一、不同免疫水平的鸡胚生产鸡(ND、IB)二联苗使用不同剂量种毒的试验（论文文献综述）
田丽娜[1]（2021）在《高致病性禽流感疫苗免疫程序优化及临床应用》文中指出禽流感（Avian influenza,AI）,尤其是高致病性禽流感是由禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）感染所引发的一种高度接触性烈性传染病。禽流感在世界范围内广泛传播,不仅能够感染鸡、鸭、鹅、雁等禽类,而且能够感染猪、马以及人类,甚至造成感染者死亡,控制禽流感已经成为人类公共卫生事业的一个共同的艰巨任务。目前世界各国防控高致病性禽流感有两种不同的策略,一种是以扑杀为主,严格控制疫苗的使用或完全不支持疫苗免疫;另一种观点是采取疫苗免疫和扑杀相结合的策略,我国采取的是疫苗免疫结合扑杀的策略。自2004年使用H5亚型高致病性禽流感疫苗进行强制免疫后,我国的禽流感疫情得到很好的控制。但是,2013年以来H7N9亚型禽流感的发生给我国养禽业发展和人类健康带来极大的危害,尤其是2016年底H7N9亚型禽流感变异为高致病性,给养殖场造成了巨大的损失。重组禽流感（H5+H7）二价灭活疫苗的研制和应用,对防控我国H5、H7亚型禽流感的发生和流行发挥了重要作用。然而,由于养殖场疫苗选择不当、免疫程序制定不合理等因素,禽流感仍时有发生。针对这些问题,本研究在现地禽流感流行病学调查基础上,选择重组禽流感（H5+H7）二价灭活疫苗、禽流感-新城疫重组二联活疫苗为候选疫苗,开展了禽流感疫苗现地免疫效果评价、免疫程序优化和应用的研究。主要研究内容和结果如下:（1）在禽流感的病原学调查中,对2015-2017年东北三省10个养殖场、重点散养户和部分活禽交易市场采集到的鸡喉腔和泄殖腔棉拭子以及疑似禽流感鸡组织脏器进行病原检测。2216份样品H5亚型荧光定量RT-PCR检测均为阴性,3041份样品H7亚型检出2份阳性样本,2661份样品H9亚型检出12份阳性样本。对检测到的2株H7亚型AIV阳性样本序列测定及分析发现,这2株H7亚型AIV的HA基因裂解位点具有-ARTAR*G-序列,具有NST/NVT/NSS/NGS等潜在糖基化位点;NA基因与达菲耐药相关位点和内部基因中PB2、NS、M和PA等基因的毒力和耐药性相关基因序列均未发生突变,其结果符合高致病性AIV特征。（2）现地禽流感疫苗免疫程序调查和抗体水平监测显示,本实验监测的10家养殖场只使用了灭活疫苗免疫,开产前进行4次免疫,分别是15、45、70和110日龄左右,开产后每隔3个月灭活疫苗免疫1次。禽流感抗体水平监测表明,H5、H7和H9亚型禽流感抗体检测合格率分别为90.31%-97.72%,90.97%-96.48%和81.51%-97.88%,均达到《动物疫病免疫监测方案》要求的免疫合格率。结合国家禽流感的监测数据,在免疫次数较多且免疫抗体合格率较高的情况下,各亚型禽流感仍然有零星散发,说明现地生产中的免疫仍然存在漏洞。（3）禽流感免疫评价指标的对比分析,根据10个养殖场禽流感免疫抗体监测的数据,对比分析了鸡群禽流感免疫状况的抗体水平、离散度和界差率（Q）之间的关系。根据国家禽流感免疫标准,免疫抗体大于4log2时判定为合格,群体抗体合格率大于70%时为群体免疫合格,离散度<20%判定为合格。这两项指标虽然能够在一定程度上反映鸡群的免疫水平,但存在一定的误差,而界差率（Q）对于指导现地生产更有意义。当Q≥50%时,禽群健康状态相对稳定,对蛋鸡而言,当Q≥100%时,不仅鸡群健康状态稳定,且对产蛋影响相比较小,即使由于某种因素导致的产蛋下降,其恢复也较快;而当Q<50%时,禽群健康状态极不稳定,提示应及时进行相应疫苗免疫。界差率的评价指标与其他指标相比能比较全面的反映鸡群免疫水平及在该免疫水平下鸡群整体健康状态,对适时掌握鸡群禽流感免疫状态和免疫时机意义重大。（4）禽流感疫苗免疫程序优化,主要包括疫苗免疫次数、首免日龄和疫苗联合应用的优化。结果表明,在免疫次数方面,灭活疫苗在蛋鸡开产前免疫3次效果最优;在首免日龄方面,禽流感-新城疫重组二联活疫苗在7、10和14日龄差异不明显,但结合新城疫的免疫程序,禽流感-新城疫重组二联活疫苗的最佳免疫日龄是7日龄,重组AIV（H5+H7）二价灭活疫苗的最优首免日龄是10日龄;联合免疫实验中,发现前期的免疫中,先使用禽流感-新城疫重组二联活疫苗再使用灭活疫苗的免疫效果优于先用灭活疫苗再用禽流感-新城疫重组二联活疫苗加强免疫,产蛋期分别使用禽流感-新城疫重组二联活疫苗和灭活疫苗加强免疫,抗体水平差异不大,但产蛋期合理使用禽流感-新城疫重组二联活疫苗可以减轻疫苗免疫对鸡群产蛋率的影响。（5）将优化后的禽流感疫苗免疫程序应用于临床,普遍采用灭活疫苗在10日龄首免,40日龄二免,110日龄第三次免疫后监测结果表明,蛋鸡开产前3次免疫能获得较高的抗体水平。蛋鸡开产后无论使用灭活疫苗免疫还是禽流感-新城疫重组二联活疫苗免疫均能起到有效的加强免疫效果,抗体合格率为100%,抗体离散度<20%,界差率≥100%,鸡群健康状态稳定,生产性能良好,但禽流感-新城疫重组二联活疫苗免疫对产蛋率的影响小于灭活疫苗,推荐产蛋高峰时使用禽流感-新城疫重组二联活疫苗免疫。总之,本文通过禽流感的流行病学调查、免疫程序调查和抗体水平监测,发现了疫苗现地使用中存在的问题。采用鸡群体禽流感免疫评价指标的对比分析、疫苗质量的检测、现地疫苗免疫效果评价等优化了禽流感疫苗的免疫程序,应用后取得了很好的效果。这将为养殖场制定科学合理的禽流感疫苗免疫程序,确保疫苗在现地中的免疫效果提供科学的指导。
宋继军[2]（2021）在《猪圆环病毒2型悬浮培养及灭活疫苗工艺优化》文中研究指明猪圆环病毒病（Porcine Circovirus disease,PCVD）在世界范围内普遍存在,是影响世界养猪产业的重大疾病之一,同时也是影响中国养猪产业能否健康顺利发展的重大疾病之一。猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type2,PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、皮炎肾病综合征（PNDS）的主要病原,PMWS在加拿大最早被发现。此病可以造成养猪业的巨大损失。目前无有效的药物治疗此病,接种疫苗被认为是最有效的防控办法。而疫苗制备过程中,抗原的制备是最重要的环节,直接影响疫苗的质量。目前,大部分生物制品企业多采用转瓶培养工艺或偶见采用微载体全悬浮培养工艺进行猪圆环病毒2型抗原的培养。运用传统的转瓶工艺,培养出的病毒效价低、批间差异大、质量不稳定、生产成本高;运用微载体全悬浮培养技术又存在剪切力耐受度低、血清用量高、生产成本高、转球工艺复杂等不足。从行业发展和产业化背景等考虑,应用悬浮培养细胞系通过生物反应器培养参数的控制开展大规模动物病毒培养,可以起到降本增效、提高产品品质和提高企业的核心竞争力。本研究采用纯悬浮培养细胞技术和细胞生物反应器生产猪圆环病毒2型抗原,摸索并优化纯悬浮培养过程中涉及的重点质量控制点,开展对抗原纯化和抗原灭活生产工艺的研究,为大规模生产抗原提供可靠的数据支持,同时对应用该工艺制备的疫苗产品进行质量、安全性和效力性评估。（1）PK15细胞培养技术全悬浮培养研究采用PK15全悬浮培养细胞,用体积为150 ml的平行生物反应器系统,摸索适合悬浮细胞培养的各种参数,包括初始接种细胞密度的优化、溶氧参数的确定、pH参数的确定、搅拌转速选择、补液方式的优化。研究结果表明最佳培养条件为:细胞接种密度为5×105cells/ml;溶氧参数为40～50%;pH参数为7.0～7.4,当7.2时细胞生长最佳;搅拌转速为100～120 r/min;补液方式采取逐步加液。（2）猪圆环病毒2型（LG株）悬浮培养参数研究采用PK15细胞的全悬浮培养研究参数,运用平行生物反应器,对猪圆环病毒2型（LG株）悬浮培养参数开展进一步研究,包括接毒细胞浓度的优化、接毒剂量的优化、收毒时间的优化、全悬浮和转瓶培养方法的比较等。研究结果表明:最佳细胞接种浓度为5×105cells/ml;最佳接毒剂量确定为5%同步接种;最佳收获时间确定为120小时;全悬浮培养法收获的病毒滴度优于转瓶培养法收获的病毒滴度。（3）猪圆环病毒2型（LG株）抗原纯化工艺的研究对纯悬浮培养工艺收获的猪圆环病毒2型（LG株）抗原液进行细胞破碎优化和抗原纯化研究。细胞破碎采用低温超高压细胞破碎仪与传统冻融方法比较。抗原纯化引入中空纤维柱过滤和膜包过滤的方式进行纯化,比较纯化前后蛋白含量和病毒效价变化。研究结果表明:采用低温超高压细胞破碎仪能够很好的破碎悬浮培养后的细胞,与传统的反复冻融方法相比,具有破碎效果好和生产效率高等特点;0.45μm和100 k D中空纤维过滤技术可以很好地用于猪圆环病毒2型（LG株）疫苗的纯化生产工艺中,有效地提高了疫苗质量,产业化前景较好。（4）猪圆环病毒2型（LG株）抗原灭活工艺的研究采用灭活剂BEI与传统的灭活剂甲醛对猪圆环病毒2型（LG株）抗原液进行灭活效果比较,并做灭活检验。同时针对新的灭活剂开展安全性试验和免疫效力试验。研究结果表明:采用1.0‰浓度的BEI在32℃条件下48小时能够完全灭活猪圆环病毒2型（LG株）,灭活后的病毒安全试验和效力试验合格;用此方法制备的疫苗抗体产生的时间和抗体效价峰值均优于传统工艺甲醛灭活的疫苗。（5）猪圆环病毒2型（LG株）试验室试制的研究采用优化确定的全悬浮细胞培养工艺、抗原处理工艺及灭活工艺在试验室试制了3批猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗,进行全项半成品和成品检验。研究结果表明:经过对实验室试制的半成品和成品样本等进行检测,证明新摸索的工艺所确定的参数能够符合圆环灭活疫苗（LG株）的生产要求,说明在实验室条件下能够制备出符合规定的合格疫苗。（6）猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗安全性试验研究采用优化确定的全悬浮细胞培养工艺、抗原处理工艺及灭活工艺在生产车间试制了5批猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗,进行全项成品检验后,开展了单剂量免疫仔猪试验、单剂量重复免疫仔猪试验、大剂量免疫仔猪试验和母猪安全性试验等安全性试验研究。研究结果表明:用新工艺方法生产的猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗,对仔猪和妊娠母猪安全可靠、无毒副作用。（7）猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗效力性试验研究采用优化确定的全悬浮细胞培养工艺、抗原处理工艺及灭活工艺在生产车间试制了5批猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗,进行全项成品检验后,进行灭活疫苗效力性试验研究,包括疫苗免疫攻毒效检猪增重率评价试验、运用荧光定量PCR法评价疫苗免疫效力试验、免疫攻毒后病毒排毒规律及组织病毒载量测定试验、疫苗免疫持续期与抗体消长规律测定试验、最小免疫剂量试验及抗体与攻毒保护相关性试验、猪圆环病毒灭活疫苗（LG株）保存期试验、猪圆环病毒灭活疫苗（LG株）母猪被动免疫试验。研究结果表明:用新工艺方法生产的猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗,通过疫苗免疫可有效抵御强毒攻击引起的猪只增重率下降,以增重率指标作为评价疫苗免疫效果的指标,简便易行,直观可信,能够反映出疫苗真实效果;荧光定量PCR方法能够定量检测病毒载量,可作为疫苗免疫效果评价指标之一;疫苗免疫刺激产生的抗体能够抵抗强毒的攻击;疫苗免疫持续期至少为6个月,该疫苗具有良好的免疫原性,刺激产生抗体快,持续时间长,能够提供充分的免疫保护;疫苗对仔猪最小免疫剂量为每头猪0.5 ml,用最小免疫剂量接种试验猪,于免疫28日后血清抗体全部阳转和免疫保护率为100%,抗体效价越高,获得的免疫保护效力越好,血清抗体效价可以作为PCV2灭活疫苗效力检验手段之一,用IPMA法测定血清抗体效价达到800倍以上,可获得100%免疫保护率;疫苗的保护期确定为2～8℃下保存,保存期为18个月;疫苗对母猪安全是安全的,被动免疫母猪对所产仔猪具有良好的免疫保护作用。上述研究结果表明,应用优化后的PK15细胞全悬浮培养技术、生物反应器大规模生产猪圆环病毒2型（LG株）抗原技术、抗原纯化技术、抗原灭活技术等最终制备的猪圆环病毒2型（LG株）灭活成品疫苗,各项检测指标都符合现行国家标准,安全性和免疫效果评价,对仔猪和母猪安全且免疫效果良好,可替代传统工艺生产的疫苗用于圆环病毒2型疾病的防控。优化工艺后生产的疫苗具有抗原含量高、杂蛋白含量低、无副反应、批间稳定、生产效率高、生产成本低等优点,符合国家科技发展需求,能够提高企业的技术竞争力,增加企业的净利润,拥有很好的市场应用前景。
林志娴[3]（2021）在《鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的研究及S蛋白表达与单抗制备》文中研究指明鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的急性、高度接触性病毒性传染病。主要引起雏鸡死亡,肉鸡饲料报酬低,产蛋鸡产蛋下降。由于其病原易于突变、并可重组产生新的基因型导致该病防控难度加大。国内目前还没有IBV抗原抗体标准参考品,有关S蛋白的生物学特性研究还不深入。该病主要通过接种疫苗进行防控,但由于疫苗交叉保护性差导致该病在免疫鸡群中仍时有发生。本研究通过扩增IBV经典毒株IBV-M41株以及当下流行毒株IBV-CK/CH/2014/FJ14株的尿囊液作为备用抗原,将病毒接种14日龄雏鸡制备多抗血清作为备用抗体。上述制备的抗原抗体通过一系列标定后研制了IBV抗原抗体参考品。同时,通过真核载体表达系统表达了 IBV-CK/CH/2014/FJ14株的S蛋白,利用杂交瘤技术研制获得3株单克隆抗体,以期为该病的防控与诊断提供相应的生物材料。1.鸡传染性支管炎病毒抗原抗体参考品的制备本研究通过SPF鸡胚尿囊腔接种IBV-M41株和IBV-CK/CH/2014/FJ14株扩增病毒。对收集的尿囊液通过接种鸡胚、气管环和细胞等进行定值,结果显示IBV-M41株和 IBV-CK/CH/2014/FJ14 株 EID50 值为 105.8EID50/mL。IBV-M4 1 株 TOC-ID50 值为105.25TOC-ID50/mL,TCID50 值为 104.5TCID50/mL。IBV-CK/CH/2014/FJ14 株病毒 TOC-ID50值为105.5TOC-ID50/mL,TCID50值为104.75TCID50/mL。特异性鉴定结果表明,制备的抗原不含禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）、小鹅瘟病毒（Gooseparvoviruses,GPV）、传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）、禽传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）、马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）、禽网状内皮组织增生病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）、鸡传染性贫血病病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）等外源病毒。所制备的样品经无菌检验和支原体检测,结果均为阴性。经分析备用抗原的物理性状、装量差异、均一性、稳定性、长期保存性等结果均良好,因此制备的抗原可以作为IBV抗原标准参考品。使用制备的IBV-M41株、IBV-CK/CH/2014/FJ14株病毒分别免疫14日龄SPF鸡,之后每间隔7天加强免疫一次,并检测抗体效价,直至第三次免疫28天后采集血清,进行抗体相关特性定值。结果:IBV-M41株多抗血清经测定,间接免疫荧光（IFA）效价为1:800,中和效价为1:1722,酶联免疫吸附试验（ELISA）效价为1:1600,血凝抑制（HI）效价为1:27。IBV-CK/CH/2014/FJ14株多抗血清经测定,IFA效价为1:800,中和效价为1:1488,ELISA效价为1:1600。进一步特异性鉴定表明该批次获得的多抗血清未检测到REV、MDV、ALV、AIV等禽类传染病病毒的抗体。分装冻干后进行无菌检测和支原体检测表明该抗体血清中细菌、霉菌和支原体均为阴性。经分析多抗血清的物理性状、装量差异、均一性、稳定性、长期保存性等结果均良好,即制备的抗体血清可作为IBV抗体标准参考品。2.鸡传染性支气管炎病毒S蛋白在真核系统中的表达本研究首先通过PCR扩增IBV-CK/CH/2014/FJ14株病毒S基因胞外域,并克隆到pFast-Bac-HTA载体中进行酶切和测序鉴定,鉴定后转座到大肠杆菌DH1OBacTM感受态细胞中,构建重组杆粒rBacmid-FJ14-S,再通过脂质体介导转染到Sf9细胞中,获得重组杆状病毒rBac-FJ14-S。IFA鉴定表明重组病毒能与IBV阳性鸡血清反应,Western blot分析发现在140 kDa附近有一条目的条带,与预期大小一致,证明IBVS蛋白胞外域获得成功表达。与此同时,将构建好的pCAGGS-FJ14SI-IgGFc真核表达载体转染到293T细胞中,通过IFA鉴定证明,融合蛋白能与IBV阳性鸡血清发生特异性反应。通过Proten G纯化柱纯化,获得纯化融合蛋白FJ14Sl-IgGFc,SDSA-PAGE、Western blot分析结果表明,纯化蛋白大小符合预期,SI融合蛋白得以正确表达。3.鸡传染性支气管炎病毒S蛋白单克隆抗体的制备本研究用超速离心浓缩的IBV-CK/CH/2014/FJ14尿囊液病毒免疫6-8周龄BALB/C小鼠,每七天免疫一次,三免7天后对小鼠进行尾静脉采血,使用研究内容二获得的转染pCAGGS-FJ14S1-IgGFc载体的293T细胞测定效价,其IFA效价为1:800。通过细胞融合,借助研究内容二构建得到的pCAGGS-FJ14S1-IgGFc载体转染293T细胞进行IFA筛选。最终获得三株单克隆抗体,分别命名为Mab-IBV-S1-1H9,Mab-IBV-S1-5D3,Mab-IBV-S 1-5G11。Western blot实验表明三株单抗均能与纯化的重组蛋白FJ14S1-IgGFc良好反应。
李晓梅[4]（2021）在《利用动物细胞悬浮培养技术驯化培养PEDV的工艺研究》文中提出
陈顺[5]（2021）在《重组新城疫病毒嵌合表达传染性支气管炎表位疫苗安全性评价》文中进行了进一步梳理新城疫（ND）和鸡传染性支气管炎（IB）是世界动物卫生组织规定须通报的动物传染病和我国农业部规定的分别为一类和二类的动物疫病,疫病的流行会造成生产性能的降低和鸡群死亡等严重后果,直接造成巨额的经济损失,已俨然成为制约水禽养殖的重大威胁。然而发展到目前为止,对于这两类疫病最高效经济的防控方式无疑是使用疫苗免疫;传统疫苗的种类主要包括:灭活疫苗和减毒的活疫苗,但是面对像IB这种血清型众多的病毒株,传统疫苗的保护就显得有些力不从心,况且传统疫苗病毒株稳定性差,常出现毒力返强现象,生产成本高、制备工艺复杂、免疫程序繁琐也导致了商品化疫苗的水平参差不齐;诸多问题的叠加放大加快了新型疫苗的研究脚步,基因工程疫苗首当其冲,逐步成为了疫苗研究中的新宠。能够同时表达多个与目标抗原相关及辅助性表位的疫苗被称为鸡尾酒式疫苗,也就是多表位疫苗。作为基因工程疫苗研究领域的翘楚,它能够被多种遗传背景的MHC分子特异性识别结合,诱导高效的递呈反应,增强免疫应答反应,在应对病原微生物的基因突变方面及克服免疫反应中的不良因素中具有得天独厚的优势。此次研究所用本团队已构建完成的重组新城疫病毒表达传染性支气管炎病毒的多表位疫苗rNDV-IBV-T/B株,它是以NDV的La Sota株作为载体,首先将NDV-TS09-C株的耐热性HN基因替换至La Sota株,增强了其热稳定性,然后应用基因工程技术,将IBV-S1蛋白的T、B淋巴细胞功能性表位插入到NDV的F和M基因之间,并通过反向遗传技术将重组病毒进行体外拯救,获得了重组病毒rNDV-IBV-T/B株,重组病毒rNDV-IBV-T/B株能够有效抵抗新城疫病毒以及多种亚型IBV感染。作为转基因微生物,基因安全问题一直以来是基因工程疫苗研究中所面临的重点,为防止对周围环境及人造成不必要的损害,《农业部转基因生物安全管理条例》对转基因生物的生产应用也做出了明确的规定,一般在通过小规模的中间实验、中规模的环境释放实验、大规模的生产性实验三个阶段,经验收合格后方能获得转基因生物安全证书并开展下一阶段的研究,作为基因工程疫苗在生产应用中必须要经历且重要的一环。为此,本研究针对重组病毒rNDV-IBV-T/B株安全性进行评估,为疫苗的生产应用提供了数据支持和保证,同时大力推动了基因工程疫苗的发展进程。本研究对构建保存的重组病毒rNDV-IBV-T/B株目的基因表达及遗传稳定性进行了分析。利用鸡胚传代的方法将重组病毒不断复制扩增,在传代25次后收取鸡胚尿囊液,对重组病毒进行RT-PCR检测并送检测序分析基因突变情况;同时,针对重组病毒外源性插入基因进行特异性检测以及灵敏性分析。结果表明,当重组病毒利用鸡胚传代若干代后无基因突变现象且能够扩增出两条大小为1592bp和977bp的特异性条带,初步说明了重组病毒具有良好的遗传稳定性。当重组病毒的c DNA模板稀释度至10-4时仍能扩增出两条特异性条带,用其他病毒配合特异性引物进行PCR扩增无任何目的条带,重组病毒rNDV-IBV-T/B株能够扩增出两条目的条带,母本La sota株能得到一条目的条带,利用鸡胚还检测出重组病毒具有高水平病毒滴度。这些结果说明重组病毒在多次传代仍具有较强复制能力与毒力水平,插入基因稳定表达且特异。对1日龄的雏鸡进行滴鼻点眼免疫接种,免疫剂量大小为106EID50/0.2m L,在免疫后每日观察鸡群的精神状态及发病死亡情况,免疫后第3、7、14、21、28、35、42、49和56天进行剖检观察,并取鸡只组织脏器及环境中的饮水、饲料等进行RT-PCR检测。结果发现在整个实验进程中未发生鸡只死亡情况,鸡群采食及精神状态良好,鸡只组织脏器剖检观察均正常,RT-PCR结果显示,在整个免疫观察期内未在免疫鸡体内各脏器中及周围环境饮水、饲料中检测到重组病毒rNDV-IBV-T/B株目的基因;为进一步检测证实PCR结果的可靠性,对重组病毒rNDV-IBV-T/B的安全性进行进一步评估,我们利用间接免疫荧光技术（IFA）,通过细胞水平的检测重新划定重组病毒在机体及环境中的留存情况。在免疫后第3、7、14、21、28、35、42、49和56天取靶动物鸡的组织器官和周围环境中饮水、饲料等处理后去感染Hela细胞,同时也用重组病毒rNDV-IBV-T/B和NDV强毒Herts33感染Hela细胞作为两个阳性对照。经过检测我们可以发现,在免疫后的56d内,组织脏器及周围环境样品中没有检测到绿色荧光信号,阳性组有明亮的绿色荧光信号标记,即在组织和周围环境中没有检测到重组病毒,说明了重组病毒对靶动物鸡和环境是安全的。综上所述,本实验对表位疫苗株rNDV-IBV-T/B安全性进行了客观性评价,证实了其安全性,为推动疫苗发展进程提供了数据支撑。
姚瑶[6]（2021）在《新城疫病毒基因Ⅰ/Ⅶ型F和HN基因嵌合弱毒疫苗候选株LX-OAI4S的构建和免疫效力评价》文中进行了进一步梳理新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）强毒株引起的禽类高度接触性传染病,被公认为是除高致病性禽流感外对全球养禽业危害最为严重的禽类疾病。近年来NDV分子流行病学数据显示,我国鸡群和水禽中NDV主要的流行基因型为基因Ⅶ型。2014年针对ND基因Ⅶ型的灭活疫苗A-Ⅶ问世,使得我国基因Ⅶ型NDV的流行得到了有力控制。但由于灭活疫苗主要依赖于注射免疫,免疫操作过程中往往带来较强烈的动物应激,同时大规模免疫下花费的人力成本较高,因此迫切需要适用于喷雾、饮水等大规模免疫途径的ND弱毒活疫苗。本研究以Ⅰ型NDV为骨架,构建一株表达基因Ⅶ型F和HN蛋白胞外区的嵌合重组病毒,并通过不同的免疫方式对该重组毒进行免疫效力评价。1.重组嵌合疫苗株LX-OAI4S的构建及滴鼻点眼免疫效力评价为获得一株安全性好、抗原性与流行株相匹配的ND疫苗株,本研究以基因Ⅰ型NDV弱毒株LX为骨架,将实验室前期获得的A-Ⅶ疫苗株的F和NDV强毒JS14/12/Ch株HN基因胞外区替换至骨架毒株相应区域,利用反向遗传技术成功拯救获得重组嵌合病毒LX-OAI4S。重组嵌合病毒LX-OAI4S毒力弱（ICPI=0.00,MDT>120h）,在鸡胚中能高效复制（EID50=10-9/0.1 mL）。将该毒株在鸡胚中连续传9代,毒力和繁殖能力依然保持稳定。为比较重组嵌合病毒株LX-OAI4S的免疫原性,LX-OAI4S和另一个前期获得的疫苗候选株LX/AI4-E34K分别以106 EID50、105 EID50、104 EID50剂量滴鼻点眼免疫SPF鸡,均能提供100%保护,证明最小免疫剂量为104 EID50。LX-OAI4S疫苗株105 EID50剂量组和106 EID50剂量组在免疫后第一周平均HI抗体水平分别达到6.30 log2和6.53 log2,明显高于LX/AI4-E347K株的相同剂量组,这些结果表明LX-OAI4S株免疫原性优于LX/AI4-E347K株。此外,用疫苗候选株LX-OAI4S、商品化弱毒疫苗株La Sota和VG/GA分别免疫3周龄SPF鸡,免疫后一周,LX-OAI4S免疫组血清中HI抗体平均为4.71 log2,比La Sota免疫组（3.43 log2）高1个滴度,比VG/GA免疫组（2.83 log2）高2个滴度;而且免疫后第二周和第三周,LX-OAI4S免疫组血清中HI抗体平均水平均高于其他免疫组。免疫三周后用基因Ⅶ型强毒株JS02/06进行攻毒,攻毒后所有免疫组都没有出现临床症状,攻毒保护率为100%。LX-OAI4S免疫组喉头和泄殖腔未发现排毒,La Sota免疫组和VG/GA免疫组在攻毒后第3天喉头（分别为2/7和3/7）和泄殖腔（分别为2/7和1/7）均有排毒。综上,传统滴鼻点眼免疫方式下LX-OAI4S株的免疫原性优于LX/AI4-E347K株和现有ND活疫苗,是值得期待的疫苗候选株。2.重组嵌合疫苗株LX-OAI4S喷雾免疫效力评价选择LX-OAI4S、La Sota和VG/GA不同免疫剂量喷雾免疫1日龄SPF鸡和商品鸡,连续观察14天,每天称重。所有免疫组鸡体重都呈增长趋势,但SPF鸡免疫后出现了一定的应激,SPF鸡免疫组的体重比对照组增长慢;商品鸡免疫后体重增长正常。不同剂量的La Sota株免疫SPF鸡和商品鸡后都出现了不同程度的呼吸道症状。在2×106 EID50剂量SPF鸡免疫组,LX-OAI4S免疫组诱导的抗体高于La Sota和VG/GA免疫组。免疫两周后攻毒,La Sota组有一只鸡出现神经症状,La Sota组感染后第5和7天泄殖腔可以测到排毒,阳性率为10%;LX-OAI4S组和VG/GA组在观察期内未出现任何的临床症状,免疫保护率为100%,并且喉头和泄殖腔均未测到排毒。在10×106EID50剂量免疫组,La Sota免疫SPF鸡和商品鸡组HI抗体水平均高于其他免疫组,但是La Sota免疫商品鸡组有1只鸡死亡;免疫后14天进行剖检,La Sota组鸡喉头出血比例（SPF鸡8/10,商品鸡8/9）最多,其次是LX-OAI4S组（SPF鸡6/10,商品鸡5/10）,VG/GA对鸡呼吸道的刺激最小（SPF鸡4/10,商品鸡5/10）,但是该组有一只鸡腺胃出血。在LX-OAI4S抗体监测组,前三周抗体滴度增长迅速,第5周达到高峰之后缓慢平稳地下降,监测到第12周的抗体滴度依然能提供保护。证明重组嵌合病毒LX-OAI4S有潜力成为可用于喷雾免疫的候选疫苗株。综上所述,本研究构建了一株重组嵌合弱毒ND疫苗LX-OAI4S,最小免疫剂量可达104 EID50,滴鼻点眼免疫三周龄SPF鸡,能提供100%的临床保护,并能有效减低NDV强毒株的分离率;喷雾免疫1日龄雏鸡,对雏鸡的生长发育影响小,安全性优于La Sota株,免疫效力优于VG/GA株。LX-OAI4S株有望成为安全有效、可用于喷雾免疫的疫苗候选株。
沈佳,张建伟,李林,史爱华,郑小兰,姜北宇,章振华[7]（2021）在《基于IBDV悬浮培养制备的ND-IB-IBD三联灭活疫苗免疫效力评估》文中提出为了评估DF-1细胞悬浮培养增殖的IBDV BJQ902抗原液的病毒滴度和基于此抗原制备的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊病三联灭活疫苗的物理性状和免疫效力,将IBDV BJQ902株病毒接种悬浮培养的DF-1细胞制备IBDV抗原液,测定抗原液病毒滴度,将此抗原液与常规方法制备的ND La Sota株和IB M41株抗原液,进行适当浓缩、灭活制备ND-IB-IBD三联灭活疫苗测定其物理性状,用ND-IB-IBD三联灭活疫苗以不同剂量免疫试验鸡,测定其免疫效果。结果显示:IBDV BJQ902株病毒接种微载体悬浮的DF-1细胞后,收获的抗原液毒滴度可达107.78.5TCID50/0.1 m L;制备的ND-IB-IBD三联苗性状稳定;以0.1 m L/只的剂量免疫鸡只即可获得良好保护。研究结果为新型ND-IB-IBD三联疫苗的研制提供理论依据。
田健霞[8]（2021）在《嵌合鸡干扰素刺激因子12-2（ISG12-2）新城疫病毒载体疫苗免疫原性的初步评价》文中提出新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株引起的严重威胁养禽业的传染病。干扰素（Interferons,IFNs）是宿主天然免疫的关键因子,NDV感染机体后,细胞的病原模式识别受体（PRRs）识别病原相关分子模式（PAMPs）后与线粒体外膜中的接头蛋白（MAVS）结合,激活TANK结合激酶1（TBK1）。由于鸡缺乏调节因子IRF3,TBK1进一步激活IFN调节因子IRF7。激活的IRF7移位到细胞核中与ISRE结合,诱导I型干扰素表达,通过JAK/STAT通路激活大量的ISGs表达,其中包括鸡源干扰素刺激基因12-2[Interferon-stimulated gene 12（2）,ISG12（2）],发挥抗病毒作用。本实验室前期研究发现,NDV感染鸡后能明显上调ISG12（2）的表达,体外实验证实ISG12（2）能抑制NDV的复制,同时IFNs能刺激鸡胚成纤维细胞（DF-1）表达ISG12（2）。同时,ISG12（2）也能促进干扰素及干扰素信号通路一系列分子的表达,表明ISG12（2）对IFN存在正向调节。基于此,推测表达ISG12（2）的NDV载体疫苗,能提高宿主对疫苗的免疫反应,增强疫苗免疫效果,提高对宿主的保护率。本研究首先通过将ISG12（2）嵌合到NDV弱毒载体LaSota上,然后通过本实验室熟练应用的NDV反向遗传操作系统,成功拯救获得ISG12（2）嵌合株,并验证了嵌合株既具有NDV活性,又能成功表达ISG12（2）蛋白,通过检测MDT,ICPI,感染6周龄低抗体鸡,实验结果表明,ISG12（2）嵌合株能显着降低病毒的致病性。最后用拯救的ISG12（2）嵌合株免疫6周龄低抗体鸡,HI抗体效价可以达到免疫保护线24以上,能起到免疫保护效果,免疫三周后用强毒株F48E9攻毒,鸡都能100%存活,体外排毒结果也显示ISG12（2）嵌合株能明显减短排毒时间,转录组结果表明ISG12（2）嵌合株不仅能激活体液免疫,还能激活细胞免疫,发挥更好的免疫保护效果。综上所述,ISG12（2）LaSota嵌合株能刺激机体产生更好的免疫保护效果,ISG12（2）具备作为分子佐剂的能力。本论文的主要研究内容和结果如下:1.ISG12（2）正向调控IFNs的机制探究为了初步探究ISG12（2）如何调节IFN及其通路相关因子的表达,首先构建既能表达ISG12（2）蛋白又能表达EGFP蛋白的质粒pCMV-ISG12（2）-EGFP。然后验证其功能,发现该质粒能抑制NDV的复制,并上调IFN及其通路相关因子的表达。为了提高转录组测序样本质量的可靠性,先将质粒转染于DF-1细胞中,36 h后通过流式分选出表达ISG12（2）蛋白的细胞,提取RNA,进行转录组测序分析。结果显示表达ISG12（2）后,相比不表达ISG12（2）的对照组,共有差异表达基因1327个,其中差异上调表达基因有709个,差异下调表达基因618个,并且KEGG通路富集分析发现,主要的富集通路有m TOR信号通路,TGF-β信号通路,Toll样受体信号通路,细胞因子相互作用信号通路和甲型流感通路等,这些通路都与免疫相关。挑选差异表达基因IFNGR1,IL1R2,IFNAR2,IFNAR1,GHR,CXCR1,CXCL12,CSF1,SMURF2,ACVR2A,SKP1,RPS6KB1进行q RT-PCR验证,检测结果与转录组测序结果相符,说明ISG12（2）的确参与免疫调节,具备激活天然免疫和增强适应性免疫的功能。2.ISG12（2）NDV嵌合株的拯救及生物学特性测定将ISG12（2）嵌合到LaSota病毒载体上拯救毒株。通过PCR、酶切、连接等分子克隆方法,在NDV LaSota原始株（r LaSota）和F蛋白裂解位点突变株（r LaSota/Fmut）的全基因组载体中插入ISG12（2）。在此基础上,借助实验室NDV反向遗传系统,成功拯救了r LaSota、r LaSota/Fmut、r LaSota-ISG12（2）、r LaSota-ISG12（2）/Fmut毒株。通过Western Blot和间接免疫荧光,验证了拯救的嵌合株既能高效表达ISG12（2）蛋白,又具有NDV活性。通过细胞因子检测、病毒增殖能力及致病性测定发现,表达ISG12（2）的嵌合株,相比未表达的NDV,在体内和体外均能更好地促进IFNs、IL-16、IL-18、IL-22等细胞因子的表达,抑制NDV的增殖,从而降低病毒的致病性。病理组织切片观察发现,嵌合了ISG12（2）的毒株感染鸡后,并未在脾脏、法氏囊等免疫器官中引起相关的炎症病理变化。3.嵌合ISG12（2）的LaSota毒株的免疫保护效果评估将成功拯救的毒株通过点眼滴鼻的接种方式,以105 EID50的接种剂量6周龄低抗体鸡,进行免疫-攻毒保护试验。NDV强毒株F48E9攻毒后,通过抗体效价的动态变化监测,4株拯救的病毒均能诱导鸡产生高抗体。通过病毒体外排泄、病毒载量、组织病理变化和存活率的检测发现,r LaSota-ISG12（2）拯救毒株能100%保护鸡群,明显减少病毒体外排泄,降低组织的病毒载量,且阻止NDV强毒株对各组织的病理损伤。进一步研究发现r LaSota-ISG12（2）组,相对r LaSota组,明显上调IFNα、IFNβ、IL-16、IL-18、IL-22等免疫相关因子的表达,并且这些细胞因子的上调,并不会导致脾脏等相关免疫组织的病理变化,避免了细胞因子风暴引起的不良反应。通过对免疫后鸡的脾脏进行转录组测序分析发现,嵌合ISG12（2）后的LaSota拯救毒株,免疫后能更好地激活鸡的体液免疫和细胞免疫,促使该弱毒株发挥更好的免疫保护作用。综上所述,本研究成功构建并拯救了表达ISG12（2）的NDV嵌合株。该嵌合株,借助ISG12（2）促进干扰素、白介素等细胞因子表达的功能,降低病毒的致病性,并且增强鸡的天然免疫和适应性免疫途径,更好地防控鸡不被NDV强毒株感染。这些研究结果,为以鸡源ISG12（2）为分子佐剂增强家禽疫苗的免疫原性,提高疫苗的保护效果,奠定了基础。
孟令宅,庞洪泽,赵卓,赵款,袁万哲[9]（2021）在《新城疫疫苗研究现状》文中认为新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的禽类的一种急性烈性传染病,严重危害养禽业的发展。在疫苗接种免疫压力下,NDV演化出不同的基因型,且各基因型毒株之间不能较好地提供交叉保护,导致临床上多见非典型新城疫与高抗体家禽发生NDV感染。目前,疫苗免疫仍是预防该病的重要措施,随着其病原学与分子生物学技术的发展,研究者研发了不同类型的ND疫苗。论文就新城疫病毒的病原分子特征、传统疫苗及新型基因工程疫苗的研究现状及发展前景进行综述,旨在为我国新城疫的防控及新城疫疫苗的研发提供一定的参考。
洪素梅,袁月,刘月月,田辉,程艺,张盼涛,王林果,薛景景,刘武杰,田克恭[10]（2021）在《鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活苗（La Sota株+M41株+Re-9株）应用效果研究》文中研究表明鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活苗（La Sota株+M41株+Re-9株）（三联苗（Re-9株））为国内首个采用基因重组H9亚型禽流感疫苗株研制的新支流三联灭活疫苗。为研究疫苗上市后的实际应用效果,使用7日龄AA肉鸡和260日龄产蛋期蛋鸡评价三联苗（Re-9株）有效性。结果显示:肉鸡免疫后14 d即可激发抗体,免疫后21 d,新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、H9亚型禽流感病毒（H9 AIV）的血凝抑制（HI）抗体分别达8.6log2、6.2log2、8.3log2,出栏时仍维持在较高水平;于免疫后14 d抽样进行NDV、H9 AIV攻毒,对照组均100%发病或排毒,免疫鸡均可获得100%保护;在蛋鸡上,免疫三联苗（Re-9株）后28 d,NDV、IBV、H9 AIV的HI抗体效价分别达12.0log2、7.8log2、12.2log2,免疫后6个月仍可以维持在较高水平。结果表明:三联苗（Re-9株）在实际应用中免疫效果较好,本研究将为鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感的防控提供有力支撑。
二、不同免疫水平的鸡胚生产鸡(ND、IB)二联苗使用不同剂量种毒的试验（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同免疫水平的鸡胚生产鸡(ND、IB)二联苗使用不同剂量种毒的试验（论文提纲范文）
（1）高致病性禽流感疫苗免疫程序优化及临床应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽流感概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 禽流感分类 |
| 1.1.3 禽流感的发生与传播 |
| 1.2 禽流感的流行病学特点 |
| 1.2.1 传染源 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.2.3 易感动物 |
| 1.2.4 时间分布 |
| 1.2.5 地区分布 |
| 1.3 禽流感的危害 |
| 1.4 禽流感的综合防控 |
| 1.5 禽流感疫苗 |
| 1.5.1 禽流感疫苗的分类 |
| 1.5.2 禽流感疫苗的选择和使用 |
| 1.5.3 我国禽流感疫苗的研究及应用情况 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要生物制剂和化学试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 禽流感的流行病学调查 |
| 2.2.2 高致病性禽流感病毒基因序列分析 |
| 2.2.3 鸡群体禽流感免疫评价指标 |
| 2.2.4 禽流感疫苗的质量检验 |
| 2.2.5 禽流感疫苗免疫程序的优化 |
| 2.2.6 禽流感疫苗免疫程序优化后的应用 |
| 2.2.7 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 禽流感的流行病学调查 |
| 3.1.1 禽流感的临床症状及病理变化 |
| 3.1.2 禽流感病原学检测 |
| 3.1.3 现地免疫情况分析 |
| 3.2 高致病性AIV的基因序列分析 |
| 3.2.1 高致病性AIV的检测 |
| 3.2.2 H7亚型AIV表面基因的扩增 |
| 3.2.3 H7亚型禽流感病毒的HA基因序列测定及其分析 |
| 3.2.4 H7亚型禽流感病毒的NA基因序列测定及其分析 |
| 3.2.5 H7亚型禽流感病毒内部基因序列测定及分析 |
| 3.3 鸡群体禽流感免疫评价指标 |
| 3.3.1 禽流感免疫抗体与鸡群健康状态相关性 |
| 3.3.2 健康鸡群免疫抗体水平与界差率(Q)之间的换算 |
| 3.3.3 界差率(Q)与抗体合格率、离散度比较分析 |
| 3.4 禽流感疫苗质量检验 |
| 3.4.1 禽流感灭活疫苗质量的实验室检验及现地免疫效果跟踪 |
| 3.4.2 重组活疫苗质量的实验室检验及现地免疫效果跟踪 |
| 3.5 禽流感疫苗免疫程序的优化 |
| 3.5.1 禽流感灭活疫苗免疫次数的优化 |
| 3.5.2 两种不同禽流感疫苗首免日龄的优化 |
| 3.5.3 两种疫苗联合使用免疫程序优化 |
| 3.5.4 不同禽流感疫苗加强免疫的效果评价 |
| 3.6 禽流感疫苗优化免疫程序后的应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 禽流感流行情况调查 |
| 4.1.1 禽流感的临床症状及病理变化 |
| 4.1.2 禽流感病原学监测 |
| 4.1.3 禽流感病毒基因序列的分析 |
| 4.2 禽流感疫苗现地免疫情况分析 |
| 4.3 不同禽流感疫苗的质量检测 |
| 4.4 不同禽流感疫苗的免疫效果评价 |
| 4.5 禽流感疫苗免疫程序的优化和应用 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略语表 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（2）猪圆环病毒2型悬浮培养及灭活疫苗工艺优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 猪圆环病毒概述 |
| 1.1.1 病毒生物学特性 |
| 1.1.2 病毒基因结构 |
| 1.2 流行病学研究 |
| 1.2.1 猪圆环病毒病发病史 |
| 1.2.2 猪圆环病毒易感动物 |
| 1.2.3 猪圆环病毒传播途径 |
| 1.3 疫苗种类 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 弱毒活疫苗 |
| 1.3.3 亚单位疫苗 |
| 1.3.4 其它疫苗 |
| 1.4 生物反应器种类和发展 |
| 1.5 悬浮培养技术的应用 |
| 1.6 悬浮培养的细胞系 |
| 1.6.1 幼仓鼠肾细胞 |
| 1.6.2 中国仓鼠卵巢细胞 |
| 1.6.3 非洲绿猴肾细胞 |
| 1.6.4 犬肾细胞 |
| 1.6.5人胚胎肾细胞293 |
| 1.6.6 猪肾细胞 |
| 1.6.7 其它细胞 |
| 1.7 产业化背景-为何要做悬浮培养 |
| 1.7.1 行业要求和标准 |
| 1.7.2 行业发展趋势 |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞和毒种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.1.5 试验动物管理 |
| 2.1.6 病毒载量测定操作规范 |
| 2.1.7 培养液配置 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 PK15细胞培养技术全悬浮培养研究 |
| 2.2.2 猪圆环病毒2型(LG株)悬浮培养参数研究 |
| 2.2.3 猪圆环病毒2型(LG株)抗原纯化工艺的研究 |
| 2.2.4 猪圆环病毒2型(LG株)抗原灭活剂的优化 |
| 2.2.5 猪圆环病毒2型(LG株)实验室试制的研究 |
| 2.2.6 猪圆环病毒2型(LG株)安全性试验研究 |
| 2.2.7 猪圆环病毒2型(LG株)灭活疫苗效力性试验研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PK15细胞培养技术全悬浮培养研究 |
| 3.1.1 初始接种细胞密度的优化 |
| 3.1.2 溶氧(DO)参数的确定 |
| 3.1.3 pH参数的确定 |
| 3.1.4 搅拌转速选择 |
| 3.1.5 补液方式的优化 |
| 3.2 猪圆环病毒2型(LG株)悬浮培养参数研究 |
| 3.2.1 接毒细胞浓度的优化 |
| 3.2.2 接毒剂量的优化 |
| 3.2.3 收毒时间的优化 |
| 3.2.4 全悬浮和转瓶培养方法的比较 |
| 3.3 猪圆环病毒2型(LG株)抗原纯化工艺的研究 |
| 3.3.1 细胞破碎 |
| 3.3.2 抗原液的纯化 |
| 3.4 猪圆环病毒2型(LG株)抗原灭活剂的优化 |
| 3.4.1 BEI灭活猪圆环病毒2型(LG株)抗原试验结果 |
| 3.4.2 两种灭活剂灭活效果结果 |
| 3.4.3 安全性试验 |
| 3.4.4 免疫效力试验 |
| 3.5 猪圆环病毒2型(LG株)实验室试制研究 |
| 3.5.1 抗原的生产及半成品检验结果 |
| 3.5.2 成品疫苗检验结果 |
| 3.6 猪圆环病毒2型(LG株)灭活疫苗安全性试验研究 |
| 3.6.1 单剂量免疫仔猪试验 |
| 3.6.2 单剂量重复免疫仔猪试验 |
| 3.6.3 大剂量免疫仔猪试验 |
| 3.6.4 母猪免疫安全性试验 |
| 3.7 猪圆环病毒2型(LG株)灭活疫苗效力性试验研究 |
| 3.7.1 疫苗免疫攻毒效检试验猪增重率评价试验 |
| 3.7.2 运用荧光定量PCR法评价疫苗免疫效力 |
| 3.7.3 免疫攻毒后病毒排毒规律及组织病毒载量测定 |
| 3.7.4 疫苗免疫持续期与抗体消长规律测定试验 |
| 3.7.5 最小免疫剂量试验及血清抗体与攻毒保护相关性试验 |
| 3.7.6 猪圆环病毒灭活疫苗(LG株)保存期试验 |
| 3.7.7 猪圆环病毒灭活疫苗(LG株)母猪被动免疫试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PK15细胞培养技术全悬浮培养研究 |
| 4.2 猪圆环病毒2型(LG株)悬浮培养参数研究 |
| 4.3 猪圆环病毒2型(LG株)抗原纯化工艺的研究 |
| 4.3.1 细胞破碎 |
| 4.3.2 抗原液的纯化 |
| 4.4 猪圆环病毒2型(LG株)抗原灭活剂的优化 |
| 4.5 猪圆环病毒2型(LG株)实验室试制研究 |
| 4.6 猪圆环病毒2型(LG株)灭活疫苗安全性试验研究 |
| 4.7 猪圆环病毒2型(LG株)灭活疫苗效力性试验研究 |
| 4.7.1 疫苗免疫攻毒效检试验猪增重率评价试验 |
| 4.7.2 运用荧光定量PCR法评价疫苗免疫效力 |
| 4.7.3 免疫攻毒后病毒排毒规律及组织病毒载量测定 |
| 4.7.4 疫苗免疫持续期与抗体消长规律测定试验 |
| 4.7.5 最小免疫剂量试验及血清抗体与攻毒保护相关性试验 |
| 4.7.6 猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)保存期试验 |
| 4.7.7 猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)母猪被动免疫试验 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的研究及S蛋白表达与单抗制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1. 概述 |
| 2. 流行病学 |
| 3. 临床症状与病理变化 |
| 4. 病原学 |
| 5. 致病机理 |
| 6. 诊断 |
| 7. 防控 |
| 8. 标准物质研究进展 |
| 9. 杆状病毒表达系统介绍 |
| 10. 单克隆抗体研究现状 |
| 11. 研究目的与意义 |
| 研究内容一 鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的制备 |
| 1. 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 IBV抗原参考品的制备 |
| 2.2 IBV抗体参考品的制备 |
| 3. 结果 |
| 3.1 IBV抗原标定结果 |
| 3.2.IBV血清抗体标定结果 |
| 4. 小结与讨论 |
| 研究二: 鸡传染性支气管炎病毒S蛋白在真核表达系统中的表达与鉴定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 设计PCR引物 |
| 2.2 PCR扩增IBV-S基因 |
| 2.3 构建和鉴定重组质粒pGEM-T-FJ14-S |
| 2.4 构建和鉴定重组质粒pFastBacHTA-FJ14-S |
| 2.5 构建和鉴定重组杆状病毒穿梭载体 |
| 2.6 制备重组杆状病毒rBac-FJ14-S |
| 2.7 重组载体pCAGGS-FJ14S1-IgGFc的鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 目的基因的扩增结果 |
| 3.2 阳性重组质粒的筛选及酶切鉴定结果 |
| 3.3 杆状病毒转移载体的构建与鉴定结果 |
| 3.4 PCR鉴定重组杆粒 |
| 3.5 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.6 WB验证S蛋白的表达 |
| 3.7 IFA鉴定重组载体pCAGGS- FJ14S1-IgGFc表达结果 |
| 3.8 SDS-PAGE鉴定纯化重组蛋白FJ14S1-IgGFc结果 |
| 3.9 WB鉴定纯化重组蛋白FJ14S1-IgGFc结果 |
| 4. 小结与讨论 |
| 研究三: 鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1. 材料 |
| 1.1生物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.2 动物的免疫 |
| 2.3 单抗筛选方法的构建 |
| 2.4 杂交瘤细胞的制备 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞的间接免疫荧光筛选 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞的亚克隆和建株 |
| 2.7 单克隆抗体生物学特性的鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 小鼠血清效价 |
| 3.2 单克隆抗体细胞建株 |
| 3.3 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.4 WB分析 |
| 3.5 单抗特异性鉴定 |
| 4. 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）重组新城疫病毒嵌合表达传染性支气管炎表位疫苗安全性评价（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 新城疫的研究概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 临床症状 |
| 1.1.3 病理变化 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.1.5 新城疫疫苗的研究进展 |
| 1.2 传染性支气管炎的研究概述 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 临床症状及病理变化 |
| 1.2.3 诊断方法 |
| 1.2.4 传染性支气管炎疫苗的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 伦理性声明 |
| 2.1.2 毒株及细胞 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 主要溶液的配制 |
| 2.1.7 主要软件的使用 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组病毒rNDV-IBV-T/B株遗传稳定性分析 |
| 2.2.2 重组病毒rNDV-IBV-T/B株灵敏性及特异性分析 |
| 2.2.3 重组病毒rNDV-IBV-T/B株的毒力测定 |
| 2.2.4 重组病毒疫苗对靶动物鸡的体内残留实验及环境影响 |
| 2.2.5 间接免疫荧光检测鸡只组织脏器及环境中重组病毒的存在 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组病毒rNDV-IBV-T/B株遗传稳定性分析 |
| 3.2 重组病毒rNDV-IBV-T/B株特异性及灵敏性分析 |
| 3.3 重组病毒rNDV-IBV-T/B株病毒滴度测定 |
| 3.4 重组病毒疫苗对靶动物鸡的体内残留实验及环境影响 |
| 3.4.1 免疫后临床及剖检变化 |
| 3.4.2 主要脏器及环境中重组病毒基因PCR检测 |
| 3.4.3 主要脏器及环境中重组病毒间接免疫荧光检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
（6）新城疫病毒基因Ⅰ/Ⅶ型F和HN基因嵌合弱毒疫苗候选株LX-OAI4S的构建和免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 新城疫疫苗种类及不同的免疫方式 |
| 1 NDV概述 |
| 1.1 NDV简介 |
| 1.2 ND流行情况 |
| 2 ND疫苗种类 |
| 2.1 活疫苗 |
| 2.2 灭活苗 |
| 2.3 ND反向遗传疫苗 |
| 2.4 以NDV为载体构建的疫苗 |
| 2.5 病毒样颗粒疫苗 |
| 2.6 DNA疫苗 |
| 3 免疫方式 |
| 3.1 喷雾免疫 |
| 3.2 其他免疫方式 |
| 3.2.1 传统免疫方式 |
| 3.2.2 鸡胚免疫 |
| 4 本课题研究目的和意义 |
| 第一章 重组嵌合疫苗株LX-OAI4S的构建及滴鼻点眼免疫效力评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒与细胞 |
| 1.2 鸡胚和实验动物 |
| 1.3 分子生物学试剂和主要化学试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 分子生物学软件 |
| 1.6 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 中间质粒的构建 |
| 2.2.1 中间质粒pLX-F的构建 |
| 2.2.2 中间质粒pLX-FHN的构建 |
| 2.2.3 重组质粒pLXS-S的构建 |
| 2.2.4 全长克隆pLX-OAI4S的构建和鉴定 |
| 2.2.5 质粒的提取 |
| 2.3 病毒拯救 |
| 2.4 获救病毒的鉴定 |
| 2.5 生物学特性的测定 |
| 2.6 嵌合病毒的稳定性试验 |
| 2.7 最小免疫剂量试验 |
| 2.8 不同疫苗株滴鼻点眼免疫效力试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 LX-OAI4S全长克隆构建、病毒拯救和鉴定 |
| 3.2 病毒的生物学特性的测定 |
| 3.3 嵌合病毒稳定性试验 |
| 3.4 最小免疫剂量试验 |
| 3.4.1 免疫后抗体水平变化 |
| 3.4.2 攻毒后剖检及排毒情况 |
| 3.5 不同疫苗株滴鼻点眼免疫效力试验 |
| 3.5.1 免疫后抗体水平变化 |
| 3.5.2 攻毒后排毒情况 |
| 4 讨论 |
| 第二章 重组嵌合疫苗株LX-OAI4S气雾免疫效力评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 鸡胚和实验动物 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 喷雾免疫方法 |
| 2.2 喷雾免疫效力试验 |
| 2.2.1 喷雾免疫SPF鸡试验 |
| 2.2.2 喷雾免疫商品鸡试验 |
| 2.3 喷雾免疫抗体监测试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床观察结果 |
| 3.2 免疫后抗体水平变化 |
| 3.3 对鸡的生长性能的影响 |
| 3.4 免疫后剖检结果 |
| 3.5 攻毒后排毒情况 |
| 3.6 抗体监测试验 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）基于IBDV悬浮培养制备的ND-IB-IBD三联灭活疫苗免疫效力评估（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验用疫苗 |
| 1.1.2 试验鸡、鸡胚和传代细胞 |
| 1.1.3 微载体、生物反应器及胰酶消化器 |
| 1.1.4 制苗用毒种 |
| 1.1.5 抗原 |
| 1.1.6 攻毒用毒种 |
| 1.1.7 制苗用原辅材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 ND-IB-IBD三联灭活疫苗抗原液的制备 |
| 1.2.2 ND-IB-IBD三联灭活疫苗抗原液的浓缩、灭活和疫苗制备 |
| 1.2.3 疫苗最佳油水比和保存期测定 |
| 1.2.4 疫苗质量检验 |
| 1.2.5 ND-IB-IBD三联灭活疫苗不同免疫剂量试验-ND效力部分 |
| 1.2.6 ND-IB-IBD三联灭活疫苗不同免疫剂量试验-IBD效力部分 |
| 1.2.7 ND-IB-IBD三联灭活疫苗不同免疫剂量试验-IB效力部分 |
| 1.2.8 中和抗体测定方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 三种疫苗抗原液的制备、浓缩及检验结果 |
| 2.2 ND-IB-IBD三联灭活疫苗最佳油水比测定结果 |
| 2.3 ND-IB-IBD三联灭活疫苗质量检验结果 |
| 2.4 ND-IB-IBD三联灭活疫苗不同免疫剂量ND部分效力试验结果 |
| 2.5 ND-IB-IBD三联灭活疫苗不同免疫剂量IBD部分效力试验结果 |
| 2.6 ND-IB-IBD三联灭活疫苗不同免疫剂量IB部分效力试验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（8）嵌合鸡干扰素刺激因子12-2（ISG12-2）新城疫病毒载体疫苗免疫原性的初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 新城疫及宿主蛋白ISG12(2)研究进展 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 NDV的分类地位及基因组结构 |
| 1.1.2 NDV的分子结构及蛋白功能 |
| 1.1.3 NDV的生命周期 |
| 1.1.4 ND的流行现状 |
| 1.2 NDV反向遗传学研究进展 |
| 1.3 新城疫疫苗研究进展 |
| 1.4 干扰素的概述 |
| 1.4.1 干扰素的产生 |
| 1.4.2 干扰素的功能 |
| 1.5 ISG12 蛋白的研究进展 |
| 1.5.1 ISG12 家族相关功能研究 |
| 1.5.2 ISG12 对抗病毒天然免疫的影响 |
| 1.6 本研究目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 ISG12(2)正向调控IFNs的机制探究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒、菌株与毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及常用试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 pCMV-ISG12(2)-EGFP真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2.2 ISG12(2)的原核表达 |
| 2.2.3 Western Blot验证ISG12(2)蛋白和EGFP蛋白的表达 |
| 2.2.4 pCMV-ISG12(2)-EGFP真核重组质粒的功能验证 |
| 2.2.5 转录组测序 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ISG12(2)多克隆抗体的制备 |
| 2.3.2 pCMV-ISG12(2)-EGFP真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 pCMV-ISG12(2)-EGFP质粒促进干扰素表达抑制NDV复制的功能鉴定 |
| 2.3.4 转录组测序分析ISG12(2)激活干扰素信号通路的方式 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ISG12(2)NDV嵌合株的拯救及生物学特性测定 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 细胞与质粒 |
| 3.1.2 鸡胚、1 日龄雏鸡 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 嵌合ISG12(2)的LaSota病毒载体的构建 |
| 3.2.2 重组病毒的拯救 |
| 3.2.3 重组病毒的鉴定 |
| 3.2.4 拯救毒株生物学特性的鉴定 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 重组病毒载体的构建 |
| 3.3.2 重组病毒的拯救及鉴定 |
| 3.3.3 拯救毒株生物学特性的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 嵌合ISG12(2)的LaSota毒株的免疫保护效果评估 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 疫苗株与病毒 |
| 4.1.2 低抗鸡和鸡胚 |
| 4.1.3 主要试验试剂和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫-攻毒试验分组 |
| 4.2.2 免疫-攻毒后HI抗体效价动态监测 |
| 4.2.3 攻毒后体外排毒情况 |
| 4.2.4 攻毒后组织体内病毒载量检测 |
| 4.3.5 攻毒后病理组织学观察 |
| 4.2.6 免疫后脾脏组织中免疫相关因子量的检测 |
| 4.2.7 免疫后脾脏组织的转录组测序分析 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 免疫-攻毒后鸡ND抗体效价的动态监测 |
| 4.3.2 免疫-攻毒后存活率 |
| 4.3.3 攻毒后体外排毒情况检测 |
| 4.3.4 攻毒后组织体内病毒载量检测 |
| 4.3.5 病理组织学观察 |
| 4.3.6 免疫后脾脏组织中免疫相关因子的表达 |
| 4.3.7 免疫后脾脏组织的转录组测序分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要仪器、试剂配方及实验方法 |
| 附录2 转录组测序数据补充材料 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）新城疫疫苗研究现状（论文提纲范文）
| 1 病原分子特征 |
| 2 传统疫苗 |
| 2.1 灭活疫苗 |
| 2.2 弱毒疫苗 |
| 3 基因工程疫苗 |
| 3.1 亚单位疫苗 |
| 3.2 重组活载体疫苗 |
| 3.3 新城疫病毒载体疫苗 |
| 3.4 病毒样颗粒疫苗 |
| 3.5 核酸疫苗 |
| 4 展望 |
（10）鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活苗（La Sota株+M41株+Re-9株）应用效果研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 疫苗 |
| 1.2 抗原 |
| 1.3 攻毒用毒株 |
| 1.4 试验场所及试验鸡 |
| 1.5 肉鸡应用效果评价 |
| 1.5.1 抗体检测 |
| 1.5.2 攻毒保护试验 |
| 1.6 蛋鸡应用效果评价 |
| 1.7 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 肉鸡应用效果 |
| 2.1.1 抗体检测 |
| 2.1.2 攻毒保护 |
| 2.2 蛋鸡应用效果 |
| 3 讨论 |
四、不同免疫水平的鸡胚生产鸡(ND、IB)二联苗使用不同剂量种毒的试验（论文参考文献）
- [1]高致病性禽流感疫苗免疫程序优化及临床应用[D]. 田丽娜. 东北农业大学, 2021
- [2]猪圆环病毒2型悬浮培养及灭活疫苗工艺优化[D]. 宋继军. 东北农业大学, 2021
- [3]鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的研究及S蛋白表达与单抗制备[D]. 林志娴. 扬州大学, 2021
- [4]利用动物细胞悬浮培养技术驯化培养PEDV的工艺研究[D]. 李晓梅. 新疆农业大学, 2021
- [5]重组新城疫病毒嵌合表达传染性支气管炎表位疫苗安全性评价[D]. 陈顺. 山东农业大学, 2021(01)
- [6]新城疫病毒基因Ⅰ/Ⅶ型F和HN基因嵌合弱毒疫苗候选株LX-OAI4S的构建和免疫效力评价[D]. 姚瑶. 扬州大学, 2021
- [7]基于IBDV悬浮培养制备的ND-IB-IBD三联灭活疫苗免疫效力评估[J]. 沈佳,张建伟,李林,史爱华,郑小兰,姜北宇,章振华. 中国家禽, 2021(04)
- [8]嵌合鸡干扰素刺激因子12-2（ISG12-2）新城疫病毒载体疫苗免疫原性的初步评价[D]. 田健霞. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [9]新城疫疫苗研究现状[J]. 孟令宅,庞洪泽,赵卓,赵款,袁万哲. 动物医学进展, 2021(02)
- [10]鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活苗（La Sota株+M41株+Re-9株）应用效果研究[J]. 洪素梅,袁月,刘月月,田辉,程艺,张盼涛,王林果,薛景景,刘武杰,田克恭. 畜牧与兽医, 2021(02)