一、应用特异性引物检测中国不同地区旋毛虫DNA（论文文献综述）
郭庆红[1]（2021）在《日本血吸虫病核酸检测方法的建立和初步应用》文中研究说明血吸虫病是由血吸虫感染引起的一种人兽共患寄生虫病,严重危害人类健康和畜牧业的发展。在我国流行的是日本血吸虫病,经过几十年综合防控措施的实施,人和家畜的日本血吸虫病感染率和感染强度已经大幅度下降。传统的病原学和免疫学诊断方法逐步无法满足需求。因此,本研究的目的是建立敏感性高、特异性强以及使用方便快捷的日本血吸虫病核酸诊断方法。本研究选取实验室前期筛选的G01片段作为检测靶序列,通过对羊血浆样本量、核酸模板量以及Real-time PCR退火温度等进行优化,建立了可以用于诊断羊日本血吸虫病的Real-time PCR方法。该方法检测下限为0.26 fg,与前后盘吸虫、大片吸虫、弓形虫、旋毛虫、裂头蚴、住肉孢子虫、巴贝斯虫和捻转血矛线虫均无交叉反应。应用该方法检测159份日本血吸虫感染的阳性羊血浆样本,敏感性为98.74%（157/159,95%CI:95.53%–99.85%）,对94份阴性羊血浆样本进行检测,特异性为100%（94/94,95%CI:96.15%–100%）。此外,应用该方法对望江（日本血吸虫病疫区）120份和威海（非日本血吸虫病疫区）33份羊血浆样本进行检测,结果表明,望江羊检出率为8.33%（10/120,95%CI:4.07%–14.79%）,威海羊检出率为0%（0/33,95%CI:0%–10.58%）。本研究同样选取G01片段作为检测靶序列,建立了诊断小鼠和羊日本血吸虫病的LFD-RPA检测方法。该方法检测下限为2.6 fg,同样与前后盘吸虫、大片吸虫、弓形虫、旋毛虫、裂头蚴、住肉孢子虫、巴贝斯虫和捻转血矛线虫均无交叉反应。应用该方法检测36份日本血吸虫感染的阳性小鼠血浆样本,敏感性为97.22%（35/36,95%CI,85.47%–99.93%）,对36份阴性小鼠血浆样本进行检测,特异性为100%（36/36,95%CI,90.26%–100%）;检测48份日本血吸虫感染的阳性羊血浆样本,敏感性为93.75%（45/48,95%CI,82.80%–98.69%）,对53份阴性羊血浆样本进行检测,特异性为100%（53/53,95%CI,93.28%–100%）。结果表明该方法的敏感性和特异性较高,同时具有快速诊断羊日本血吸虫病的潜力。此外,利用建立好的Real-time PCR方法对日本血吸虫不同感染量（感染5/10/40条尾蚴）的小鼠在感染后不同时间进行检测,以评估该方法在日本血吸虫病早期诊断上的效果。结果显示,在感染后1-7天,不同感染量小鼠的检出率在20%-75%之间;感染10-20天后,不同感染量小鼠的检出率均在12.5%以下;在感染20天后检出率逐渐升高,至感染后第40天,检出率均为77.8%以上。因此,该方法对小鼠日本血吸虫感染早期诊断的效果不理想。此外,我们对人工感染山羊在感染后1、2、3、4、5、6、7、14、24和56天采集的血浆样本进行了Real-time PCR检测,结果显示,在感染后1-5天,检出率在10%-50%之间;感染6-24天后,检出率均在12.5%以下;在感染20天后检出率逐渐升高,至感染后第56天检出率达到100%。因此,该方法对羊日本血吸虫感染的早期诊断效果不理想。
岳涛涛[2]（2021）在《旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌抗肿瘤效应研究》文中指出肺癌是当前死亡率最高的癌症,发病率、死亡率持续上升,发病年龄逐渐年轻化。目前,肺癌的治疗方法主要有手术、放疗、化疗和生物免疫疗法。生物免疫疗法主要包括抗体疗法、细胞疗法和肿瘤疫苗。研究发现细菌活载体疫苗具有明显的抗肿瘤效应,其中乳酸菌是益生菌,具有免疫调节能力和一定的抗肿瘤活性,已有研究表明乳酸菌可作为疫苗载体用于宫颈癌的防治。近年来,人们发现旋毛虫可抑制骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤的生长。本实验室前期发现旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原sHSPs抗血清具有良好的抗肺癌作用。因此,本试验构建相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌,研究其对Lewis肺癌的作用,以期为肿瘤防治提供新思路,并为肿瘤疫苗的研发及应用提供实验数据。旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的构建扩增出sHSPs基因,连接真核质粒pValac,转染293T细胞验证表达,将验证后的重组质粒转化重组侵入型植物乳杆菌NC8/FnBPA,筛选出阳性克隆命名为NC8-sHSPs。对重组植物乳杆菌NC8-sHSPs的生长特性、黏附、侵袭、定植能力及安全性进行检测。结果表明成功扩增出相关抗原基因sHSPs,构建的重组质粒pValac-sHSPs在真核细胞内可以表达。生长特性分析表明重组植物乳杆菌NC8-sHSPs的生长特性无明显改变,能以活菌的形式通过人工胃液,并可在人工肠液中繁殖。定植试验表明NC8-sHSPs在体外可黏附、侵入小鼠mode-k细胞,在小肠内也可定植。安全性检测表明NC8-sHSPs对mode-k细胞增殖无明显影响,体内、外均未引起IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ和TNF-α等促炎细胞因子的过量释放,也未引起小鼠体重的明显改变和组织器官的明显损伤。重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的预防作用首先经口免疫1×109 cfu NC8-sHSPs,二免后7 d皮下注射2×106个Lewis肺癌细胞荷瘤,荷瘤后14 d,处死小鼠,剥离肿瘤,计算抑瘤率。通过ELISA和流式细胞术检测免疫学指标。CCK-8、LDH试验研究体外重组sHSPs对脾淋巴细胞增殖的影响及诱导CTL杀伤Lewis肺癌细胞的能力。最后对病理组织学损伤进行观察。结果表明重组植物乳杆菌NC8-sHSPs可明显抑制Lewis肺癌生长,平均肿瘤体积和重量抑制率分别为62.36%和68.37%。免疫学检测发现重组植物乳杆菌可诱导sHSPs特异性IgG,提高血清中TNF-α、IFN-γ、总sIgA以及肠道灌洗液中总sIgA的水平,增加CD8+T淋巴细胞的数量,表明免疫NC8-sHSPs可激活宿主的体液免疫,增强细胞免疫和黏膜免疫抑制Lewis肺癌的生长。淋巴细胞增殖试验表明重组sHSPs可促进小鼠脾淋巴细胞增殖,联合IL-2可诱导产生直接杀伤Lewis肺癌细胞的CTL。免疫组化表明肿瘤内PCNA的表达降低,病理组织学观察未见明显损伤。重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的治疗作用首先皮下注射2×106 Lewis肺癌细胞建立荷瘤小鼠模型,然后用1×109 cfu NC8-sHSPs连续治疗15 d,治疗结束剥离肿瘤,计算抑瘤率。使用ELISA检测免疫学指标,最后对组织器官进行HE染色观察病理组织学损伤。结果表明重组植物乳杆菌NC 8-sHSPs治疗可抑制Lewis肺癌生长,延长荷瘤小鼠生存时间,平均肿瘤体积和重量抑制率分别为40.76%和44.22%。免疫学检测结果表明重组植物乳杆菌可诱导sHSPs特异性IgG,提高血清中IL-12、TNF-α、IFN-γ、总sIgA以及肠道灌洗液中总sIgA的水平,表明重组植物乳杆菌治疗可诱导体液免疫,增强黏膜免疫和细胞免疫杀伤Lewis肺癌。组织器官HE染色表明重组植物乳杆菌NC 8-sHSPs治疗后未出现明显的病理损伤。
伊娜娜[3]（2020）在《旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究》文中进行了进一步梳理旋毛虫是一种食源性寄生虫。在旋毛虫寄生期间,宿主需要尽可能的排出病原生物,而寄生虫需要在宿主体内成功繁殖和生存,因此在寄生过程中逐渐进化出一种复杂的宿主-寄生虫相互作用关系,而旋毛虫serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂（TsSPI）在这一过程中可能发挥重要作用。TsSPI在旋毛虫ML、AW、NBL中都有表达,其中在ML期表达水平最高。本研究旨在通过RNAi研究TsSPI在旋毛虫入侵以及调节宿主免疫方面的功能,同时探讨重组蛋白TsSPI在体外对巨噬细胞极化的影响。本研究利用RNA干扰技术来探索TsSPI基因在旋毛虫生命周期中的功能。设计合成三条特异性siRNA（siRNA-153、siRNA-479、siRNA-986）,同时体外合成特异性dsRNA-TsSPI,利用脂质体辅助浸泡的方法将特异性siRNA和dsRNA传递到旋毛虫肌幼虫体内,结果发现RNAi可以有效地传递到旋毛虫肌幼虫体内;利用qPCR和Western-blot检测TsSPI基因转录水平和蛋白表达水平,结果发现siRNA和dsRNA-TsSPI的沉默效果为剂量依赖性,且2μM siRNA或60ng/μl dsRNA为最佳的作用浓度;三组特异性siRNA和dsRNA-TsSPI均可有效的降低TsSPI基因转录水平和蛋白表达水平,其中siRNA-986和dsRNA-TsSPI效果最佳,考虑到成本,后续实验均利用60ng/μl dsRNA-TsSPI进行;利用dsRNA-TsSPI浸泡处理旋毛虫2 d后开始有很好的沉默效果,3 d后沉默效果最佳,而且持续到7 d依旧有显着的沉默效果,可见在后续感染实验中,整个肠期感染阶段（感染后3-7 d）内经过dsRNA-TsSPI浸泡处理的旋毛虫都处于TsSPI基因沉默状态;利用检测dsRNA-TsSPI处理后的旋毛虫中Ts Ka SPI的基因转录水平及蛋白水平的方法验证dsRNA-TsSPI干扰的特异性,结果显示dsRNA-TsSPI特异性良好。在本研究中,dsRNA介导的TsSPI基因沉默不影响幼虫在体外的蜕皮和存活率,但降低旋毛虫体外入侵肠上皮细胞的能力。将各组旋毛虫肌幼虫感染小鼠,结果发现与对照感染组相比,TsSPI基因沉默组小鼠肠道成虫荷和肌肉中肌幼虫数量均显着降低,但两组之间相同数量的成虫产出的新生幼虫数量没有差异。dsRNA干扰遗传性分析结果显示,旋毛虫成虫的TsSPI基因依旧受到抑制,而P 1代肌幼虫中TsSPI基因已经基本恢复到正常水平。因此我们推测肌肉中P 1代肌幼虫数量降低可能是肠道成虫荷降低导致的。将dsRNA-TsSPI介导的TsSPI基因沉默的旋毛虫感染小鼠,小鼠感染后4 d、7 d取腹腔巨噬细胞,用ELISA检测试剂盒检测小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中炎性细胞因子含量,结果显示,与对照组相比,感染旋毛虫后,小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10含量均有不同程度的升高,而这种促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子形成的混合体内环境有利于旋毛虫的寄生;与感染后4 d相比,感染后7 d,促炎性细胞因子含量均有不同程度的降低,而抗炎性细胞因子含量没有显着变化。与感染未经过处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中炎性细胞因子含量均有不同程度的升高。可见TsSPI基因沉默后,旋毛虫引起的宿主炎性反应显着加剧,说明TsSPI可能通过影响宿主炎症因子之间的平衡缓解旋毛虫引起的宿主炎性反应。利用Western blot检测各组小鼠巨噬细胞P65磷酸化水平变化,结果显示,与对照组相比,感染旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化水平显着升高;和感染后4 d相比,感染后7 d小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化显着降低,间接证明了随着感染时间的推移,旋毛虫引起的宿主免疫反应从Th1/Th2混合型反应转变为Th2型免疫反应为主。而与感染未经处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化水平显着升高,说明TsSPI可以缓解旋毛虫感染引起的巨噬细胞NF-κB的磷酸化,进而抑制宿主炎症反应。利用qPCR检测旋毛虫感染后腹腔巨噬细胞中效应因子CAM标志物i NOs和AAM标志物Arg-1的m RNA表达量,结果显示,与对照组,感染旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞效应因子i NOs以及Arg-1的表达量均显着升高;和感染后4 d相比,感染后7 d小鼠腹腔巨噬细胞i NOs表达量显着降低,而Arg-1表达量则显着升高,说明旋毛虫感染可以调节宿主巨噬细胞极化。与感染未经处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞中效应因子i NOs的相对表达量显着升高,而效应因子Arg-1的相对表达量显着降低,说明TsSPI在旋毛虫调节宿主巨噬细胞极化过程中发挥重要作用。诱导表达重组蛋白TsSPI和mu TsSPI,其中mu TsSPI为丝氨酸蛋白酶抑制剂活性降低的突变体TsSPI。qPCR检测各CAM相关因子转录水平变化,结果显示,TsSPI可以抑制LPS介导巨噬细胞分泌CAM相关促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和效应因子i NOs的转录表达,同时利用Western blot检测巨噬细胞P65磷酸化水平和IRAK、IκB的蛋白表达情况,结果显示,TsSPI可以抑制LPS介导的IRAK、IκB降解以及P65磷酸化,并且如果改用突变体刺激,以上调节功能均明显减弱。可见TsSPI可以依赖丝氨酸蛋白酶抑制活性抑制LPS介导的NF-κB通路活性,并进一步抑制促炎性细胞因子和效应因子i NOs的释放,阻止巨噬细胞向CAM极化。利用重组蛋白TsSPI和mu TsSPI直接刺激巨噬细胞。qPCR检测各AAM相关因子转录水平变化,结果显示,TsSPI可以有效的促进AAM相关抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10和效应因子Arg-1的转录表达。同时利用Western blot检测巨噬细胞JAK2和STAT3磷酸化水平,结果显示,TsSPI可以刺激激活JAK2和STAT3发生磷酸化,改用突变体刺激并不影响这种调节功能。可见TsSPI可以刺激激活JAK2/STAT3信号通路,同时促进抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10和AAM标志效应因子效应因子Arg-1的分泌,促进巨噬细胞向AAM极化。综上所述,dsRNA-TsSPI可以特异而有效的抑制TsSPI的基因转录水平及蛋白水平。TsSPI可能不直接参与寄生虫自身的生长和繁殖,但在一定程度上参与调节旋毛虫与宿主的相互作用。TsSPI基因沉默可以增强巨噬细胞NF-κB的磷酸化水平,促进巨噬细胞分泌炎性细胞因子,调节巨噬细胞极化。重组蛋白TsSPI可以依赖丝氨酸蛋白酶抑制活性抑制LPS介导的NF-κB通路活性,同时刺激激活JAK2/STAT3信号通路,并调节相应细胞因子和效应因子的表达。TsSPI可能通过调节巨噬细胞极化,进而影响宿主炎症因子之间的平衡,从而调节宿主免疫反应,为旋毛虫在宿主中的定殖创造有利环境。
金启旺[4]（2020）在《旋毛虫诱导分化巨噬细胞调节小鼠Th2型免疫应答影响弓形虫共感染的分子机制研究》文中研究说明旋毛虫（Trichinella spiralis）和弓形虫（Toxoplasma gondii）是两种重要的食源性寄生虫,具有相似的感染途径和宿主范围。由于两种病原分别属于多细胞的线虫和单细胞的原虫,因此它们感染宿主后诱导的免疫应答也截然不同。旋毛虫感染宿主诱导Th2型为主的免疫应答,弓形虫感染宿主诱导Th1型为主的免疫应答。众所周知,巨噬细胞在调节Th1和Th2型免疫应答方面发挥关键作用。两种病原的共感染改变了宿主对每种病原的免疫应答反应,进一步增加了对食品安全和人类健康的威胁。阐明旋毛虫与弓形虫感染同一宿主的致病机理和免疫机制是防控两种病原共感染的重点。本研究旨在探究由旋毛虫活化巨噬细胞诱导产生的Th2型免疫应答对弓形虫再感染的调节作用,明确旋毛虫诱导活化巨噬细胞介导Th2型免疫应答调节弓形虫再感染的分子机制,为防控旋毛虫和弓形虫感染同一宿主奠定理论基础。本研究建立了旋毛虫-弓形虫同时感染、旋毛虫先期感染-弓形虫继发感染和弓形虫先期感染-旋毛虫继发感染BALB/c小鼠模型。通过ELISA方法检测了共感染小鼠外周血Th1和Th2型细胞因子水平的变化;利用流式细胞技术评价了共感染小鼠外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞变化情况;显微镜计数方法检测了共感染小鼠旋毛虫荷虫量;q RT-PCR方法检测了共感染小鼠弓形虫荷虫量。结果显示单独旋毛虫感染主要诱导以Th2型细胞因子（IL-4）升高和CD4+T细胞增加为标志的Th2型免疫应答;单独弓形虫感染主要诱导以Th1型细胞因子（IFN-γ）升高和CD8+T细胞升高为标志的Th1型免疫应答;旋毛虫与弓形虫同时感染诱导Th1/Th2型混合免疫应答,且弓形虫感染可以推迟旋毛虫感染诱导的Th2型细胞因子达到峰值的时间,旋毛虫感染可以推迟弓形虫感染诱导的Th1型细胞因子达到峰值的时间;旋毛虫感染6周后弓形虫继发感染,诱导比旋毛虫单独感染时较低的CD4+T细胞和较高的CD8+T细胞为特征的免疫应答;弓形虫感染6周后旋毛虫继发感染诱导比弓形虫单独感染较高的CD4+T细胞和较高的CD8+T细胞为特征的免疫应答;旋毛虫和弓形虫共感染小鼠与单独寄生虫感染小鼠相比,尽管无法显着改变旋毛虫荷虫量,但可以显着增加弓形虫荷虫量。以上研究结果表明旋毛虫感染诱导与弓形虫感染截然相反的免疫应答,即旋毛虫感染主要诱导抑制炎症反应的Th2型免疫应答,弓形虫感染主要诱导促进炎症反应的Th1型免疫应答;旋毛虫/弓形虫共感染时,诱导的两种免疫应答相互影响,互相拮抗,即旋毛虫感染诱导的免疫应答可以抑制弓形虫感染诱导的免疫应答;旋毛虫感染可以促进弓形虫的感染,但是弓形虫感染无法显着影响旋毛虫的感染。旋毛虫通过哪些分子调节宿主免疫应答影响弓形虫感染尚未明确。前期研究表明,旋毛虫可以通过ES抗原调节宿主Th2型免疫应答。本研究鉴定了旋毛虫ES抗原成分之一——硫氧还蛋白过氧化物酶（thioredoxin peroxidase,TPX2）,并初步明确了旋毛虫TPX2通过活化巨噬细胞诱导小鼠Th2型免疫应答的机制。采用免疫组化和免疫荧光方法研究了TPX2蛋白在旋毛虫肌幼虫和成虫中的定位;以r TSTPX2蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA方法检测了血清中细胞因子和特异性抗体变化,流式细胞技术检测了外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞含量,攻虫实验评价r Ts TPX2免疫保护效果;采用q RT-PCR和Western Blotting方法检测TPX2体外诱导活化的腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞的表型;利用MTS法评价了r Ts TPX2活化的巨噬细胞体外刺激CD4+T细胞的增殖能力;将r Ts TPX2体外活化的腹腔巨噬细胞移植至健康BALB/c小鼠,通过ELISA方法检测了血清中细胞因子和特异性抗体变化,流式细胞技术检测了外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞含量,攻虫实验评价移植r Ts TPX2活化的巨噬细胞诱导的免疫保护效果。结果显示旋毛虫TPX2主要分布于旋毛虫肌幼虫和成虫的表皮层和杆状体中,少量分布于肌幼虫和成虫寄生部位的周围宿主组织中;以r Ts TPX2直接免疫小鼠可以诱导以Th2型细胞因子（IL-4和IL-10）增加、Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-12和TNF-α）降低、Th2型特征性抗体（Ig G1）大量分泌为特征的Th2型为免疫应答,同时伴随CD4+T细胞的增加和CD8+T细胞的降低。并且r Ts TPX2诱导的上述免疫应答可以引起约35%成虫减虫率和45%肌幼虫减虫率。体外研究显示,r Ts TPX2可以直接诱导腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞分化成M2表型,表现为M1（i NOS-1）标志分子表达下调和M2（MRC-1、Arg-1、CCL22）标志分子表达上调;体外巨噬细胞/CD4+T细胞共培养模型显示,r Ts TPX2活化的巨噬细胞可以直接诱导CD4+T细胞极化为Th2并大量增殖;将r Ts TPX2体外活化的巨噬细胞过继小鼠,可以诱导Th2型增强为特征的免疫应答,攻虫实验表明,r Ts TPX2活化的巨噬细胞可诱导44.7%的成虫减虫率和52.9%的肌幼虫减虫率。以上结果表明,旋毛虫TPX2可通过诱导M2亚群巨噬细胞活化进而抑制Th1型免疫应答而发挥抗旋毛虫感染作用。巨噬细胞是抗胞内病原感染重要效应细胞,在抗弓形虫天然免疫中发挥关键作用,旋毛虫诱导活化的巨噬细胞是否影响弓形虫感染?本研究进一步探究了旋毛虫诱导巨噬细胞活化以及诱导活化的巨噬细胞对弓形虫体外感染的影响。通过q RT-PCR和WB方法检测了体内和体外活化的巨噬细胞标志分子,明确了旋毛虫诱导活化的巨噬细胞表型;通过弓形虫速殖子体外感染巨噬细胞,明确不同活化方式的巨噬细胞对弓形虫感染的影响。结果显示体内旋毛虫感染诱导巨噬细胞以Arg-1、Fizz-1和MRC-1表达上调为标志的M2表型;旋毛虫肌幼虫ES抗原和r TSTPX2体外刺激RAW264.7和腹腔巨噬细胞,诱导以Arg-1和MRC-1上调,i NOS-1下调为标志的M2表型;M2表型的巨噬细胞可以增加弓形虫感染。表明旋毛虫可以通过直接诱导巨噬细胞替代途径活化调节弓形虫感染。综上所述,本研究初步阐明了旋毛虫诱导Th2型免疫应答的分子机制,明确了旋毛虫诱导的Th2型免疫应答对弓形虫感染的影响,初步确定了旋毛虫通过诱导巨噬细胞活化调节弓形虫感染的细胞机制。
李亚兰[5]（2020）在《旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B的表达与鉴定及其在侵入宿主肠粘膜过程中作用的研究》文中研究说明旋毛形线虫（Trichinella spiralis）是一种细胞内寄生性线虫。由旋毛虫感染引起的旋毛虫病是对经济和公共卫生危害严重的一种食源性人兽共患寄生虫病。人体旋毛虫病主要因生食或半生食含旋毛虫肌幼虫囊包的肉类。旋毛虫幼虫没有口器、刺突和板齿等器官侵入宿主,旋毛虫侵入宿主、在体内迁移的机制并不明确。研究认为旋毛虫肌幼虫侵入小肠粘膜不仅有机械力穿透作用,旋毛虫分泌的蛋白酶类对肠粘膜上皮细胞的损伤,在肌幼虫侵入小肠粘膜的过程中亦发挥着关键作用。半胱氨酸蛋白酶是一类重要的分布于多种生物体内的蛋白水解酶,不但具有蛋白水解及代谢的基本功能,还在寄生虫脱包囊/包囊形成、侵入宿主粘膜屏障、免疫逃避等过程中发挥着重要作用。本研究中,旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B（TsATG4B,Genbank:XM＿003371464）属于半胱氨酸蛋白酶CA分支,C54蛋白酶家族,是旋毛虫早期感染血清识别成虫可溶蛋白,并通过质谱分析鉴定出的一种半胱氨酸蛋白酶。本研究构建重组质粒并进行原核系统表达,通过重组TsATG4B蛋白（rTsATG4B）的免疫原性分析、酶活性分析和生物学功能特性研究,对其在旋毛虫感染中的免疫保护作用及其在旋毛虫侵入宿主肠粘膜过程中的作用等进行系列研究。期望进一步明确旋毛虫侵入宿主肠粘膜组织的机制,并为新型疫苗的发展和寻求新的旋毛虫病治疗药物靶点做基础研究工作。材料与方法1.实验动物,旋毛虫虫种保种和收集,血清、细胞培养,质粒及菌株实验动物BALB/c小鼠和昆明小鼠均购自河南省实验动物中心,旋毛虫ISS534株最初是从中国河南省南阳地区家猪中分离的旋毛虫T1株,昆明雌性小鼠保种并传代。实验血清包括感染小鼠血清、免疫小鼠血清和正常小鼠血清。原核表达载体为p QE80L,克隆菌、表达菌分别为DH5α、BL21大肠杆菌菌株。小鼠小肠上皮细胞（IECs）来自本课题组前期分离BALB/c胎鼠小肠并保存,小鼠成肌细胞（C2C12）、人类结肠癌细胞（HT29）为本实验室保存。2.TsATG4B的生物信息学分析、克隆与表达利用NCBI、Ex Pasy、Signal P4.1 server、EMBI、TMHMM Server v.2.0等网站,在线对TsATG4B蛋白理化性质、结构域、信号肽、跨膜结构域等进行生物信息学分析及预测。SWISS-MODEL在线建模并预测TsATG4B分子空间结构;利用MEGA 7.0软件采用最大简约法构建系统进化树。构建重组质粒TsATG4B-sig-p QE80L/BL21进行大肠杆菌原核表达系统表达并进一步纯化,将纯化的rTsATG4B蛋白免疫BALB/c小鼠获得免疫小鼠血清,并用ELISA法检测免疫血清滴度及其引起的免疫应答类型。3.rTsATG4B蛋白的酶活性鉴定及其与IECs细胞的作用应用稀释法复性rTsATG4B蛋白并超滤浓缩,SDS-PAGE鉴定后,明胶酶谱法检测rTsATG4B活性及特异性抑制剂E-64对rTsATG4B活性的抑制作用。Cytation 5 imaging reader（Bio Tek）检测rTsATG4B断裂底物Ac-KKCha G-AFC后,在Ex/Em=380/500 nm时荧光值变化,进行酶动力学分析,并分别检测抑制剂E-64对rTsATG4B活性的影响及最适p H值、最适温度。Far-Western blot,ELISA,IFA检测rTsATG4B与IECs蛋白的相互作用。rTsATG4B与IECs共孵育后,对照木瓜蛋白酶与PBS观察对IECs细胞单层的损伤作用;多重细胞免疫荧光检测rTsATG4B对HT29细胞形态及细胞间连接蛋白E-cadiherin、Occludin、Claudin-1的作用及改变。应用抗rTsATG4B血清通过组织免疫荧光实验分别检测感染旋毛虫2 h、6 h、8 h、12 h小鼠小肠粘膜组织的损伤及改变。通过细胞免疫荧光及流式细胞术检测rTsATG4B对IECs的凋亡作用。4.TsATG4B的表达、定位及其在旋毛虫侵入宿主肠粘膜过程中的作用Western blot分析rTsATG4B蛋白抗原性和免疫原性,应用Real time-PCR观察TsATG4B基因在旋毛虫不同发育期的转录水平;应用间接免疫荧光实验（IFT）分析TsATG4B蛋白在旋毛虫的表达及其在虫体组织的定位。应用旋毛虫体外侵入IECs实验模型,观察rTsATG4B、抗rTsATG4B血清及特异性抑制剂E-64对旋毛虫肠道感染性幼虫侵入IECs的影响。5.rTsATG4B对旋毛虫感染的免疫保护作用将4-6周龄BALB/c雌鼠60只随机分为3组（每组20只）:rTsATG4B蛋白免疫组、弗氏佐剂对照组和PBS组。rTsATG4B蛋白组,每只小鼠20μg rTsATG4B蛋白每隔2周皮下免疫1次,共免疫3次。ELISA法检测Ig G、Ig G1、Ig G2a抗体水平。末次免疫后2周,每只小鼠攻击感染旋毛虫肌幼虫300条,分别于攻虫后6 d和35 d每组各剖杀10只小鼠,收集肠道成虫和肌幼虫,计算成虫减虫率和肌幼虫减虫率,评价rTsATG4B对旋毛虫感染的免疫保护作用。6.统计学分析使用IBM SPSS Statistics 25.0（美国IBM公司）对数据进行统计分析。TsATG4B基因在ML、IIL、3 d AW、6 d AW和NBL中的相对表达数据以均数±标准差（Mean±SD）显示,采用单因素方差分析比较各组之间的差异。使用卡方检验分析不同浓度（0-15μg/m L）的rTsATG4B和不同血清稀释度时侵入IECs细胞单层百分比的差异。统计学显着性定义为P<0.05。结果1.TsATG4B的生物信息学分析,克隆、表达TsATG4B基因ORF为基因序列全长,总长1245 bp,编码414个氨基酸,其中包括1个Peptidase＿C54保守结构域;TsATG4B蛋白分子量为46.94 k Da,p I为5.79;预测为非分泌性蛋白质,无跨膜结构域;基因全长由金唯智公司合成,建重组质粒TsATG4B-sig-p QE80L/BL21进行原核表达系统诱导表达蛋白,rTsATG4B存在于包涵体沉淀。SDS-PAGE结果表明,rTsATG4B蛋白纯化理想,分子量为43 k Da,与推算TsATG4B蛋白分子量大小一致。2.rTsATG4B蛋白复性及酶活性鉴定明胶酶谱显示rTsATG4B复性后能水解明胶基质,水解作用能被半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64抑制。合成荧光肽段底物Ac-KKCha G-AFC,应用Cytation 5imaging reader（Bio Tek）进行酶动力学分析,rTsATG4B最适反应温度与最适p H值分别为37℃和p H=5.5。依据米氏方程得出rTsATG4B对Ac-KKCha G-AFC的动力学参数Vmax=2.391 n M/min,Km=60.06 n M/min。rTsATG4B在37℃,p H=5.5,能够水解羊免疫球蛋白、人免疫球蛋白、鼠尾I型胶原蛋白及小鼠血红蛋白,随rTsATG4B浓度的升高,底物被水解更彻底。3.rTsATG4B蛋白的鉴定及其在旋毛虫侵入宿主肠粘膜上皮细胞过程中的作用Real time-PCR结果表明,TsATG4B基因在旋毛虫不同发育阶段均有转录,其中6天成虫期转录水平最高（F=98.144,P<0.01）。Western blot分析发现rTsATG4B可被旋毛虫感染小鼠血清、抗rTsATG4B小鼠血清识别。rTsATG4B免疫小鼠血清可识别不同发育期旋毛虫及肌幼虫ES中TsATG4B,说明rTsATG4B具有良好的免疫原性且为分泌性蛋白。IFT结果表明,TsATG4B在虫体定位于表皮,杆状体及胚胎周围。旋毛虫肠道感染性幼虫体外侵入IECs实验结果显示:rTsATG4B对旋毛虫感染性幼虫侵入IECs单层有明显的促进作用,该促进作用与rTsATG4B具有剂量依赖关系（r=0.97,P<0.01）,随rTsATG4B剂量的增加而呈现出上升趋势（F=52.623,P<0.01）。E-64能抑制rTsATG4B促进侵入的作用。与正常血清组相比,抗rTsATG4B血清和感染血清对侵袭具有抑制作用（χ2=112.418,P<0.01）。抗rTsATG4B血清的抑制作用随着稀释度的增加呈下降趋势,并且与抗rTsATG4B血清呈剂量依赖关系（r=0.96,P<0.01）。4.rTsATG4B对IECs的特异性结合及损伤作用Far-Western blot及ELISA检测结果显示,rTsATG4B与IECs具有特异性结合作用。细胞及组织间接免疫荧光实验表明,rTsATG4B可与IECs及小鼠小肠粘膜组织特异性结合,与C2C12细胞和小鼠肝组织无特异性结合。激光共聚焦显示结合部位为IEC胞质和胞膜。rTsATG4B对IECs细胞单层具有损伤作用,其损伤作用能被E-64抑制。多重细胞免疫荧光标记HT29细胞间连接蛋白E-cadiherin、Occludin、Claudin-1结果显示,rTsATG4B损伤HT29单层细胞并破坏细胞间连接蛋白。组织免疫荧光（抗rTsATG4B血清1:100）检测感染旋毛虫2 h、6 h、8 h、12 h小鼠小肠粘膜揭示,TsATG4B蛋白参与旋毛虫侵入小鼠小肠粘膜并引起肠粘膜损伤的病理改变,TsATG4B是旋毛虫侵入宿主肠粘膜的一种重要蛋白酶。应用Annexin V-FITC抗体及ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒通过荧光显微镜及流式细胞仪检测rTsATG4B具有促发IECs凋亡损伤的作用。5.rTsATG4B对旋毛虫感染的免疫保护作用将rTsATG4B免疫4-6周龄BALB/c雌鼠3次后ELISA检测小鼠抗rTsATG4B抗体滴度为1:105,分析抗rTsATG4B血清Ig G亚型,Ig G1抗体水平显着高于Ig G2a抗体水平,表明rTsATG4B免疫小鼠后引起Ig G1升高为主型免疫反应。将300条旋毛虫幼虫攻击感染免疫小鼠后6 d与35 d,肠道6 d成虫和肌幼虫减虫率分别为53.7%和53.8%,表明rTsATG4B免疫小鼠对旋毛虫感染具有一定免疫保护作用。结论:1.rTsATG4B蛋白具有良好的免疫原性,具有半胱氨酸蛋白酶水解功能,诱导了Ig G1升高为主型免疫反应,对旋毛虫感染具有较好的免疫保护作用;2.TsATG4B可破坏细胞间连接蛋白,损伤IECs细胞单层,并诱导细胞凋亡,促进旋毛虫侵入宿主小肠粘膜上皮细胞;TsATG4B是参与旋毛虫侵入小鼠小肠粘膜组织过程中的一种重要蛋白酶。
胡坤敏[6]（2020）在《三种并殖吸虫囊蚴的多重荧光定量PCR检测方法的建立及应用》文中提出目的:建立一种能特异性鉴别卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫及三平正并殖吸虫囊蚴的荧光定量PCR方法,并将该方法在我国4省并殖吸虫病流行区进行初步评价。方法:1、通过GenB ank TM下载卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的CO1序列进行比对分析,设计了3对特异性引物和探针,可特异性的鉴别上述三种并殖吸虫。2、对三种并殖吸虫的单重荧光定量PCR引物浓度、探针浓度和退火温度进行优化,分别建立了卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的单重荧光定量PCR鉴定检测方法,并进行特异性实验、灵敏度实验和建立了相应的标准曲线。3、使用与单重荧光定量PCR方法相同的引物和探针,并对其浓度进行优化,建立同时鉴别检测卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的多重荧光定量PCR检测方法,并进行特异性实验、灵敏度实验和建立了相应的标准曲线。4、采集来自安徽省休宁县蓝田镇、浙江省永嘉县陡门乡、河南省济源市邵原镇、福建省政和县岭腰乡及漳州市南靖县和溪镇的并殖吸虫囊蚴,提取囊蚴DNA后,使用常规PCR方法和多重荧光定量PCR方法同时分类鉴定采集的囊蚴样本,评估多重荧光定量PCR方法的分类鉴定能力。结果:1、构建的阳性质粒分别与GenBankTM中发表的卫氏并殖吸虫（AY140692.1）、斯氏并殖吸虫（AY618798.1）、三平正并殖吸虫（AF159594.1）序列相似性分别为99.65%、98.17%、98.85%。2、卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的单重荧光定量PCR方法仅对目的基因有扩增曲线,对其他寄生虫无特异性扩增。在灵敏度试验中,三种并殖吸虫的单重荧光定量PCR检测的DNA最低浓度分别达到卫氏并殖吸虫30.5 copies/μL、斯氏并殖吸虫32.1 copies/μL、三平正并殖吸虫0.322 copies/μL。单重荧光定量PCR扩增效率、扩增曲线方程式及相关系数分别为:卫氏并殖吸虫E=96.6%、Y=-6.8128x+37.059、R2=0.9998;斯氏并殖吸虫 E=91.8%、Y=-7.0721x+45.106、R2=0.9997;三平正并殖吸虫E=105.40%、Y=-6.3993x+33.957、R2=0.9995。可见本研究建立的三种并殖吸虫的单重荧光定量PCR方法满足荧光定量的基本参数,且具有较高的特异性和灵敏度。3、本研究建立的多重荧光定量PCR方法能同时特异性扩增卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的目的基因片段,而其他寄生虫无特异性扩增。在灵敏度试验中,多重荧光定量PCR方法检测到的最低浓度为:卫氏并殖吸虫3.05×102 copies/μL、斯氏并殖吸虫 3.21×103 copies/μL、三平正并殖吸虫3.22×102 copies/μL。多重荧光定量PCR方法建立的相关系数、扩增效率及标准曲线方程分别为:卫氏并殖吸虫R2=0.9984,E=85.8%,Y=-3.7082x+27.501;斯氏并殖吸虫R2=0.9974,E=97.5%,Y=-3.3715x+33.68;三平正并殖吸虫 R2=0.9938,E=93.0%,Y=-3.5608x+18.874。因此,本研究建立的多重荧光定量PCR方法满足荧光定量的基本参数,且具有较高的特异性和灵敏度。4、多重荧光定量PCR方法鉴定5个调查点的样本结果分析显示:安徽省休宁县蓝田镇和浙江省永嘉县陡门乡的并殖吸虫囊蚴DNA在FAM通道（465-510）显示阳性结果（图2.4 A）,而其他均为阴性;河南省济源市邵原镇和福建省政和县岭腰乡的并殖吸虫囊蚴DNA在VIC通道（533-580）显示阳性结果（图2.4 B）,而其他均为阴性;福建省漳州市南靖县和溪镇的并殖吸虫囊蚴DNA在CY5通道（618-660）显示阳性结果（图2.4 C）,而其他均为阴性。结果表明多重荧光定量PCR方法鉴定安徽省休宁县和浙江省永嘉县的并殖吸虫囊蚴为卫氏并殖吸虫,河南省济源市和福建省政和县的并殖吸虫囊蚴为斯氏并殖吸虫,福建省漳州市的并殖吸虫囊蚴为三平正并殖吸虫。5、采用多重荧光定量PCR方法与常规PCR后测序方法同时分类鉴定65份囊蚴样本。结果显示,多重荧光定量PCR方法对采集的并殖吸虫囊蚴样本的分类鉴定率为100%（65/65）,而常规PCR后测序方法对采集的并殖吸虫囊蚴样本的分类鉴定率为72.31%（47/65）,常规PCR方法中显示阳性的结果在多重荧光定量PCR方法中均显示阳性,显示阴性的结果经加量测序分析或形态学鉴定,鉴定结果均与多重荧光定量PCR方法鉴定结果一致。该结果表明多重荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度和特异性。6、安徽省休宁县蓝田镇、浙江省永嘉县陡门乡、河南省济源市邵原镇、福建省政和县岭腰乡、福建省漳州市南靖县和溪镇5个调查点的溪蟹阳性率分别为82%（49/60）、41%（29/70）、55%（41/74）、65%（41/63）和 45%（32/71）。经形态学鉴定,5个地区的并殖吸虫囊蚴虫种分别为卫氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫。经常规PCR后分子鉴定分析:安徽省和浙江省两地区采集的并殖吸虫囊蚴ITS2、CO1基因序列与卫氏并殖吸虫ITS2、CO1 基因（KC417492.1,AF219379.2）相似性最高,分别为 99%～100%、96%～99%,均与卫氏并殖吸虫聚为一支;河南省采集的并殖吸虫囊蚴ITS2、CO1基因序列与斯氏并殖吸虫ITS2、CO1基因（KX129924.1,MK568551.1）相似性最高,分别为98%～100%、95%～99%,均与斯氏并殖吸虫聚为一支;福建政和县采集的并殖吸虫囊蚴ITS2基因序列与斯氏并殖吸虫ITS2基因（KX129924.1）的相似性最高,为98%～100%,与斯氏并殖吸虫、宫崎并殖吸虫聚为一大支（两虫种分支不明显）,CO1基因序列与宫崎并殖吸虫CO1基因（AY618823.1,AY618834.1）相似性最高,为91%～94%,与宫崎并殖吸虫聚为一小支,而与斯氏并殖吸虫聚为一大支（两虫种分支较为明显）;福建省漳州市南靖县和溪镇溪蟹并殖吸虫囊蚴ITS2基因序列与卫氏并殖吸虫ITS2基因（KC417492.1）的相似性最高,达100%,CO1基因序列与三平正并殖吸虫CO1基因（AF159595.1）的相似性最高,为97%～99%,ITS2、CO1序列均与三平正并殖吸虫聚为一支。此结果表明无论是形态学鉴定,还是分子序列分析鉴定,结果均与多重荧光定量PCR方法鉴定结果一致,进一步证明了多重荧光定量PCR方法的高灵敏性和强特异性。结论:本研究建立的多重荧光定量PCR方法能够对溪蟹中并殖吸虫囊蚴样本进行快速鉴别。此方法的建立对并殖吸虫的分类研究提供了技术支持,开辟了并殖吸虫囊拗鉴定检测方法的新路径,对并殖吸虫的分类、地理分布、流行病学调查、食品安全、检疫具有重要应用价值。
张胜兰[7]（2020）在《旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的抗原性和对树突状细胞的免疫调节性研究》文中进行了进一步梳理旋毛虫（Trichinella spiralis）是一种典型的人兽共患寄生线虫,其引发的旋毛虫病是一种世界广泛分布的食源性寄生虫病。目前的诊断方法主要为集样消化法和ELISA检测方法。肌幼虫排泄分泌产物（ES）为应用最广泛的诊断抗原,但具有期特异性且成分复杂。旋毛虫相关蛋白可引发宿主Th2型免疫反应,造成宿主的免疫抑制,进而形成慢性感染导致长期寄生,现阶段该反应机理尚不清楚。旋毛虫ES成分复杂,包含多种蛋白酶:丝氨酸蛋白酶、谷胱甘肽转移酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等。因此,旋毛虫ES相关抗原分子的分离、鉴定及其抗原性和免疫调节性的研究对于旋毛虫病免疫学检测方法的建立及疫苗研制非常重要。本实验室前期构建了旋毛虫3日龄成虫的c DNA文库,经过免疫学方法筛选得到高丰度与强免疫反应性的丝氨酸蛋白酶基因Ts-Sp-7（Gen Bank登录号EU263332.1）。本研究基于该基因对Ts-Sp-7蛋白抗原性及免疫调节性进行研究。参照Gen Bank公布的Ts-Sp-7基因序列,设计特异性引物,收取感染3天的旋毛虫成虫阶段的总RNA,反转录获取目的序列,常规PCR扩增,并构建原核表达载体p ET28a-Ts-Sp-7,原核表达。SDS-PAGE结果显示,在47 k Da左右呈现一条蛋白条带,与理论值47.5 k Da一致,收获复性纯化后的Ts-Sp-7蛋白。Western-Blot结果显示,该蛋白能够与10000条/头感染剂量不同感染天数（15dpi、30 dpi、45 dpi、60 dpi、90 dpi、120 dpi）的猪阳性血清发生特异性反应。结果可知,纯化后的目的蛋白具备良好的反应原性。其次,采用变性纯化的Ts-Sp-7蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗Ts-Sp-7蛋白兔多克隆抗体。用间接ELISA测得该多抗效价是1:350000。由间接免疫荧光结果可以看出,相对于兔阴性血清对照组,Ts-Sp-7蛋白多抗作为一抗的肌幼虫表皮有很强烈的红色荧光信号。采用变性纯化Ts-Sp-7蛋白免疫BABL/c小鼠,复性纯化的重组Ts-Sp-7蛋白及ES进行筛选,收获稳定分泌抗Ts-Sp-7蛋白抗体的杂交瘤细胞株。经过3次亚克隆,收获了5株杂交瘤细胞株,可以稳定地分泌抗Ts-Sp-7蛋白抗体。竞争ELISA结果显示,猪阳性血清能够抑制其中两株单抗与重组Ts-Sp-7的结合,命名为H4H7-2A4、H8D12-5B9。Western-Blot结果显示纯化后的两株单抗均能特异性地识别虫体蛋白。亚型鉴定显示,H4H7-2A4抗体为Ig G2a亚类,κ亚型;H8D12-5B9抗体Ig G2b亚类,λ亚型。以Ts-Sp-7基因序列为模板,设计3对引物,对Ts-Sp-7蛋白进行分段截短表达。Western-Blot结果表明,两株单抗都能够特异性地识别Ts-Sp-7-2蛋白。进而利用Pep Scan技术合成8个短肽,进行间接ELISA鉴定。确定H4H7-2A4所识别抗原表位位于W5肽段,氨基酸序列为222 GVDRSATCQGDSGGP236。H8D12-5B9所识别抗原表位位于W7肽段,氨基酸序列为252PPTCGDARHSVKFAKVP268。多克隆抗体和竞争性单克隆抗体的成功制备为建立基于Ts-Sp-7蛋白的旋毛虫感染诊断试剂奠定了基础。从小鼠骨髓源细胞里分离提取到树突状细胞（BMDCs）,体外对其诱导分化,形成未成熟状态的BMDCs,设立Ts-Sp-7蛋白单独作用组、LPS阳性对照组以及PBS阴性对照组,分别刺激BMDCs,利用流式细胞术分析目的蛋白对BMDCs成熟活化的影响。结果显示,Ts-Sp-7蛋白可诱导BMDCs表面分子CD86的表达,对MHCⅡ类分子的表达无显着影响,表明Ts-Sp-7蛋白可促进BMDCs的成熟。进而从OVA抗原特异性转基因小鼠（OT-II）脾脏内分离提取到Na?ve CD4+T细胞,和Ts-Sp-7蛋白预先刺激的BMDCs建立共培养体系,在OVA抗原刺激的前提下,检验Na?ve CD4+T细胞活化、增殖和分化的情况。结果表明Ts-Sp-7蛋白可促进Na?ve CD4+T细胞的明显增殖。可促进效应T细胞表面分子CD44和CD62L的表达,促进效应T细胞活化为可以参与淋巴细胞再循环的效应T细胞。Ts-Sp-7蛋白孵育的BMDCs可诱导Na?ve CD4+T细胞向Treg型分化,推测TsSp-7蛋白是具有免疫调节性的重组蛋白,可能参与宿主免疫调控。综合以上实验结果,Ts-Sp-7蛋白具备良好的抗原性及免疫调节性,可作为旋毛虫的诊断抗原及调控分子,在旋毛虫诊断方法的建立及宿主免疫反应的调节过程中发挥重要功能。
郝朔[8]（2020）在《华支睾吸虫核酸检测方法的建立与初步应用》文中研究说明华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）病又称肝吸虫病,全球约3500万人感染,其中中国有超过1200万人感染。人或其他哺乳动物由于食用生或半生被囊蚴感染的鱼虾而感染此病。华支睾吸虫囊蚴经过一个月便可以在宿主体内发育为成虫,成虫寄生于人体胆管及胆囊中,可引起肝脏受损,进而导致肝胆疾病及混合细菌感染等。儿童和青少年感染华支睾吸虫后,临床表现较重,除肝胆症状外,常伴有营养不良、贫血、低蛋白血症、浮肿和发育障碍,是一种危害严重的人兽共患寄生虫病。现阶段对于华支睾吸虫的检测,目前所使用的加藤厚涂片法存在漏检,误检等缺陷。实验室常用的分子生物学检测的方法有传统PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等,免疫学检测方法普遍为ELISA。但这些传统的分子生物学及免疫学检测方法成本较高、操作繁琐、耗费时间较长,进而无法满足基层实地快速化检测。因此,开发低成本、操作简便、检测时间短的华支睾吸虫检测方法,可以大大提高华支睾吸虫检测效率,并为华支睾吸虫的防控提供新的方法和技术支持。本研究针对华支睾吸虫ITS-2基因序列的6个区域设计4条引物,并对该体系的灵敏度、特异性等进行验证后初步建立了华支睾吸虫环介导等温扩增（LAMP）检测方法。另外针对华支睾吸虫COX-1基因序列设计2条长链引物,并对该体系的灵敏度、特异性等进行验证后初步建立了华支睾吸虫重组酶聚合酶扩增（RPA）检测方法。利用上述建立的LAMP检测方法中的2条短链引物建立了一套华支睾吸虫普通PCR检测方法,并验证普通PCR体系可检测的华支睾吸虫DNA最低浓度。通过对松花江各支流进行实地采集鱼样并用人工模拟胃液消化法收集华支睾吸虫囊蚴,完成了比格犬人工感染实验。随后我们利用已知阳性样本和阴性样本来验证LAMP和RPA技术实际运用于华支睾吸虫检测时的有效性和准确性,并对比分析二种方法的检测步骤及结果,以进一步评测两种方法应用于检测华支睾吸虫感染的可行性。结果显示,本研究建立LAMP检测方法可检测到华支睾吸虫最低DNA浓度为90 pg/μL,与旋毛虫、东方次睾吸虫、台湾次睾吸虫、隐孢子虫等无交叉扩增反应。RPA检测方法可检测到华支睾吸虫的最低DNA浓度为2 ng/μL,与旋毛虫、东方次睾吸虫、台湾次睾吸虫、隐孢子虫等无交叉扩增反应。利用LAMP短链引物建立的普通PCR可检测到华支睾吸虫最低DNA浓度为11 ng/μL。本研究中LAMP检测的灵敏度约为普通PCR检测的120倍,RPA检测的灵敏度约为普通PCR检测的5倍。在对实际样品的检测中,通过添加核酸染料Sybr Green I,LAMP及RPA均可以在脱离PCR仪及紫外凝胶系统的条件下,快速地检测出华支睾吸虫囊蚴及虫卵。综上,本研究建立的华支睾吸虫LAMP检测方法与RPA检测方法具有良好的特异性、灵敏性等。两种体系均能够快速检测出华支睾吸虫的感染情况,具有较好的应用前景。
任博雯[9]（2020）在《基于丝氨酸蛋白酶抑制因子WM5的猪旋毛虫检测方法的建立》文中提出旋毛虫病是由于人类摄入含有旋毛虫的肉类而感染的危害严重的人兽共患病,该病不仅对人和动物的身体健康产生巨大的伤害,同时对畜牧养殖和肉类进出口也造成了极大的经济损失。基于旋毛虫肌幼虫ES抗原建立的ELISA检测方法是世界动物卫生组织推荐使用的血清学检测方法,但ES抗原制备困难。因此,研究出一种制备工艺便捷、特异性和灵敏度高的旋毛虫病检测方法,对保障社会的公共卫生安全、维护肉类进出口贸易的稳定、减少畜牧业的损失有着重要意义。丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serine proteinase inhibitor,Serpin）是一类结构相对保守的蛋白质超家族,它能抑制丝氨酸蛋白酶在凝血、补体激活和炎症中的功能,且在多种生物系统中发挥着重要的生理作用。目前,已有研究证实丝氨酸蛋白酶抑制因子在旋毛虫发育的各个阶段均有转录表达,但是以丝氨酸蛋白酶抑制因子WM5作为检测抗原,建立猪旋毛虫感染的诊断方法却没有系统的报道。首先,本实验室前期通过免疫学方法对旋毛虫肌幼虫时期的cDNA表达文库进行筛选时,发现了高丰度且具有强反应原性的丝氨酸蛋白酶抑制因子WM5抗原。本研究利用已构建好的WM5原核表达系统诱导表达WM5重组蛋白,并对其进行纯化。感染旋毛虫的猪阳性血清可以特异性识别WM5重组蛋白,表明WM5重组蛋白的免疫反应性较强,是建立猪旋毛虫感染检测方法的候选抗原。随后制备多克隆抗体并对其进行鉴定,结果表明制备的兔抗WM5血清的抗体效价为1:160 000,且可以特异性识别肌幼虫虫体粗提物（crude worm extract,CWE）、肌幼虫ES产物和WM5重组蛋白,由此推测WM5可能是一种分泌性蛋白。其次,建立了基于丝氨酸蛋白酶抑制因子WM5的猪旋毛虫间接ELISA检测方法,并对该方法的各步反应条件进行优化。通过对205份未感染旋毛虫病的猪阴性血清的检测及计算,确定该方法的cut-off值为0.207,且与华支睾吸虫、囊虫、蛔虫等阳性血清无交叉反应。该方法的批内变异系数和批间变异系数均小于10%,且与基于旋毛虫肌幼虫期ES抗原建立的ELISA检测方法对比,检测效果相似。由于WM5重组蛋白的生产工艺更适合应用于工业化生产,故此检测方法避免了旋毛虫ES抗原在制备过程中成本昂贵等问题,所以该方法更适用于大规模的推广及应用。最后,我们将纯化后的WM5重组蛋白免疫小鼠,获得了两株杂交瘤细胞株M2A12和M3F11。单克隆抗体鉴定结果表明:两株单克隆抗体均可识别旋毛虫肌幼虫期ES产物和虫体抗原中的WM5,且两株单克隆抗体均属于IgG1亚类。对旋毛虫不同发育时期虫体进行WM5的免疫荧光定位,在肌幼虫的杆状体和各时期虫体的表皮发现明显的荧光信号,表明WM5是由杆状体分泌到体外发挥作用。随后对两株单克隆抗体的B细胞表位进行定位,确定了两株单克隆抗体可结合的表位均位于277EALKKLGIEDLF288氨基酸序列上。制备的单克隆抗体和多克隆抗体对检测旋毛虫多宿主的感染和建立血清学检测方法有着重要意义。
张雨璐[10]（2020）在《旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫期排泄分泌物蛋白质组学分析》文中研究指明旋毛形线虫（Trichinella spp.）,又称旋毛虫,截至目前已分离鉴定出13种不同的类群[1]。根据其生活史中肌幼虫期是否在宿主肌细胞重组过程中形成包囊主要被分为两个进化枝,即有包囊虫种和无包囊虫种。旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）和伪旋毛虫（Trichinella pseudospiralis,T4）作为两大进化枝的代表虫种,其区别除是否形成包囊外,还在于易感宿主和感染后炎症反应的差异。就目前的流行病学调查发现T4是旋毛虫种属中唯一一个可以感染鸟类的虫种,其余则仅寄生于脊椎哺乳动物宿主。造成以上差异的原因很可能是由于虫种间排泄分泌物（excretory-secretory products,ESP）不同所致。ESP成分复杂,又直接暴露于宿主免疫系统,参与机体细胞调控,与寄生虫的寄生生活和致病性密切相关。此外旋毛虫ESP对自身免疫性疾病具有显着的预防及治疗效果[2]。由于虫体直接寄生会对患者造成一定的心理、病理损害,加之旋毛虫衍生蛋白成分、浓度难以控制,导致相关研究及应用受限。那么鉴定筛选旋毛虫ESP中的功能性蛋白分子则既可避免旋毛虫感染带来的危害,又可代替旋毛虫寄生为治疗自身免疫疾病提供新思路和新方向。本实验预期从T1、T4排泄分泌物入手,从蛋白质水平初步筛选影响包囊形成和/或参与免疫调节的相关蛋白分子。首先进行T1、T4肌幼虫时期排泄分泌物的收集,SDS-PAGE鉴定ESP蛋白质量后利用iTRAQ技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation）对二者进行蛋白鉴定以及差异表达蛋白的筛选。该过程共鉴定到蛋白1027个,T1中表达上调蛋白163个,T4中表达上调蛋白31个。T1中表达丰度较高的有DNaseⅡ家族（包括具有DNaseⅡ活性的Plancitoxin-1）、丝氨酸蛋白酶及丝氨酸蛋白酶抑制剂、胱抑素样蛋白、烯醇酶、热休克蛋白、核苷酸酶等;T4上调表达的主要有钙粘蛋白、DNaseⅡ、Moesin/ezrin/radixin蛋白、β-己糖胺酶、组蛋白H2B/H4等。为验证iTRAQ鉴定结果的准确性,对选取的9个蛋白的编码基因采用实时荧光定量PCR进行转录水平的验证。结果与蛋白表达水平相符,证实了iTRAQ结果的可靠性。随后选取了旋毛虫胱抑素样蛋白进行后续的初步探索。根据pET22b质粒成功构建出重组旋毛虫胱抑素样蛋白-pET22b表达载体,利用大肠杆菌表达出重组旋毛虫胱抑素样蛋白。生物信息学分析显示旋毛虫胱抑素样蛋白共由237个氨基酸组成,蛋白质量27.6 kDa,理论等电点8.02,N端具有1-18位氨基酸的信号肽。蛋白细胞亚定位显示其位于细胞质。具有5个酪蛋白激酶II磷酸化位点;3个N-肉豆蔻酰化位点;3个蛋白激酶C磷酸化位点以及1个酪氨酸激酶磷酸化位点。无保守的半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域,与现存的几种寄生性线虫的cystatin同源性极低。该蛋白可能为一种新型旋毛虫分泌型胱抑素样蛋白。之后使用重组旋毛虫胱抑素样蛋白免疫家兔获得抗血清,利用抗血清对虫体的间接免疫荧光实验发现该蛋白定位于虫体表面及包囊上。最后,使用重组旋毛虫胱抑素样蛋白免疫小鼠,三次免疫后进行攻虫计算减虫率探究旋毛虫胱抑素样蛋白对小鼠的保护作用。减虫率显示旋毛虫胱抑素样蛋白免疫组平均每只小鼠检获肌幼虫与PBS和佐剂对照组在分别感染T1、T4后相比均有显着性差异（P<0.05）,T1肌幼虫减虫率达到60.54%,T4肌幼虫减虫率达到37.49%。旋毛虫重组胱抑素样蛋白对T1感染小鼠有较好的减虫效果。综上所述,本研究一方面对旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫期排泄分泌物的差异蛋白进行了总体分析,另一方面发现一种定位于旋毛虫虫体和包囊上的新型重组旋毛虫胱抑素样蛋白,它对旋毛虫和伪旋毛虫分别感染的小鼠有较好的减虫效果。
二、应用特异性引物检测中国不同地区旋毛虫DNA（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用特异性引物检测中国不同地区旋毛虫DNA（论文提纲范文）
（1）日本血吸虫病核酸检测方法的建立和初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血吸虫病概述 |
| 1.2 血吸虫病诊断技术 |
| 1.2.1 病原学诊断 |
| 1.2.2 免疫学诊断 |
| 1.2.3 分子生物学诊断 |
| 第二章 羊日本血吸虫病Real-time PCR诊断方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 酶和试剂 |
| 2.2.4 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠组织、日本血吸虫成虫、虫卵和羊血浆和血清样本的收集 |
| 2.3.2 DNA提取 |
| 2.3.3 Real-time PCR反应条件优化 |
| 2.3.4 Real-time PCR诊断方法的检测下限、敏感性、特异性 |
| 2.3.5 血浆和血清样本检测结果对比 |
| 2.3.6 血浆保存时间 |
| 2.3.7 ELISA检测 |
| 2.3.8 对疫区和非疫区羊进行Real-time PCR诊断 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 Real-time PCR反应条件优化 |
| 2.4.2 Real-time PCR反应的检测下限、敏感性和特异性 |
| 2.4.3 血浆样本和血清样本检测效果对比 |
| 2.4.4 血浆保存时间 |
| 2.4.5 ELISA检测结果 |
| 2.4.6 疫区和非疫区羊血浆样本的Real-time PCR检测结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 小鼠/羊日本血吸虫病LFD-RPA诊断方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 生物材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 酶和试剂 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠和羊血浆样本的收集 |
| 3.3.2 DNA提取 |
| 3.3.3 LFD-RPA最佳引物的选择 |
| 3.3.4 LFD-RPA反应条件优化 |
| 3.3.5 LFD-RPA检测下限、特异性和敏感性 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 LFD-RPA最佳引物和探针的选择 |
| 3.4.2 LFD-RPA反应甜菜碱加入量的优化 |
| 3.4.3 LFD-RPA反应最佳孵育温度的优化 |
| 3.4.4 LFD-RPA反应最佳孵育时间的优化 |
| 3.4.5 LFD-RPA反应产物最佳稀释度的优化 |
| 3.4.6 LFD-RPA检测下限和交叉反应结果 |
| 3.4.7 LFD-RPA与 Real-time PCR在小鼠和羊上检测敏感性和特异性比较 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 Real-time PCR诊断早期日本血吸虫病的效果评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 生物材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 酶和试剂 |
| 4.2.4 试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠和羊血浆样本的收集 |
| 4.3.2 DNA提取 |
| 4.3.3 Real-time PCR检测小鼠和羊样本 |
| 4.3.4 日本血吸虫虫体计数 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Real-time PCR检测小鼠结果 |
| 4.4.2 虫体计数结果 |
| 4.4.3 Real-time PCR检测羊结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌抗肿瘤效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 旋毛虫抗肿瘤研究进展 |
| 1.1 旋毛虫虫体抗肿瘤 |
| 1.2 旋毛虫可溶性粗抗原抗肿瘤 |
| 1.3 旋毛虫与肿瘤相关抗原抗肿瘤 |
| 1.4 旋毛虫排泄分泌抗原抗肿瘤 |
| 第二章 细菌作为活疫苗载体研究现状 |
| 2.1 单增李斯特菌 |
| 2.2 沙门氏菌 |
| 2.3 牛结核分枝杆菌卡介苗 |
| 2.4 乳酸菌 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 旋毛虫肌幼虫的富集与纯化 |
| 1.2.2 旋毛虫sHSPs基因的扩增 |
| 1.2.3 表达载体pValac-sHSPs的构建 |
| 1.2.4 蛋白sHSPs的表达及鉴定 |
| 1.2.5 NC8-sHSPs的生长特性 |
| 1.2.6 黏附、侵袭能力检测 |
| 1.2.7 质粒递送及表达能力检测 |
| 1.2.8 小肠内定植能力检测 |
| 1.2.9 安全性评价 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 sHSPs基因的选择 |
| 1.3.2 真核质粒pValac-sHSPs表达鉴定 |
| 1.3.3 重组植物乳杆菌NC8-sHSPs的转化与构建 |
| 1.3.4 重组植物乳杆菌NC8-sHSPs生长特性分析 |
| 1.3.5 重组植物乳杆菌NC8-sHSPs侵袭、定植能力 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的预防作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 抑瘤率检测 |
| 2.2.2 重组sHSPs的诱导、纯化 |
| 2.2.3 血清sHSPs特异性IgG的检测 |
| 2.2.4 肠道灌洗液和血清总sIgA水平的检测 |
| 2.2.5 细胞因子检测 |
| 2.2.6 脾淋巴细胞亚群及数量检测 |
| 2.2.7 sHSPs对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.2.8 sHSPs诱导的特异性CTL的功能检测 |
| 2.2.9 免疫组化检测肿瘤内PCNA的表达 |
| 2.2.10 小鼠体重和病理组织学变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 NC8-sHSPs处理对黏膜免疫的影响 |
| 2.3.2 NC8-sHSPs处理对体液免疫的影响 |
| 2.3.3 NC8-sHSPs处理对细胞免疫的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对 Lewis肺癌的治疗作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 小鼠Lewis肺癌模型的建立 |
| 3.2.2 NC8-sHSPs治疗对LLC生长的影响 |
| 3.2.3 NC8-sHSPs治疗对LLC小鼠生存率的影响 |
| 3.2.4 血清sHSPs特异性IgG的检测 |
| 3.2.5 血清、肠道灌洗液总sIgA水平的检测 |
| 3.2.6 血清细胞因子的检测 |
| 3.2.7 小鼠体重和组织病理学检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 NC8-sHSPs治疗对黏膜免疫的影响 |
| 3.3.2 NC8-sHSPs治疗对体液免疫的影响 |
| 3.3.3 NC8-sHSPs治疗对细胞免疫的影响 |
| 3.3.4 NC8-sHSPs疗效分析 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫病与旋毛虫 |
| 1.1.1 旋毛虫病概述 |
| 1.1.2 旋毛虫生活史 |
| 1.1.3 旋毛虫入侵对宿主的影响 |
| 1.2 RNA干扰技术在寄生虫中的应用 |
| 1.2.1 常见的生物基因功能研究技术 |
| 1.2.2 RNA干扰技术的原理 |
| 1.2.3 RNA干扰在寄生虫中的作用方式和应用 |
| 1.3 旋毛虫与丝氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 1.3.1 丝氨酸蛋白酶概述 |
| 1.3.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂概述 |
| 1.3.3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类及结构特点 |
| 1.3.4 寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能 |
| 1.4 旋毛虫感染与免疫 |
| 1.4.1 寄生虫感染后宿主免疫策略 |
| 1.4.2 寄生虫感染与宿主T细胞 |
| 1.4.3 寄生虫感染与宿主巨噬细胞 |
| 1.4.4 寄生虫感染与宿主其他重要免疫细胞 |
| 1.4.5 寄生虫与免疫逃避 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫株与实验动物 |
| 2.1.2 主要菌株、细胞株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配置 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 主要应用软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 TsSPI基因siRNA设计与合成 |
| 2.2.2 TsSPI基因dsRNA设计与合成 |
| 2.2.3 旋毛虫肌幼虫的收集与体外培养 |
| 2.2.4 siRNA/dsRNA导入旋毛虫肌幼虫 |
| 2.2.5 qPCR检测TsSPI基因转染水平变化 |
| 2.2.6 Western blot检测TsSPI蛋白表达水平 |
| 2.2.7 qPCR检测dsRNA干扰效果的时间效应 |
| 2.2.8 检测dsRNA干扰的基因特异性 |
| 2.2.9 检测TsSPI基因沉默后肌幼虫体外存活率以及入侵IECs能力 |
| 2.2.10 检测TsSPI基因沉默后旋毛虫在小鼠体内发育、繁殖、减虫率情况 |
| 2.2.11 qPCR检测TsSPI基因沉默在旋毛虫中的遗传情况 |
| 2.2.12 检测旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞细胞相关因子表达水平变化 |
| 2.2.13 检测TsSPI基因沉默的旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB磷酸化情况 |
| 2.2.14 CCK8 检测小鼠巨噬细胞raw264.7 增值活力 |
| 2.2.15 qPCR检测CAM相关因子基因表达量 |
| 2.2.16 Western blot检测巨噬细胞IRAK通路相关蛋白含量 |
| 2.2.17 qPCR检测AAM相关基因表达量 |
| 2.2.18 Western blot检测巨噬细胞JAK2/STAT3磷酸化水平 |
| 2.2.19 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 利用RNAI沉默TSSPI基因 |
| 3.1.1 siRNA的设计与dsRNA的构建结果 |
| 3.1.2 siRNA导入旋毛虫体内情况分析 |
| 3.1.3 不同浓度RNAi对 TsSPI转录水平的影响 |
| 3.1.4 不同RNAi对 TsSPI转录水平的影响 |
| 3.1.5 dsRNA-TsSPI干扰的时间效应 |
| 3.1.6 dsRNA-TsSPI干扰的特异性 |
| 3.2 TSSPI基因沉默对ML体外存活率与入侵肠上皮细胞影响 |
| 3.2.1 TsSPI基因沉默对ML体外存活率的影响 |
| 3.2.2 TsSPI基因沉默对肌幼虫体外入侵肠上皮细胞的影响 |
| 3.3 TSSPI基因沉默对ML入侵宿主肠道并发育的影响 |
| 3.4 TSSPI基因沉默的遗传性分析 |
| 3.5 TSSPI基因沉默对ML入侵后宿主免疫相关因子的影响 |
| 3.5.1 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子含量影响 |
| 3.5.2 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞效应因子含量的影响 |
| 3.5.3 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB磷酸化水平的影响 |
| 3.6 重组蛋白TSSPI对小鼠巨噬细胞极化的影响 |
| 3.6.1 重组蛋白的表达纯化及复性 |
| 3.6.2 重组蛋白对小鼠巨噬细胞raw264.7增值活力的影响 |
| 3.6.3 重组蛋白对CAM相关因子基因表达水平影响 |
| 3.6.4 重组蛋白对巨噬细胞NF-κB通路相关蛋白的影响 |
| 3.6.5 重组蛋白对AAM相关因子基因表达水平影响 |
| 3.6.6 重组蛋白对巨噬细胞JAK2/STAT3 通路相关蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RNA干扰对旋毛虫TsSPI基因表达的影响 |
| 4.2 旋毛虫TSSPI基因沉默在旋毛虫入侵宿主过程中的功能研究 |
| 4.3 旋毛虫TSSPI基因沉默在旋毛虫入侵过程中免疫调节功能的研究 |
| 4.4 重组蛋白TSSPI调节巨噬细胞极化的研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（4）旋毛虫诱导分化巨噬细胞调节小鼠Th2型免疫应答影响弓形虫共感染的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫及弓形虫概述 |
| 1.1.1 旋毛虫概述 |
| 1.1.2 弓形虫概述 |
| 1.2 旋毛虫诱导的免疫应答 |
| 1.2.1 Th2型免疫应答 |
| 1.2.2 AAMs及其在蠕虫感染中的作用 |
| 1.3 蠕虫诱导的免疫应答对其他病原感染的影响 |
| 1.3.1 蠕虫感染对病毒再感染的影响 |
| 1.3.2 蠕虫感染对细菌再感染的影响 |
| 1.3.3 蠕虫感染对原虫再感染的影响 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、虫株和实验用动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 旋毛虫肌幼虫及 ES 收集 |
| 2.2.2 旋毛虫3日龄成虫(Ad3)收集与计数 |
| 2.2.3 弓形虫PRU株速殖子的收集 |
| 2.2.4 旋毛虫-弓形虫共感染模型的建立 |
| 2.2.5 外周血和细胞培养上清细胞因子的检测 |
| 2.2.6 流式细胞术分析外周血T淋巴细胞和RAW264.7细胞 |
| 2.2.7 巨噬细胞总RNA提取和反转录 |
| 2.2.8 小鼠组织基因组DNA提取 |
| 2.2.9 qRT-PCR分析小鼠基因表达和弓形虫荷虫量 |
| 2.2.10 旋毛虫肌幼虫显微镜压片计数 |
| 2.2.11 RAW264.7细胞复苏与培养 |
| 2.2.12 小鼠腹腔巨噬细胞收集 |
| 2.2.13 rTSTPX2 原核表达与纯化 |
| 2.2.14 兔抗TsTPX2重组蛋白高免血清制备及鉴定 |
| 2.2.15 旋毛虫TPX2免疫定位 |
| 2.2.16 rTSTPX2 蛋白免疫小鼠 |
| 2.2.17 体外活化巨噬细胞 |
| 2.2.18 小鼠CD4+T细胞分选 |
| 2.2.19 体外活化的巨噬细胞与CD4+T细胞体外共培养 |
| 2.2.20 体外活化的巨噬细胞移植及保护效率评价 |
| 2.2.21 弓形虫速殖子感染巨噬细胞 |
| 2.2.22 ELISA方法分析外周血抗体水平 |
| 2.2.23 Western Blotting检测巨噬细胞表型和弓形虫TP3 蛋白表达量 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 旋毛虫-弓形虫共感染模型的建立及其免疫特征研究 |
| 3.1.1 旋毛虫-弓形虫共感染诱导小鼠细胞因子IL-4变化 |
| 3.1.2 旋毛虫-弓形虫共感染诱导小鼠细胞因子IFN-γ变化 |
| 3.1.3 旋毛虫-弓形虫共感染诱导小鼠T细胞组成变化 |
| 3.1.4 旋毛虫-弓形虫共感染对旋毛虫荷虫量的影响 |
| 3.1.5 旋毛虫-弓形虫共感染对弓形虫荷虫量的影响 |
| 3.2 旋毛虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX2)替代激活巨噬细胞诱导小鼠Th2型免疫应答研究 |
| 3.2.1 rTSTPX2 蛋白原核表达与纯化 |
| 3.2.2 兔抗TsTPX2重组蛋白多克隆抗体鉴定 |
| 3.2.3 旋毛虫TPX2蛋白在成虫中的分布 |
| 3.2.4 旋毛虫TPX2蛋白在旋毛虫肌幼虫中的分布 |
| 3.2.5 TsTPX2 蛋白在旋毛虫肌幼虫ES抗原中的分布 |
| 3.2.6 rTSTPX2 蛋白(rTsTPX2)诱导小鼠Th2 型细胞因子的变化 |
| 3.2.7 rTsTPX2 诱导小鼠Th1 型细胞因子的变化 |
| 3.2.8 rTsTPX2 诱导小鼠T细胞组成变化 |
| 3.2.9 rTsTPX2 诱导小鼠抗体变化 |
| 3.2.10 rTsTPX2 对小鼠免疫保护评价 |
| 3.2.11 rTsTPX2 体外诱导RAW264.7 细胞活化 |
| 3.2.12 rTsTPX2 体外诱导腹腔巨噬细胞活化 |
| 3.2.13 rTsTPX2 活化的腹腔巨噬细胞体外诱导Na(?)ve CD4+~T细胞增殖 |
| 3.2.14 rTsTPX2 活化的腹腔巨噬细胞体外诱导Na(?)ve CD4~+T产生细胞因子 |
| 3.2.15 rTsTPX2 活化的腹腔巨噬细胞体内诱导小鼠细胞因子变化 |
| 3.2.16 rTsTPX2 活化的腹腔巨噬细胞体内诱导小鼠T细胞组成变化 |
| 3.2.17 rTsTPX2 活化的腹腔巨噬细胞体内诱导小鼠抗体变化 |
| 3.2.18 rTsTPX2活化的腹腔巨噬细胞诱导小鼠抗旋毛虫感染能力变化 |
| 3.3 旋毛虫诱导活化的巨噬细胞在调节弓形虫感染中的作用研究 |
| 3.3.1 q RT-PCR引物扩增效率和产物特异性验证 |
| 3.3.2 旋毛虫感染诱导腹腔巨噬细胞极化 |
| 3.3.3 旋毛虫肌幼虫ES抗原体外诱导RAW264.7细胞活化 |
| 3.3.4 旋毛虫肌幼虫ES抗原体外诱导腹腔巨噬细胞活化 |
| 3.3.5 旋毛虫肌幼虫ES抗原和rTSTPX2活化的巨噬细胞对弓形虫速殖子感染的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 旋毛虫-弓形虫共感染模型建立及其免疫特征研究 |
| 4.2 旋毛虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX2)替代激活巨噬细胞诱导小鼠Th2型免疫应答研究 |
| 4.3 旋毛虫诱导活化的巨噬细胞在调节弓形虫感染中的作用研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B的表达与鉴定及其在侵入宿主肠粘膜过程中作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 TsATG4B的分子生物学鉴定及其对旋毛虫感染的免疫保护作用研究 |
| 1 实验材料与试剂配制 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 旋毛虫虫种、细胞系及实验动物 |
| 1.4 质粒载体、宿主菌株 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 TsATG4B生物信息学分析 |
| 2.2 TsATG4B基因克隆与表达 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 TsATG4B生物信息学分析 |
| 4.2 目的基因的合成及引物设计 |
| 4.3 TsATG4B基因的原核表达 |
| 4.4 重组质粒TsATG4B-sig-pQE80L诱导表达、可溶性分析及纯化 |
| 4.5 rTsATG4B免疫血清抗体滴度检测及抗体亚型分析 |
| 4.6 Western blot分析rTsATG4B及TsATG4B天然蛋白抗原性 |
| 4.7 rTsATG4B的复性与明胶酶谱酶活性分析及鉴定 |
| 4.8 TsATG4B在旋毛虫不同发育阶段的表达 |
| 4.9 rTsATG4B对小鼠感染旋毛虫的免疫保护作用 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二部分 rTsATG4B的功能分析及其在侵入宿主过程中的作用机制研究 |
| 1 实验材料与试剂配制 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 旋毛虫虫种、细胞系及实验动物 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 rTsATG4B酶活性检测 |
| 2.2 rTsATG4B降解不同蛋白质 |
| 2.3 rTsATG4B的获取,旋毛虫虫体的收集 |
| 2.4 rTsATG4B与 IEC作用的体外实验 |
| 2.5 rTsATG4B对宿主细胞的损伤作用 |
| 2.6 rTsATG4B对 IEC细胞的凋亡作用 |
| 2.7 体外侵入实验 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 rTsATG4B酶活性测定 |
| 4.2 rTsATG4B与 IEC细胞的结合 |
| 4.3 rTsATG4B对 IEC细胞的作用 |
| 4.4 rTsATG4B对 IEC细胞的凋亡作用 |
| 4.5 rTsATG4B蛋白在旋毛虫侵入过程中发挥的作用 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫中作用的研究 |
| 参考文献 |
| 个人简历、博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）三种并殖吸虫囊蚴的多重荧光定量PCR检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 并殖吸虫的分类 |
| 1.2 并殖吸虫病的危害 |
| 1.3 并殖吸虫的分类技术研究进展 |
| 1.3.1 形态学分类 |
| 1.3.2 分子生物学分类 |
| 1.3.3 研究局限 |
| 2 研究意义 |
| 3 研究目的 |
| 4 研究内容 |
| 4.1 单重荧光定量方法的建立及优化 |
| 4.2 多重荧光定量方法的建立及应用评价 |
| 4.3 溪蟹感染情况及虫种分子鉴定分析 |
| 5 技术路线 |
| 参考文献 |
| 第一部分 单重荧光定量PCR方法的建立 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 标准寄生虫种株 |
| 1.1.2 实验主要试剂 |
| 1.1.3 实验主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 序列分析与引物设计 |
| 1.2.2 DNA提取方法 |
| 1.2.3 目的基因扩增 |
| 1.2.4 重组标准质粒的制备 |
| 1.2.5 优化单重荧光PCR反应条件 |
| 1.2.6 单重荧光定量PCR特异性的实验 |
| 1.2.7 单重荧光定量PCR灵敏度的实验 |
| 1.2.8 构建单重荧光定量PCR方法标准曲线 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的片段的扩增及并殖吸虫重组质粒标准品的制备 |
| 2.2 三种并殖吸虫重组质粒OD值的测定结果 |
| 2.3 单重荧光定量PCR反应条件优化结果 |
| 2.3.1 单重荧光定量PCR反应探针优化的结果 |
| 2.3.2 单重荧光定量PCR引物浓度优化结果 |
| 2.3.3 单重荧光定量PCR反应体系中退火温度的优化 |
| 2.4 单重荧光定量PCR特异性的鉴定 |
| 2.5 单重荧光定量PCR灵敏度实验 |
| 2.6 单重荧光定量PCR标准曲线的构建 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 多重荧光定量PCR方法的建立及应用 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 标准寄生虫种株 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 现场囊蚴样本 |
| 2 多重荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.1 多重荧光定量PCR反应条件 |
| 2.2 多重荧光定量PCR特异性的试验 |
| 2.3 多重荧光定量PCR灵敏度的试验 |
| 2.4 多重荧光定量PCR稳定性试验 |
| 2.5 多重荧光定量PCR标准曲线的构建 |
| 2.6 现场应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 多重荧光定量PCR特异性试验结果 |
| 3.2 多重荧光定量PCR灵敏度试验结果 |
| 3.3 多重荧光定量PCR稳定性试验结果 |
| 3.4 标准曲线的构建试验结果 |
| 3.5 多重荧光定量PCR方法的现场应用评价 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 豫皖闽浙4省5地区溪蟹感染情况及虫种分子鉴定 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 样本采集 |
| 1.2 主要的试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 囊蚴分离 |
| 2.2 基因组DNA提取 |
| 2.3 目的基因常规PCR扩增 |
| 2.3.1 扩增引物 |
| 2.3.2 扩增体系和条件 |
| 2.4 扩增产物鉴定 |
| 2.5 数据分析 |
| 2.5.1 溪蟹感染资料分析 |
| 2.5.2 DNA序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 豫皖闽浙4省5地区溪蟹并殖吸虫囊蚴感染情况 |
| 3.2 豫皖闽浙4省5地区溪蟹并殖吸虫囊蚴形态 |
| 3.3 并殖吸虫ITS2、CO1基因PCR扩增结果 |
| 3.4 并殖吸虫ITS2、CO1基因序列Blast比对结果 |
| 3.5 并殖吸虫ITS2、CO1基因序列遗传距离分析 |
| 3.6 并殖吸虫ITS2、CO1基因序列系统进化树分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 综述 并殖吸虫DNA分类技术的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的抗原性和对树突状细胞的免疫调节性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 旋毛虫流行病学调查 |
| 1.1 旋毛虫概述 |
| 1.2 旋毛虫流行途径分析 |
| 1.3 旋毛虫病分布 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 旋毛虫感染诊断抗原研究进展 |
| 2.1 排泄分泌抗原(ES) |
| 2.2 虫体抗原(粗抗原) |
| 2.3 表面抗原(SA抗原) |
| 2.4 重组抗原 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 旋毛虫及其虫源性分子免疫调控作用的研究 |
| 3.1 旋毛虫免疫调节 |
| 3.2 旋毛虫排泄分泌抗原(ES)免疫调节作用研究 |
| 3.3 旋毛虫重组抗原免疫调节作用研究 |
| 3.4 旋毛虫丝氨酸蛋白酶免疫调节作用研究 |
| 3.5 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白的表达与纯化 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物与旋毛虫虫种 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 常用试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 总RNA的提取及反转录 |
| 1.2.3 目的基因的扩增 |
| 1.2.4 重组质粒的构建与鉴定 |
| 1.2.5 重组Ts-Sp-7 蛋白的诱导表达 |
| 1.2.6 重组Ts-Sp-7 蛋白的纯化 |
| 1.2.7 重组Ts-Sp-7 蛋白的Western-Blot分析 |
| 1.2.8 重组Ts-Sp-7 蛋白与猪阳性血清Westen-Blot分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 Ts-Sp-7 蛋白信号肽预测 |
| 1.3.2 目的基因的扩增 |
| 1.3.3 重组质粒双酶切鉴定 |
| 1.3.4 重组Ts-Sp-7 蛋白的可溶性分析 |
| 1.3.5 重组Ts-Sp-7 蛋白不同咪唑浓度纯化SDS-PAGE分析 |
| 1.3.6 重组Ts-Sp-7 蛋白Westen-Blot分析 |
| 1.3.7 重组Ts-Sp-7 蛋白与猪阳性血清Westen-Blot分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白多克隆抗体及单克隆抗体的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.2.2 单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.3.2 单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 旋毛虫Ts-Sp-7蛋白对小鼠骨髓源树突状细胞抗原提呈功能的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 C57BL/6 小鼠树突状细胞的分离与培养 |
| 3.2.2 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白对骨髓源树突状细胞成熟的影响 |
| 3.2.3 OT-Ⅱ小鼠Na?ve CD4+T 细胞的制备 |
| 3.2.4 小鼠骨髓源树突状细胞与Na?ve CD4+T 细胞共培养体系的建立 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白对骨髓源树突状细胞成熟的影响 |
| 3.3.2 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白刺激后的BMDCs对 Na?ve CD4+T细胞增殖的影响 |
| 3.3.3 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白刺激后的BMDCs对 Na?ve CD4+T 细胞活化的影响 |
| 3.3.4 旋毛虫Ts-Sp-7蛋白刺激后的BMDCs对Treg细胞的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（8）华支睾吸虫核酸检测方法的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 华支睾吸虫及华支睾吸虫病研究进展 |
| 1.1 华支睾吸虫病 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床表现及病理生理 |
| 1.4 基因组学和蛋白组学 |
| 1.5 治疗及预防 |
| 第二章 华支睾吸虫诊断方法的研究进展 |
| 2.1 粪便检查法 |
| 2.2 影像学检查 |
| 2.3 免疫学诊断方法 |
| 2.3.1 间接ELISA |
| 2.3.2 双抗夹心ELISA |
| 2.3.3 斑点ELISA |
| 2.4 分子生物学诊断方法 |
| 2.4.1 实时荧光定量PCR |
| 2.4.2 巢式PCR |
| 2.4.3 多重PCR |
| 第三章 LAMP及 RPA检测方法的概述与应用 |
| 3.1 LAMP简介及原理 |
| 3.2 RPA检测方法及原理 |
| 3.3 LAMP及 RPA检测方法的优势 |
| 3.4 LAMP及 RPA的临床应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 华支睾吸虫LAMP检测方法的建立与优化 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 华支睾吸虫基因组提取 |
| 1.2.2 LAMP反应条件的优化 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 华支睾吸虫DNA提取结果 |
| 1.3.2 引物特异性扩增结果 |
| 1.3.3 dNTPs优化结果 |
| 1.3.4 MgSO_4 优化结果 |
| 1.3.5 Bst酶优化结果 |
| 1.3.6 退火时间优化结果 |
| 1.3.7 退火温度优化结果 |
| 1.3.8 变性温度优化结果 |
| 1.3.9 新旧体系效果对比 |
| 1.3.10 新体系DNA灵敏度的检测 |
| 1.5 本章讨论 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 华支睾吸虫RPA检测方法的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RPA反应条件的优化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 引物特异性筛选 |
| 2.3.2 DNA灵敏度检测 |
| 2.4 本章讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 华支睾吸虫普通PCR检测方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 仪器 |
| 3.1.2 试剂及耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 普通PCR引物设计 |
| 3.2.2 PCR反应体系 |
| 3.2.3 PCR扩增产物的凝胶电泳 |
| 3.2.4 DNA灵敏度检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 DNA灵敏度检测 |
| 3.4 本章讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 LAMP及 RPA对实际样品的检测效果 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 试剂及耗材 |
| 4.1.4 主要试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 华支睾吸虫囊蚴的镜下收集及纯化 |
| 4.2.2 华支睾吸虫囊蚴比格犬人工感染实验 |
| 4.2.3 华支睾吸虫成虫的收集 |
| 4.2.4 LAMP对华支睾吸虫虫卵检测效果 |
| 4.2.5 LAMP对华支睾吸虫囊蚴检测效果 |
| 4.2.6 RPA对华支睾吸虫虫卵检测效果 |
| 4.2.7 RPA对华支睾吸虫囊蚴检测效果 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 华支睾吸虫囊蚴 |
| 4.3.2 华支睾吸虫成虫 |
| 4.3.3 LAMP对华支睾吸虫虫卵检测结果 |
| 4.3.4 LAMP对华支睾吸虫囊蚴检测结果 |
| 4.3.5 RPA对华支睾吸虫虫卵检测结果 |
| 4.3.6 RPA对华支睾吸虫囊蚴检测结果 |
| 4.4 本章讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）基于丝氨酸蛋白酶抑制因子WM5的猪旋毛虫检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 旋毛虫病研究进展 |
| 1.1 旋毛虫病的概述 |
| 1.2 旋毛虫感染的诊断抗原 |
| 1.3 旋毛虫感染的检测方法 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制因子研究进展 |
| 2.1 丝氨酸蛋白酶抑制因子概述 |
| 2.2 丝氨酸蛋白酶抑制因子的结构和功能 |
| 2.3 寄生虫中的丝氨酸蛋白酶抑制因子 |
| 2.4 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 WM5重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于丝氨酸蛋白酶抑制因子WM5的猪旋毛虫感染间接ELISA方法的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 WM5重组蛋白单克隆抗体制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间成果 |
| 致谢 |
（10）旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫期排泄分泌物蛋白质组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 旋毛虫种属研究进展 |
| 1 旋毛虫种属 |
| 2 旋毛虫属的进化分支及主要地理分布 |
| 3 旋毛虫种属流行病学 |
| 4 旋毛虫和伪旋毛虫ESP中功能性蛋白的研究进展 |
| 4.1 43-、45-、53-kDa糖蛋白 |
| 4.2 蛋白酶 |
| 4.3 蛋白酶抑制剂 |
| 4.4 热休克蛋白 |
| 4.6 糖苷酶 |
| 4.7 核酸内切酶 |
| 4.8 胸苷酸合成酶 |
| 4.9 核苷酸代谢酶 |
| 4.10 巨噬细胞迁移抑制因子 |
| 4.11 烯醇化酶 |
| 4.12 超氧化物歧化酶 |
| 5 小结 |
| 第二章 蛋白质组概述 |
| 1 新兴蛋白质组学研究技术 |
| 2 寄生虫领域的蛋白质组学研究 |
| 3 寄生虫源半胱氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 4 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期ESP蛋白质组学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要实验动物与虫株 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 T1和T4排泄分泌产物的收集 |
| 2.2 iTRAQ鉴定T1和T4肌幼虫时期ESP中差异蛋白 |
| 2.3 数据检索及分析 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.5 实时荧光定量PCR验证部分编码差异蛋白的基因转录水平 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 T1、T4肌幼虫期ESP SDS-PAGE结果 |
| 3.2 差异表达蛋白统计 |
| 3.3 生物信息学分析 |
| 3.4 荧光定量PCR验证部分编码差异蛋白基因表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 旋毛虫胱抑素样蛋白原核表达及生物信息学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验质粒及细胞 |
| 1.4 主要试剂的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2 重组蛋白的表达及纯化 |
| 2.3 目的蛋白检测 |
| 2.4 旋毛虫重组胱抑素样蛋白生信分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组质粒酶切 |
| 3.2 重组蛋白表达纯化后SDS-PAGE结果 |
| 3.3 WB检测 |
| 3.8 浓度测定 |
| 3.9 旋毛虫胱抑素样蛋白理化性质及结构预测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 旋毛虫胱抑素样蛋白荧光定位及对小鼠感染T1和T4减虫率的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验动物及虫株 |
| 1.4 主要试剂的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.5 抗血清的制备 |
| 2.6 间接ELISA进行抗血清效价的测定 |
| 2.7 旋毛虫胱抑素样蛋白虫体免疫荧光定位 |
| 2.8 旋毛虫重组胱抑素样蛋白对小鼠感染T1和T4减虫率的影响 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 旋毛虫胱抑素样蛋白在肌幼虫虫体中的定位 |
| 3.2 重组旋毛虫胱抑素样蛋白对小鼠感染T1和T4减虫率的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在学期间成果 |
| 致谢 |
四、应用特异性引物检测中国不同地区旋毛虫DNA（论文参考文献）
- [1]日本血吸虫病核酸检测方法的建立和初步应用[D]. 郭庆红. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌抗肿瘤效应研究[D]. 岳涛涛. 吉林大学, 2021(01)
- [3]旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究[D]. 伊娜娜. 东北农业大学, 2020
- [4]旋毛虫诱导分化巨噬细胞调节小鼠Th2型免疫应答影响弓形虫共感染的分子机制研究[D]. 金启旺. 东北农业大学, 2020
- [5]旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B的表达与鉴定及其在侵入宿主肠粘膜过程中作用的研究[D]. 李亚兰. 郑州大学, 2020(02)
- [6]三种并殖吸虫囊蚴的多重荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D]. 胡坤敏. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
- [7]旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的抗原性和对树突状细胞的免疫调节性研究[D]. 张胜兰. 吉林大学, 2020(08)
- [8]华支睾吸虫核酸检测方法的建立与初步应用[D]. 郝朔. 吉林大学, 2020(08)
- [9]基于丝氨酸蛋白酶抑制因子WM5的猪旋毛虫检测方法的建立[D]. 任博雯. 吉林大学, 2020(08)
- [10]旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫期排泄分泌物蛋白质组学分析[D]. 张雨璐. 吉林大学, 2020(08)