一、多重引物聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒基因及基因分型（论文文献综述）
杨婉汝[1]（2019）在《云南地区HCV基因型流行特征及耐药突变基因检测方法的初步建立》文中认为丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种主要经血液传播的疾病,丙型肝炎病毒呈全球性流行,据统计,全球约有1.85亿人为HCV感染者。我国属HCV高感染区,丙型肝炎报告数在病毒性肝炎中也呈上升趋势。HCV的基因型分布复杂,呈明显的地域差异性。目前HCV已发现8种基因型80多种亚型,我国以1b、2a型最常见。目前,针对HCV的直接抗病毒药物（DAA）已经应用于临床,该药具有强效抑制病毒复制,快速降低HCV病毒载量,提高了丙型肝炎治疗的持续病毒应答（SVR）。然而,随着DAA药物的广泛使用,加上HCV病毒复制时的高错配率和RNA聚合酶低保真性等特性致使HCV在DAA药物的压力下产生了耐药基因的突变,进而影响了丙肝治疗效果。HCV相关耐药基因突变又与HCV不同基因型和亚型直接相关。因此,阐明HCV基因型和亚型的分布以及耐药突变基因特征对丙肝的临床治疗具有重要的指导意义。此外,针对HCV DAA耐药突变的检测目前主要通过一代测序（Sanger）的方法,该方法具有灵敏度低、信息量小等不足也制约了HCV耐药位点的监测。基于此,本论文研究了云南地区HCV基因型和亚型流行特征,建立了基于新一代测序技术（NGS）HCV耐药突变基因的检测方法。首先,本论文研究了2018年云南地区的1464例样本,结果表明HCV基因型以3b（39.3%）、1b（21.0%）、3a（20.0%）、6n（8.8%）、2a（7.2%）、6a（2.1%）,呈现出3b、3a和1b为主的分布特征。此外,我们针对昆明地区2008-2018年503例HCV阳性样本11年来基因型动态变化进行了分析,结果表明总体HCV基因型分布情况为3b（37.6%）,3a（21.9%）,1b（19.3%）,2a（10.5%）,6n（7.2%）。其中1b由2008年的13%到2018年的4%、2a由2008年的10%到2018年的0%均呈明显的逐年下降趋势。相反,3a从2008年的3%到2018年的16%、3b从2008年的9%到2018年的24%均呈明显的逐年上升趋势。其次,为了调查云南地区HCV治疗前耐药突变的流行特征,我们随机选取主要流行的HCV 1b（60例）、3a（60例）、3b（60例）、2a（30例）、6n（40例）。利用RT-PCR方法针对DAA作用靶点基因NS3、NS5A、NS5B进行了测序分析。结果表明,HCV 1b的NS3区容易发生M/V170I（54.5%）对波普瑞韦、M/V170I（52.7%）对西咪匹韦、M/V170I（52.7%）对特拉匹韦、M/V170I（52.7%）伏西瑞韦发生抗性耐药;NS5A区容易发生L28M（42.6%）而对达卡他韦、雷迪帕韦、奥比他韦发生抗性耐药;NS5B区容易发生C/R316N（80.4%）而对达塞布韦产生抗性耐药。3a的NS3区容易发生H170I（98.2%）而对伏西瑞韦产生抗性耐药。3b的NS3区容易发生H170I（98.1%）而对伏西瑞韦产生抗性耐药;NS5A区容易发生Q30K（100%）而对艾尔巴韦、雷迪帕韦、维拉他韦发生抗性耐药,D/G31M（98.1%）而对达卡他韦、艾尔巴韦发生抗性耐药。最后,我们针对云南地区HCV六种主要流行基因亚型（1b、2a、3a、3b和6n）,根据HCV NS3、NS5A和NS5B三个区段耐药位点分布的特点,设计了50对多重PCR引物进行模板扩增,NGS检测结果表明高通量测序可以检出Sanger测序未检出的低频率耐药突变位点,其他位点两种检测方法结果基本一致且NGS测序检出的突变频率为100%。此外,我们还进行了特异性验证,结果说明此方法中设计的多重PCR引物对HCV病毒基因组具有特异性,说明HCV耐药突变基因下一代测序方法的初步建立。综上所述,本论文阐明了云南地区目前HCV基因型和亚型的分布特征,以及昆明地区HCV基因型和亚型11年来的变化规律,为HCV患者的治疗和预防提供了科学依据。此外,我们首次研究了云南地区DAA治疗前HCV主要流行基因型和亚型预存耐药突变特征,并初步建立了基于NGS技术HCV不同基因型亚型耐药突变基因检测方法,为下一步准确监控HCV DAA治疗中耐药突变提供了重要的技术手段。
杨川琪[2]（2019）在《基于恒温扩增原理建立丙型肝炎病毒基因分型的方法》文中提出[目的]采用环介导恒温扩增和解螺旋酶依赖的恒温扩增方法建立丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）基因分型的方法。[方法]1.建立HCV的恒温扩增反应体系。基于环介导恒温扩增（LAMP）的原理,针对丙型肝炎病毒HCV-1b,2a,3和6a基因型设计每种亚型的引物。基于解螺旋酶恒温扩增（HDA）的原理,设计一对通用引物以扩增HCV-1b,3a和3b,另设计一对通用引物扩增HCV-2a和6a,在两个体系中分别设计各亚型的探针对HCV进行基因分型。2.依据HCV全基因的5,UTR～Core区中各基因型特异的基因序列,用Primer Explorer V.4软件设计1 b,2a,3和6a型对应的引物用于LAMP扩增,优化LAMP反应体系。设计HCV-1/3引物和2/6引物用于HDA扩增,每个体系设计对应型别Taqman探针用于基因分型。3.LAMP法扩增HCV的性能评价。将所设计的引物与对应的模板反应,确定所设计的HCV各基因型的引物特异性。对不同型别的阳性标本倍比稀释,稀释后的不同浓度的样本平均分成10份分别提取RNA,加入对应的特异性的引物,以10个样本全部检测为阳性的最低浓度确立为该方法的最低检测限。以HIV,HBV,HAV阳性血清提取的核酸作为模板与所设计的LAMP引物进行反应,验证这两种方法的抗干扰能力。4.LAMP法对HCV基因分型的临床应用。80例临床筛选丙肝阳性的血清经过测序确认基因型后,HCV-1b,2a,3和6a型各选取20例,同时用LAMP法和实时荧光定量PCR同时进行检测,比较两者之间的检出率和正确性。5.以HDA扩增反应的引物采用常规PCR试剂验证引物的可行性,再采用HDA试剂进行检测,并依据对LAMP方法进行性能评价的方案对HDA法进行方法学分析性能评价。[结果]1.成功建立了 HCV基因分型的LAMP检测方法。LAMP在65℃,60min下可以用肉眼可见的方式区分HCV-1b,2a,3和6a四种基因亚型。2.基于LAMP方法原理建立的HCV基因分型方法的引物只与对应模板反应,与其他病毒模板无交叉反应。检测HCV-1b,3和6a型的最低检测限为1.5×103IU/mL.,HCV-2b 的最低检测限为 1.0×103 IU/mL。3.LAMP法与PCR法的临床比较。对80份临床标本进行测序确定HCV基因型检测（HCV-1b,2a,3,6a各20份）,用LAMP法成功检测75份为阳性,其中1b,2a,3,6a分别为20,17,18,20份,用rea1-time PCR方法检测74份为阳性,其中1b,2a,3,6a分别为20,18,19,17份。检测时间进行比较LAMP方法用时60min,real-time PCR 法用时 90min。4.基于HDA法原理设计的HCV-1/3通用引物能,采用常规PCR方法可正确扩增出HCV-1b,3a和3b基因亚型,但采用HDA方法尚未获得成功。[结论]本研究所建立的LAMP检测方法能够特异,敏感地检测出HCV-1b,2a,3和6a四种基因亚型。设计用于HDA的HCV1/3型通用引物采用常规PCR方法能得到正确的产物,但采用HDA扩增方法尚未成功。
廖远泉[3]（2014）在《丙型病毒性肝炎病毒感染实验诊断技术及方法学概述》文中进行了进一步梳理丙型病毒性肝炎（丙肝）病毒感染呈世界性传播,严重威胁人类健康。预防和控制丙肝传播的重要手段之一是临床早期明确诊断,及时抗病毒治疗。临床常用的实验诊断血清标志物主要有HCV-Ab、HCV-Ag,以及HCVRNA定性/定量、HCV-基因型及基因亚型的检测。本文介绍了丙肝病毒感染的实验诊断技术及方法学（包括ELISA、RIBA、CLIA、DIFA、real-time PCR和RT-LAMP）研究的现况,希望能够为丙肝的临床诊断、疾病监测及其流行病学调查有所裨益。
肖桂娥[4]（2014）在《广州地区丙型肝炎患者的HCV基因型相关研究》文中指出研究背景丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）感染可导致75%-85%感染者发展为慢性肝病，是慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病因，严重危害人类的健康和生命。全球HCV感染率约3.0%，即有1.7-2.0亿的HCV感染者；我国的HCV感染率约为2.5-4.9%，感染人数已超过3000万。HCV可经静脉吸毒、输血、性传播、垂直传播、或经破损的皮肤粘膜传播如手术、纹身、拔牙、共用卫生器具等。发达国家以静脉吸毒传播为主，我国早期以输血和血制品传播为主，在实行血液筛查HCV制度后，此传播途径大幅下降。但随着我国吸毒人群增多，经静脉吸毒感染HCV的比例增大。HCV基因型繁多，目前国内外常采用Simmonds命名法，将HCV分为6种基因型和80多种基因亚型。基因型分布有明显的地域差异性，la、lb、2a、2b、3a型呈全球广泛分布，其中1b型分布最广；中国以1b和2a型多见，其中以1b型为主，2a型主要分布在中国北部，3型主要分布在云南等西南地区，4型、5型报道罕见，6型主要见于香港、澳门及南方边境省份，6亚型最复杂，变异株最多，到目前为止，6型已发现有23个亚型。有报导广东地区献血员和静脉吸毒人群中，以1b和6a型为主，并发现新的6型变异株。而本地区丙型肝炎患者的HCV基型变化有待进一步研究。不同基因型的HCV对肝脏损伤程度不同，1b型对肝脏的损伤严重度大于其他基因型。目前多采用聚乙二醇干扰素（PEG-IFN）α联合利巴韦林（RBV）进行抗病毒治疗，不同基因型感染者疗效不一，1、4型病毒应答率低于2、3型，因此，准确诊断HCV基因型对HCV抗病毒治疗方案选择及疗效判断至关重要。为了精准分型，国际上对HCV基因分型技术进行了长期研究。目前，HCV基因分型技术包括基因测序法、型特异性引物扩增法、探针杂交法、基因芯片法、限制性片段长度多态性分析（RELP）、异源分子迁移率分析法（HMA）等。对HCV全基因组测序是最准确的方法，但难度大、费时、成本高，临床上难以实行，而部分基因测序法相对简单易行，目前已将HCV基因NSB5区测序分型法视为“金标准”。但我们临床上常规采用国产商业试剂（探针杂交法）对HCV基因分型，此法只能分出1型与非1型，且准确率较低。鉴于基因分型方法存在的问题和广东地区HCV基因型的复杂性，为配合临床丙型肝炎诊疗的需求，本研究以广州地区丙型肝炎患者为主体，对其HCV基因相关问题进行了研究，包括临床切实可行的两种基因分型方法的准确性比较和HCV分子流行病学研究两部分内容。第一部分临床切实可行的两种基因分型法（部分基因测序法与探针杂交法）的准确性比较研究内容及目的比较临床常规使用的HCV部分基因测序法和探针杂交法对HCV基因分型的准确性，为临床选择HCV基因分型方法、基因型诊断和制定抗病毒治疗策略及HCV分子流行病学研究提供可靠依据。研究方法收集2012-2013年在广州市第八人民医院就诊的191例临床丙型肝炎患者，其血清标本已采用国产探针杂交法进行了HCV基因分型。以国际HCV基因库中HCV全基因序列代表株的分型结果为“金标准”，设计C区和NS5B区基因序列扩增引物，分别扩增HCV C区和NS5B区基因，基因产物的测序结果与“金标准”共建系统进化树进行基因分型，分型结果与患者的探针杂交法分型结果进行对比。研究结果1.从国际HCV基因库中共获得92个代表株，涵盖7个基因型、54个基因亚型和5个重组基因型。分别构建代表株的全基因、C区和NS5B区的系统进化树，结果显示，92个代表株的全基因序列分型结果与其C区和NS5B区基因分型结果一致。2.用HCV C区和NS5B区扩增引物分别检测191例临床丙型肝炎患者的HCV基因，结果显示两区均扩增成功的有171例，其中167例C区和NS5B区HCV基因分型结果一致。3.167例基因测序分型结果与患者的探针杂交法分型结果对比显示，总符合率为84.43%（141/167）。探针杂交法误检的26例中，23例6a型误检为1型；2例1b和1例1a型被误检为非1型。171例患者中另外4例（2.34%）的C区与NS5B区HCV分型结果不一致，其中3例C区分型为6a而NS5B区分型为1b，另外1例C区分型为1b而NS5B分型为6a，4例患者的探针杂交结果显示，2例与C区结果一致；另外2例与NS5B区结果一致。结论1.目前临床上常规使用的国产商业试剂（探针杂交法）误检率高，且易在1型和6型间出现误检。2.建立了更精确的基因分型法：C区和NS5B区基因同时测序可使分型结果更加准确，两区分型结果一致时可以取代HCV全基因测序分型，两区分型结果不一致时，提示可能存在混合株或重组株感染，需做进一步分析。第二部分广州地区丙型肝炎患者的HCV分子流行病学研究研究内容及目的研究广州地区丙型肝炎患者HCV基因型特点及其与患者年龄、性别、传播途径及HCV病毒载量的相关性，以便了解本地区丙肝临床HCV分子流行病学变化趋势及对临床预后的影响。研究方法收集2012-2013年在广州市第八人民医院就诊的207例HCV RAN阳性的丙型肝炎患者血清，分别提取病毒RNA，反转录生成cDNA。对其HCV C区和NS5B区基因序列进行RT-NPCR扩增，两区扩增成功的PCR产物进行基因测序，测序结果分别与相应的参照株序列比对，构建系统进化树，两区基因分型结果一致者确定HCV基因亚型，分析广州地区HCV基因型特点及传播途径。并采用SPSS13.0统计软件分析性别、年龄、HCV病毒载量与基因型的相关性。研究结果1.179例结果纳入分析207例标本分别进行HCV C区及NS5B区巢式PCR扩增，产物分别为401bp，375bp，目的条带清晰且单一，无非特异性杂带。有185例HCV C区和NS5B区都扩增成功，其中179例两区基因分型结果一致。2. HCV基因型特点1)179例HCV基因特点共检出1型、2型、3型、6型四种基因型和八种基因亚型，以1b和6a为主。各亚型所占比例为：1b型40.78﹪（73/179），6a型27.37﹪（49/179），3b型11.73﹪（21/179），3a型8.94﹪（16/179），2a型6.15﹪（11/179），1a型3.91﹪（7/179），2b型0.56﹪（1/179），6n型0.56﹪（1/179）。未发现新的6型变异株。2)1b和6a型系统进化树特点1b株主要分为在A、B、C三簇，A簇与中国广泛流行1b株同源性高、B簇与中国中部及南部地区流行1b株同源性高；6a型株分为Ⅰ、Ⅱ两大簇，与广东地区献血人群及静脉吸毒人群中HCV6a型感染株同源性高。3.流行病学特点：1)传播途径患者主要通过静脉吸毒、输血和血制品感染HCV。静脉吸毒感染者中主要以6a型为主，占57.45%（27/47），其次为3a型，占21.28%（10/47）；通过输血和血制品感染者中主要以1b型为主，占78.95%（30/38）。2)性别6组基因亚型间患者的性别比例有明显统计学差异（P=0.002）。3)年龄6组基因亚型间患者年龄分布有统计学差异（P=0.007），2a型患者平均年龄最大（53.45±11.02岁），与其他组相比，均有统计学差异（均为P<0.05），而其他组两两比较均无统计学差异。4)病毒载量6组基因亚型间患者的病毒载量有统计学差异（P=0.000），1b型患者病毒载量平均水平最高（6.51±0.90log10IU/ml），与其他组相比，均有统计学差异（均为P<0.05），而其他组两两比较均无统计学差异。5)合并HIV感染患者特点179例患者中，有30例患者合并HIV感染，其中以6a型患者最多，达51.51%（17/33）。采用独立样本的t检验，比较单纯HCV与合并HIV感染者的HCV载量均值，结果显示，两组间无统计学差异（P=0.691）。结论：1.广州地区丙型肝炎患者HCV基因型存在多种亚型；以1b、6a、3型为主，1b型株包含中国大部分地区的1b型株，6a、3型已取代2a型分别成为第二、三主要流行基因型；未发现其他文献报道的或未曾发现的6型变异株。2.丙型肝炎患者性别比例、年龄、病毒载量在基因亚型上均有统计学差异，其中2a型平均年龄水平最高。1b型病毒载量最高，这与1b型比其他基因型有更强的致病性等报道是相符的。输血及血制品传播中以lb型为主，静脉吸毒传播中以6a型为主。3. HCV/HIV共感染者以6a型占主要，其病毒载量与单纯HCV感染者相比无统计学差异。
李威[5]（2013）在《中国南方HCV基因型的分布和抗病毒疗效影响因素的相关研究》文中研究指明研究背景丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）引起的急、慢性肝病表现为很宽的临床谱,从症状轻到肝功能衰竭,慢性丙型肝炎患者有20%-30%在10-30年后进展为肝硬化,甚至肝癌。目前全球约有1.8亿人口感染HCV。HCV的流行率高,慢性率高,抗HCV筛查不能可靠的避免其经输血途径传播,又无疫苗预防及特异性的抗病毒药物,迄今HCV感染仍是全球严重的公共卫生问题之一。HCV是单股正链RNA病毒,由于复制所依赖的多聚酶缺乏校对功能,HCV基因序列易发生突变,从而呈现一定的异质性。HCV基因型和亚型的区分是根据基因组核苷酸序列的差异程度,前者的序列差异度为30-35%,后者为20-25%。目前,HCV可分为6种基因型和80多种基因亚型。HCV基因型的分布具有明显的地域和人种分布特征。但HCV基因型的分布并非一成不变的,随着HCV传播方式的改变以及全球人口的迁移和流动以及,各地区的HCV基因型分布也在发生变化。有研究表明在一些国家如法国、意大利、波兰、德国等国家HCV基因型分布正在发生变化。随着我国经济的迅猛发展,国内外及国内不同地区之间在各个领域的交流增多,人口流动性增强,这为HCV在人群中快速传播流行提供了环境。在我国1993年对献血者实施HCV抗体筛查之后,丙肝的传播途径也由原来以输血传播为主到以输血、吸毒、纹身、性传播等多种途径并存的现象。HCV的传播方式的改变以及人口的大规模流动,使我国HCV基因型的分布也在发生改变。我国主要HCV基因亚型为1b亚型,其次为2a亚型,北方地区2a亚型患者比例比南方地区高。华南地区1997-2002年间研究报道的HCV 1b亚型的流行率是90%左右,2a亚型是8%左右,未见6a亚型报道。2005年Lu等调查发现,华南地区珠三角三城市66例样本中1b亚型的比例为66.7%,6a亚型所占比例21.2%,已超过2a亚型的比例（7.6%）成为仅次于1b亚型的第二大基因型。但是因为研究样本量较少,结论需要进一步证实。影响慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的病毒因素包括HCV基因型、病毒Core和NS5A区突变、治疗前病毒载量等因素。现已公认,HCV基因型与临床抗病毒治疗疗效及疗程有关联。2004年我国发布的《丙型肝炎防治指南》和2009年美国肝病研究协会（AASLD）的《丙型肝炎的临床实践指南》（更新版）中均明确指出：1型的持续病毒学应答比2、3型低；推荐1型的治疗疗程为48周,而非1型（2/3型）的疗程为24周,1型和非1型患者的利巴韦林的剂量也不同。由此可见,HCV基因型对指导慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗具有重要的临床意义。由于HCV 6型分布地区较为局限,关于该基因型的抗病毒治疗结局和影响因素报道不多。鉴于我国华南地区HCV 6a亚型的快速流行趋势,加快对6a亚型慢性丙型肝炎的临床特征、抗病毒治疗疗效、预测因素以及与lb亚型的差异等研究,具有重要的临床意义。慢性丙型肝炎标准治疗方案（SOC）是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗,从全球来看患者病毒学应答率在50%左右。SOC方案治疗有很多副作用和禁忌症,且花费昂贵,致使部分患者无法完成全程治疗或无法接受该治疗方案。因此,积极探索能够预测抗病毒治疗疗效的因素对患者避免治疗带来的高风险、将药物的毒副作用降低到最低以及合理的进行个体化治疗,具有重要的临床实践意义。2009年以来,全球多项研究发现人基因组编码干扰素的基因IL28B附近rs12979860和rs8099917位点单核苷酸多态性与聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗应答有关,这一发现标志着在HCV研究领域对宿主作用的认识进入新的阶段。同时探索寻求快速、简单、可靠的IL28B多态性检测方法,也成为近年与该领域相关的研究热点之一。长期以来,HCV体外细胞培养模型研究进展缓慢。直到2005年日本学者Wakita等成功地建立了HCV 2a （JFHl）型全基因组细胞培养系统,该细胞培养体系的全长JFH1 RNA能够有效复制并分泌感染性病毒颗粒。它的构建在HCV细胞培养模型发展史上具有里程碑式的意义。由于不同HCV基因型的生物学特点及对抗病毒治疗应答存在差异,2a亚型细胞培养模型并不能满足HCV相关研究需要,随后许多学者积极探索构建其他基因型的全基因组细胞培养系统,但收获不多。近年,在JFH1细胞培养模型的基础上来进行改造,构建其他基因型与JFH1嵌合病毒细胞培养系统取得了一些进展。目前已报道的嵌合病毒细胞培养体系包括1a、1b、2a、3a、4a、2b、5a、6a、7a等,而HCV 6a犁全基因组细胞培养系统未见报道。鉴于目前HCV 6a亚型在我国华南地区快速增长和流行,并有向全国传播趋势。加快对我国6a亚型的生物学特点、疫苗研发、抗病毒药物的评价和筛选等已成为我国丙型肝炎防治研究的迫切需要。因此,有必要尽快建立我国6a亚型流行毒株细胞培养系统。研究目的基于前期我们研究团队对HCV基因型的初步研究结果,本研究旨在通过扩大样本以调查我国华南地区慢性丙型肝炎的HCV基因亚型分布情况与特征,分析该地区HCV基因亚型流行和变迁,探讨HCV基因亚型流行模式转变的原因和6a亚型病毒株的进化来源。对比分析我国华南地区HCV 1b和6a亚型慢性丙型肝炎的临床特征,比较两组患者的抗病毒治疗结局差异,探讨影响病毒学应答的因素。建立一种与慢性丙型肝炎抗病毒治疗应答相关的IL28B rs8099917基因多态性检测方法,并应用该方法检测rs8099917基因型,分析该位点基因型与治疗结局的关系。利用JFH1（2a）可高效细胞培养的特性,以JFH1序列为骨架,构建HCV 6a/JFH1重组病毒,为下一步构建6a亚型全基因细胞培养系统奠定实验基础,以期为我国HCV 6a病毒株的生物学特点、相关免疫学特征、疫苗研制、抗病毒药物的评价和筛选等提供实验技术平台。研究方法1.慢性丙型肝炎的病毒基因型和亚型的分布：通过比对分析我国HCV主要流行基因亚型的序列,改进HCV基因分型引物,选择C/E1和NS5B区PCR扩增测序分型。回顾性收集患者年龄、性别、病毒载量、感染时间及传播途径等资料,多因素分析HCV基因型/亚型与这些因素的关系。2.影响慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的病毒与宿主因素研究：建立华南地区1b亚型和6a亚型慢性丙型肝炎临床对照研究,所有患者应用聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗48周,并随访至少24周。收集患者抗病毒治疗前临床基线资料：性别、年龄、HCV RNA定量、ALT、AST、TBIL、ALB、TG、CHOL、 GLU、WBC、NEU、RBC、PLT、HGB等资料,记录抗病毒治疗期间4、12、48周以及治疗结束随访24周时HCV RNA定量。比较分析两组患者的临床一般特征以及抗病毒治疗应答差异,分析影响病毒学应答的因素。3.与抗病毒疗效相关的IL28B多态性检测方法的建立与应用：根据四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应方法（T-ARMS-PCR）的原理,设计两对引物,特异性扩增鉴定IL28B rs8099917基因型,并通过直接测序和设置阳性参照评价T-ARMS-PCR方法的特异性。应用该方法对我国慢性丙型肝炎患者IL28B rs8099917基因型进行检测,对IL28B另一位点rs12979860直接测序法鉴定基因型,分析两位点基因多态性与抗病毒治疗疗效的关系。4.我国华南地区6a/JFH1重组病毒的构建：应用重叠延伸PCR方法分别扩增华南地区HCV 6a亚型Core-NS2基因和JFH1两基因片段,进行基因融合连接,酶切连接构建6a/JFH1重组病毒质粒。5.统计学方法：计数资料采用卡方检验；计量资料两组之间比较t检验或非参数Mann-Whitney U检验,计量资料三组之间比较采用方差分析；HCV基因型与相关因素的关系采用多分类Logistic回归分析；探讨慢性丙型肝炎患者获得SVR的预测因子应用二分类Logistic回归分析。P值小于0.05时有显着性差异,所有统计学分析使用SPSS13.0。结果1.388例慢性丙型肝炎患者中,检测出HCV基因型有8种：1a、1b、2a、2b、3a、3b、6a和6d,各种基因亚型的例数分别为5例（1.3%）、230例（59.3%）、31例（8.0%）、1例（0.3%）、30例（5.2%）、16例（4.1%）、84例（21.6%）和1例（0.3%）。2.不同HCV基因型患者的平均年龄有显着性差异（p<0.001）。与6a亚型患者相比,感染1b和2/3型患者的平均年龄大（34.9±8.6岁vs.42.7±15.3岁和40.2±10.7岁）。在大于25岁以上年龄组中,1b亚型的比例随年龄增大有增多趋势,而6a亚型的比例有随年龄增大有减少趋势。3.不同HCV基因型患者的性别分布有显着性差异（p=0.011）。感染2/3型和6a亚型的男性患者比例明显高于女性（67.6%vs.32.4%和76.2%vs.23.8%）。4.不同HCV基因型患者的传播途径有明显差异（p<0.001）。通过输血或血制品感染HCV的患者中1b亚型的比例是80.5%,经静脉吸毒感染HCV患者中6a亚型的比例是63.3%。117例有明确输血或血制品时间的lb亚型患者中,1995年之前感染HCV的患者比例高达84.6%（99/117）,而在1995年之后,通过此途径感染的患者比例显着下降并维持一定水平。5.多因素Logistic回归表明,HCV基因型与传播途径独立相关。1b亚型与输血或血制品途径相关（P<0.001）,而6a亚型与经静脉吸毒途径相关（P<0.001）。6.进化树分析显示,我国华南地区慢性丙型肝炎的6a亚型病毒株与香港6a亚型病毒株有高度的相似性,二者在进化距离上与越南6a亚型病毒株更接近。7.本研究共纳入47例lb亚型和41例6a亚型慢性丙型肝炎患者,两组患者在抗病毒治疗前的性别分布、平均年龄,以及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清白蛋白、总胆红素、甘油三酯、胆固醇、血糖、白细胞、中性粒细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、HCV RNA定量等水平差异无统计学意义（P值均大于0.05）。8.88例慢性丙型肝炎患者,总体SVR率为71.6%（63/88）。与lb亚型患者相比,6a亚型患者有较高的RVR和SVR（92.7%vs.66%,P=0.002和85.4%vs.59.6%,P=0.007）；但两组患者的EVR和ETVR无显着性差异（95.1%vs.87.2%,P=0.362和95.1%vs.91.5%,P=0.802）。9.多变量Logistic回归分析影响SVR的因素表明,在抗病毒治疗前,HCV基因型（0R=3.59,P=0.036）和患者年龄（0R=0.92,P=0.001）独立与SVR相关；而治疗开始后,患者年龄（0R=0.88,P=0.001）和RVR（OR=17.24, P=0.012）与SVR独立相关。10.本研究建立了IL28B rs8099917基因分型方法即T-ARMS-PCR法,应用该方法对56例HCV 1b亚型慢性丙型肝炎患者的rs8099917基因分型结果与直接测序较为一致,特异性为（98.2%）。T-ARMS-PCR法是一种快速、简单、有效的rs8099917基因分型方法。11.56例1b亚型慢性丙型肝炎患者中,rs8099917位点的TT基因型的比例为80.4%（45/56）,TG基因型的比例为19.6%（11/56）,未检测到GG基因型。携带TT基因型患者获得病毒学应答率显着高于携带TG基因型患者（68.9%vs.27.3%,p=0.029）。测序结果表明,rs12979860与rs8099917位点基因型有高度的关联性。12.本研究构建了6a/JFH1重组病毒质粒,转染Huh7.5.1细胞后,复制效力较低,需进一步改造,筛选适应性突变病毒株。结论1.华南地区慢性丙型肝炎患者中存在8种不同HCV基因亚型：1a、1b、2a、 2b、3a、3b、6a和6d。该地区主要流行的HCV基因型是1b亚型,其次为6a亚型。华南地区HCV基因型的流行模式呈现新特点：与输血或血制品途径相关的lb亚型患者比例有减少趋势,而与静脉吸毒途径相关的6a亚型患者比例有增多趋势。2.1b和6a亚型两组慢性丙型肝炎患者治疗前临床基线特征相似,但两组患者的抗病毒治疗结局不同：与1b亚型相比较,6a亚型患者能够获得有较高的SVR率。在抗病毒治疗前,HCV基因型是预测SVR的主要因素；而抗病毒治疗开始后,RVR是预测SVR的主要因素。3.四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应方法（T-ARMS-PCR）是一种快速、简单、有效的IL28B rs8099917基因分型方法。携带rs8099917 TT基因型患者比TG基因型患者有较高病毒性应答率。我国慢性丙型肝炎患者人群中rs8099917与rs12979860位点高度关联。4.本研究成功构建了6a/JFH1重组病毒质粒,为构建6a亚型全基因组细胞培养体系奠定了实验基础。
姜树朋[6]（2017）在《慢性丙型肝炎患者酒精代谢基因、性激素与显着性肝纤维化的相关性研究》文中研究说明研究背景:丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）感染是一种严重危害人类健康的重要病毒性疾病,HCV感染后,约55%～85%会发展成慢性丙型肝炎,其中10～20%可进展为肝硬化。肝纤维化是一种慢性病变过程,肝纤维化意味着肝损伤加重,其持续进展是慢性肝病发展至肝硬化的中间过程。众多流行病学研究显示,大部分肝硬化患者有饮酒史,肝脏作为酒精代谢的主要器官,酒精是导致慢性肝炎发展的独立危险因子,ALDH2 rs671和ADH1Brs1229984基因多态性是最主要酒精代谢基因,酒精代谢基因又决定了酒精代谢的速率。已有研究表明,在丙型肝炎患者中,有饮酒习惯的人群罹患晚期慢性肝脏疾病（如肝硬化、肝癌）的比例较高,且以男性居多。性别因素（男性）是慢性晚期肝脏疾病发生发展的危险因素之一,因此本研究采用Sanger测序、HRM和Tetra-primerARMSPCR方法,检测慢性丙型肝炎男性ALDH2、ADH1B基因多态性,同时检测血清性激素,通过单因素和多因素Logistic回归分析,研究慢性丙型肝炎男性患者的酒精代谢基因多态性、性激素水平与显着性肝纤维化的关系。研究目的:1.研究慢性丙型肝炎患者肝纤维化进展的危险因素。2.研究酒精代谢基因多态性与慢性丙型肝炎肝纤维化的相关性。3.研究性激素水平与慢性丙型肝炎肝纤维化的相关性。研究方法:1.回顾性分析武汉大学人民医院就诊的慢性丙型肝炎患者359例,研究影响患者肝纤维化进展的危险因素。2.本研究采用Sanger测序法筛选出ALDH2 rs671和ADH1Brs1229984基因多态性各种基因型别,建立高分辨率熔解曲线分析（HRM）法和Tetra-primer ARMS-PCR法检测ALDH2和ADH1B基因多态性,并以Sanger测序法验证上述两种方法的准确性。3.以ALDH2和ADH1B基因型、饮酒情况、吸烟情况、糖尿病情况、抗病毒治疗情况、输血史和合并其他肝炎病毒感染情况作为自变量,以患者是否有显着性肝纤维化作为因变量,进行单因素和多因素Logistic回归分析,研究影响慢性丙型肝炎纤维化进展可能的危险因素。4.检测慢性丙型肝炎男性患者睾酮、雌二醇水平变化,进一步纳入患者血清睾酮、雌二醇、睾酮/雌二醇比值、γ-谷氨酰转肽酶、白蛋白、总胆红素、HCV基因型、HCV-RNA载量作为自变量,以患者是否发生显着性肝纤维化为因变量,进行多因素Logistic回归分析,评估慢性丙肝男性患者发生显着性肝纤维化的独立风险因素。研究结果:1.本研究分析显示,男性是慢性丙型肝炎发生显着性肝纤维化的风险因素（P<0.05）;慢性丙型肝炎患者血清γ-谷氨酰转肽酶水平在显着性肝纤维化组中升高（P<0.05）,可以反映肝纤维化进程;在轻微性肝纤维化组和显着性肝纤维化组中HCV-RNA载量高低分布、HCV1b与非1b分布无明显差异（P>0.05）,即丙型肝炎病毒HCV-RNA水平和基因分型与慢性丙型肝炎患者发生显着性肝纤维化风险无关。2.本研究成功建立Sanger测序、HRM分析、Tetra-primerARMSPCR技术检测酒精代谢基因ALDH2rs671和ADH1B rs1229984多态性。3.在本研究结果显示,在单因素分析时,ADH1BAA型、饮酒、吸烟≥20支/天、有输血史是慢性丙型肝炎男性患者发生显着性肝纤维化的危险因素（P<0.05）,但在多因素分析时,只有ADH1B AA型（OR=2.23,95%CI 1.13-4.41,P<0.05）、饮酒（OR=5.70,95%CI 2.83-11.50,P<0.05）是慢性丙型肝炎男性患者发生显着性肝纤维化的独立危险因素。4.在本研究中慢性丙型肝炎男性患者睾酮、雌二醇水平升高,但仅睾酮在显着性纤维化组升高,多因素Logistic回归分析显示,慢性丙肝男性患者血清睾酮含量（OR=1.01,95%CI 1.00-1.02,P<0.05）、谷氨酰转肽酶水平（OR=1.01,95%CI 1.01-1.02,P<0.05）与白蛋白水平（OR=0.84,95%CI 0.77-0.92,P<0.05）是评估显着性肝纤维化发生风险独立指标。研究结论:慢性丙型肝炎男性患者携带ADH1B AA型、有饮酒史、血清高睾酮含量是其发生显着性肝纤维化的危险因素。
戴俊斌[7]（2019）在《湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析》文中研究指明目的:1.根据HCV基因NS5B区段设计引物,对湖南省吸毒人群HCV患者的HCV病毒基因进行分型。2.探讨湖南省吸毒人群中HCV基因型的分布特点,为对该人群中HCV阳性者进行精确治疗提供指导和帮助。方法:收集湖南省内14个市州18岁以上、未接受抗病毒治疗、既往HCV抗体阳性的吸毒患者的血浆样本,每市州样本15份,共210份。对收集到的血浆样本分别进行HCV抗体ELISA复检、荧光PCR法定量HCV-RNA检测和基因分型检测。结果:在210名调查对象中,ELISA法复检HCV抗体阳性标本202例,阳性率96.19%;荧光PCR法检出HCV-RNA病毒载量>15IU/m L标本181例,阳性率86.19%。HCV基因型分别为1型18例（9.94%）,2型51例（28.18%）,3型47例（25.97%）,其他型别65例（35.91%）。区域分布以非1型为主,2型和3型普遍分布。结论:湖南省吸毒患者HCV基因型比较复杂,区域分布以非1型为主,2型和3型普遍分布,需进一步研究。
石莹,陈肖潇,田绿波,樊学军,高国龙[8]（2016）在《丙型肝炎病毒检测方法进展及应用》文中研究指明丙型肝炎病毒（HCV）感染的实验室检测是丙型肝炎诊断的重要依据。本文对目前主要应用的各种检测方法的主要内容、应用范围及主要特点进行系统综述。
陈悦科[9]（2016）在《基于磁微粒核酸提取平台的HPV核酸分型技术的建立与应用》文中指出宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,居女性恶性肿瘤的第二位。每年全球有52.9万新发宫颈癌病例,约有20万人死于宫颈癌,90%以上来自发展中国家。在我国每年大约有7.5万宫颈癌新发病例。大量研究资料表明,子宫颈癌的发生与病毒感染有关,尤其是与人乳头瘤病毒（HPV）感染密切相关。HPV是乳头瘤病毒中最具多样性的一类,迄今已发现尽百种,约30种不同型HPV可以感染生殖系统上皮细胞。各型HPV引起疾病的危险性高低不同,分为低危型和高危型。高危型HPV编码具有生长、刺激和转化功能的癌蛋白,导致宫颈上皮内瘤样病变和宫颈癌的发生,是引发子宫颈癌的主要原因。HPV检测和分型对宫颈癌预防与诊治至关重要。目前常用的细胞学检测灵敏度低,分型困难。基于实时荧光定量的核酸分型技术是HPV高敏分型检测技术。HPV检测与分型可以区分持续感染与一过性感染,单一感染和多重感染等;预测患者宫颈癌风险度,针对不同型别的感染采取不同的处理方案。本研究拟开发出基于磁微粒提取平台的人乳头瘤病毒（HPV）的24种不同诱癌风险的基因型的分型方法。针对常见的24种不同诱癌风险的HPV基因型,通过设计特异性的引物探针,建立磁珠法核酸提取和多重实时荧光定量PCR平台,确定方法的检测灵敏度、特异性等检测性能参数。本研究建立了基于磁微粒核酸提取平台的HPV基因分型检测技术,可以检测HPV的24种基因型,灵敏度达100 copies/ml,检测范围为1.0×1021.0×109 copies/ml,分型准确,批间批内差异率均不高于5%,与带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒低危型、白色念珠菌、大肠杆菌、解脲支原体、生殖支原体、人型支原体、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌没有交叉反应,不受样本中尿素（6%）、无机盐（6%）、免疫球蛋白（1.6 g/dL）、白细胞含量（1×107个/ml）、抗生素（6 mg/ml）的干扰。本方法可以实现单次同时对HPV 24种基因型的快速、灵敏甄别,可用于宫颈癌的早期诊断。
潘琨琨[10]（2019）在《基于血清拉曼光谱的丙肝诊断和1b亚型的鉴定》文中研究说明目的:初步建立基于血清拉曼光谱的丙型肝炎病毒（HCV）的诊断及1b亚型的鉴定方法。方法:应用激光拉曼光谱仪检测各样品的血清,检测波长区间为300至300 0cm-1,采用airPLS-pls-svc算法处理拉曼光谱数据并分型鉴定,HCV诊断训练集,纳入健康志愿者145例和HCV患者152例,HCV诊断测试集,纳入健康志愿者55例和HCV患者72例。1b亚型鉴定的训练集为1b亚型患者88例和非1b亚型患者64例,1b亚型鉴定的测试集为1b亚型患者51例和非1b亚型患者15例。结果:HCV1b型和非1b亚型血清拉曼光谱拉曼峰型相似,在100 7 cm-1,115 4cm-1,151 9 cm-1波长的拉曼光谱峰强度存在差异。应用统计学分析这些拉曼光谱,1b型鉴定准确率为100%（51/51）,非1b亚型鉴定准确率为93.333 3%（14/15）,误诊一例。总准确率为98.48 4 8%,总误诊1例。结论:本研究初步证明拉曼光谱可应用于HCV诊断和HCV1b亚型的鉴定,为研发HCV新型诊断和分型技术奠定了基础。
二、多重引物聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒基因及基因分型（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、多重引物聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒基因及基因分型（论文提纲范文）
（1）云南地区HCV基因型流行特征及耐药突变基因检测方法的初步建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丙型肝炎 |
| 1.2 HCV的基因组和生命周期 |
| 1.2.1 HCV的基因组 |
| 1.2.2 HCV的生命周期 |
| 1.3 HCV基因型的分布情况 |
| 1.3.1 HCV基因型在全球的分布情况 |
| 1.3.2 HCV基因型在中国的分布情况 |
| 1.3.3 HCV基因型在云南的分布情况 |
| 1.4 HCV的治疗现状 |
| 1.4.1 HCV抗病毒药物 |
| 1.4.2 HCV新型直接抗病毒药物 |
| 1.4.3 HCV药物治疗方案 |
| 1.5 HCV的预存耐药 |
| 1.6 HCV基因检测常用技术和方法 |
| 1.6.1 第一代测序技术 |
| 1.6.2 等位基因特异性聚合酶链反应 |
| 1.6.3 高分辨率溶解曲线定量聚合酶链反应 |
| 1.6.4 下一代测序技术 |
| 1.7 Ion Torrent PGM测序平台 |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 1.9 研究的技术路线 |
| 第二章 云南地区HCV基因型的分布情况和流行的变化趋势 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验对象 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 主要实验仪器 |
| 2.2.4 主要的数据分析方法 |
| 2.3 引物设计 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 样品准备 |
| 2.4.2 样品RNA提取 |
| 2.4.3 巢式PCR扩增 |
| 2.4.4 PCR电泳检测 |
| 2.4.5 PCR产物的纯化 |
| 2.4.6 送测序 |
| 2.4.7 双峰样品TA克隆 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 云南省HCV的流行病学 |
| 2.5.2 昆明地区HCV的流行病学 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 小结 |
| 第三章 DAA治疗前HCV不同基因型预存耐药的突变特征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验对象 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 引物设计 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 样本PCR扩增结果及测序分析 |
| 3.5.2 同源进化树分析及HCV不同基因型直接作用靶点发生RAVs的分析 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 小结 |
| 第四章 高通量测序方法的初步建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验对象 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验仪器 |
| 4.3.3 实验方法 |
| 4.3.4 测序数据的处理 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 HCV5 种亚型三区段单对引物扩增结果 |
| 4.4.2 HCV5 型三区段多重PCR结果 |
| 4.4.3 Ion Torrent PGM测序质量报告评估 |
| 4.4.4 HCV耐药突变基因高通量测序方法的特异性验证 |
| 4.4.5 耐药突变位点 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（2）基于恒温扩增原理建立丙型肝炎病毒基因分型的方法（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 建立环介导恒温扩增方法进行丙型肝炎病毒基因分型的的方法及对其进行性能评价 |
| 引言 |
| 材料 |
| 研究方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 采用解螺旋酶依赖的恒温扩增方法建立丙型肝炎病毒基因分型的方法 |
| 引言 |
| 材料 |
| 研究方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）丙型病毒性肝炎病毒感染实验诊断技术及方法学概述（论文提纲范文）
| 1 HCV抗体的检测 |
| 1.1 酶联免疫吸附试验 (ELISA) |
| 1.2 重组免疫印迹试验 (recombinant immunoblot assay, RIBA) |
| 1.3 斑点免疫渗滤试验 (direct immuno floresecnce assay, DIFA) |
| 1.4 化学发光免疫分析 (chemi luminescence immuno assay, CLIA) |
| 2 HCV核心抗原的检测 |
| 2.1 量子点 (quantum dots, QD) 技术 |
| 2.2 ELISA |
| 2.3 CLIA |
| 3 HCV核酸 (HCV-nucleicacid, HCV-NA) 的检测 |
| 3.1 实时荧光聚合酶链反应 (real-time PCR) |
| 3.2 荧光定量-环介导反转录等温扩增技术 (reverse loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP) |
| 3.3 磁珠法在HCV-RNA定量检测中的临床应用 |
| 4 HCV基因型及基因亚型的检测 |
| 4.1 real-time PCR |
| 4.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态 (PCR-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP) 分析 |
| 4.3 序列特异性引物-聚合酶链反应 (PCR-Scquence specific primer, PCR-SSP) |
| 4.4 聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针杂交技术 (PCR-sequence-specific oligonucleotide, PCR-SSO) |
| 4.5 聚合酶链反应-分型测序 (PCR-se-quence-based typing, PCR-SBT) |
| 4.6 聚合酶链反应-核酸液相芯片分型技术 (PCR-nucleic liquichip typing techniques, PCR-NLTT) |
| 5 结语 |
（4）广州地区丙型肝炎患者的HCV基因型相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 临床切实可行的两种基因分型法（部分基因测序法与探针杂交法）的准确性比较 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部份 广州地区丙型肝炎患者的 HCV 分子流行病研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间参与撰写的文章 |
| 致谢 |
（5）中国南方HCV基因型的分布和抗病毒疗效影响因素的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 慢性丙型肝炎病毒基因型和亚型的分布 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 影响慢性丙型肝炎抗病毒疗效的病毒与宿主因素研究 |
| 一、1b和6a亚型慢性丙型肝炎抗病毒疗效及影响因素 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 二、与抗病毒疗效相关的IL28B多态性检测方法的建立与应用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 我国南方HCV 6a亚型重组病毒的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文缩写注释 |
| 攻读博士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（6）慢性丙型肝炎患者酒精代谢基因、性激素与显着性肝纤维化的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 慢性丙型肝炎患者肝纤维化进展的危险因素 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 酒精代谢基因多态性与慢性丙型肝炎肝纤维化的相关性分析 |
| 一、酒精代谢基因多态性检测方法的建立及验证 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 二、酒精代谢基因多态性与慢性丙型肝炎肝纤维化的相关性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 慢性丙型肝炎男性患者血清性激素水平与肝纤维化的相关性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 1 |
| 参考文献 |
| 综述 2 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（7）湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 HCV感染者丙型肝炎知识知晓与接受直接抗病毒药物治疗意愿调查 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.1.1 调查对象 |
| 1.1.2 调查内容及方式 |
| 1.1.3 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 人口学情况 |
| 1.2.2 治疗意愿及影响因素 |
| 1.2.3 丙型肝炎知识知晓情况 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样本来源 |
| 2.2.2 样本收集与处理 |
| 2.2.3 丙型肝炎病毒核酸定量和基因分型检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 检测结果 |
| 2.3.2 湖南省丙型肝炎基因型地理分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）丙型肝炎病毒检测方法进展及应用（论文提纲范文）
| 1 丙肝抗体检测 |
| 1.1 抗-HCV酶联免疫吸附测定(enzy me-linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 1.2 化学发光试验(Che milu minescence immunoas-says,CLIA) |
| 1.3 胶体金法检测(gold immunochro matography as-say,GICA) |
| 1.4 重组免疫印迹法(reco mbinant immunoblot as-say,RIBA) |
| 1.5 检测结果的解释 |
| 2 HCV核心抗原检测(HCVc Ag) |
| 3 抗原-抗体联合检测(Co mbination HCV core an-tigen and antibody assay) |
| 4 HCV核酸RNA检测(HCV-RNA) |
| 4.1 HCV RNA定性检测 |
| 4.2 HCV RNA定量检测 |
| 5 HCV基因检测 |
| 5.1 测序法[49-51] |
| 5.2 型特异性引物扩增法(PCR a mplification withhSequence.Specific Pri mers,PCR-SSP) |
| 5.3 特异性探针杂交法(Li PA) |
| 5.4 基因芯片法 |
| 5.5 特异性片段长度多态性法(PCR-RFLP) |
| 5.6 遗传关系进化树(遗传关系分析法) |
| 6 结论 |
（9）基于磁微粒核酸提取平台的HPV核酸分型技术的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 综述 |
| 1 核酸提取技术研究进展 |
| 1.1 传统核酸提取技术 |
| 1.2 固相核酸提取技术 |
| 2 人乳头瘤病毒检测技术研究进展 |
| 2.1 宫颈癌对健康的危害 |
| 2.2 HPV与宫颈癌的关系 |
| 2.3 HPV致癌机制 |
| 2.4 HPV检测研究进展 |
| 3 本研究的目的、内容 |
| 3.1 本研究的目的 |
| 3.2 本研究的主要内容 |
| 第二章 磁微粒核酸提取平台的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 磁微粒选择 |
| 2.3.2 核酸萃取液优化 |
| 2.3.3 洗涤液A优化 |
| 2.3.4 洗涤液B优化 |
| 2.3.5 洗涤脱液优化 |
| 2.3.6 基于磁微粒平台检测过程优化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 HPV多重荧光PCR核酸分型技术的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与结论 |
| 3.3.1 引物/探针优化 |
| 3.3.2 耐热DNA聚合酶 |
| 3.3.3 脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) |
| 3.3.4 核酸扩增体系中Mg~(2+)浓度的优化 |
| 3.3.5 核酸扩增体系中KCl浓度的优化 |
| 3.3.6 核酸扩增体系中Tris-HCl优化 |
| 3.3.7 甘油浓度的优化 |
| 3.3.8 UNG酶优化 |
| 3.3.9 内标用量的优化 |
| 3.3.10 试剂盒核酸扩增反应主要参数的优化 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于磁微粒提取平台的HPV分型技术初步评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与结论 |
| 4.3.1 样本检测干扰 |
| 4.3.2 含免疫球蛋白的样本对核酸扩增检测的影响 |
| 4.3.3 含白细胞样本对核酸扩增检测的影响 |
| 4.3.4 含抗生素样本对核酸扩增检测的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 基于磁微粒提取平台的HPV核酸分型方法的性能评估 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与结论 |
| 5.3.1 阳性判断值确定 |
| 5.3.2 试剂盒分析灵敏度评估 |
| 5.3.3 分析特异性评估 |
| 5.3.4 分析检测范围评估 |
| 5.3.5 分型准确性评估 |
| 5.3.6 试剂盒批内差异率、批间差异率评估 |
| 5.4 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（10）基于血清拉曼光谱的丙肝诊断和1b亚型的鉴定（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 内容与方法 |
| 1.研究对象 |
| 1.1 样本的纳入标准和排除 |
| 1.2 样本的分组 |
| 2.实验仪器 |
| 3.实验试剂 |
| 4.研究方法 |
| 4.1 待测样本制备 |
| 4.2 最佳测量实验条件的建立 |
| 4.3 标本检测 |
| 4.4 质控物质 |
| 5.数据处理及及分析 |
| 6.技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 导师评阅表 |
四、多重引物聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒基因及基因分型（论文参考文献）
- [1]云南地区HCV基因型流行特征及耐药突变基因检测方法的初步建立[D]. 杨婉汝. 昆明理工大学, 2019(01)
- [2]基于恒温扩增原理建立丙型肝炎病毒基因分型的方法[D]. 杨川琪. 昆明医科大学, 2019(06)
- [3]丙型病毒性肝炎病毒感染实验诊断技术及方法学概述[J]. 廖远泉. 疾病监测, 2014(10)
- [4]广州地区丙型肝炎患者的HCV基因型相关研究[D]. 肖桂娥. 广州医科大学, 2014(03)
- [5]中国南方HCV基因型的分布和抗病毒疗效影响因素的相关研究[D]. 李威. 南方医科大学, 2013(08)
- [6]慢性丙型肝炎患者酒精代谢基因、性激素与显着性肝纤维化的相关性研究[D]. 姜树朋. 武汉大学, 2017(06)
- [7]湖南省吸毒患者感染丙型肝炎病毒基因型特征分析[D]. 戴俊斌. 南华大学, 2019(01)
- [8]丙型肝炎病毒检测方法进展及应用[J]. 石莹,陈肖潇,田绿波,樊学军,高国龙. 预防医学情报杂志, 2016(04)
- [9]基于磁微粒核酸提取平台的HPV核酸分型技术的建立与应用[D]. 陈悦科. 上海交通大学, 2016(03)
- [10]基于血清拉曼光谱的丙肝诊断和1b亚型的鉴定[D]. 潘琨琨. 新疆医科大学, 2019(01)