用中成药爱康胶囊，对照组服用外观同治疗药物的安慰剂。治疗组患者服用爱康胶囊，一次五粒，一日三次，温开水送服；对照组服用安慰剂，服法同治疗组。试验以每三个月为一疗程，连续观察三个疗程。本研究在严格进行质量控制的前提下，观察两组临床症状，进行症状积分评定；采用艾森客量表测量生存质量；应用流式细胞仪检测免疫学指标CD4+、CD8+；应用病毒载量检测仪检测病毒载量值。结果：本研究最终纳入的97例病例一般情况的基线情况经统计分析，在α=0.05水准上无显着的统计学意义（P＞0.05），两组具有可比性。研究后结果显示：1症状积分爱康胶囊治疗HIV／AIDS脾肺虚弱证，在改善体倦乏力、食少纳呆、食后腹胀、喘促气短、自汗、恶风、神疲懒言、脘闷、肠鸣等症状方面与对照组比较，在疗后多个时间点上比较为P＜0.05，治疗组症状积分低于对照组的差别具有统计学意义。从两组症状积分图示来看，十余项症状表现治疗组积分整体均呈下降趋势，提示症状得到改善。主要症状体倦乏力在接受治疗1个月的时间点上积分陡然下降，提示爱康胶囊对于纳入病例实施了准确对症治疗，患者反应敏感，其他主症治疗3个月期间图示曲线下降幅度也较大，提示患者症状在治疗3个月后得到明显改善，喘促气短症状曲线整体趋势保持稳定下降，提示药物对现有样本当前症状的治疗改善作用持续稳定。次要症状治疗组积分也呈下降趋势，相同时间点治疗组优于对照组，提示药物干预的积极作用。走向图显示，治疗组与对照组自汗、肠鸣、恶风在治疗6个月后症状积分均增高，神疲懒言在治疗4个月症状积分均增高，考虑季节变化、气候特点以及由于季节改变伴随生活方式、饮食习惯的转变、农忙耕作对患者症状变化产生不同程度不可避免的干扰作用，但两组比较在统计学上仍有意义，且对照组的积分高于治疗组，提示爱康胶囊对于这些症状仍具有一定的疗效。综合各方面因素，参考症状积分，提示爱康胶囊对改善脾肺虚弱症状有积极疗效。从症状体征综合疗效来看，治疗组在治疗3个月后疗效显现，总的症状积分不断趋于降低，对照组则在治疗两月后积分曲线趋于平坦，经比较显示出爱康胶囊在改善患者症状上的良好疗效。疗后3个月与6个月，爱康胶囊在症状疗效的判断上，有效率达100％。2免疫指标检测了疗前、6个月、9个月的CD4+、CD8+、CD4+／CD8+，其中治疗组的CD4+依时间顺序为399.9±95.9、330.9±156.9、346.6±131.9，对照组为387.1±90.3、333.3±114.5、316.2±153.8，治疗前，经检验得，F组别=0.352，P组别=0.554＞0.05，提示两组对CD4+的差异在α=0.05水准上无统计学意义；F时间=14.019，P时间=0.001＜0.05，提示两组CD4+在治疗过程中不同时间的α=0.05水准上差异有统计学意义；对两组改善CD4+的疗效进行判定，得出疗前与6个月、疗前与9个月比较均为P＞0.05，提示在现有样本及条件下，治疗组与对照组对免疫功能的影响无差异。但治疗组在6个月出现回落后，9个月时较6个月时有所上升，9个月时有效率也较6个月时有所提高；对照组CD4+则随着疗程的延长而持续下降，因此，有必要延长疗程进行后续的研究。3病毒载量病毒载量费用较高，本课题随机选取了治疗组22例、对照组11例进行检测，其中获得有效数据治疗组14例、对照组10例。治疗组的结果在疗前、9个月时依次为4.28±0.68、4.08±0.71，对照组依次为4.57±1.00、4.52±1.06，经检验可知，疗前两组比较P=0.402＞0.05，提示疗前两组病毒载量的差异在α=0.05水准上无统计学意义；疗后两组比较P=0.242＞0.05，提示疗后两组病毒载量的差异在α=0.05水准上无统计学意义；但治疗组病毒载量下了0.2个log，高于对照组的0.05个log。4生存质量系采用诺丁汉健康量表（Nottingham Health Profile，NHP）中的健康问卷，从生存质量方面评价发现，躯体活动的F组别=6.256，P组别=0.014＜0.05，提示两组在躯体活动方面的差异在α=0.05水准上有统计学意义；F时间=6.056，P时间=0.003＜0.05，提示两组在治疗过程中不同时间的差异在α=0.05水准上有统计学意义。精力纬度的F组别=41.064，P组别=0.001＜0.05，提示两组在精力方面的差异在α=0.05水准上有统计学意义；F时间=20.532，P时间=0.001＜0.05，提示两组在治疗过程中不同时间的差异在α=0.05水准上有统计学意义。疼痛的F组别=4.483，P组别=0.037＜0.05，提示两组在疼痛方面的差异在α=0.05水准上有统计学意义；F时间=22.346，P时间=0.001＜0.05，提示两组在治疗过程中不同时间的差异在α=0.05水准上有统计学意义，且疗后治疗组躯体活动、精力、疼痛三个纬度的积分均低于各自对照组的积分，提示治疗组在这三个纬度上疗效优于对照组，这也与爱康胶囊能明显改善患者体倦乏力、食少纳呆等症状是相一致的，显示了爱康胶囊对脾肺虚弱证的良好效果。但患者在情感反应、社会生活、睡眠三个纬度上两组并无差别，提示患者服药期间仍因患此病在心理上具有很大压力，情绪低落，并因此而引起了患者的睡眠异常，提示了缓解患者的心理压力非单纯药物所能及。5临床安全性分析表明，血常规WBC、RBC、HGB、PLT四项均没有异常改变。治疗组与对照组肝肾功能治疗前后比较分析P＞0.05，提示爱康胶囊对肝肾功能没有损害。尿、粪常规、心电图以及胸透的统计分析表明，治疗组与对照组比较无明显差异。6药效学试验爱康胶囊可显着提高CY、氢化可的松致免疫抑制小鼠的免疫功能，可显着促进CY致免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，促进溶血素和溶血空斑形成，促进外周血淋巴细胞转化。结论：本研究拟研究爱康胶囊对HIV／AIDS脾肺虚弱证患者的疗效，经临床多个指标的观察，初步得出以下结论：1爱康胶囊能明显改善或消除HIV／AIDS患者脾肺虚弱证的体倦乏力、食少纳呆、食后腹胀、喘促气短、自汗、恶风、神疲懒言、脘闷、肠鸣等多个症状；能明显降低脾肺虚弱证患者的综合积分，对脾肺虚弱证有良好的临床疗效，并有控制其症状复发的作用。2爱康胶囊在治疗过程中有能延缓CD4+的下降，稳定或升高CD4+的趋势，有必要延长疗程进行后续研究。3爱康胶囊具有能降低HIV／AIDS脾肺虚弱证患者病毒载量的趋势。4爱康胶囊能改善患者的生存质量，特别是在躯体运动、精力、疼痛三个纬度上，具有显着效果。5爱康胶囊未见明显毒副作用，具有安全性。6爱康胶囊能提高免疫抑制小鼠的免疫功能。
翁瑞文[8]（2007）在《DHBV模型定量评价体系的建立及用于评价中药复方抑制DHBV作用》文中进行了进一步梳理目前全世界大约有4亿人感染了乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV），每年因此有30万人成为肝癌患者，每年因HBV感染而死亡的人数为50—120万；全世界有1／3的人在其一生中会感染上HBV，HBV慢性感染率从2％—20％不等，对于HBV的研究一直是热点问题。DHBV与HBV同属嗜肝DNA病毒科，DHBV与HBV在复制形式、致病机理等方面有着众多的相似之处，所以鸭乙肝模型一直被用作抗HBV药物筛选及HBV致病机理研究的动物模型；多年来对于DHBV检测一直采用斑点杂交，该方法具有可进行大规模检测、价格便宜等优势，但精确性不高；而且目前鸭乙肝模型评价药效一般给药10天，这对于药效温和的中药抑制DHBV作用评价则时间太短，且斑点杂交精确性也不高；鸭胚肝细胞模型一直在国外被认为是唯一一类病毒直接感染、复制的原代细胞模型，很受重视。而其培养上清中的DHBV变化要用斑点杂交进行评价则很困难，且不准确。因此本研究建立了DHBV体内外模型的定量评价体系，并用该评价体系对中药复方的抑制DHBV作用进行了评价。1通过对Genbank中所公布的所有DHBV全基因序列进行对比，找出保守序列，设计了DHBV荧光定量PCR引物和探针，并构建了包含该套引物探针靶序列的DHBV荧光定量PCR标准品质粒。用探针检测标准品后表明，该方法在8个浓度梯度范围具有良好的线性关系，能够很好的检测最高2×107—2copy／25μL反应体系。批内差异最大只有2.03％，批间最大变异系数仅为2.47％。2通过对NP-40提取法、辛酸钠提取法和达晖生物公司的血清病毒DNA提取试剂盒的对比，最终表明了辛酸钠法与达晖生物试剂盒提取效果相似，NP—40法效果较差。辛酸钠法是适合于DHBV荧光定量PCR标本提取的高效、经济的方法。3用普通PCR方法对100只1日龄广东麻鸭进行DHBV阳性筛选，用筛选所得先天感染DHBV的鸭作为模型动物对扶正利湿活血复方水煎剂进行抑制DHBV效果评价，共给药1个月，分别于开始给药当天（D0）、给药第10天（D10）、给药第20天（D20）、给药第30天（D30）及停药第5天（P5）采集血清，用荧光定量PCR法进行检测，结果表明，扶正利湿活血复方高、低剂量组在给药后第10、20、30天时均可使先天感染鸭乙肝模型血清DHBV载量明显降低，停药5天后也有一定抑制作用。4分别对DHBV先天感染和后天感染的鸭胚肝细胞培养上清中DHBV在载量动态变化进行检测，结果表明，先天感染的鸭胚肝细胞中，细胞接种后第1天上清中的病毒含量最高，第2天则有所下降，随后逐渐上升，至第6天后达到稳定波动，但都达不到第一天的水平。但是先天感染DHBV鸭胚肝细胞上清中DHBV载量都在108内波动。因此较为稳定。在后天DHBV感染的鸭胚肝细胞中，DHBV感染时间是在细胞长成单层以后，但其上清中仍然出现了DHBV感染后第一天DHBV载量最高，第二天大幅下降，第三天逐步上升，一直至DHBV感染后第11天达到最高值。这与以前用斑点杂交检测认为DHBV感染后第六天培养上清中的DHBV达到高峰明显不同。但后天感染DHBV的鸭胚肝细胞培养上清中的DHBV载量波动幅度较大，波动范围为1e5—1e8copy／ml之间。本研究分别以20ul、50ul、100ulDHBV阳性血清感染鸭胚肝细胞，这三种DHBV感染剂量均在第11天时DHBV达到高峰，DHBV含量只在感染后前2天有明显差别，随后均无明显区别。5用先天感染DHBV的鸭胚肝细胞对扶正利湿活血复方的水提物和醇提物进行抑制DHBV药效评价，共给药5天，结果表明，扶正利湿活血复方水提物3个剂量组均无明显抑制鸭胚肝细胞培养上清中的DHBV作用，而其醇提物则显示明显抑制作用，这表明扶正利湿活血复方水煎剂在鸭体内可能不是通过直接抑制DHBV而起作用。扶正利湿活血复方醇提物显示了明显抑制鸭胚肝细胞培养上清中DHBV的作用，说明醇提物中的成分不同于水提物，其中可能含有直接抑制DHBV作用的物质，值得进一步研究。本文完整的建立了荧光定量PCR检测DHBV的方法，使DHBV检测敏感性、精确性大大提高；建立了经济而精确高效的血清DHBV提取方法，整合于DHBV定量PCR方法中，使DHBV定量检测可以经济而精确的大规模应用。首次将鸭乙肝动物模型给药时间延长至1月，使之更适合于中药抑制HBV药效评价；首次用荧光定量PCR方法检测了先天感染、后天感染DHBV的鸭胚肝细胞培养上清中DHBV载量的动态变化，并表明先天感染鸭胚肝细胞培养上清中DHBV载量变化在一个数量级之内，比后天感染更适合于抗HBV药效体外评价。通过这些建立了抗DHBV药效体内外定量评价体系，在抗HBV药物体内外模型研究方面作出了创新性工作，提高了模型的精确性、敏感性。本文还利用建立的抗DHBV药效体内外定量评价体系评价了中药扶正利湿活血复方的抑制DHBV作用，表明该复方水煎剂在给药1月内在体内能够明显降低血清中的DHBV载量；体外在上药5天内，水提物3个剂量均无明显抑制DHBV作用，而醇提物3个剂量均有一定抑制DHBV作用。说明水煎剂体内抑制DHBV可能不是通过直接抑制DHBV而起作用。本文DHBV定量评价体系如再建立DHBVcccDNA定量检测方法则更加全面；扶正利湿活血复方的抑制DHBV效果仍需要更多重复以确定其效果。
盖丽丽[9]（2007）在《小柴胡片对慢性乙肝患者外周血树突状细胞抗原递呈的影响》文中指出研究目的1．了解正常人与慢乙肝患者外周血单核细胞来源的树突状细胞（dendritic cell DC）是否具有功能上的差异，探讨慢乙肝患者体内HBV持续感染的机制。2．从细胞免疫学角度评价小柴胡片治疗前后慢乙肝病人外周血DC的抗原提呈功能的变化，并探讨打破HBV持续感染状态可能办法。3．探索HBcAg负载对DC抗原提呈能力及刺激CTL特异性活化的影响，从而尝试将HBcAg负载作为刺激慢乙肝病人DC功能恢复或上调的新办法。研究方法1．慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的分离培养：收集临床试验中出现良好临床应答的5例患者的肝素抗凝外周血，用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞（PBMC），调整细胞浓度至2×106个／孔，接种于6孔细胞培养板，贴壁培养3小时后，获得单核细胞，再添加rhGM-CSF和rhIL-4终浓度分别达到100ng／ml和500U／ml，置37℃、5％CO2细胞培养箱继续培养，至第7天添加rhTNF-α，使其终浓度达到60ng／ml，继续培养至第11天，荧光显微镜下采集成熟DC的图像。收集培养的DC，运用流式细胞术检测DC表面标志CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达水平，并将DC与自体T淋巴细胞进行自体混合淋巴细胞反应（AMLR）鉴定DC刺激T细胞增殖的能力。2．HBcAg负载对DC刺激细胞增殖能力和CTL分泌IFN-γ水平的影响：我们引入了具有极强免疫原性的HBcAg刺激培养治疗后的慢乙肝患者DC，通过流式细胞术和自体混合淋巴细胞反应（AMLR）分析负载前后DC表面标志表达水平和刺激淋巴细胞增殖能力的变化，再利用酶联免疫斑点试验（ELISPOT），分析抗原负载后DC对于CTL的活化，特别是IFN-γ的分泌水平的变化，考察慢性乙型肝炎患者治疗后临床指标的改善与机体内细胞免疫功能之间是否存在联系。3．HBcAg负载的DC对CTL应答的影响：CTL应答的强弱可以通过细胞毒性试验进行判定。我们将治疗后的慢乙肝患者DC用HBcAg负载后作为刺激细胞与自体的外周血淋巴细胞混合培养为效应细胞，以人肝癌细胞系HepG2和转染了HBV病毒的HepG2.2.1.5细胞作为靶细胞，运用乳酸脱氢酶释放试验（LDH释放试验）检测CTL对两种靶细胞的杀伤作用，进而评价HBcAg负载DC对CTL应答能力的作用。研究结果1．成功诱导培养出5例正常人及5例获得临床应答的慢乙肝患者外周血单核来源DC，并进行了鉴定：培养11天后，在荧光显微镜下可以看到细胞体积明显增大，胞体可见大量毛发样突起，细胞形态不规则，呈半悬浮生长状态，细胞增殖不明显，具备典型DC的形态学特征；正常人群与CHB患者的外周血DC在分子表面标志CD1a、CD80、CD83、CD86的表达分别为（49.8±3.3）％VS（40.5±2.9）％、（75.0±1.2）％VS（43.3±1.9）％、（21.3±2.8）％VS（6.8±1.4）％、（56.0±1.1）％VS（72.3±3.0）％，两组间比较有显着差异（P＜0.01）；而HLA-DR则分别为（95.7±1.2）％和（96.7±1.0）％，两组间比较无显着差异（P=0.120）；正常人和CHB患者DC与自体T细胞在1：60混合比的刺激指数SI分别为（2.20±0.14）VS（1.84±0.03），两者比较有显着差异（t=5.722，P=0.000）2．CHB患者接受治疗前后CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达率分别为（40.5±2.9）％VS（41.1±2.6）％、（43.3±1.9）％VS（44.1±2.0）％、（6.8±1.4）％VS（8.6±0.8）％、（72.3±3.0）％VS（73.1±2.3）％和（96.7±1.0）％VS（97.1±0.7）％，治疗前后无显着差异（P=0.748，0.488，0.122，0.543，0.503）；经HBcAg刺激的DC与无HBcAg刺激的DC相比，两者的分子表面标志表达率也基本无太大的改变，但其中的CD83的表达分别为（11.0±1.2）％和（8.6±0.8）％，两者比较有显着差异（P＜0.05）；在最适混合比培养下，正常人组与CHB治疗前、CHB治疗后（无HBcAg负载）和CHB治疗后（HBcAg负载）的DC刺激增殖SI分别为：2.20±0.14、1.85±0.03、1.95±0.03、2.06±0.02和1.95±0.03，组间比较有显着差异（P＜0.000，P＜0.005，P＜0.000）。HBcAg负载DC刺激PBLs与无HBcAg负载DC刺激PBLs均能活化较多的CTL，并分泌出较高水平的IFN-γ，5例CHB病人分别用HBcAg负载的DC刺激PBLs，均显示出强烈的刺激CTL分泌IFN-γ的作用，与无HBcAg负载的DC相比，其刺激强度有显着差异（P＜0.05）。3．5例接受治疗的CHB患者的外周血单核来源DC经过HBcAg刺激后，对于两种靶细胞——HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率分别为（57.93±3.00）％和（77.73±3.63）％，两者间比较有显着差异（t=-16.284，P=.000）；未经HBcAg刺激的DC对两种靶细胞——HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率分别为（47.42±2.02）％和（64.45±1.76）％，两者间比较也有显着差异（t=-24.559，P=0.000）；无HBcAg负载DC刺激自体PBLs与未受DC刺激的自体PBLs对两种靶细胞HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率之间也有显着差异（t=-13.527，P=0.000；t=-15.526，P=0.000）；HBcAg负载DC刺激自体PBLs与未受DC刺激的自体PBLs对两种靶细胞HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率之间也有显着差异（t=-3.881，P=0.001；t=-22.345，P=0.000）；5例接受治疗的CHB患者DC经HBcAg刺激或无HBcAg刺激与HepG2反应产生CTL杀伤率各自进行比较，分别为：（56.40±1.57）％VS（46.60±4.12）％、（59.17±2.64）％VS（49.20±0.46）％、（55.67±0.71）％VS（48.00±1.44）％、（58.23±1.10）％VS（46.60±0.89）％和（62.00±0.44）％VS（46.70±0.75）％，病例1经HBcAg刺激与否的自身比较无显着差异（t=2.83，P=0.104），病例2、3、4、5经HBcAg刺激与否的自身比较均有显着差异（P=0.016，0.010，0.006.0.001）；5例慢性乙型肝炎患者DC经HBcAg刺激或无HBcAg刺激与HepG2.2.1.5反应产生CTL杀伤率各自进行比较，分别为：（74.67±1.29）％VS（61.90±0.60）％、（81.77±0.72）％VS（63.73±0.21）％、（74.17±1.40）％VS（64.47±0.85）％、（76.33±1.34）％VS（65.73±1.21）％和（81.70±1.45）％VS（64.40±0.70）％，5个病例经HBcAg刺激与否的自身比较均有显着差异（P=0.003，0.000，0.012.0.005，0.006）。研究结论1．CHB患者外周血DC刺激自体淋巴细胞增殖能力下降。我们认为，DC的刺激增殖能力下降与其表面黏附分子的表达下降有一定关系，可能是表面黏附分子的表达下降导致DC抗原提呈能力的下降，进而影响了DC的刺激增殖能力。提高CHB患者DC的抗原提呈能力可能有助于HBV感染者体内的病毒清除。2．慢乙肝病人接受小柴胡汤治疗前后DC的表面标志表达水平无显着差异，但治疗后的表达呈上升趋势，表明治疗后CHB患者外周血DC的黏附分子的表达得到了一定程度上调，经HBcAg刺激后CD83表达水平的上调，可能与DC的成熟度提高、抗原提呈能力的恢复有一定关系；综合表面标志表达水平、AMLR和ELISPOT的结果，我们认为，HBcAg负载可以使治疗后患者的DC抗原提呈能力得到上调或恢复，从而使DC启动的Th和CTL细胞免疫应答得到增强或恢复。3．CHB患者DC经HBcAg冲击后，能有效提呈HBcAg，诱导HBcAg特异性CTL反应。我们的实验证实，慢性乙型肝炎患者单核细胞来源的DC经HBcAg抗原冲击后，能有效的诱导HBV特异性CTL。该结果为DC作为免疫佐剂进行慢性乙型肝炎免疫治疗提供了有益的实验依据。小柴胡汤作为治疗慢乙肝的有效方剂已被大量的临床及实验研究证实，其具有免疫调节作用，对多种细胞因子的调节均有影响。考虑入选本次研究的患者仅接受了小柴胡汤片剂的治疗，并未进行西医临床的抗病毒治疗，结合我们整个DC功能的实验究结果分析，可以推断，小柴胡汤片剂可能对患者外周血DC的抗原提呈功能的恢复或上调具有一定作用，因而可能使免疫功能得到一定提高。
孔庆波[10]（2005）在《转移因子增强犬细胞免疫功能的作用机理研究》文中进行了进一步梳理转移因子（transfer factor,TF）由T 淋巴细胞产生,分子质量小,化学本质为小肽与寡聚核苷酸复合物。TF 能够将供体的细胞免疫功能转移给受体,尤其是非特异性TF 能够提高受体天然免疫和特异性免疫功能的特性使其在人类和多种动物疾病防治中获得普遍应用。弄清TF 增强犬免疫功能的细胞和分子机制,无疑将为TF 临床用于犬病尤其是犬传染病的防治提供理论依据和指导。本研究首先提取制备了研究所需要的猪、犬TF,然后选择杂种牧羊犬作为实验犬,用淋巴细胞转化增殖试验MTT 法、流式细胞技术、ELISA、吞噬杀伤试验MTT 法,检测了实验犬注射猪TF、犬TF 前后不同时间的淋巴细胞增殖效果、T 细胞亚群的变化、在免疫应答调控中起重要作用的细胞因子（IL-2、IL-12、IL-4 和IFN-γ）分泌量的变化、外周血中性粒细胞吞噬杀伤活性的变化。在此基础上,用猪TF 等联合治疗人工感染和自然发病的犬细小病毒病,对猪TF 的效果进行评估。试验获得如下结果: 1.制备的猪、犬TF 理化性质相似,所制备的TF 可供本研究使用。2.淋转试验中,PHA-P 在12.5μg/mL 时对犬淋巴细胞有促进增殖的作用,但t 检验分析表明,其促进淋巴细胞增殖的效果并不显着。ConA 在浓度为0.5～2.5μg/mL 范围内均可以显着刺激T 细胞的增殖（P<0.05）,且在浓度为2.5μg/mL 时刺激效果最佳。LPS在浓度为40μg/mL 时,能够显着刺激B 细胞增殖;同种、异种TF 均可以单独刺激犬淋巴细胞增殖,但同种TF 的作用效果要优于异种TF。在协同PHA-P 刺激淋巴细胞增殖时,同种TF 的作用在较大的浓度范围内（0.097～12.5mg/mL）能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖,而异种TF 只在较小的浓度范围内（0.097～3.125mg/mL）能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖;但在协同ConA 刺激淋巴细胞增殖时,同种TF 的作用却在较小的浓度范围内（0.097～0.78mg/mL）能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖,而异种TF 只在浓度范围0.78～3.125mg/mL 内能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖。注射异种TF 后,在6～10d 内,犬淋巴细胞单独增殖的能力越来越强。注射了异种TF 的犬,其淋巴细胞再次受到TF 单独或协同丝裂原刺激时,淋巴细胞的增殖能力呈现早期（4～6d）下降趋势,后期（6d 后）受到抑制的现象。3.同种、异种TF 均可提高犬外周血淋巴细胞数量,CD4/CD8 比值变化分析证实,外周血增加的淋巴细胞中主要为CD4+ T 细胞。犬注射同种、异种TF 后在20d 内CD4+ T 细胞呈现持续增加的规律。同种TF 促进犬外周血CD4+ T 细胞上升的作用优于异种TF。4.犬注射同种、异种TF,均可提高淋巴细胞分泌IFN-γ。注射犬TF 后第10 天,犬
二、植物血凝素皮肤试验检测病毒性肝炎非特异性细胞免疫功能——222例观察报导（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、植物血凝素皮肤试验检测病毒性肝炎非特异性细胞免疫功能——222例观察报导（论文提纲范文）
（1）结核分枝杆菌抗原特异性细胞免疫反应鉴别诊断潜伏性结核感染和活动性结核病（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 主要仪器设备 |
| 引言 |
| 第一部分 结核分枝杆菌潜伏相关抗原鉴别诊断活动性结核病和潜伏性结核感染的准确性研究 |
| 研究对象与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 结核分枝杆菌特异性抗原多细胞因子应答的免疫反应在诊断结核感染中的应用价值研究 |
| 研究对象与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 结核分枝杆菌特异性T细胞免疫与结核感染研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）从免疫应答、氧化损伤及中药干预机理探讨上呼吸道病毒感染温病证型特点（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 一、古代医学在温病学范畴关于温热类温病、湿热类温病的论述 |
| (一) 温热与湿热的分类源流 |
| (二) 温热类温病 |
| (三) 湿热类温病 |
| 二、岭南温病近代研究概况 |
| (一) 岭南地区地理气候特点与人群体质特点 |
| (二) 岭南地区常见温病及治法用药特点 |
| (三) 以岭南温病理论为指导治疗现代感染性疾病临床发挥 |
| 三、病毒感染与免疫失衡、炎症损伤,氧化应激反应机制及与温病温热证、湿热证的相关性现代研究基础 |
| (一) 免疫系统各组成成员简介与病毒感染 |
| (二) 温热证的现代研究概况 |
| (三) 湿热证的现代研究概况 |
| (四) 呼吸道病毒感染性疾病与温病温热证、湿热证的关系 |
| 四、病毒性上呼吸道感染的现代医学研究现状及治疗局限性 |
| (一) 急性上呼吸道感染流行病学 |
| (二) 急性病毒性上呼吸道感染的病原学 |
| (三) 西医治疗局限性 |
| 五、蒿芩清胆汤治疗病毒性疾病的应用及现代药理作用研究 |
| (一) 蒿芩清胆汤的组成、功效、主治和配伍特点 |
| (二) 蒿芩清胆汤在病毒感染性疾病中的应用 |
| (三) 蒿芩清胆汤的药理作用现代研究概况 |
| 六、麻杏石甘汤治疗病毒性疾病的应用及现代药理作用研究 |
| (一) 麻杏石甘汤的组成、功效、主治和配伍特点 |
| (二) 麻杏石甘汤在病毒感染性疾病中的应用 |
| (三) 麻杏石甘汤的药理作用现代研究概况 |
| 第二章 临床研究 |
| 一、临床病例 |
| (一) 研究对象 |
| (二) 试验设计 |
| (三) 诊断标准 |
| (四) 研究方法 |
| 二、相关实验室指标处理 |
| (一) 观察指标 |
| (二) 指标检验方法 |
| 三、数据统计学处理方法 |
| 四、统计结果与分析 |
| (一) 入组时一般资料分析 |
| (二) 各组病毒抗原阳性率的比较 |
| (三) 治疗后各组退热时间比较 |
| (四) 治疗前后各组中医证候评分比较 |
| (五) 治疗前后各组西医症状评分比较 |
| (六) 治疗后疾病疗效比较 |
| (七) 中医证候疗效比较 |
| (八) 各组治疗前后安全性观测 |
| (九) 不良反应 |
| (十) 免疫功能指标比较 |
| (十一) 细胞因子指标比较 |
| (十二) 氧化反应指标比较 |
| (十三) 免疫功能与氧化反应指标变化与上呼吸道病毒感染温病证型的相关性研究 |
| 第三章 讨论 |
| 一、岭南急性病毒性上呼吸道感染病原学特点 |
| 二、病毒性上呼吸道感染温热证、湿热证的免疫应答机制研究 |
| 三、病毒性上呼吸道感染温热证、湿热证的氧化损伤机制研究 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 课题来源 |
| 致谢 |
（3）山羊胎盘肽的分离和初步鉴定及营养、免疫、抗氧化作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 胎盘肽的理化性质和生物学活性研究进展 |
| 1.1.1 胎盘肽的概念及其理化性质 |
| 1.1.2 免疫调节活性研究进展 |
| 1.1.3 延缓衰老的作用 |
| 1.1.4 对皮肤的保健作用 |
| 1.1.5 其他的生物功能 |
| 1.2 胎盘的临床应用 |
| 1.2.1 治疗病毒性肝炎 |
| 1.2.2 护肝作用 |
| 1.2.3 抗结核作用 |
| 1.2.4 辅助治疗恶性肿瘤 |
| 1.3 细胞免疫和抗氧化能力检测方法研究进展 |
| 1.3.1 白细胞介素-2 检测方法 |
| 1.3.2 淋巴细胞转化检测方法 |
| 1.3.3 先天性免疫细胞的检测 |
| 1.3.4 抗氧化能力的检测指标简介 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 胎盘的处理 |
| 2.3.2 超滤的操作方法 |
| 2.3.3 用 Superdex-75 层析柱对粗样品进行分离提纯的操作方法 |
| 2.3.4 灌胶 |
| 2.3.5 电泳 |
| 2.3.6 氨基酸分析操作方法 |
| 2.3.7 矿物元素分析方法 |
| 2.3.8 山羊胎盘肽对小鼠免疫功能的影响 |
| 2.3.9 山羊胎盘肽对小鼠抗氧化能力的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 胎盘肽的提取分离和初步鉴定 |
| 3.2 氨基酸分析结果 |
| 3.3 矿物元素测定结果 |
| 3.4 胎盘肽对小鼠免疫功能的影响 |
| 3.5 山羊胎盘肽对小鼠抗氧化能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 山羊胎盘肽的分离提纯和初步鉴定 |
| 4.2 山羊胎盘肽的氨基酸和矿物元素分析 |
| 4.3 山羊胎盘肽对小鼠免疫作用的影响 |
| 4.4 山羊胎盘肽对小鼠抗氧化能力的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 硕士学位论文内容简介及自评 |
（4）黄精多糖和牛膝多糖及其硫酸化产物的抗病毒和增强免疫活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 第一章 黄精多糖研究进展 |
| 1 黄精的生物学特性 |
| 2 黄精的化学成分及药用价值 |
| 3 黄精多糖的提取和纯化及糖含量的测定 |
| 3.1 黄精多糖的提取 |
| 3.2 黄精多糖的纯化 |
| 3.3 分子结构及分子质量 |
| 3.4 糖含量的测定 |
| 4 黄精多糖的生物活性 |
| 4.1 增强免疫活性 |
| 4.2 抗病毒活性 |
| 4.3 抗氧化作用 |
| 4.4 其他生物活性 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 牛膝多糖研究进展 |
| 1 牛膝的主要化学成分 |
| 2 牛膝多糖的提取及纯化 |
| 3 牛膝多糖的药理作用 |
| 3.1 增强免疫作用 |
| 3.2 抗病毒作用 |
| 3.3 抗衰老和抗氧化作用 |
| 3.4 抗凝血作用 |
| 3.5 抗肿瘤作用 |
| 3.6 降血糖作用 |
| 3.7 其他活性 |
| 4 应用前景与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 多糖的分子修饰及本研究的目的意义 |
| 1 修饰方法及意义 |
| 1.1 多糖类化学性分子修饰 |
| 1.2 物理修饰 |
| 1.3 生物学修饰 |
| 2 本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第四章 黄精多糖和牛膝多糖的提取 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 多糖的提取 |
| 1.5 多糖的糖含量测定 |
| 1.6 蛋白含量测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黄精多糖的提取率、糖含量及蛋白含量 |
| 2.2 牛膝多糖的提取率、糖含量及蛋白含量 |
| 3 讨论 |
| 3.1 分级多糖的提取 |
| 3.2 多糖提取前药材的预处理 |
| 3.3 多糖含量的测定 |
| 参考文献 |
| 第五章 两种多糖体外对新城疫病毒感染细胞能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 多糖准备 |
| 1.2 病毒准备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 各多糖对CEF的生长和安全浓度的测定 |
| 1.6 多糖对NDV感染CEF能力的测定 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黄精多糖对CEF的生长和最大安全浓度 |
| 2.2 牛膝多糖对CEF的生长和最大安全浓度 |
| 2.3 黄精多糖对NDV感染CEF能力的影响 |
| 2.4 牛膝多糖对NDV感染CEF能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 两种多糖对CEF的安全浓度 |
| 3.2 SRPS抗病毒活性的比较 |
| 3.3 ARPS抗病毒活性的比较 |
| 参考文献 |
| 第六章 两种多糖体外对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 多糖准备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 SRPS单独刺激时淋巴细胞增殖的变化 |
| 2.2 SRPS与PHA共同刺激时淋巴细胞增殖的变化 |
| 2.3 ARPS单独刺激时淋巴细胞增殖的变化 |
| 2.4 ARPS与PHA共同刺激时淋巴细胞增殖的变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 黄精多糖对淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.2 牛膝多糖对淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.3 多糖增强免疫活性与分子量的关系 |
| 参考文献 |
| 第七章 两种多糖的纯化及硫酸化修饰条件的优选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 多糖准备 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 SRPS和ARPS的纯化 |
| 1.4 因素水平确立 |
| 1.5 酯化试剂制备和酯化操作 |
| 1.6 硫酸基取代度的测定 |
| 1.7 修饰条件的优选和验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 SRPS_(tc)柱层析的洗脱曲线 |
| 2.2 ARPS_(tc)柱层析的洗脱曲线 |
| 2.3 SRPS_(tp)的正交实验 |
| 2.4 ARPS_(tp)的正交实验 |
| 2.5 SRPS、sSRPS和ARPS、sARPS的红外光谱结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 多糖的纯化方法 |
| 3.2 SRPS_(tp)硫酸化修饰的最佳条件 |
| 3.3 ARPS_(tp)硫酸化修饰的最佳条件 |
| 参考文献 |
| 第八章 两种硫酸化多糖体外对新城疫病毒感染细胞能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 多糖准备 |
| 1.2 病毒准备 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 多糖对CEF安全浓度测定 |
| 1.5 NDV感染CEF能力的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 各多糖对CEF的生长和安全浓度 |
| 2.2 先加多糖时NDV感染CEF能力的变化 |
| 2.3 后加多糖时NDV感染CEF能力的变化 |
| 2.4 多糖和病毒感作后加时NDV感染CEF能力的变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 四种硫酸化多糖和未修饰多糖对NDV感染CEF能力的影响 |
| 3.2 四种硫酸化多糖和未修饰多糖抗病毒作用的比较 |
| 参考文献 |
| 第九章 两种硫酸化多糖体外对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 多糖准备 |
| 1.2 主要试剂及其配制 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 外周血淋巴细胞增殖的测定 |
| 1.5 数据分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 多糖单独刺激时淋巴细胞增殖的变化 |
| 2.2 多糖与PHA共同刺激时淋巴细胞增殖的变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 硫酸化多糖对淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.2 多糖对淋巴细胞增殖作用与浓度之间的关系 |
| 参考文献 |
| 第十章 两种硫酸化多糖对新城疫疫苗免疫应答的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 多糖准备 |
| 1.2 试剂与疫苗 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 动物分组及处理 |
| 1.5 抗体效价测定 |
| 1.6 淋巴细胞增殖测定 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 淋巴细胞增殖的变化 |
| 2.2 血清抗体效价的变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 硫酸化多糖对细胞免疫的影响 |
| 3.2 硫酸化多糖对体液免疫的影响 |
| 参考文献 |
| 第十一章 两种硫酸化多糖对鸡新城疫的疗效比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 多糖准备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 ND病毒 |
| 1.4 动物分组及处理 |
| 1.5 疗效判定 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床症状的变化 |
| 2.2 病理剖检变化 |
| 2.3 各组的临床疗效 |
| 2.4 各组血清抗体效价的变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 两种硫酸化多糖对雏鸡人工感染新城疫的疗效 |
| 3.2 两种硫酸化多糖对攻毒后抗体效价的影响 |
| 3.3 多糖的抗病毒活性机制 |
| 参考文献 |
| 第十二章 两种硫酸化多糖对感染CEF的NDV NP基因的MRNA表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 多糖准备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 ND病毒感染细胞及样品收集 |
| 1.5 CEF总RNA的提取和反转录 |
| 1.6 PCR引物的设计 |
| 1.7 NDV的RT-PCR反应 |
| 1.8 NDV的Real-time PCR扩增 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡NDV的RT-PCR扩增 |
| 2.2 NDV Real-time PCR扩增 |
| 2.3 NDV NP mRNA表达量的变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 硫酸化多糖对NDV NP基因mRNA表达的影响 |
| 3.2 NDV NP基因的检测方法 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 攻读学位期间发表和完成的学术论文 |
| 致谢 |
（5）天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要(ABSTRACT) |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 干扰素的分类及性质 |
| 1.1 Ⅰ型干扰素 |
| 1.2 Ⅱ型干扰素 |
| 1.3 Ⅲ型干扰素 |
| 2 干扰素的分子结构 |
| 3 干扰素的产生 |
| 4 干扰素的作用机制 |
| 4.1 干扰素受体 |
| 4.1.1 Ⅰ型干扰素受体 |
| 4.1.2 Ⅱ型干扰素受体 |
| 4.1.3 IFN-γ受体 |
| 4.2 干扰素的信号传导和效应途径 |
| 4.2.1 干扰素的信号传导 |
| 4.2.1.1 IFN-α/β |
| 4.2.1.2 IFN-γ |
| 4.2.2 效应途径 |
| 4.2.2.1 PKR途径 |
| 4.2.2.2 2'-5'OAS途径 |
| 4.2.2.3 Mx途径 |
| 5 IFN的生物学活性 |
| 5.1 抗病毒繁殖作用 |
| 5.2 抑制细胞分裂增殖、抗肿瘤作用 |
| 5.3 免疫凋节作用 |
| 5.4 免疫佐剂作用 |
| 5.5 干扰素与机体组织系统的相互作用和影响 |
| 5.5.1 干扰素信号的负调控因素 |
| 5.5.1.1 SOCS家族 |
| 5.5.1.2 PIAS家族 |
| 5.5.1.3 PTP家族 |
| 5.5.2 干扰素与神经内分泌系统的相互作用 |
| 5.5.3 病毒对干扰素的抵抗 |
| 5.5.3.1 转录水平的抑制—病毒阻抑干扰素的诱生 |
| 5.5.3.2 病毒对干扰素信号通路的抑制 |
| 5.5.3.3 病毒对干扰素效应蛋白的抑制 |
| 6 家禽α干扰素的研究概况 |
| 7 IFN的基因工程研究及应用 |
| 7.1 IFN的基因工程研究 |
| 7.2 干扰素的应用 |
| 7.3 干扰素临床应用中的副作用问题 |
| 8 α干扰素作为免疫佐剂的研究进展 |
| 9 利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究 |
| 9.1 分泌蛋白的翻译后修饰加工 |
| 9.2 影响外源蛋白表达的因素 |
| 第二章 研究目的与意义 |
| 第三章 鹅INF-α基因的克隆及生物信息学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 方法设计 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 天府肉鹅外周血单核细胞的分离培养及细胞总RNA的提取 |
| 2.3.1 天府肉鹅外周血单核细胞的分离培养 |
| 2.3.2 细胞的诱导培养 |
| 2.3.3 细胞总RNA的提取 |
| 2.4 天府肉鹅IFN-α基因的扩增 |
| 2.4.1 RT-PCR反应 |
| 2.4.2 PCR扩增目的片段及检测 |
| 2.4.3 扩增产物的纯化 |
| 2.5 干扰素基因的克隆与测序 |
| 2.5.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.5.2 PCR纯化产物与克隆载体的连接 |
| 2.5.3 连接产物的转化 |
| 2.5.4 阳性重组子的鉴定 |
| 2.5.4.1 质粒的提取 |
| 2.5.4.2 重组质粒pMD18-T-GoIFN-α的双酶切鉴定 |
| 2.5.4.3 重组质粒pMD18-T-GoIFN-α的PCR鉴定 |
| 2.5.5 序列测定 |
| 2.6 天府肉鹅干扰素α的生物信息学分析 |
| 2.6.1 tf-GoIFN-α ORF基因序列分裂 |
| 2.6.2 tf-GoIFN-α基因的密码子使用法特征分析 |
| 2.6.3 信号肽分析 |
| 2.6.4 糖基化位点分析 |
| 2.6.5 跨膜区预测 |
| 2.6.6 磷酸化位点预测 |
| 2.6.7 疏水性分析 |
| 2.6.8 亚细胞定位预测 |
| 2.6.9 抗原表位分析 |
| 3.6.10 二级结构分析 |
| 2.6.11 同源性及进化树分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 天府肉鹅外周血单核细胞诱导培养结果 |
| 3.2 天府肉鹅1FN-α基因PCR扩增 |
| 3.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.4 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.5 tf-GoIFN-α基因序列 |
| 3.6 生物信息学分析 |
| 3.6.1 tf-GoIFN-αORF基因序列分析 |
| 3.6.2 tf-GoIFN-α基因的密码子使用法特征分析 |
| 3.6.2.1 不同动物IFN-α基因参数的分析 |
| 3.6.2.2 天府肉鹅IFN-α基因密码子使用频率 |
| 3.6.3 信号肽分析 |
| 3.6.4 糖基化位点分析 |
| 3.6.5 跨膜区预测 |
| 3.6.6 磷酸化位点预测 |
| 3.6.7 疏水性分析 |
| 3.6.8 抗原表位分析 |
| 3.6.9 亚细胞定位预测 |
| 3.6.10 二级结构分析 |
| 3.6.11 同源性及进化树分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 天府肉鹅IFN-α的诱导和产生 |
| 4.2 RNA的提取及基因扩增 |
| 4.3 天府肉鹅IFN-α基因的生物信息学分析 |
| 4.4 天府肉鹅IFN-α基因的密码子特征 |
| 5 小结 |
| 第四章 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种、质粒及毒株 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 成熟肽基因的扩增 |
| 2.1.3 成熟肽基因的克隆 |
| 2.1.4 pMD18-T-mGoIFN-α和pET-32a(+)质粒的提取 |
| 2.1.5 质粒DNA的酶切和回收 |
| 2.1.6 目的基因(mGoIFN-α)和表达载体pET-32a(+)的连接 |
| 2.1.7 重组质粒的转化 |
| 2.1.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.8.1 PCR鉴定 |
| 2.1.8.2 酶切鉴定 |
| 2.1.8.3 原核表达质粒的序列测定 |
| 2.2 重组蛋白的表达 |
| 2.2.1 Rosetta感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 工程菌的诱导表达 |
| 2.2.3 诱导表达重组蛋白的条件优化 |
| 2.2.4 重组蛋白的纯化和复性 |
| 2.2.4.1 包涵体的制备 |
| 2.2.4.2 包涵体的洗涤 |
| 2.2.4.3 包涵体的溶解 |
| 2.2.4.4 透析复性 |
| 2.2.4.5 Ni-IMAC纯化复性 |
| 2.2.4.6 蛋白浓度的测定 |
| 2.3 高免血清的制备 |
| 2.3.1 蛋白疫苗的制备 |
| 2.3.2 动物免疫 |
| 2.3.3 高免血清效价检测 |
| 2.3.4 Western Blot检测 |
| 2.4 重组天府肉鹅α干扰素的抗病毒活性研究 |
| 2.4.1 天府肉鹅IFN-α抗VSV活性研究 |
| 2.4.1.1 VSV的扩增与保存 |
| 2.4.1.2 原代鹅胚成纤维细胞的制备和培养 |
| 2.4.1.3 VSV半数细胞感染量(TCID50)测定 |
| 2.4.1.4 重组天府肉鹅IFN-α抗VSV活性的测定 |
| 2.4.2 重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 2.4.2.1 GPV的接种、收获与毒价测定 |
| 2.4.2.2 荧光定量PCR检测重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 2.4.2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.4.2.2.2 标准阳性模板的制备 |
| 2.4.2.2.3 引物合理性验证及反应条件的优化 |
| 2.4.2.2.4 标准曲线制备 |
| 2.4.2.2.5 试验样品的制备 |
| 2.4.2.2.5.1 试验分组 |
| 2.4.2.2.5.2 样品制备 |
| 2.4.2.2.6 定量PCR检测 |
| 2.4.2.2.7 结果计算 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 天府肉鹅IFN-α成熟蛋白基因片段的克隆 |
| 3.2 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因原核表达载体的构建 |
| 3.3 重组蛋白的原核表达 |
| 3.3.1 诱导时间的优化 |
| 3.3.2 IPTG诱导浓度的优化 |
| 3.3.3 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因重组蛋白复性 |
| 3.4 高免血清效价测定 |
| 3.5 免疫兔血清的Western Blot检测 |
| 3.6 重组天府肉鹅α干扰素成熟蛋白的抗病毒活性研究 |
| 3.6.1 重组天府肉鹅IFN-α抗VSV活性研究 |
| 3.6.2 SYBR Green real-time PCR检测重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 3.6.2.1 反应条件的优化 |
| 3.6.2.2 标准曲线的建立 |
| 3.6.2.3 溶解曲线分析 |
| 3.6.2.4 SYBR Green real-time PCR检测鹅IFN-α抗GPV活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于信号肽及成熟蛋白基因表达 |
| 4.2 关于蛋白的复性 |
| 4.3 鹅IFN-α重组蛋白抗VSV活性 |
| 4.4 SYBR Green real-time PCR测鹅IFN-α抗GPV活性 |
| 5 小结 |
| 第五章 鹅IgG的提取纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物\毒株 |
| 1.2 主要酶和试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 兔抗鹅IFN-α基因蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.1.1 实验动物准备 |
| 2.1.2 鹅卵黄IgG的提纯 |
| 2.1.3 鹅卵黄IgG的鉴定 |
| 2.1.4 蛋白含量的测定 |
| 2.1.5 蛋白疫苗的制备 |
| 2.1.6 动物免疫 |
| 2.1.7 血清的分离 |
| 2.1.8 兔抗鹅IgG效价的测定 |
| 2.1.9 兔血清IgG的纯化 |
| 2.1.9.1 用辛酸-硫酸铵法粗提血清IgG |
| 2.1.9.2 DEAEA-50纤维柱层析纯化兔抗鹅血清IgG |
| 2.1.9.2.1 纤维素平衡 |
| 2.1.9.2.2 离子交换层析纯化IgG |
| 2.2 兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 |
| 2.2.1 兔抗鹅辣根过氧化物(HRP)酶标抗体的制备 |
| 2.2.2 ELISA抗原的制备 |
| 2.2.3 间接ELISA操作方法 |
| 2.2.4 抗原最适浓度和最适鹅血清稀释度的确定 |
| 2.2.5 酶标抗体稀释度的选择 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 免疫扩散试验 |
| 3.2 抗体纯化检测 |
| 3.4 抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定 |
| 3.5 HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于血清IgG的纯化 |
| 4.2 关于ELISA条件的优化 |
| 4.3 关于酶标二抗 |
| 5 小结 |
| 第六章 天府肉鹅IFN-α真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅α干扰素真核表达质粒的构建 |
| 2.1.1 菌种的培养 |
| 2.1.2 pMD-18-T-GoIFN-α质粒的提取 |
| 2.1.3 目的基因的准备 |
| 2.1.4 pcDNA3.1(+)的线性化 |
| 2.1.5 pcDNA3.1(+)的去磷酸化 |
| 2.1.6 连接反应 |
| 2.1.7 重组质粒的转化 |
| 2.1.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.8.1 PCR鉴定 |
| 2.1.8.2 酶切鉴定 |
| 2.1.8.3 真核表达质粒的序列测定 |
| 2.2 pcDNA3.1-GoIFN-α在COS-7细胞中的瞬时表达 |
| 2.2.1 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α转染COS-7细胞 |
| 2.2.1.1 真核表达质粒pcDNA3.1-goIFN-α的提取 |
| 2.2.1.2 COS-7细胞的准备 |
| 2.2.1.2.1 COS-7细胞复苏 |
| 2.2.1.2.2 转染前COS-7细胞的处理 |
| 2.2.1.3 脂质体法转染COS-7细胞 |
| 2.2.2 间接免疫荧光法检测pcDNA3.1-GoIFN-α的表达 |
| 2.2.3 ELISA法鉴定目的蛋白的分泌 |
| 2.2.4 Westem blot分析 |
| 2.3 pcDNA3.1-GoIFN-α生物活性的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鹅α干扰素真核表达质粒的构建 |
| 3.2 GoIFN-α基因表达产物在COS-7细胞中的定位 |
| 3.3 GoIFN-α基因表达产物在细胞上清液中的检测 |
| 3.4 Westem-blot分析 |
| 3.5 基因表达产物GoIFN-α抗病毒检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GoIFN-α外源蛋白在COS-7细胞中的表达 |
| 4.2 抗病毒活性的检测 |
| 5 小结 |
| 第七章 天府肉鹅IFN-α真核表达质粒的免疫佐剂效应 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌种、质粒和毒株 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分子佐剂和小鹅瘟VP3基因疫苗大量制备和纯化 |
| 2.1.1 碱裂解法提取质粒,大量制备基因疫苗及佐剂 |
| 2.1.2 聚乙二醇法(PEG-8000)纯化基因疫苗及佐剂质粒 |
| 2.2 动物分组和免疫 |
| 2.3 血样的采集和处理 |
| 2.4 淋巴细胞转化试验 |
| 2.4.1 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.4.2 淋巴细胞的诱导培养 |
| 2.4.3 检测及数据处理 |
| 2.5 血清IgG的变化 |
| 2.5.1 ELISA抗原的制备 |
| 2.5.2 血清抗体IgG检测 |
| 2.5.3 结果分析 |
| 2.6 中和抗体水平的检测 |
| 2.6.1 小鹅瘟强毒的培养 |
| 2.6.2 抗体水平检测 |
| 2.6.3 计算中和指数 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.1 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同剂量的佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.2 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.3 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗及佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.2 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后的IgG动态变化结果 |
| 3.2.1 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同剂量佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.2.2 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.2.3 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.3 小鹅瘟强毒TCID_(50)的测定 |
| 3.4 中和抗体试验检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于细胞免疫和淋巴细胞体外增殖的关系 |
| 4.2 关于IFN-α的分子免疫佐剂功能 |
| 5 小结 |
| 第八章 天府肉鹅α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌种、质粒和病毒 |
| 1.2 主要酶和试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅α干扰素成熟肽基因的克隆 |
| 2.1.1 引物设计及合成 |
| 2.1.2 基因扩增 |
| 2.1.3 成熟肽基因的克隆 |
| 2.2 酵母表达载体的构建 |
| 2.2.1 pMD18-T-m2GoIFN-α和pPICZαA质粒的提取 |
| 2.2.2 质粒DNA的酶切和回收 |
| 2.2.3 目的基因(mGoIFN-α)与表达载体pPICZαA的连接 |
| 2.2.4 连接产物的转化 |
| 2.2.5 酵母表达载体的鉴定 |
| 2.2.5.1 PCR鉴定 |
| 2.2.5.2 酶切鉴定 |
| 2.2.5.3 酵母表达载体的序列测定 |
| 2.3 天府肉鹅IFN-α在毕赤酵母中的表达 |
| 2.3.1 重组酵母的构建 |
| 2.3.1.1 空载体pPICZαA及表达载体pPICZαA-GoIFN-α的线性化 |
| 2.3.1.1.1 SacⅠ单酶切 |
| 2.3.1.1.2 线性化质粒的纯化 |
| 2.3.1.2 受体菌X-33感受态细胞的制备 |
| 2.3.1.3 酵母菌的电转化 |
| 2.3.1.3.1 电转仪参数的设置 |
| 2.3.1.3.2 电转化操作 |
| 2.3.1.4 重组鹅α干扰素基因酵母菌株的鉴定 |
| 2.3.1.4.1 重组酵母基因组DNA的提取 |
| 2.3.1.4.2 PCR鉴定 |
| 2.3.2 重组酵母菌株的诱导表达 |
| 2.3.2.1 Mut+型重组酵母菌株的初步表达 |
| 2.3.2.2 高拷贝重组酵母菌株的筛选 |
| 2.3.2.3 重组酵母菌株的表达条件的优化 |
| 2.3.2.3.1 诱导表达时间的优化 |
| 2.3.2.3.2 甲醇浓度的优化 |
| 2.3.2.3.3 双抗体夹心ELISA检测表达条件的优化 |
| 2.3.3 重组酵母表达产物的SDS-PAGE和Western-blot分析 |
| 2.3.3.1 配制SDS-PAGE凝胶 |
| 2.3.3.2 SDS-PAGE |
| 2.3.3.3 表达产物的Western-blot分析 |
| 2.4 重组天府肉鹅α干扰素抗病毒活性检测 |
| 2.4.1 酵母表达产物的纯化 |
| 2.4.1.1 透析袋的预先处理 |
| 2.4.1.2 重组IFN-α的纯化 |
| 2.4.2 抗病毒活性检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 成熟肽基因的克隆 |
| 3.2 酵母表达载体的构建 |
| 3.3 酵母转化子的鉴定 |
| 3.4 斑点法筛选高表达菌株 |
| 3.5 诱导表达条件的优化 |
| 3.6 表达产物的SDS-PAGE |
| 3.7 Western-blot检测 |
| 3.8 重组天府肉鹅IFN-α酵母表达产物的抗病毒活性检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于表达系统的选择 |
| 4.2 关于毕赤酵母转化方法的选取 |
| 4.3 关于酵母表达的糖基化 |
| 4.4 天府肉鹅α干扰素酵母表达产物的抗病毒活性 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间文章完成情况 |
（6）奶山羊胎盘肽的分离提纯及其对小白鼠免疫功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 1 胎盘肽生物学功能的研究进展 |
| 1.1 胎盘肽的概念及其理化性质 |
| 1.2 抗病毒性肝炎 |
| 1.3 护肝作用 |
| 1.4 抗结核作用 |
| 1.5 抗免疫抑制 |
| 1.6 抗氧化功能 |
| 1.7 辅助治疗恶性肿瘤 |
| 1.8 抗衰老作用 |
| 1.9 增强细胞免疫 |
| 1.10 增强体液免疫 |
| 2 羊胎盘肽生物学活性的研究进展 |
| 2.1 羊胎盘肽的制备流程 |
| 2.2 羊胎盘肽的理化性质 |
| 2.3 羊胎盘肽的免疫调节作用 |
| 2.4 延缓衰老的作用 |
| 2.5 对皮肤的保健作用 |
| 2.6 其他的生物功能 |
| 3 细胞免疫反应检测方法的研究进展 |
| 3.1 白细胞介素-2 检测方法 |
| 3.2 淋巴细胞转化检测方法 |
| 3.3 先天性免疫细胞的检测 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 试验一 奶山羊胎盘肽的分离提纯 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 胎盘肽粗提物的的制备方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 试验二 用 Tricine-SDS-PAGE 电泳法初步鉴定奶山羊胎盘肽 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 试验三 考马斯亮蓝 G - 250 法测定胎盘肽的含量 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 试验四 奶山羊胎盘肽对小鼠外周血血清白介素 2 含量的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验五 奶山羊胎盘肽对小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖反应的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验六 奶山羊胎盘肽对小鼠脾脏 NK 细胞活性的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 试验设计与处理 |
| 1.2.2 脾脏 NK 细胞的制备 |
| 1.2.3 NK 细胞杀伤活性检测,采用 MTT 检测方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验七 奶山羊胎盘肽对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 试验设计与处理 |
| 1.2.2 腹腔巨噬细胞的制备 |
| 1.2.3 腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（7）爱康胶囊治疗HIV/AIDS脾肺虚弱证的临床研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 艾滋病防治概况 |
| 1 中医药防治艾滋病文献综述 |
| 1.1 理论研究 |
| 1.2 辨证分型研究 |
| 1.3 治则治法研究 |
| 1.4 药物研究 |
| 2 现代医学有关艾滋病研究进展 |
| 2.1 艾滋病免疫学研究 |
| 2.2 化学药物研究进展 |
| 2.3 疫苗的研究 |
| 2.4 艾滋病研究热点和前沿生物技术 |
| 3 中医药治疗艾滋病的特色优势及发展趋势 |
| 3.1 中医药治疗艾滋病的特色优势 |
| 3.2 中医药治疗艾滋病的发展趋势 |
| 参考文献 |
| 第二部分 爱康胶囊治疗HIV/AIDS脾肺虚弱证临床研究 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 3 观察指标及方法 |
| 4 疗效评价 |
| 5 质量控制 |
| 6 统计学分析 |
| 7 结果 |
| 7.1 入选患者基线值同质性分析 |
| 7.2 临床有效性分析 |
| 7.3 临床安全性分析 |
| 8 讨论 |
| 9 结论 |
| 10 社会影响及社会效益 |
| 参考文献 |
| 第三部分 爱康胶囊药效学、毒理学研究 |
| 1 对环磷酰胺(CY)致免疫抑制小鼠免疫功能的影响 |
| 1.1 试验目的 |
| 1.2 试验材料 |
| 1.3 试验方法与结果 |
| 1.4 小结 |
| 2 对氢化可的松致免疫抑制小鼠免疫功能的影响 |
| 2.1 试验目的 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.3 试验方法与结果 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 3 爱康胶囊急性毒性试验 |
| 4 长期毒性试验 |
| 结语 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介(含论文目录) |
| 附:医疗机构制剂临床研究批件(爱康胶囊) |
（8）DHBV模型定量评价体系的建立及用于评价中药复方抑制DHBV作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对乙型病毒性肝炎的认识 |
| 1.1 乙型肝炎病毒的病原学 |
| 1.2 乙型肝炎病毒的流行病学与危害 |
| 1.3 乙肝的传播途径 |
| 1.4 乙型病毒性肝炎的危害 |
| 2 中医对乙型病毒性肝炎的认识 |
| 3 乙型病毒性肝炎致病机理的研究进展 |
| 3.1 有关 HBV 与肝细胞膜受体的结合 |
| 3.2 其它因素介导的 HBV 与肝细胞的结合 |
| 3.3 有关机体自身的免疫反应 |
| 4 乙型病毒性肝炎的动物模型研究进展 |
| 4.1 感染 HBV 的动物模型 |
| 4.2 与 HBV 相似的其他嗜肝 DNA 病毒的动物模型 |
| 4.3 复制 HBV 的小鼠模型 |
| 5 乙型病毒性肝炎的细胞模型研究进展 |
| 5.1 原代肝细胞 |
| 5.2 肝癌细胞系 |
| 5.3 非肝源细胞系 |
| 6 现代医学对乙型病毒性肝炎治疗的研究进展 |
| 6.1 抗乙肝病毒药物治疗疗效评价指标 |
| 6.2 抗乙肝病毒药物治疗的研究现状 |
| 6.3 免疫调节剂与基因治疗 |
| 6.4 治疗性疫苗 |
| 6.5 病毒壳体化抑制剂 |
| 6.6 联合治疗 |
| 7 中药抗乙型病毒性肝炎的研究进展 |
| 7.1 反相间接血凝实验 |
| 7.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 7.3 利用体外细胞培养筛选抗 HBV 中草药 |
| 7.4 以嗜肝 DNA 病毒感染动物作模型评价中草药抗 HBV 活性 |
| 8 抗乙型病毒性肝炎疗效评估检测方法的研究进展 |
| 8.1 免疫学检测方法及应用 |
| 8.2 分子生物学检测方法及应用 |
| 第二部分 实验部分 |
| 1 荧光定量 PCR 检测 DHBV 方法的建立 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 讨论 |
| 2 血清 DHBV 提取方法的建立 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 3 扶正利湿活血复方对鸭乙肝模型血清 DHBVDNA 影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 4 原代培养鸭胚肝细胞上清 DHBV 载量动态变化 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 5 扶正利湿活血复方对先天感染鸭胚肝细胞培养上清中 DHBV 的抑制作用 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录(英文缩略词) |
| 致谢 |
（9）小柴胡片对慢性乙肝患者外周血树突状细胞抗原递呈的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章: 文献研究 |
| 第一节: 中医学对慢性乙肝的认识 |
| 1. 病因病机 |
| 2. 治疗方面 |
| 第二节: 现代医学对慢性乙肝的认识 |
| 1. 发病机理 |
| 2. 治疗方面 |
| 第三节: 小柴胡汤治疗慢性乙肝的研究概况 |
| 1. 小柴胡汤治疗慢性乙肝符合中医学的辨证论治规律 |
| 2. 药理作用研究 |
| 3. 临床疗效研究 |
| 第二章: 实验研究 |
| 第一节: 试验一 慢性乙肝病毒感染者外周血树突状细胞的分离培养 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节: 实验二 HBcAg负载对DC刺激增殖能力和CTL分泌IFN-水平的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三节: 实验三 HBcAg负载的树突状细胞对CTL应答的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章: 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（10）转移因子增强犬细胞免疫功能的作用机理研究（论文提纲范文）
| 文献综述 |
| 第一章 免疫佐剂研究概况 |
| 1.1 免疫佐剂类型及作用机理研究 |
| 1.1.1 免疫佐剂的类型 |
| 1.1.2 佐剂活性及作用机理 |
| 1.1.2.1 佐剂活性 |
| 1.1.2.2 佐剂作用方式 |
| 1.1.2.3 佐剂作用机理 |
| 1.2 部分类型免疫佐剂的研究概述 |
| 1.2.1 盐类佐剂 |
| 1.2.2 油乳佐剂 |
| 1.2.3 微生物及微生物来源的佐剂 |
| 1.2.4 脂质体作为佐剂 |
| 1.2.5 蜂胶的佐剂作用 |
| 1.2.6 植物来源的佐剂 |
| 1.2.7 中药免疫佐剂 |
| 1.2.8 人工合成佐剂 |
| 1.2.9 微量元素、维生素佐剂 |
| 1.2.10 细胞因子类免疫佐剂 |
| 1.2.11 其他类型的免疫佐剂 |
| 1.3 免疫佐剂的副作用和适应症 |
| 1.3.1 免疫佐剂的副作用 |
| 1.3.2 免疫佐剂的适应症 |
| 1.4 免疫佐剂的临床应用前景 |
| 第二章 转移因子及临床应用研究进展 |
| 2.1 TF 研究简史 |
| 2.2 TF 研究现状 |
| 2.2.1 TF 的种类 |
| 2.2.2 TF 的生物学特性研究 |
| 2.2.2.1 TF 的抗原特异性 |
| 2.2.2.2 TF 是非抗原物质 |
| 2.2.2.3 TF 的免疫学特性 |
| 2.2.2.4 TF 转移细胞免疫能力和种属差异 |
| 2.2.2.5 TF 的特异性与非特异性 |
| 2.2.3 TF 的理化特性 |
| 2.2.4 TF 的制备方法 |
| 2.2.4.1 TF 的原料来源和供体的选择 |
| 2.2.4.2 TF 制备方法 |
| 2.2.5 TF 的质量标准 |
| 2.2.6 TF 的活性测定 |
| 2.2.6.1 TF 活性体内测定法 |
| 2.2.6.2 TF 活性体外测定法 |
| 2.2.7 TF 的功能和作用机制 |
| 2.2.7.1 TF 的功能 |
| 2.2.7.2 TF 的作用机制 |
| 2.2.8 TF 的剂型 |
| 2.2.9 TF 的用量和用法研究 |
| 2.2.10 TF 的适应症 |
| 2.2.10.1 TF 在人医临床上的应用 |
| 2.2.10.2 TF 在兽医临床上的应用 |
| 2.2.11 TF 的副作用 |
| 2.3 TF 在兽医临床应用研究现状 |
| 2.3.1 不同动物TF 免疫活性研究 |
| 2.3.1.1 猪TF 免疫活性的研究 |
| 2.3.1.2 鸡TF 免疫活性的研究 |
| 2.3.1.3 牛TF 免疫活性的研究 |
| 2.3.1.4 其他动物TF 免疫活性的研究 |
| 2.3.2 不同动物TF 在疾病防治方面的研究 |
| 2.3.2.1 TF 在猪病防治方面的应用 |
| 2.3.2.2 TF 在家禽疾病防治方面的应用 |
| 2.3.2.3 TF 在牛病防治方面的应用 |
| 2.3.2.4 TF 在其他动物病防治方面的应用 |
| 2.4 动物TF 在兽医领域研究前景 |
| 第三章 犬病毒病免疫防治研究进展 |
| 3.1 犬机体免疫研究 |
| 3.1.1 犬机体免疫功能特点 |
| 3.1.2 新生幼犬的被动免疫特点 |
| 3.2 3 种常见的犬病毒病免疫防治研究 |
| 3.2.1 犬瘟热免疫预防研究 |
| 3.2.1.1 流行病学 |
| 3.2.1.2 发病机理 |
| 3.2.1.3 机体免疫 |
| 3.2.2 犬细小病毒病免疫预防研究 |
| 3.2.2.1 流行病学 |
| 3.2.2.2 发病机理 |
| 3.2.2.3 机体免疫 |
| 3.2.3 犬传染性肝炎免疫预防研究 |
| 3.2.3.1 流行病学 |
| 3.2.3.2 发病机理 |
| 3.2.3.3 机体免疫 |
| 3.3 犬病毒病免疫预防失败原因分析及应对策略 |
| 3.3.1 免疫预防失败原因分析 |
| 3.3.1.1 年龄因素 |
| 3.3.1.2 遗传因素 |
| 3.3.1.3 母源抗体的干扰作用 |
| 3.3.1.4 潜在性感染 |
| 3.3.1.5 诱发感染的影响 |
| 3.3.1.6 多联苗的使用 |
| 3.3.1.7 异毒株的出现 |
| 3.3.1.8 药物因素 |
| 3.3.1.9 免疫次数不够或免疫剂量不足 |
| 3.3.1.10 免疫注射的时间间隔不当 |
| 3.3.1.11 营养条件的影响 |
| 3.3.1.12 其他因素 |
| 3.3.2 免疫失败应对策略 |
| 第四章 免疫增强剂在犬病毒病防治方面的应用现状及前景 |
| 4.1 免疫增强剂在犬病防治方面国内外研究现状 |
| 4.2 免疫增强剂在犬病防治研究及应用方面的依据 |
| 试验研究 |
| 第五章 猪、犬脾TF 的提取及理化性质和部分生物学特性测定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 试验材料 |
| 5.1.1.2 试验动物 |
| 5.1.1.3 主要试验试剂 |
| 5.1.1.4 主要仪器设备 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 猪、犬脾TF 的提取方法 |
| 5.1.2.2 猪、犬脾TF 理化性质分析内容及方法 |
| 5.1.2.3 猪、犬脾TF 生物学特性检验内容及方法 |
| 5.1.2.4 猪、犬脾TF 活性分析内容及方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 理化性质 |
| 5.2.1.1 性状 |
| 5.2.1.2 化学分析结果 |
| 5.2.1.3 紫外光谱分析结果 |
| 5.2.1.4 透析液有关成分含量 |
| 5.2.1.5 氨基酸组分测定结果 |
| 5.2.2 生物学特性检验 |
| 5.2.2.1 无菌检验 |
| 5.2.2.2 安全试验 |
| 5.2.2.3 过敏试验 |
| 5.2.2.4 热原试验 |
| 5.2.2.5 抗原性检验 |
| 5.2.3 活性分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 TF 对犬淋巴细胞增殖的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.1.1 试验动物 |
| 6.1.1.2 试验试剂 |
| 6.1.1.3 主要溶液 |
| 6.1.1.4 主要仪器设备 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.1.2.1 犬淋巴细胞悬液的制备 |
| 6.1.2.2 不同浓度的PHA-P、Con A、LPS 对犬淋巴细胞增殖的影响 |
| 6.1.2.3 TF 对犬淋巴细胞转化增殖的影响测定 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同浓度的PHA-P、Con A、LPS 对犬淋巴细胞增殖的影响 |
| 6.2.1.1 不同浓度的PHA-P 对犬淋巴细胞增殖的影响 |
| 6.2.1.2 不同浓度的ConA 对犬淋巴细胞增殖的影响 |
| 6.2.1.3 不同浓度的LPS 对犬淋巴细胞增殖的影响 |
| 6.2.2 TF 对犬淋巴细胞转化增殖的影响 |
| 6.2.2.1 TF 对正常犬淋巴细胞增殖的影响 |
| 6.2.2.2 体内注射猪TF 后不同因素对犬淋巴细胞增殖的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 TF 对犬外周血T 细胞亚群的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.1.1 试验动物 |
| 7.1.1.2 试验试剂 |
| 7.1.1.3 主要溶液的配制 |
| 7.1.1.4 主要仪器设备 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.1.2.1 动物试验 |
| 7.1.2.2 直接标记法测定T 细胞亚群 |
| 7.1.2.3 淋巴细胞数测定 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 注射TF 后犬的T 细胞数量测定结果 |
| 7.2.2 注射TF 后犬的T 细胞亚群测定结果 |
| 7.2.2.1 注射猪TF 后犬的T 细胞亚群变化测定结果 |
| 7.2.2.2 注射犬TF 后犬的T 细胞亚群变化测定结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 TF 对几种调控犬免疫应答的细胞因子分泌的影响 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.1.1 试验动物 |
| 8.1.1.2 试验试剂 |
| 8.1.1.3 主要溶液 |
| 8.1.1.4 主要仪器设备 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.1.2.1 注射TF |
| 8.1.2.2 淋巴细胞培养 |
| 8.1.2.3 细胞因子的测定 |
| 8.1.2.4 细胞因子含量的计算 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 注射TF 后体外培养的淋巴细胞上清中IFN-γ含量的变化 |
| 8.2.1.1 IFN-γ的标准曲线 |
| 8.2.1.2 淋巴细胞上清中IFN-γ的含量 |
| 8.2.2 注射TF 后体外培养的淋巴细胞上清中IL-2 含量的变化 |
| 8.2.2.1 IL-2 的标准曲线 |
| 8.2.2.2 淋巴细胞上清中IL-2 的含量 |
| 8.2.3 注射TF 后体外培养的淋巴细胞上清中IL-12 含量的变化 |
| 8.2.3.1 IL-12 的标准曲线 |
| 8.2.3.2 犬淋巴细胞上清中IL-12 的含量 |
| 8.2.4 注射TF 后体外培养的淋巴细胞上清中IL-4 含量的变化 |
| 8.2.4.1 IL-4 的标准曲线 |
| 8.2.4.2 犬淋巴细胞上清中IL-4 的含量 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 TF 对犬外周血中性粒细胞数量和吞噬杀菌活性的影响 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 材料 |
| 9.1.1.1 试验动物 |
| 9.1.1.2 试验试剂 |
| 9.1.1.3 主要溶液的配制 |
| 9.1.1.4 主要仪器设备 |
| 9.1.2 方法 |
| 9.1.2.1 猪TF 的配制 |
| 9.1.2.2 大肠杆菌菌液的制备 |
| 9.1.2.3 犬中性粒细胞悬液的制备 |
| 9.1.2.4 犬外周血中性粒细胞杀菌活性的最优条件选择 |
| 9.1.2.5 猪TF 对犬外周血中性粒细胞杀菌活性影响的测定 |
| 9.1.2.6 统计分析 |
| 9.2 结果 |
| 9.2.1 试验因素最优组合的确定 |
| 9.2.2 猪TF 影响杀菌活性的最佳浓度选择 |
| 9.2.3 注射最佳浓度猪TF 对犬外周血中性粒细胞杀菌活性的影响 |
| 9.2.4 注射不同浓度猪TF 在不同时间对犬中性粒细胞杀菌活性的影响 |
| 9.2.5 注射最佳浓度猪TF 在不同时间对犬外周血中性粒细胞数量的影响 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 第十章 猪TF 等联合治疗犬细小病毒病的临床效果观察 |
| 10.1 材料与方法 |
| 10.1.1 材料 |
| 10.1.1.1 猪脾TF |
| 10.1.1.2 犬细小病毒强毒 |
| 10.1.1.3 犬用五联血清 |
| 10.1.1.4 犬细小病毒快速诊断试纸 |
| 10.1.1.5 健康未免疫犬 |
| 10.1.1.6 自然发病的免疫犬 |
| 10.1.2 方法 |
| 10.1.2.1 人工感染健康未免疫犬 |
| 10.1.2.2 发病犬分组 |
| 10.1.2.3 治疗药物与方法 |
| 10.1.2.4 疗效判定标准 |
| 10.2 结果 |
| 10.2.1 人工感染发病的健康未免疫犬 |
| 10.2.2 自然发病的免疫犬 |
| 10.3 讨论 |
| 10.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、植物血凝素皮肤试验检测病毒性肝炎非特异性细胞免疫功能——222例观察报导（论文参考文献）
- [1]结核分枝杆菌抗原特异性细胞免疫反应鉴别诊断潜伏性结核感染和活动性结核病[D]. 马慧敏. 北京协和医学院, 2021
- [2]从免疫应答、氧化损伤及中药干预机理探讨上呼吸道病毒感染温病证型特点[D]. 张艳红. 广州中医药大学, 2013(S1)
- [3]山羊胎盘肽的分离和初步鉴定及营养、免疫、抗氧化作用的研究[D]. 王炳祥. 山东农业大学, 2011(08)
- [4]黄精多糖和牛膝多糖及其硫酸化产物的抗病毒和增强免疫活性的研究[D]. 赛福丁·阿不拉. 南京农业大学, 2011(08)
- [5]天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究[D]. 刘菲. 四川农业大学, 2011(02)
- [6]奶山羊胎盘肽的分离提纯及其对小白鼠免疫功能的影响[D]. 马兴亮. 山东农业大学, 2008(02)
- [7]爱康胶囊治疗HIV/AIDS脾肺虚弱证的临床研究[D]. 谢世平. 南京中医药大学, 2007(09)
- [8]DHBV模型定量评价体系的建立及用于评价中药复方抑制DHBV作用[D]. 翁瑞文. 广州中医药大学, 2007(06)
- [9]小柴胡片对慢性乙肝患者外周血树突状细胞抗原递呈的影响[D]. 盖丽丽. 广州中医药大学, 2007(02)
- [10]转移因子增强犬细胞免疫功能的作用机理研究[D]. 孔庆波. 西北农林科技大学, 2005(03)