一、重组PEA受体结合区蛋白的免疫活性（论文文献综述）
刘开拓[1]（2021）在《HA蛋白受体结合区及邻近区域适应性变异协同PB2-627K增强H9N2亚型禽流感病毒对小鼠致病性的机制研究》文中研究表明H9N2亚型禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）当前在我国广泛流行,不仅对家禽养殖业造成巨大的经济损失,同时还可跨种间传播感染人,潜在威胁公共卫生安全。活禽市场从业人员中较高的抗体阳性率表明H9N2亚型AIV跨种间感染人的现象非常普遍,但由于对人的致病性较低导致H9N2感染人的报道较少。AIV对哺乳动物的致病性是多基因协同作用的结果,其中影响毒株受体结合特性的HA以及影响AIV在哺乳动物细胞中复制能力的PB2基因起到重要作用。因此探究H9N2 HA和PB2关键氨基酸变异对哺乳动物的致病性以及致病机制对防控未来可能存在的大流行具有重要的指导意义。本实验室在对华东地区活禽市场进行流行病学监测过程中分离到一株H9N2毒株,该毒株在HA和PB2蛋白上天然具有多个哺乳动物标记位点,但对小鼠为低致病性。为了探究可增强该H9N2毒株对小鼠致病性的其它分子标记,我们通过人工适应以及自然毒株基因序列比对分析的方法发现了多个未曾报道的HA蛋白关键位点,同时对这些位点导致H9N2对小鼠致病性增强的机制进行了探究。1 天然携带哺乳动物分子标记的H9N2病毒SDKD1/15株生物学特性测定在对华东地区AIV进行流行病学调查过程中,我们分离到一株天然具有哺乳动物分子标记的禽源H9N2毒株A/chicken/Eastern China/SDKD1/2015（SDKD1/15）。该毒株在HA蛋白上存在可增强AIV对α-2,6-SA结合能力的226L和228S分子标记;同时在PB2蛋白上存在可增强AIV在哺乳动物细胞中复制能力的E627K突变。在体外实验中,SDKD1/15毒株具有双受体结合特性,在哺乳动物源细胞中的复制效率显着高于禽源细胞,表明对哺乳动物的适应性较好。在对小鼠致病性实验中,SDKD1/15虽然天然具有HA（226L和228S）和PB2-627K等哺乳动物分子标记,但仅可在小鼠个别器官中进行短暂的低滴度复制,对小鼠为低致病性（MLD50>107.5 EID50）。另外SDKD1/15可通过气溶胶的方式在鸡群中传播,具备在家禽中大流行的潜力;同时可通过气溶胶传播的方式感染豚鼠,具有较强的跨种间传播能力。综上所述,我们的研究表明虽然SDKD1/15毒株在一定程度上适应了哺乳动物,但还需要基因组其它未知位点的协助才能增强H9N2毒株对哺乳动物的致病性。2 H9N2毒株SDKD1/15在小鼠体内的适应性研究为了探究H9N2在哺乳动物体内的适应机制,我们将SDKD1/15毒株在小鼠肺脏中连续六次传代获得对小鼠致病性显着增强的SDKD1-P6毒株。相比于野生毒株,SDKD1-P6在全基因组中仅在HA蛋白上存在T187P,222-224位缺失（△222-224）和M227L突变,这些位点均位于受体结合区或邻近区域。通过反向遗传学实验发现△222-224单独突变以及T187P+M227L联合突变均可显着增强H9N2毒株在小鼠肺脏和气管中的复制水平和持续时间,以及对肺脏的病理损伤,从而增强对小鼠的致病性。在体外实验中,△222-224单独突变以及T187P+M227L联合突变均可显着增强H9N2毒株在感染哺乳动物细胞初期的复制水平,增强毒株在MDCK细胞中形成噬斑的能力。以上生物学特性的改变是由于HA蛋白突变（△222-224,T187P+M227L）可显着增强H9N2毒株对α2,6-SA受体的结合能力,以及对哺乳动物细胞和小鼠肺脏组织的亲和力。流感病毒的传播性同样和HA蛋白密切相关。△222-224单独突变以及T187P+M227L联合突变均不能使H9N2通过气溶胶的方式在豚鼠间传播,但T187P+M227L可使H9N2毒株具备在豚鼠间接触传播的能力。流感病毒对宿主的致病性是多基因共同作用的结果。我们的研究表明HA蛋白突变（△222-224,T187P+M227L）需和PB2-627K协同作用才能导致H9N2增强对小鼠的致病性,另外这种特性不只在母本毒株SDKD1/15中起作用,在其它H9N2毒株中可获得同样的结论,因此排除毒株特异性。综上所述,我们的研究新发现了 HA受体结合区及邻近区域位点变异协同PB2-627K增强H9N2对小鼠致病性,并阐明了致病机制,为防范H9N2病毒在未来可能存在的大流行提供了有价值的信息。3 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2亚型AIV对小鼠致病性的机制研究AIV在适应进化的过程中可自然发生氨基酸突变,但需要多个关键突变位点的积累才能使毒株具备跨种间传播和对宿主致病性增强的能力,因此很多重要的突变在毒株生物学特性改变之前不能被及时发现,导致应对大流行的滞后性。在本章的研究中我们发现同样具有PB2-627K分子标记的两株H9N2拯救毒株对小鼠的致病性存在显着差异,其中HA蛋白是导致这种差异的决定性因素。通过反向遗传学技术进行差异氨基酸的正向和反向单点突变,发现198N和198T分别可显着降低和增强H9N2毒株在小鼠肺脏中的复制水平以及对小鼠的致病性。198位氨基酸位于HA蛋白头部区域的190-helix区域,同时N198T突变导致HA蛋白糖基化位点数目的减少,因此该位点的改变可能影响毒株的受体结合特性。我们的研究表明198T和198N分别可显着增强和降低H9N2毒株对小鼠肺脏组织的亲和力,这或许是导致突变毒株对小鼠致病性不同的原因。流感病毒对宿主的致病性是多基因共同作用的结果,HA-198T同样需要和PB2-627K联合作用才能导致H9N2毒株增强对小鼠的致病性。另外198位氨基酸位点的改变不影响H9N2毒株的抗原性以及热稳定性。重要的是,可增强对小鼠致病性的198T分子标记在当前H9N2流行毒株中占绝对优势（93.82%）,表明H9N2对公共卫生安全的威胁较大。综上所述,我们的研究新发现了 HA蛋白受体结合区优势流行位点198T和PB2-627K协同作用可显着增强H9N2亚型AIV对小鼠的致病性,为防范未来可能存在的H9N2大流行提供了预警信息。4 HA蛋白受体结合区222-224位缺失增强H9N2亚型AIV对小鼠致病性的宿主因素分析决定病毒对宿主致病力强弱的因素包括两个方面:一个是病毒本身的特性,另一个是病毒感染后宿主所作出的应答。我们将感染rSDKD1-WT和rSDKD1-△222-224毒株的小鼠肺脏进行转录组和蛋白质组联合测序分析,发现HA蛋白△222-224突变使H9N2毒株诱导更多的宿主基因和蛋白差异表达。进一步的生物信息功能分析结果表明rSDKD1-△222-224诱导的差异基因/蛋白参与的免疫相关生物过程条目显着多于rSDKD1-WT毒株;KEGG通路分析结果显示rSDKD1-WT毒株诱导的少数差异基因/蛋白仅参与RIG-I-like受体信号通路,而rSDKD1-△222-224毒株诱导的差异基因/蛋白参与了几乎所有重要的免疫相关信号通路。我们进一步对这些天然免疫相关基因/蛋白的表达水平进行了分析,结果显示rSDKD1-△222-224毒株可使大部分蛋白/基因表达水平上调,个别下调。综上所述HA蛋白△222-224突变使H9N2毒株诱导了更广泛以及更强烈的免疫反应,异常的免疫应答导致了严重的肺脏病理变化,因此增强了对小鼠的致病性。
张瑾[2]（2019）在《新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究》文中指出研究背景:感染是引起新生儿死亡及严重后遗症的主要原因之一。其中,新生儿细菌性脑膜炎病死率高,即便恢复亦伴发神经系统损伤后遗症,为家庭和社会造成严重的负担。大肠杆菌K1（Escherichia coli K1,E.coli K1）是引发新生儿细菌性脑膜炎的主要病原体,超过80%患者是由该菌感染所致。外膜蛋白A（Outer membrane A,OmpA）是E.coli K1的关键致病因子,其胞外Loops在E.coli K1抵抗免疫系统的损伤并引发菌血症、入侵血脑屏障导致颅内感染过程中发挥决定性的作用。新生儿感染性肺炎是新生儿期最常见的感染性疾病和重要死亡病因,即使感染控制后亦可造成不可逆损伤,严重影响大脑和身体发育。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是引起新生儿感染性肺炎的三大主要病原菌之一。PA致病因子繁多,其中外毒素A（Exotoxin A,ETA）是PA发现最早、毒力最强、也是最经典的毒力因子。它主要通过细胞识别、跨膜转位和催化活性等过程发挥其细胞的致死效应,在PA引起的新生儿感染性肺炎中发挥重要作用。随着E.coli K1和PA耐药日趋严重,常规抗感染治疗手段已捉襟见肘。因此选择合适的抗体是治疗PA,尤其对耐药PA感染的是有效替代疗法。历史经验证明:疫苗是预防与控制病原菌流行、感染及致病的最佳科学手段;抗体是中和病原菌毒素、治疗感染性疾病的特效药物。若能成功研制针对E.coli K1 OmpA和PA ETA的特异性疫苗或抗体药物,必将有效控制上述细菌的传播和致病。因此本研究针对新生儿常见病原菌Ecoli.K1和铜绿假单胞菌的严峻防控形势,研究新型疫苗和抗体为核心的免疫干预策略和药物,以期为预防新生儿感染的发生、提高其救治水平打下基础。第一部分基于脑膜炎大肠杆菌K1外膜蛋白A胞外功能片段的纳米粒疫苗的研制研究目的:本研究针对新生儿细菌性脑膜炎常见病原菌Ecoli.K1的严峻防控形势,针对其关键毒力因子OmpA研制新型疫苗,以期为预防新生儿Ecoli.K1脑膜炎的发生、提高其救治水平打下基础。研究方法:1.本课题拟在前期发现Vo抗原具有良好的免疫保护效果的基础上,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly（1actide-CO-glycolide）PLGA）和壳聚糖（Chitosan,CS）为辅料,构建包裹Vo的纳米粒疫苗。以复乳溶剂挥发法和直接吸附法制备空白纳米粒,通过检测纳米粒的形态、粒径、分散性指数等重要参数,评价PLGA、丙酮、二氯甲烷及不同修饰方法对纳米粒的影响,筛选出空白纳米粒的最优处方;通过测定不同条件下纳米粒包裹Vo蛋白的包封率,获得最大载药量Vo纳米粒（Vo nanoparticles,VoNP）的最优处方;通过检测VoNP冻干前后的外观、形态学、粒径、电位、物理及化学稳定性等参数的变化,评价冻干工艺对VoNP质量的影响,获得VoNP的最佳制备工艺;按照最佳工艺制备VoNP,通过透射电镜、扫描电子显微镜和原子显微镜,粒度和电位分析仪,质谱仪等考察纳米粒疫苗的基本理化特征及其稳定性。2.以L929国家标准细胞毒性细胞为模型,评价VoNP的体外细胞毒性;以BALB/c小鼠为模型,肌肉注射VoNP后观察心、肝、脾、肺、肾组织病理改变,评价其体内毒性;将VoNP于0,7和14天三次免疫小鼠,检测血清中抗Vo特异性抗体的水平及类型,评价VoNP的免疫原性;致死剂量攻毒VoNP免疫后小鼠,观察小鼠生存率、体重变化情况评价VoNP的保护效果,亚致死剂量攻毒VoNP免疫后小鼠,观察脾、血细菌定植量,初步评价VoNP的免疫保护机制;将制备的VoNP4℃保存180天后按上述方法评价其免疫原性和免疫保护效果,与同样处理的Al（OH）3佐剂吸附的Vo疫苗相比较,评价VoNP长期稳定性。研究结果:1.纳米粒的最适配方为:以丙酮为溶剂壳聚糖修饰的PLGA纳米粒;VoNP的最大载药量为1mg,其包封率为59%;冻干过程（冷冻3h,干燥22小时）对VoNP的形态,粒径和分散性无明显影响;最佳工艺制备的VoNP的平均粒径为250.8±2.13 nm,分散性指数为0.09±0.01,电位为0.6110±0.0267 mV,VoNP呈球状、表面光滑,无明显聚集现象,分散性好;通过MALDI-TOF MS研究证实Vo蛋白在纳米粒疫苗中稳定存在;4℃放置180天的VoNP的粒径、分散性及Zeta电位未发生明显变化,稳定性良好。2.VoNP对L929细胞无明显细胞毒性作用;肌肉注射VoNP的BALB/c小鼠7天内无死亡及不良反应的发生情况,心、肝、脾、肺和肾脏器无明显病理组织学改变,表明VoNP对BALB/c小鼠无明显毒性作用;VoNP免疫小鼠后可引起较强的体液免疫应答反应,且其免疫应答类型以Th2型免疫应答为主。在攻毒保护实验中,VoNP的免疫能通过降低外周血及脾脏中的细菌定植,减轻体重变化等方式抵抗E.coli K1的感染,提高小鼠的生存率。通过动物实验证实长期保存（180天）VoNP不仅具有稳定的理化性质,且其免疫原性和免疫保护效果未见显着变化。表明,VoNP安全性较好,质量稳定。研究结论:本研究成功建立并优化了VoNP的制备工艺,获得了质量稳定、安全性较好的VoNP疫苗,动物实验表明该疫苗具有长期稳定的免疫原性和免疫保护效果,这些发现为进一步成功研发E.coli K1疫苗奠定了基础,并对促进新生儿脑膜炎E.coli K1感染的免疫干预策略研究具有重要的推动作用。第二部分抗外毒素A人免疫球蛋白在铜绿假单胞菌肺炎中的预防和治疗作用研究研究目的:本研究针对新生儿铜绿假单胞菌肺炎治疗的难题,研究以免疫球蛋白为核心的干预策略和药物,以期为预防新生儿PA感染的发生、提高其救治水平打下基础。研究方法:1.建立以Luminex技术为基础的抗ETA抗体浓度检测方法,检测320份健康的志愿者血清中ETA特异性抗体浓度;通过Protein A亲和层析法纯化含高效价ETA抗体的免疫球蛋白（Intravenous immunoglobulin,IVIG）;用L929细胞模型评价抗ETA抗体对ETA毒素的中和活性;对BALB/c小鼠腹腔注射抗ETA抗体,后予致死剂量的ETA攻毒小鼠,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的预防性保护效果,同时,通过亚致死剂量ETA攻毒小鼠,观察肝脏细胞因子及病理组织改变,探索其保护机制。2.BALB/c小鼠腹腔注射不同浓度的抗ETA抗体,1小时后致死剂量PA103菌气管注射攻毒小鼠,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的预防性保护效果,同时,通过亚致死剂量PA103菌攻毒小鼠,观察肺部细菌定植量和炎性病理改变,检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平等参数,探索其保护机制;致死剂量PA103菌气管注射攻毒BALB/c小鼠3小时后,腹腔注射不同浓度的抗ETA抗体,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的治疗效果,同时,通过亚致死剂量PA103菌攻毒小鼠,观察肺部细菌定植量和炎性病理改变,检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平等参数,探索其保护机制;将结合GST-ETA的固相载体与纯化得到含高效价抗ETA抗体IVIG共孵育,去除其中ETA特异性IgG,用上述方法评价其毒素中和活性,预防和治疗保护效果的变化,验证其保护效果的特异性。研究结果:1.本研究成功构建了表达ETA及其无毒突变体（mETA）的工程菌株,并纯化得到重组ETA毒素,其活性与天然毒素相当;建立了以Luminex技术为基础的抗ETA抗体浓度检测方法。检测320名健康志愿者血清中抗ETA抗体水平,发现抗ETA抗体平均浓度为98.7 ng/ml,最高可达918.24 ng/ml。其中血清抗ETA抗体浓度在099 ng/ml约占54%。通过Protein A亲和层析法,成功纯化得到含有高浓度抗ETA抗体的人免疫球蛋白,其SDS-PAGE纯度大于90%。2.通过L929细胞模型发现该抗ETA抗体能有效抑制ETA的细胞毒性,且具有浓度依赖的趋势;通过ETA毒素攻毒小鼠模型发现该抗体可阻断ETA导致的肝脏损伤,从而发挥良好保护效果;在急性PA肺部感染模型上发现,高效价的抗ETA免疫球蛋白可显着降低细菌在肺部的定植和炎症反应,从而发挥预防性及治疗性效应。此外,本研究发现单独使用兔抗ETA抗体或非特异性人IgGs亦可产生有限的保护效果。研究结论:本研究成功从健康的献血者中纯化得到高效价的抗ETA抗体的免疫球蛋白,其具有良好的毒素中和活性。动物实验发现该免疫球蛋白针对ETA毒素和PA急性肺部感染具有良好预防及治疗效果。这些结果为非抗生素预防和治疗PA肺部感染奠定了基础,对PA的防控提供了新的策略和方案,也为其它耐药细菌的免疫干预提供了范例。
沈晨光[3]（2018）在《乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究》文中指出季节性流感主要由乙型流感病毒和甲型流感病毒引起,流感的季节性流行每年在全球范围内造成大量的重症和死亡病例,可在局部范围内暴发疫情的乙型流感,约占流感总发病率的25%左右,其对人类健康造成的危害不容忽视。由于病毒种类的多样性和病毒表面抗原的高变性,当今流感疫苗和抗病毒药物对乙型流感的防治效果均不理想,研制乙型流感新型特效药物和疫苗意义重大。流感表面血凝素（Hemagglutinin,HA）蛋白为流感病毒包膜上最主要的膜蛋白,存在包括病毒受体结合位点（Receptor binding site,RBS）在内的多个病毒生命周期中必需的功能区,可诱导宿主产生多种类型的保护性抗体,是新型广谱抗流感药物和疫苗研究的主要靶蛋白。近几年来,流感HA广谱抗体的研发和广谱表位的鉴定,为流感高效抗病毒药物及疫苗的研制带来了新希望。研究显示,乙型流感HA蛋白RBS区存在广谱中和表位,但当前的乙型流感疫苗并不能诱导机体产生针对两种病毒亚系的广谱中和抗体。因此,乙型流感RBS区广谱中和表位是否较普遍存在,何种免疫方式能够刺激此类广谱表位在机体高效诱导跨亚系广谱中和抗体,识别RBS区保守表位的跨亚系中和抗体通过何种机制发挥抗病毒作用等科学问题均值得深入研究。本研究尝试了多种乙型流感RBS区广谱抗体诱导策略,通过活毒滴鼻序贯免疫策略,制备出一株IgG亚型的乙型流感RBS区广谱中和抗体C12G6。C12G6识别病毒RBS区高度保守表位,同已报道的乙型流感HA广谱单抗相比,具更优的体外抗病毒活性,为第一株发现的对Yamagata和Victoria亚系乙型流感均具血凝抑制（Hemagglutination Inhibition,HI）活性的抗体。在小鼠和雪貂动物保护模型中,C12G6显示出良好的体内抗病毒效果,具备一定的晚期抗病毒疗效,保护活性优于已报道的其他广谱中和单抗和流感抗病毒药物“达菲”,并同“达菲”联合使用具协同抗病毒效果。Cl2G6所具备的多种高效抗病毒机制解释了其良好的体内外抗病毒活性的原因,其可通过直接抑制病毒感染细胞、抑制病毒子代释放、抑制病毒基因组释放、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（CDC）协同抑制病毒,值得关注的是,C12G6为目前发现的抗病毒机制最多样化的流感广谱抗体。乙型流感病毒不断变异,C12G6虽具备良好的抗病毒反应性,但其逃逸突变病毒株仍随时可能进化产生,开发由多种类型乙型流感广谱单抗联合组成的抗病毒鸡尾酒药物,可大大降低因病毒逃逸突变使药物失效的风险。为诱导不同类型的乙型流感RBS区广谱中和单抗,本研究发现,对于乙型流感活毒滴鼻免疫,IgM亚型抗体含量高的免疫初期血清,其抗病毒反应谱强于IgG亚型抗体含量高的免疫后期血清,提示IgM亚型抗体可能具备更为广谱的抗病毒反应性。据此,本研究制备出数株具高效效抗病毒活性的乙型流感RBS区广谱中和单抗,其中抗病毒活性最优的IgM亚型RBS区广谱抗体C7G6-IgM,可高效抑制所有测试病毒对细胞的感染,其体外抗病毒谱和活性均大大优于包括C12G6在内的本研究中的和已报道的所有乙型流感HA广谱中和抗体,并在小鼠和雪貂动物模型上显示出了良好的抗病毒保护活性。上述研究结果表明,乙型流感病毒RBS区确实存在跨亚系广谱表位,但常规的免疫策略很难激发机体产生针对此类表位的有效应答,活毒滴鼻序贯免疫策略是诱导此类表位产生应答的有效手段,为乙型流感通用疫苗的设计提供重要科学依据;本研究筛选到针对乙型流感RBS表位区的多个广谱中和单抗,证明识别乙型流感RBS区广谱中和单抗具备多种抗病毒作用机制,为乙型流感新型抗病毒药物的研制提供科学依据;本研究还发现识别乙型流感RBS区特定表位的IgM亚型抗体,可高效抑制多亚系病毒感染细胞,提示IgM亚型抗体的研究可为高变异病原体提供新的防控手段。
张坤[4]（2017）在《大麦条纹花叶病毒γb蛋白在病毒复制和运动中的新功能解析》文中研究说明病毒的基因组相对较小,蛋白编码能力有限,而病毒的侵染、复制、移动、致病等过程均需要一种或者几种病毒蛋白的直接参与。在寄主与病毒长期地共进化过程中,病毒蛋白逐渐进化出同时具有多种功能的特性,并参与病毒侵染循环的不同过程。大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus,BSMV）是一种ss（+）RNA病毒,基因组由α、β和γ3条RNA链组成。RNAα编码的αa蛋白具有解旋酶（HEL）和甲基转移酶（MET）结构域,是病毒的复制酶大亚基;RNAβ编码病毒的外壳蛋白CP和病毒的运动相关蛋白TGBs,RNAy编码的γa具有保守的GDD基序,是病毒的复制酶小亚基。γb是一个分子量为17 kDa的富含半胱氨酸的蛋白,具有致病决定因子、种传相关因子、本生烟上的系统运动决定因子和基因沉默抑制子等多种功能,但其与BSMV其它蛋白间的相互作用并协同调控病毒的复制和运动的研究尚未见报道。前人的研究表明,在BSMV侵染的条件下γb蛋白主要定位于细胞质中,部份能特异性的定位于叶绿体上,但是关于其叶绿体定位的生物学功能却是未知的。为此,利用瞬时表达、Pumilio为基础的ssRNA可视化定位系统、dsRNA可视化定位系统等,在激光共聚焦显微镜（CLSM）下观察到病毒的复制酶αa和γa、病毒的（+）RNA、复制过程中产生的（-）RNA及dsRNA复制中间体均能定位于叶绿体,通过实验证据明确了叶绿体是BSMV的主要复制位点。通过酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）及免疫共沉淀（Co-IP）等技术,首次证明γb蛋白与复制酶αa在体内直接互作,yb被αa招募至病毒的复制位点,互作的关键区域分别为yb蛋白的coiled-coil区（aa 86-127）和复制酶αa的甲基转移酶结构域（aa 1-834）。通过分析γb蛋白缺失或者突变后病毒的复制积累量,以及顺式或反式表达番茄丛矮病毒（TBSV）抑制子p19均不能回补由于γb蛋白的缺失或者突变造成的BSMV复制缺陷等实验,首次发现γb蛋白具有促进病毒复制的新功能,且该功能与其基因沉默抑制子的活性关系不大;通过体外dsRNA解旋酶活性等实验证明γb蛋白促进复制酶αa的解旋酶活性,且该促进作用完全依赖于其ssRNA结合活性。γb蛋白通过与复制酶αa直接互作被招募至BSMV主要复制场所叶绿体、以及作为解旋酶增强子促进病毒复制这些新功能的发现增加了我们对病毒编码的基因沉默抑制子多功能性的进一步认识。作为在本生烟上的系统运动决定因子,γb蛋白参与BSMV运动的具体形式及其调控机制并不清楚。通过分析缺失γb蛋白的BSMV突变体在本生烟和大麦上的运动效率及其致病性,证明了BSMV在不同的寄主植物的运动中对于γb蛋白的需求是不同的,即双子叶植物本生烟需要γb参与,而单子叶植物大麦上却不需要,这可能与植物的维管束组织存在差异有关;利用Y2H及BiFC证明了 γb蛋白与病毒的运动蛋白TGB2发生互作;Co-IP实验证明了 γb蛋白是病毒核糖核蛋白（Ribonucleoprotein,RNP）运动复合物的组分;最后,通过CLSM观察发现,缺失γb蛋白的病毒突变体在本生烟上表现出胞间运动受阻的现象。这些实验初步证明了 γb蛋白能与运动蛋白TGB2于微丝或内质网上互作,并可能作为病毒RNP运动复合物的组分来促进BSMV的胞间运动。γb蛋白促进BSMV复制和运动新功能的发现有助于我们深刻理解病毒编码的基因沉默抑制子和富含半胱氨酸的小病毒蛋白的多功能性。
杜玮[5]（2016）在《SpiB在肺癌发生发展中的功能及调控研究》文中进行了进一步梳理目的:转录因子SpiB是ETS家族蛋白的成员之一,主要表达于淋巴细胞中,对B细胞的发育和成熟、T细胞的发育以及浆细胞样树突细胞的生存和发育起到了重要作用。SPIB基因敲除的小鼠不仅导致了T细胞依赖的抗原激活的缺陷,阻断了Ig G1、Ig G2a和Ig G2b的产生,而且严重影响了生发中心的形成和维持。SPIB与它的同族蛋白PU.1双基因敲除的小鼠会发生pre-B细胞急性淋巴细胞白血病。在实体肿瘤中,已经发现在结肠癌、肝癌和胃癌中SpiB的表达显着升高,但只是基于临床样本的免疫组化结果,究其功能以及作用的分子机制仍然不是很清楚。本论文中,我们发现SpiB在肺癌中异位表达,并深入研究了该蛋白异位表达的功能及作用的分子机制,明确其表达的高低与肺癌转移的相关性,进而判断该蛋白是否能成为肺癌患者诊断和治疗的分子靶点。本研究将丰富人们对肺癌转移调控网络的理解,为临床肺癌的诊断和治疗提供新的途径。方法:1、利用RNA-seq比较了小细胞肺癌H209和非小细胞肺癌A549表达谱的差异,发现小细胞肺癌中一系列淋巴细胞特异性转录因子被上调,其中包括SpiB;通过免疫组化检测SpiB在肺癌组织中的表达情况,并分析其表达水平与肺癌患者预后的相关性。2、利用小鼠皮下注射实验、细胞侵袭、Soft agar、三维培养等实验探讨SpiB表达水平的变化是否会引起细胞生物学行为的改变,进而判断SpiB异位表达的功能。3、采用基因芯片技术,分析A549过表达SpiB所引起的基因表达谱的变化,找到其所调控的信号通路和靶点基因,并进行回复实验,进一步验证SpiB调控的靶点基因。4、通过3C、Ch IP、Luciferase assay等实验研究SpiB对下游基因调控的分子机制。结果:1、淋巴细胞特异性转录因子SpiB在肺癌中异位表达通过对临床肺癌组织的检测,发现转录因子SpiB异位表达于肺癌中,并与肺鳞癌患者的预后呈显着负相关（p<0.05）。2、SpiB通过下调细胞紧密连接蛋白Claudin-2（CLDN2基因编码）,促进了肺癌的转移与侵袭在不表达SpiB的鼠肺癌细胞LLC1中导入该蛋白之后进行小鼠皮下注射,其肺转移能力较对照组显着增强;过表达SpiB于A549细胞可以改变细胞的生长状态,Soft agar培养中细胞团变得松散,Matrigel三维培养中细胞呈葡萄样的克隆;下调SpiB于H209细胞可使悬浮细胞生长更加紧密。基因芯片的结果显示SpiB可以显着下调Tight junction相关基因的表达,以及上调转移相关基因MMP9等的表达。将Tight junction主要蛋白Claudin-2过表达于A549细胞能够回复SpiB引起的三维培养的表型。体内小鼠实验中,过表达Claudin-2于LLC1细胞可以显着抑制SpiB促肿瘤转移的能力。这说明SpiB主要是通过抑制Claudin-2的表达来促进肿瘤的转移。3、SpiB通过直接结合CLDN2上游顺式调控元件S1,介导S1与启动子的相互作用,从而抑制了CLDN2基因的转录ChIP检测表明SpiB在CLDN2基因上游有多个结合位点,这些结合位点也是DNase I超敏感位点,是潜在的顺式调控元件。经3C实验验证SpiB可以介导S1与启动子的直接相互作用。通过Luciferase assay和EMSA实验表明S1是基因的沉默子,SpiB直接结合于S1序列上。结论:本论文发现淋巴细胞特异性转录因子SpiB在肺癌中异位表达,SpiB结合于紧密连接蛋白CLDN2基因上游的抑制子S1,介导S1与CLDN2基因启动子的相互作用,抑制CLDN2表达,从而破坏了细胞间的紧密连接,促进肿瘤细胞转移。这一结果进一步证实实体肿瘤细胞可以利用淋巴细胞特异性转录因子,模仿淋巴细胞的低粘附性,实现远端转移。这些研究结果丰富了人们对实体肿瘤转移调控网络的理解,为肺癌的诊断和治疗提供了新的思路与方法。
惠琦[6]（2014）在《靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应》文中研究指明恶性黑色素瘤是恶性肿瘤中发病率增长最快的一种，目前仍没有找到治疗转移性黑色素瘤最为有效的方法。重组毒素由于具有特异性高、细胞毒性强的特点，有望成为黑色素瘤（辅助）治疗的有效方法之一，特别是对转移性黑色素瘤的治疗可能是最好的方式。本研究利用恶性黑色素瘤细胞表面MC1R的结合位点为正常细胞及其它肿瘤的几十倍的巨大差异，并利用促黑色素细胞激素（Melanophore-stimulating hormone, α-MSH）可特异性的与恶性黑色素瘤表面的MC1R结合的特性，将α-MSH作为恶性黑色素瘤特异的靶向载体；将绿脓杆菌外毒素PE作为免疫毒素的毒性部分用于杀伤靶细胞，构建了重组毒素MSH-PE38KDEL，以基因工程方式表达黑色素瘤靶向免疫毒素。重组毒素MSH-PE38KDEL的构建与表达。本研究通过生物信息学分析，优化MSH与PE40的链接Linker，确保各自的结构与功能不受影响；然后对PE40进行修饰，降低其免疫原性（PE38），并增加其活性（PE38KDEL）；构建了MSH-PE38KDEL基因，将其连接到pET28a、pHis1525表达载体上，构建了pET28a-MSH-PE38KDEL、 pHis1525-MSH-PE38KDEL重组质粒，分别在Rosegami、WH320表达宿主菌内进行了表达，经SDS-PAGE分析及活性测定，最终筛选了高表达且具有生物活性的重组质粒pET28a-MSH-PE38KDEL。将序列鉴定正确的重组质粒转化入Rosetta-gamiTM2（DE3），IPTG诱导目的蛋白表达。以SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。同时用凝胶成像分析系统配套软件对MSH-PE38KDEL融合蛋白的表达量进行分析，证明其表达量可占全菌体的10%。重组毒素MSH-PE38KDEL的纯化。利用Western blot对超声破碎后菌体进行分析证明融合蛋白为可溶性表达。对表达后蛋白采用了菌体超声破碎、离心、疏水层析、离子交换及分子筛层析等纯化手段， SDS-PAGE分析MSH-PE38KDEL的纯度，其纯度可达90%以上。重组毒素MSH-PE38KDEL的体外抗黑色素瘤活性。采用α-MSH受体高表达的人黑色素瘤A875细胞及鼠黑色素瘤B16细胞进行了体外生物活性试验，同时以α-MSH受体低表达的鼻咽癌细胞CNE、乳腺癌细胞MCF及人正常细胞2BS做对照，证明其靶向杀伤作用。MTT检测MSH-PE38KDEL对黑色素瘤细胞A875及B16的杀伤作用在85%以上，而对人正常细胞2BS无杀伤作用。重组毒素MSH-PE38KDEL的体内抗黑色素瘤活性。以鼠黑色素瘤B16细胞在NIH/nu裸鼠体内建立黑色素瘤高转移动物模型。采用了瘤周围注射及静脉注射两种给药途径，对荷瘤小鼠进行治疗。结果显示以MSH-PE38KDEL1.1mg/只连续注射10天，可显着抑制肿瘤生长，其抑瘤率＞90%，且瘤周注射组肿瘤消失率为30%，静脉注射组肿瘤消失率为40%。病理切片HE染色结果显示MSH-PE38KDEL有效抑制了黑色素瘤B16细胞的肝内转移；电镜观察肝脏超微结构结果显示，MSH-PE38KDEL抑制了黑色素瘤B16细胞对机体细胞的破坏作用。重组毒素MSH-PE38KDEL在体内具有明显的抗黑色素瘤的效应，毒副作用低，病理及电镜结果显示对实质脏器均未见损伤。MSH-PE38KDEL有望成为靶向治疗黑色素瘤的候选药物。
冯越[7]（2013）在《抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗的研究》文中指出在烧伤患者中绿脓杆菌的检出率高居各种感染菌首位,绿脓杆菌所产生的致死性毒素绿脓杆菌外毒素A（PEA）是引起患者死亡的主要原因。现有的针对PEA的治疗方法主要分为主动免疫和被动免疫两种形式,但应用异源动物血清治疗,可能造成严重过敏反应,加之绿脓杆菌具有天然耐药性以及广谱抗生素的泛滥使用,使得多重耐药绿脓杆菌感染的情况日益严重。PEA毒素具有受体结合区、越膜区和毒性区,毒素由受体结合区与细胞表面广泛存在的受体结合,通过越膜区将毒性区转入细胞内发挥ADP核糖基化酶作用,使EF-2发生ADP核糖基化,失活EF-2,阻止细胞蛋白质合成,造成细胞死亡和组织、器官衰竭。所以抑制毒素与受体结合是保护细胞的重要环节。热休克蛋白（HSP）是一种高度保守且具有分子伴侣功能的应激性蛋白,同时具有增强免疫的生物学特性：通过模式识别受体激活效应细胞产生应答反应。因此本研究利用基因工程手段将PEA中序列高度保守、免疫原性突出的受体结合亚基与结核杆菌HSP65融合表达,经发酵罐高密度发酵并层析纯化获得融合蛋白HSP65-PEA,作为免疫原对实验动物进行免疫,经小鼠攻毒保护性实验,进行免疫效果评估。同时建立多克隆和单克隆ELISA抗体检测方法及鼠、兔抗体水平的ELISA检测方法。结果证明重组蛋白HSP65-PEA在大肠杆菌中获得高效表达,纯化获得纯度为95%以上的重组蛋白,用其免疫后小鼠能够产生足量滴度的保护性抗体,保护动物耐受PEA毒素攻击,在机体中可以产生对抗PEA毒素的能力,以5、10倍LD50致死剂量的天然精致PEA毒素攻击小鼠,同时ELISA检测抗体滴度,结果显示无佐剂组产生抗体滴度高于弗氏佐剂组和铝盐佐剂组,其攻毒保护率达到70-100%,证明该融合蛋白HSP65-PEA作为免疫原产生的抗体具备了保护PEA毒素攻击的能力,充分达到实验预期目的。综上所述,构建获得的高效融合表达蛋白HSP65-PEA具有很强的免疫原性,能够刺激机体产生高滴度的中和抗体,在体内中和感染的PEA毒素,防止毒素的侵袭和细胞毒性作用,同时证明结核杆菌HSP65可以作为自体佐剂,发挥抗原提呈和加强作用,抗体水平优于外来佐剂,避免了外来佐剂的不良反应,大大提高了蛋白的安全性。
宋杰[8]（2013）在《重组毒素rG17PE38的表达、纯化及胃癌杀伤作用研究》文中研究指明胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，是中国的第二大常见肿瘤。全球每年约有100万新增胃癌患者，同时有80万患者死亡。中国胃癌发病率占全世界的42%，死亡率占35%，是世界平均水平两倍多。我国早期胃癌的检出率平均为10%，90%中晚期胃癌的5年生存率不足20%；手术是目前唯一根治胃癌的方法，但只有不足1/3的人能够进行手术治疗，而且这1/3的病人也不是纯粹的早期胃癌，对于中晚期病人除进行手术治疗外常配合化疗、放疗等治疗手段；但化疗和放疗副作用太大，往往严重破坏患者的免疫系统。很多肿瘤的抗药性越来越严重，加大了治疗的困难。目前进行的疫苗等生物治疗尝试，尚未获得理想结果。本实验以反向17肽胃泌素为导向单元设计抗胃癌靶向药物，在此基础上优化表达条件、进行重组毒素的纯化，并进行细胞杀伤实验确证该重组毒素的癌细胞靶谱，以期为临床实验病例筛选和个性化治疗方案设计提供指导。胃癌发生时，肿瘤细胞膜上胆囊收缩素受体（CCK-2R）表达量与亲和力都明显增加，而正常组织不表达或表达量极低，形成几十至上千倍的差异，表明CCK-2R高表达与胃癌发生及恶化程度有关。本实验利用基因工程手段分别将正向与反向的17肽胃泌素与截短并修饰的绿脓杆菌外毒素（PE38KDEL）进行重组，制备胃癌靶向免疫毒素。大肠杆菌表达所得以反向胃泌素片段为导向单元的重组毒素rG17PE38对BGC-823、MGC-803与SGC-7901胃癌细胞系具有很好的杀伤作用，western blot证明其可被抗人胃泌素抗体及抗PE38抗体识别。密码子偏爱性是原核表达中最重要的一个影响因素，为便于蛋白纯化及下游实验，本文先后对靶基因进行了两次优化，最终获得一株高表达重组菌株Rosetta（DE3）（pET-rG17PE38），表达量可达全菌体蛋白的40%以上，28.7℃诱导时绝大多数目的蛋白以可溶形式表达；然而高表达只能在试管摇培条件下获得，三角瓶诱导不表达，遇到表达体系无法放大的问题。经培养基筛选及组分优化后，获得适合三角瓶生产的发酵条件：1%接种量接种SOB培养基，OD值约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG，28.7℃继续培养4h。由于该蛋白自身的特性，常规方法纯化得率太低；本文以切胶回收方式制备免疫原，足垫免疫Balb/C鼠，以LHRH-PE38为检测原筛选杂交瘤细胞株；获得3株稳定分泌PE38单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中3B9株分泌抗体呈现良好的醇洗脱反应性；温和条件下即可与PE38识别与解聚，最佳洗脱条件为50mM Tris-HCl, pH7.9,850mM NaCl,40%propyleneglycol,1mM EDTA。将辛酸-硫酸铵法纯化的3B9抗体与CNBr活化的Sepharose4FF介质偶联，制备PE38的亲和层析柱；同时优化组合硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换层析等纯化条件，最终获得纯度达92%以上的rG17PE38蛋白。对包括BGC-823、MGC-803、SGC-7901胃癌细胞，LOVO、HCT-8、SW480、SW620、Caco-2、SW116结肠癌细胞及PANC-1胰腺癌细胞在内的30余株细胞进行靶向杀伤实验；并利用CCK-8试剂盒，测定该免疫毒素对各细胞的IC50值。结果表明，rG17PE38对胃癌细胞具有靶向特异的杀伤活性，对部分结肠癌细胞有细胞毒作用，对其它癌细胞及正常细胞没有明显毒性。本文制备的rG17PE38重组毒素分子量小、靶向性好，其rG17单元可执行酰胺化胃泌素的靶向功能；细胞毒试验证实对胃癌细胞杀伤活力强，对正常细胞毒性小，具有良好的应用前景和坚实的科学基础，有可能成为胃癌非手术性治疗方法，为转移性或扩散性胃癌的生物性治疗开辟新途径。
郭德军[9]（2012）在《靶向肿瘤重组毒素IL6T23-PE38KDEL的表达、纯化及其生物活性的研究》文中指出肿瘤疾病已成为人类的第一杀手，对于恶性肿瘤目前还缺少较为理想的药物，利用细胞因子及其受体介导杀伤癌细胞是癌症靶向治疗的一个策略。根据IL-6R在一些肿瘤细胞表面过表达，而正常细胞表面数量极少表达或不表达的事实，我们利用基因工程原理和分子生物学技术，将截短的IL6的基因与绿脓杆菌外毒素变体PE38KDEL的基因相偶联，构建了重组毒素IL6T23-PE38KDEL的原核表达载体和酵母表达载体，并分别在大肠杆菌和毕赤酵母中实现了重组毒素的活性表达；同时初步建立了该重组毒素的纯化工艺，其体外和体内抗肿瘤生物学活性表明，重组毒素IL6T23-PE38KDEL在体内和体外具有明显的靶向抗肿瘤活性，为其进一步开发提供技术和理论支持。重组毒素IL6T23-PE38KDEL的构建与表达。利用PCR技术，将N端截去23个氨基酸的IL6基因与改造的绿脓杆菌外毒素PE38KDEL基因相连接，成功构建了重组毒素IL6T23-PE38KDEL的基因。然后将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a和pET-22b上，构建了大肠杆菌表达质粒28a-IL6T23-PE38KDEL和22b-IL6T23-PE38KDEL，重组毒素IL6T23-PE38KDEL在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达，可溶性表达的重组毒素IL6T23-PE38KDEL具有选择性细胞毒；28a-IL6T23-PE38KDEL表达量高于22b-IL6T23-PE38KDEL，28℃表达时可溶性重组毒素占可溶蛋白总量的12.9%。28a-IL6T23-PE38KDEL在改良ZYM-5052培养基中可实现高密度自诱导表达，菌体密度与IPTG诱导的LB培养基相比，可提高4倍，目的蛋白占菌体上清蛋白总量的11.7%，这为利用醇溶性单抗纯化该重组蛋白奠定了基础。成功构建了巨大芽胞杆菌pHis-IL6T23-PE38KDEL重组质粒，但重组巨大芽胞杆菌在培养基中分泌表达的重组毒素IL6T23-PE38KDEL无细胞活性。利用密码子优化的IL6T23-PE38KDEL基因，成功构建了甲醇酵母pPICZ-IL6T23-PE38KDEL重组质粒，并在毕赤酵母GS115中获得分泌性表达，表达产物具有选择性细胞活性，但表达量较低。重组毒素的纯化。利用包涵体复性技术和层析技术，建立了利用大肠杆菌制备重组毒素IL6T23-PE38KDEL的纯化工艺。大肠杆菌表达的重组毒素的包涵体，经洗涤、复性、Q Bio-sep HP和MonoQ层析和多粘菌素B除内毒素等步骤，制备了高纯度、具有细胞活性的重组毒素IL6T23-PE38KDEL，为体外和体内抗肿瘤试验奠定了基础。重组毒素的体外抗肿瘤活性。初步建立了重组毒素IL6T23-PE38KDEL体外抗肿瘤谱；IL6T23-PE38KDEL可特异性杀伤骨髓瘤细胞、髓系白血病细胞、肝癌细胞，而对其他供试细胞无效，并使用MTT法测定了敏感细胞的半致死剂量；重组毒素的半致死剂量在同系细胞间表现为明显的IL6R数量依赖关系，非同系细胞间无受体数量依赖关系。IL6T23-PE38KDEL与IL6R受体的结合时间在1530min之间。IL6可竞争阻断IL6T23-PE38KDEL的细胞毒性，当IL6浓度达到IL6T23-PE38KDEL二倍以上时，其阻断效果明显增加。重组毒素的体内抗肿瘤活性。在小鼠腹腔瘤模型的静脉给药治疗试验中，重组毒素IL6T23-PE38KDEL在体内表现出明显的抗肿瘤效应，能明显延长荷瘤鼠的生存期；高剂量组与对照组相比延长荷瘤鼠的生存期6.6d，肿瘤完全消退率为30%，治疗效果在组间表现出明显的剂量依赖关系。在小鼠腹腔瘤模型的腹腔给药治疗试验中，介入给药表现为强烈的抗肿瘤效果，肿瘤完全消退率为70%，有效率为100%，肿瘤转移抑制率100%。重组毒素IL6T23-PE38KDEL在体内具有明显的抗肿瘤效应，毒副作用低，对其他实质性脏器未见明显损伤，仅表现为转氨酶轻度升高和红细胞数略微下降，可能成为一个潜在的抗肿瘤候选药物。
王幸兴[10]（2011）在《绿脓杆菌外毒素A基因的密码子优化、脱毒改造及其特性研究》文中提出绿脓杆菌外毒素A（Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA）是由假单胞菌属绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）分泌的一种细胞毒性外毒素,是绿脓杆菌重要的致病因子。PEA的ADP-核糖基转移酶活性能使靶细胞的延伸因子-2（EF-2）发生核糖基化而失活,导致蛋白质的生物合成受阻,从而对细胞产生毒性作用。利用PEA的这一毒性作用,将其与靶向蛋白（抗体或靶细胞膜受体配基）连接或融合制成的免疫毒素被广泛用于癌症的靶向治疗。PEA除具有上述细胞毒性作用外,还具有较强的免疫原性,它不仅可作为疫苗蛋白,也是一种重要的疫苗佐剂和疫苗载体。然而由于天然PEA的细胞毒性较强,不能直接作为疫苗佐剂和载体应用于疫苗的生产,必须通过基因工程方法对其进行基因改造使其毒性降低或完全脱毒才能应用。为提高PEA基因在大肠杆菌中的表达水平和获得脱毒的PEA基因,我们首先利用PCR方法从本实验室构建的含有PEA基因的pcDNA3.1/PEA质粒中扩增PEA基因,然后依据该基因的序列,利用大肠杆菌偏爱的密码子对PEA编码基因进行了全序列优化改造并人工合成,然后利用pET20b（+）质粒分别构建其与His标签融合的野生型和密码子优化型的PEA原核表达载体pET20b-PEAwt/His和pET20b-PEAopt/His。将表达载体分别转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,经IPTG诱导使其进行分泌表达。采用硫酸镁休克的方法从细菌周质中分离表达的重组PEA蛋白,用Ni-NTA琼脂糖进行纯化,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组PEA蛋白,用考马斯亮蓝显色法检测PEA蛋白的浓度,并比较野生型和密码子优化型PEA的表达水平。然后以构建好的pET20b-PEAopt/His质粒为模板,根据PEA蛋白的结构特点,在PEA蛋白的氨基酸序列中选定若干位点,通过核苷酸介导的定点突变方法对选定位点氨基酸的编码基因进行定点突变,从而得到若干PEA突变体的原核表达载体。将各种突变体表达载体转化大肠杆菌进行表达,用与上述同样的方法分离纯化和鉴定重组PEA蛋白。最后利用小鼠成纤维细胞L929检测不同PEA突变体对细胞的毒性作用,从中筛选出毒性低的PEA突变体。实验结果表明,经过密码子优化,PEA编码基因发生402个碱基的取代,GC含量由原来的69.8%降至52.2%,下降了33.7%。蛋白表达结果显示,密码子优化型PEA的表达量（78.7±2.5 mg/L）明显高于未优化的表达量（39.0±2.0 mg/L）（P<0.01）,表达水平提高了近1倍。细胞毒性实验表明,密码子优化的PEA基因制备的重组蛋白对培养的动物细胞L929有明显的毒性作用,说明该蛋白具有天然生物活性。经过定点突变得到的12个PEA基因突变体,经SDS-PAGE检测证实不同PEA突变体基因均能在大肠杆菌中进行分泌表达。表达的PEA重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖纯化,作用于L929细胞显示出不同的细胞毒性,通过比较得出12个低细胞毒性的PEA突变体,并最终从中选取3个毒性较低的突变体用于下一步的研究,从而为PEA蛋白在疫苗佐剂与载体上的研究和应用奠定了基础。
二、重组PEA受体结合区蛋白的免疫活性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组PEA受体结合区蛋白的免疫活性（论文提纲范文）
（1）HA蛋白受体结合区及邻近区域适应性变异协同PB2-627K增强H9N2亚型禽流感病毒对小鼠致病性的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述一 禽流感病毒的跨种间传播 |
| 综述二 当前我国H9N2亚型AIV的流行现状以及对公共卫生安全的威胁 |
| 第1章 天然携带哺乳动物分子标记的H9N2病毒SDKD1/15株生物学特性测定 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 毒株和细胞 |
| 1.2.2 实验动物 |
| 1.2.3 主要试剂和仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 病毒RNA提取和反转录 |
| 1.3.2 病毒全基因组测序 |
| 1.3.3 病毒的空斑纯化 |
| 1.3.4 病毒各基因片段的遗传进化分析 |
| 1.3.5 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定 |
| 1.3.6 细胞半数感染量(TCID_(50))的测定 |
| 1.3.7 鸡多抗血清的制备 |
| 1.3.8 鸡静脉接种致病指数(IVPI)的测定 |
| 1.3.9 病毒的受体结合能力测定 |
| 1.3.10 病毒在不同细胞中的生长动力学测定 |
| 1.3.11 病毒对BABL/c小鼠的致病性 |
| 1.3.12 病毒在鸡群中气溶胶传播能力测定 |
| 1.3.13 病毒通过气溶胶方式进行跨种间传播能力的测定 |
| 1.3.14 应用Tapman探针荧光定量PCR方法测定病毒核酸拷贝数 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 SDKD1/15株遗传进化分析 |
| 1.4.2 SDKD1/15株关键氨基酸位点分析 |
| 1.4.3 SDKD1/15株基本生物学特性的测定 |
| 1.4.4 SDKD1/15株受体结合能力测定 |
| 1.4.5 SDKD1/15株在不同细胞中的生长动力学 |
| 1.4.6 SDKD1/15株对小鼠的致病性 |
| 1.4.7 SDKD1/15株可通过气溶胶的方式在鸡群中传播 |
| 1.4.8 SDKD1/15株可通过气溶胶的方式发生跨种间传播 |
| 1.5 讨论 |
| 第2章 H9N2毒株SDKD1/15在小鼠体内的适应性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 毒株,细胞和质粒 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 主要试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 SDKD1/15毒株在BALB/c小鼠肺脏中连续传代 |
| 2.3.2 鼠适应株病毒的纯化 |
| 2.3.3 鼠适应株和母本病毒的全基因序列比对 |
| 2.3.4 HA蛋白三维结构模拟 |
| 2.3.5 质粒的构建 |
| 2.3.6 质粒的点突变 |
| 2.3.7 野生毒株和点突变毒株的拯救 |
| 2.3.8 拯救的野生毒株和突变毒株基本生物学特性测定 |
| 2.3.9 病毒对小鼠的致病性实验 |
| 2.3.10 病毒的受体结合特性测定 |
| 2.3.11 病毒在不同种属细胞中的生长动力学测定 |
| 2.3.12 病毒对不同种属细胞的吸附能力测定 |
| 2.3.13 病毒对不同种属组织的吸附能力测定 |
| 2.3.14 病毒在细胞上形成噬斑能力的比较 |
| 2.3.15 病毒在豚鼠中的传播实验 |
| 2.3.16 病毒的热稳定性实验 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 鼠适应株的获得 |
| 2.4.2 野生毒株和鼠适应株全基因序列比对 |
| 2.4.3 各点突变病毒的拯救和鉴定 |
| 2.4.4 影响H9N2毒株对小鼠致病性的关键氨基酸位点的确定 |
| 2.4.5 点突变对HA蛋白三维结构的影响 |
| 2.4.6 HA突变增强H9N2毒株对小鼠的致病性以及在体内的复制 |
| 2.4.7 突变毒株在不同种属细胞中的生长动力学 |
| 2.4.8 突变毒株在豚鼠中的传播特性 |
| 2.4.9 突变毒株的受体结合特性分析 |
| 2.4.10 突变毒株对不同种属细胞的吸附能力 |
| 2.4.11 突变毒株对不同种属组织的吸附能力 |
| 2.4.12 突变毒株在细胞上形成噬斑的能力 |
| 2.4.13 突变毒株的热稳定性 |
| 2.4.14 HA蛋白点突变和PB2-627K协同作用导致H9N2对小鼠致病性增强 |
| 2.4.15 HA蛋白点突变和PB2-627K协同作用增强H9N2病毒对小鼠的致病性具有普适性 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2亚型AIV对小鼠致病性的机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 毒株,细胞和质粒 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂和仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 HA蛋白序列的比对分析 |
| 3.3.2 糖基化位点分析 |
| 3.3.3 HA蛋白三维结构模拟 |
| 3.3.4 点突变质粒的构建 |
| 3.3.5 重组病毒和点突变病毒的拯救 |
| 3.3.6 拯救的野生毒株和突变毒株基本生物学特性测定 |
| 3.3.7 探究H9N2病毒HA基因片段对小鼠毒力的影响 |
| 3.3.8 探究影响H9N2病毒对小鼠致病性的HA关键位点 |
| 3.3.9 HA蛋白198位氨基酸突变毒株在小鼠体内的复制动力学 |
| 3.3.10 小鼠肺脏病理切片的制作和观察 |
| 3.3.11 受体结合偏嗜性和亲和力检测 |
| 3.3.12 HA蛋白198位氨基酸突变毒株对不同种属组织的亲和力分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 重组和点突变病毒的生物学特性 |
| 3.4.2 HA基因互换影响H9N2毒株对小鼠的致病性 |
| 3.4.3 SDKD1/15和AH320/15毒株的HA蛋白氨基酸位点差异 |
| 3.4.4 SDKD1/15和AH320/15毒株HA蛋白三维结构预测 |
| 3.4.5 SDKD1/15和AH320/15毒株HA蛋白糖基化位点预测 |
| 3.4.6 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2毒株对小鼠的致病性 |
| 3.4.7 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2病毒在小鼠各脏器中的复制 |
| 3.4.8 HA蛋白受体结合区198位变异影响小鼠肺脏的病理变化 |
| 3.4.9 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2病毒的受体亲和力 |
| 3.4.10 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2病毒和不同种属组织的吸附能力 |
| 3.4.11 HA蛋白受体结合区198T和PB2-627K协同作用影响H9N2毒株对小鼠的致病性 |
| 3.4.12 HA蛋白受体结合区198位变异不影响H9N2毒株的热稳定性 |
| 3.4.13 HA蛋白受体结合区198位变异不影响H9N2毒株的抗原性 |
| 3.4.14 HA蛋白受体结合区198位氨基酸类型的变化趋势 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 HA蛋白受体结合区222-224位缺失增强H9N2亚型AIV对小鼠致病性的宿主因素分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 毒株 |
| 4.2.2 鸡胚和实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 BALB/c小鼠感染实验 |
| 4.3.2 转录组测序 |
| 4.3.3 蛋白质组测序 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 转录组数据分析 |
| 4.4.2 蛋白质组数据分析 |
| 4.4.3 转录组数据和蛋白质组数据关联分析 |
| 4.5 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 基于脑膜炎大肠杆菌K1外膜蛋白A胞外功能片段的纳米粒疫苗的研制 |
| 前言 |
| 第一节 纳米粒疫苗制备及质量评价 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 纳米粒疫苗保护效果评价及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 第二部分 抗外毒素A人免疫球蛋白在铜绿假单胞菌肺炎中的预防和治疗作用研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 |
（3）乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 乙型流感病毒综述 |
| 1.1.1 流感病毒的分类和命名 |
| 1.1.2 乙型流感病毒的结构 |
| 1.1.3 乙型流感的编码蛋白 |
| 1.1.4 流感病毒的生命周期 |
| 1.1.5 乙型流感的进化 |
| 1.1.6 乙型流感的宿主 |
| 1.1.7 乙型流感的流行病学和临床特征 |
| 1.1.8 乙型流感的抗病毒治疗及预防 |
| 1.2 流感病毒血凝素广谱单抗的研究概述 |
| 1.2.1 甲型流感病毒血凝素广谱单抗概述 |
| 1.2.2 乙型流感病毒血凝素广谱单抗概述 |
| 1.2.3 乙型流感病毒血凝素广谱单抗的中和机制 |
| 1.2.4 流感病毒血凝素广谱单抗的制备策略 |
| 1.3 本研究的意义及主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 研究中用到的主要仪器 |
| 2.2 主要试剂及实验动物 |
| 2.2.1 E.coli菌株 |
| 2.2.2 质粒 |
| 2.2.3 细胞株 |
| 2.2.4 流感病毒 |
| 2.2.5 实验动物 |
| 2.2.6 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
| 2.2.7 其他常规试剂 |
| 2.3 实验用溶液及培养基配制 |
| 2.3.1 细胞培养用溶液的配制 |
| 2.3.2 常规分子生物学实验溶液的配制 |
| 2.3.3 抗原和分子检测用溶液的配置 |
| 2.3.4 病毒培养及检测用溶液的配置 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.4.2 常规细胞生物学实验方法 |
| 2.4.3 流感病毒相关实验方法 |
| 2.4.4 鼠单克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.4.5 免疫学相关实验方法 |
| 2.4.6 单抗可变区编码序列的测定及分析 |
| 2.4.7 单克隆抗体Fab片段的制备 |
| 2.4.8 人鼠嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 2.4.9 高效排阻色谱和抗体亲和力测定方法 |
| 2.4.10 逃逸突变病毒株筛选方法 |
| 2.4.11 小鼠动物实验方法 |
| 2.4.12 雪貂动物实验方法 |
| 2.4.13 结构生物学相关实验方法 |
| 2.4.14 抗体中和机制研究相关实验方法 |
| 2.4.15 本研究的抗体和病毒序列在Genbank中的检索号 |
| 2.4.16 本研究的统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗的筛选与鉴定 |
| 3.1.1 乙型流感的进化及抗原性分析 |
| 3.1.2 乙型流感RBS区广谱单抗制备策略的初步摸索 |
| 3.1.3 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗活性鉴定 |
| 3.1.4 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗研究小结 |
| 3.2 乙型流感RBS区跨亚系广谱单抗的筛选与鉴定 |
| 3.2.1 乙型流感RBS区跨亚系广谱单抗的诱导 |
| 3.2.2 乙型流感RBS区多功能性广谱单抗的筛选 |
| 3.2.3 乙型流感RBS区广谱单抗12G6体外抗病毒活性鉴定 |
| 3.2.4 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6体外抗病毒活性鉴定 |
| 3.2.5 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6体内保护活性鉴定 |
| 3.2.6 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6识别表位鉴定 |
| 3.2.7 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6中和病毒机制分析 |
| 3.2.8 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6研究小结 |
| 3.3 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的筛选与鉴定 |
| 3.3.1 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的制备 |
| 3.3.2 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的初步活性鉴定 |
| 3.3.3 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗嵌合抗体的制备 |
| 3.3.4 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗体外抗病毒活性鉴定 |
| 3.3.5 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗体内保护活性分析 |
| 3.3.6 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗识别表位分析 |
| 3.3.7 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗抗病毒机制分析 |
| 3.3.8 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗研究小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 流感HA广谱表位诱导机体产生有效免疫应答的困难与对策 |
| 4.2 多功能抗体作为新型治疗性药物的重要性 |
| 4.3 IgM广谱抗体在防治高变异病原体中的重要性 |
| 4.4 流感HA广谱抗体应用于流感治疗的前景与挑战 |
| 4.5 流感HA广谱表位应用于通用流感疫苗设计的前景与挑战 |
| 4.6 本研究的局限性 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果及奖励 |
| 致谢 |
（4）大麦条纹花叶病毒γb蛋白在病毒复制和运动中的新功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 病毒编码蛋白的相互作用及其多功能性 |
| 1.2 正义单链RNA病毒的复制及其调控 |
| 1.3 大麦条纹花叶病毒的研究概述 |
| 1.4 本论文研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三章 多功能蛋白γb在BSMV复制中的新功能解析 |
| 3.1 叶绿体是BSMV的主要复制场所 |
| 3.2 γb蛋白能定位于BSMV的复制场所 |
| 3.3 γb蛋白与BSMV的复制酶αa直接互作 |
| 3.4 γb与αa蛋白互作的关键区域 |
| 3.5 γb蛋白的抑制子功能对BSMV复制的影响有限 |
| 3.6 γb蛋白显着的影响BSMV RNAα的复制水平 |
| 3.7 γb蛋白通过直接增强αa解旋酶活性来促进BSMV的复制 |
| 3.8 γb蛋白促进BSMV复制的工作模型 |
| 3.9 小结与讨论 |
| 第四章多功能蛋白γb在BSMV运动中的新功能解析 |
| 4.1 γb蛋白对于BSMV在本生烟上的系统运动是必需的 |
| 4.2 γb蛋白对于BSMV在大麦上的系统运动不是必需的 |
| 4.3 γb蛋白与TGB2蛋白直接互作 |
| 4.4 γb蛋白是BSMV的RNP复合物的组分 |
| 4.5 γb蛋白与TGB2蛋白互作区的确定 |
| 4.6 γb蛋白的突变能减弱病毒的胞间运动 |
| 4.7 γb蛋白组成的RNP运动复合物可能沿着微丝结构运动 |
| 4.8 γb蛋白促进BSMV运动可能的工作模型 |
| 4.9 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ BSMV RNAβ及RNAγ-gfp转基因本生烟的培育 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅱ 引物与质粒列表 |
| 个人简历 |
（5）SpiB在肺癌发生发展中的功能及调控研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、转录因子SpiB在肺癌发生发展中的功能研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 转录因子SpiB在肺癌中的异位表达 |
| 1.2.2 体内实验中SpiB可以促进LLC1的肺转移 |
| 1.2.3 体外实验中改变SpiB的表达影响细胞的侵袭 |
| 1.2.4 改变SpiB的表达影响细胞间的紧密连接 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 SpiB在肺癌中的异位表达与肿瘤侵袭转移 |
| 1.3.2 SpiB通过降解胞外基质和破坏细胞间紧密连接来促进肿瘤的转移 |
| 1.3.3 改变SpiB的表达影响细胞三维培养的表型 |
| 1.4 小结 |
| 二、SpiB通过下调紧密连接蛋白来促进肿瘤转移与侵袭 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SPIB基因表达谱的变化 |
| 2.2.2 在肺癌中Claudin-2与SpiB表达的负相关性 |
| 2.2.3 Claudin-2 可以回复SpiB破坏的紧密连接 |
| 2.2.4 Claudin-2 可以抑制SpiB的促肿瘤转移和侵袭能力 |
| 2.2.5 SpiB促进A549细胞分泌MMP9 降解胞外基质 |
| 2.2.6 下调MMP9不能回复SpiB促侵袭的表型 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 SpiB在肺癌中的过表达引起的基因表达的变化 |
| 2.3.2 细胞间紧密连接与细胞侵袭 |
| 2.4 小结 |
| 三、SpiB调控下游基因表达的机制研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CLDN2基因启动子的确定 |
| 3.2.2 CLDN2基因上游染色质的空间构象 |
| 3.2.3 CLDN2 基因上游顺式调控元件S1、S3的功能研究 |
| 3.2.4 SpiB在 CLDN2基因上的结合位点的鉴定 |
| 3.2.5 SpiB不影响CLDN2基因启动子区的甲基化和组蛋白修饰 |
| 3.2.6 SpiB调控MMP9表达的机制研究 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 CLDN2基因的表达受到染色质高级结构的调控 |
| 3.3.2 SpiB调控CLDN2基因表达的表观遗传机制 |
| 3.3.3 SpiB调控MMP9基因表达的机制 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 转录因子ETS家族蛋白的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 黑色素瘤研究进展 |
| 1.1 我国黑色素瘤发生情况 |
| 1.2 恶性黑色素瘤的转移途径及发生机制 |
| 1.3 黑色素瘤的治疗 |
| 1.4 免疫毒素用于黑色素瘤治疗的展望 |
| 第2章 免疫毒素的研究进展 |
| 2.1 免疫毒素的概念及策略 |
| 2.2 免疫毒素的研究历程 |
| 2.3 重组免疫毒素靶向分子的选择 |
| 2.4 重组免疫毒素毒素配体的设计及作用机制 |
| 2.5 重组免疫毒素在肿瘤治疗中的研究 |
| 2.6 重组免疫毒素治疗实体瘤的研究进展 |
| 2.7 重组免疫毒素研发及应用的瓶颈 |
| 第3章 PE 类重组免疫毒素的研究进展 |
| 3.1 PE 的结构与功能 |
| 3.2 PE 的细胞毒性机制 |
| 3.3 PE 衍生物 |
| 3.4 PE 衍生物基因重组免疫毒素的研究进展 |
| 3.5 PE 类毒素在肿瘤导向中的应用 |
| 第4章 促黑色素细胞激素及其受体研究进展 |
| 4.1 促黑色素细胞激素及其受体 |
| 4.2 以促黑色素细胞激素为靶向载体的重组毒素的研究进展 |
| 4.3 促黑色素细胞激素及其受体在人类疾病中的作用 |
| 4.4 促黑色素细胞激素为导向的研究策略 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 MSH-PE38KDEL 在巨大芽孢杆菌中的表达及活性测定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 MSH-PE38KDEL 在大肠杆菌中的表达及活性测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 MSH-PE38KDEL 的表达、纯化及鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 MSH-PE38KDEL 对黑色素瘤细胞生长的抑制作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 MSH-PE38KDEL 对鼠黑色素瘤模型的治疗试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的成果 |
| 致谢 |
（7）抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 绿脓杆菌的研究概况 |
| 1.1 绿脓杆菌简介 |
| 1.2 绿脓杆菌对人和畜禽的致病性 |
| 1.3 绿脓杆菌外毒素A(PEA)及其分子结构 |
| 1.4 绿脓杆菌外毒素A的作用机理 |
| 1.5 绿脓杆菌外毒素A的应用 |
| 第二章 热休克蛋白的研究概况 |
| 2.1 热休克蛋白(HSP)简介 |
| 2.2 HSP的生物学功能 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 HSP65-PEAⅠ基因构建及表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 工程菌PEAⅠ、HSP65-PEAⅠ发酵及融合蛋白纯化 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第三章 抗PEAⅠ单克隆抗体、多克隆抗体标准品制备 |
| 1.1 材料方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第四章 小鼠经HSP65-PEAⅠ免疫后攻毒保护性试验 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）重组毒素rG17PE38的表达、纯化及胃癌杀伤作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 免疫毒素在血液瘤治疗中的应用 |
| 1.1 免疫毒素 |
| 1.2 细菌毒素的作用机制 |
| 1.3 以截短的细菌毒素片段制备免疫毒素 |
| 1.4 免疫毒素的生产及临床试验 |
| 1.5 靶向血液瘤免疫毒素面临的困难及机遇 |
| 第2章 绿脓杆菌外毒素 A：从致病因子到抗癌药物 |
| 2.1 绿脓杆菌外毒素 A |
| 2.2 PE 为基础的免疫毒素 |
| 2.3 面临的问题 |
| 2.4 今后发展方向 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 以胃泌素为靶向的治疗药物 |
| 3.1 胃泌素结构及其功能 |
| 3.2 胃泌素受体类型与分布 |
| 3.3 胃泌素靶向 CCK2R |
| 3.4 胃泌素在胃酸分泌中的作用 |
| 3.5 CCK2R 拮抗剂在治疗酸分泌失调中的作用 |
| 3.6 胃泌素在癌症中的作用 |
| 3.7 CCK2R 拮抗剂在胰腺癌治疗中的作用 |
| 3.8 结论 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 重组免疫毒素 rG17PE38 原核表达载体的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 高效表达 rG17PE38 重组菌株的建立及发酵条件优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 醇洗脱型PE38单克隆抗体制备及rG17PE38重组免疫毒素纯化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 rG17PE38 重组免疫毒素的细胞靶向分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）靶向肿瘤重组毒素IL6T23-PE38KDEL的表达、纯化及其生物活性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 细菌毒素源性重组毒素的研究进展 |
| 1.1 免疫毒素的定义 |
| 1.2 细菌毒素的作用机制 |
| 1.3 截断的细菌毒素 |
| 1.4 重组免疫毒素的生产和临床测试 |
| 1.5 针对血液恶性肿瘤的免疫毒素的优缺点 |
| 第2章 IL6 及其受体与癌症的关系 |
| 2.1 IL-6/IL-6R |
| 2.2 IL6 在人类疾病中所扮演的角色 |
| 2.3 IL6 与癌症 |
| 2.4 极度瘦弱 |
| 2.5 IL6 为导向的治疗策略 |
| 第3章 免疫毒素研究进展及其瓶颈 |
| 3.1 靶点和导向的种类 |
| 3.2 植物及细菌蛋白毒素配体 |
| 3.3 核酸酶及人源蛋白毒素 |
| 3.4 临床测试的免疫毒素 |
| 3.5 免疫毒素在临床的应用及存在的问题 |
| 3.6 前景与展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 IL6_(T23)-PE38KDEL 构建及大肠杆菌表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 IL6_(T23)-PE38KDEL 在巨大芽胞杆菌中的分泌表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 IL6_(T23)-PE38KDEL 在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 重组毒素 IL6_(T23)-PE38KDEL 的纯化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 IL6_(T23)-PE38KDEL 重组毒素体外抗癌活性 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 IL6_(T23)-PE38KDEL 重组毒素对鼠骨髓瘤模型的治疗试验 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师及作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的成果 |
| 致谢 |
（10）绿脓杆菌外毒素A基因的密码子优化、脱毒改造及其特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 绿脓杆菌外毒素A |
| 1.1.1 绿脓杆菌外毒素A 的分子结构 |
| 1.1.2 PEA 的细胞毒作用方式 |
| 1.1.3 PEA 的应用 |
| 1.2 研究的目的与意义 |
| 2 实验一 PEA 基因密码子的优化及其在大肠杆菌中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、载体和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基及溶液的配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 野生型PEA 基因的扩增 |
| 2.2.2 原核表达载体pET-20b(+)的制备 |
| 2.2.3 野生型PEA 基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.4 PEA基因密码子优化和人工合成 |
| 2.2.5 密码子优化型PEA 基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.6 重组PEA 蛋白的表达与鉴定 |
| 2.2.7 重组PEA 蛋白的生物活性鉴定与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 野生型PEA 基因的扩增和原核表达载体的构建 |
| 2.3.2 PEA基因的密码子优化及其原核表达载体的构建 |
| 2.3.3 PEA 基因的原核分泌表达 |
| 2.3.4 密码子优化对PEA 基因表达水平的影响 |
| 2.3.5 重组PEA 蛋白生物活性的鉴定与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 实验二 PEA 基因突变体的构建及脱毒突变体的筛选 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、载体和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PEA 基因不同突变体及其原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 低毒突变体的筛选 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 PEA 基因不同突变体的构建及原核表达 |
| 3.3.2 低毒突变株的选定与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
四、重组PEA受体结合区蛋白的免疫活性（论文参考文献）
- [1]HA蛋白受体结合区及邻近区域适应性变异协同PB2-627K增强H9N2亚型禽流感病毒对小鼠致病性的机制研究[D]. 刘开拓. 扬州大学, 2021(02)
- [2]新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究[D]. 张瑾. 重庆医科大学, 2019(01)
- [3]乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究[D]. 沈晨光. 厦门大学, 2018(08)
- [4]大麦条纹花叶病毒γb蛋白在病毒复制和运动中的新功能解析[D]. 张坤. 中国农业大学, 2017(05)
- [5]SpiB在肺癌发生发展中的功能及调控研究[D]. 杜玮. 天津医科大学, 2016
- [6]靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应[D]. 惠琦. 吉林大学, 2014(09)
- [7]抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗的研究[D]. 冯越. 吉林农业大学, 2013(S2)
- [8]重组毒素rG17PE38的表达、纯化及胃癌杀伤作用研究[D]. 宋杰. 吉林大学, 2013(08)
- [9]靶向肿瘤重组毒素IL6T23-PE38KDEL的表达、纯化及其生物活性的研究[D]. 郭德军. 吉林大学, 2012(09)
- [10]绿脓杆菌外毒素A基因的密码子优化、脱毒改造及其特性研究[D]. 王幸兴. 河北农业大学, 2011(07)