一、支原体冻干保护剂的比较试验（论文文献综述）
张梦垚[1]（2021）在《基于CRISPR技术的副溶血性弧菌核酸现场检测系统的研究》文中提出食品安全关系到每个人的生命健康。其中,食源性致病菌导致的食品污染影响最大、分布最广泛,已成为世界性的公共卫生问题。食品在生产、加工、流通、销售、消费等多个环节都可能存在生物安全风险,因此构建有效的致病菌检疫体系,实现致病菌现场快速检测具有重要意义。聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术是检疫机构最常使用的检测技术。本论文以水产中常见的致病菌副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）为研究对象,以核酸检测技术为基础,结合以规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR）及相关蛋白Cas12a酶体系为主的基因编辑技术和真空冷冻干燥技术,建立了操作简单、准确性高、成本低、荧光可视化、便于储存运输的现场快速检测系统。主要研究内容及结果如下:（1）建立了基于热循环仪的副溶血性弧菌荧光PCR检测方法。针对副溶血性弧菌的特异性不耐热溶血素（Thermolabile hemolysin,tlh）基因保守区域,设计3对特异性PCR引物并进行筛选,并优化核酸提取方法和扩增体系。为减少气溶胶污染,将PCR扩增原料里的脱氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine triphosphate,d TTP）替换为脱氧尿苷三磷酸（Deoxyuridine triphosphate,d UTP）,采用打开热盖的小型商业热循环仪进行PCR扩增。并将建立的PCR现场检测方法与实验室实时PCR系统检测方法相比较,结果具有一致性。该检测方案可以有效避免核酸检测过程中的气溶胶污染问题,其结果可在便携式观察仪上进行荧光可视化检测。（2）为进一步提高检测的特异性,建立了基于CRISPR/Cas12a的副溶血性弧菌现场荧光可视化检测方法。针对副溶血性弧菌tlh基因的最适特异性PCR引物的扩增片段,筛选含原间隔基序（Protospacer-adjacent motif,PAM）的区域,并设计向导核糖核酸（CRISPR RNA,cr RNA）,构建CRISPR/Cas12a体系。通过对反应试管、反应体系的优化实现了Cas12a蛋白酶最佳反应活性温度与PCR反应高温的平衡。利用商业热循环仪和实验室设计的与之配套的小型荧光观察装置,建立无需开盖即可进行后续荧光检测避免交叉污染的一体化反应。阳性扩增产生肉眼可见的绿色荧光而阴性扩增无荧光信号。该方法检测限为1.02×102 copies/reaction,且低浓度阳性扩增样本也发出明显的绿色荧光,结果判别方便直观。通过利用一次性棉签擦拭携带副溶血性弧菌的病虾进行致病菌取样,快速裂解细胞提取DNA进行后续反应验证了可行性,最终建立以便携式仪器为主的准确度高、可靠性好、操作简单、成本低廉的现场可视化检测方法。（3）为减少核酸检测试剂对低温环境的依赖,建立了应用于现场检测的核酸扩增试剂冷冻干燥方法。利用冷冻干燥技术对PCR检测试剂进行脱水处理,使检测试剂能以固体形态在室温下稳定储存和运输,并能保持其生物活性。研究优化了冻干保护剂的配方并调试了冻干工艺参数,以30%（w/v）海藻糖、10%（w/v）普鲁兰多糖和60%（w/v）甘露醇按2:2:1体积比混合的溶液作为冻干保护剂。将直径为1.8 mm的钢珠加入到PCR混合液中,预冷冻后进行6小时的真空干燥,成功制备了形态良好,具有较高韧性,可在磁力吸附作用下移动的冻干产品。复水活化后冻干试剂维持原反应活性。经验证该冻干试剂在聚丙烯、聚苯乙烯和聚乙烯等不同硬度的材质表面均具有良好的移动性能。该冻干PCR试剂不溶于油相,以15μL无核酶水复溶,数秒内即可得到澄清溶液。冻干试剂在50℃的高温条件下保存一周仍能保持较好的活性。该方法有助于解决核酸现场检测面临的冷链保存运输问题,降低现场检测的限制条件和检测成本,对推动核酸检测技术向资源匮乏地区的应用具有重大意义。
李姝琪[2]（2021）在《以聚乳酸-羟基乙酸为载体的氟苯尼考药物控制释放体系及抗菌性能的研究》文中研究表明氟苯尼考（FF）是一种硫代苯酚的氟化物类似物,是一种对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有效的广谱兽用抗生素,无潜在再生障碍性贫血作用等优点,被广泛应用于兽医畜牧业。但是,FF的水溶性差,生物利用度差,血浆半衰期缩短,这些缺点对于临床应用有很多不便。本文采用改良的单一乳化溶剂挥发法,以聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）为载体材料,考察不同的包覆材料制备的氟苯尼考纳米粒制剂,以提高氟苯尼考的水溶性及控制药物释放来达到更好的治疗效果,结合冷冻干燥技术提高纳米粒制剂的稳定性,最后考察了氟苯尼考纳米粒制剂体外抗菌活性。文章主要研究内容及结果如下:1.本文建立FF高效液相色谱（HPLC）分析方法;采用G50葡聚糖凝胶柱色谱法有效分离纳米粒与游离药物,建立了纳米粒的包封率和载药量测定方法。测定FF在不同溶剂中的平衡溶解度为后期理化性质考察和体外释放评价提供依据。2.纳米控释给药系统是一种很有前景的新型给药系统,具有提高药物有效治疗剂量的长期可控性、降低副作用、减少给药次数、减少药物毒性反应等优点。文章采用O/W乳液溶剂挥发法制备了载有氟苯尼考的PLGA纳米粒,并通过改变制备工艺（超声时间和超声功率）和制备处方（乳化剂种类、乳化剂浓度、药脂比、油水相体积比、药物浓度）为正交试验优化提供数据依据,以PVA浓度（A）、药脂比（B）、油水相体积比（C）、药物浓度（D）为考察对象,以包封率为评价指标,最终获得高包封率的FF-PLGA纳米粒（FF-PLGA NPs）,并对最佳处方进行验证及理化性质（FTIR、DSC、XRD、TEM）的研究。结果表明FF-PLGA NPs所得最佳处方为:PVA浓度为4%,药脂比（FF:PLGA）为1:15,油水相体积比1:8,FF浓度为1.5 mg·mL-1。最佳处方制备的包封率为80.99±0.87%,载药量为1.65±0.01%,粒径为201.40±3.50 nm,PDI值为0.08±0.02,Zeta电位为0.95±0.04 m V,符合注射要求。最佳处方在水中的饱和溶解度为1.92±0.04 mg mL-1,明显高于FF原药（P<0.05）。体外释放结果表明FF-PLGA NPs开始释放较大量的药量,存在一定的突释现象,接着缓慢释放,维持一个较高的血药浓度水平直至药物释放完全。数学模型拟合结果显示,FF体外释放行为符合一级药物动力学,拟合方程为ln（1-Q/100）=-0.6251t-0.2335,R2=0.9963,FF-PLGA NPs符合Ritger-peppas方程,拟合方程为lnQ=0.451lnt+2.974,R2=0.9609,n<0.5,符合Fick扩散规律。3.利用亲水性2-HP-β-环糊精（2-HP-β-CD）作为包覆材料考察纳米体系的稳定性及理化性质。通过单因素考察及正交试验优化制备出高包封率又稳定的2-HP-β-CD包覆的FF-PLGA NPs（FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs）。根据前期试验的基础重点研究了乳化剂浓度,药脂比,油水相体积药物浓度及2-HP-β-CD浓度。结果显示最佳处方为PVA浓度为2%,药脂比（FF:PLGA）为1:15,油水相体积比1:8,FF浓度为2 mg·mL-1,2-HP-β-CD浓度为1.5%。FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率为82.02±0.82%,载药量为2.03±0.02%,粒径为185.90±2.80 nm,PDI值为0.10±0.05,Zeta电位为-5.92±1.80 m V。最佳处方在水中的饱和溶解度为5.60±0.32 mg mL-1（约是原药的5倍,是FF-PLGA NPs的3倍）,表明2-HP-β-CD的存在有效提高了FF在水中的分散作用。体外释放结果表明FF-PLGA NPs前4个小时约释放约44.96%,而FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs前4个小时约释放37.85%,突释作用明显减弱（P<0.05）,然后维持高血药浓度缓慢释放,这表明2-HP-β-CD包覆减缓药物的释放,避免了FF纳米粒的突释。数学模型拟合结果显示FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs符合Ritger-peppas方程,拟合方程为lnQ=0.417lnt+2.794,R2=0.9655,n<0.5,符合Fick扩散规律。4.以聚乙二醇(PEG4000)改性PLGA的两亲性共聚物PEG4000-PLGA作为载体材料,利用单因素考察和正交试验优化制备出较高包封率的FF纳米粒制剂(FF-PEG4000-PLGA NPs)。重点考察采用乳化溶剂挥发法制备FF-PEG4000-PLGA NPs的制备工艺中几个主要因素:乳化剂浓度、药脂比、油水相体积比、药物浓度对纳米粒制备的影响。结果表明当PVA浓度为1%,药脂比(FF:PEG4000-PLGA)为1:15,油水相体积比1:6,FF浓度为0.8 mg·mL-1,FF-PEG4000-PLGA NPs的包封率为81.04±1.04%,载药量为2.63±0.03%,粒径为129.10±3.90 nm,PDI值为0.11±0.03,Zeta电位为-4.53±0.37 m V。最佳处方在水中的饱和溶解度为4.64±0.56mg mL-1（约是原药的4倍,是FF-PLGA NPs的2.5倍）,充分说明PEG4000对纳米粒的改性提高了载体材料的水合性能。体外释放结果表明FF-PLGA NPs前4个小时约释放约44.96%,FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs前4个小时约释放37.85%,而FF-PEG4000-PLGA NPs前4个小时约释放33.79%,FF-PEG4000-PLGA NPs的释放速率明显较FF原药慢且平稳（P<0.05）,然后缓慢释放至完全,这表明PEG4000对PLGA的修饰会对聚合物纳米粒的降解过程和释药行为产生影响,也更有利于药物活性的保持。数学模型拟合结果FF-PEG4000-PLGA NPs显示符合Ritger-peppas方程,拟合方程为lnQ=0.611lnt+2.208,R2=0.9701,n<0.5,符合Fick扩散规律。5.采用冷冻干燥技术制备三种纳米粒制剂的冻干处方,以外观、色泽、再分散性作为指标,优化纳米粒的冷冻干燥工艺。最终选择预冻温度为-50℃,预冻时间6 h,干燥时间32 h,10%甘露醇作为FF-PLGA NPs的冻干保护剂,5%甘露醇作为FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs和FF-PEG4000-PLGA NPs冻干保护剂,制备最佳冻干处方。分别对冻干样品的粒径,电位,包封率及再分散性等性质进行研究,结果表明冻干前后包封率、粒径、电位变化较小,再分散性良好。初步稳定性实验表明,冻干粉在4℃条件下放置90天,粒径、电位及包封率均无明显变化,稳定性良好。体外释放曲线与冻干前纳米粒相似,符合Ritger-peppas方程。6.抑菌圈试验结果表明,FF对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为22.0,19.0,22.5 mm,19 mm;FF-PLGA NPs对四种菌株的抑菌圈直径分别为23.0,22.0,26.0 mm,21.0mm;FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs对四种菌株的抑菌圈直径分别为23.0,22.5,25.5,21.0 mm;FF-PEG4000-PLGA NPs对四种分离菌株的抑菌圈直径分别为22.5,22.0,24.5,20.0 mm,结果说明三种纳米粒对常见分离菌株的抑菌作用均比FF原药显着（P<0.05）。MIC结果表明三种纳米粒制剂对铜绿假单胞菌的MIC是FF的1/2,FF-PLGA NPs对于肺炎克雷伯菌的MIC是FF的1/2,FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs和FF-PEG4000-PLGA NPs对肺炎克雷伯菌的MIC与FF无明显差异,三种制剂对大肠杆菌的MIC分别是FF的1/4,1/2,1/2（P<0.05）。MBC结果表明FF-PLGA NPs和FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs对于肺炎克雷伯菌的MBC是FF的1/2（P<0.05）,FF-PEG4000-PLGA NPs对肺炎克雷伯菌的MBC与FF无显着性差异;三种制剂对于大肠杆菌的MBC分别是FF的1/4,1/2,1/2（P<0.05）。溶血试验结果表明三种FF纳米粒制剂浓度在100-1000μg·mL-1范围内,对红细胞均无明显溶血作用,安全性较高,可用于静脉注射。本文初步探讨了以PLGA为载体的氟苯尼考药物控制释放体系,提高了FF在制剂中的溶解度,粒径均一稳定,生物相容性好,制剂安全性高,可用于静脉注射给药,一定程度上提高了药物的抑菌活性。经2-HP-β-CD或PEG4000修饰后的纳米粒可明显减轻纳米粒突释,持续高浓度缓慢释放,提高药物稳定性,证明了以PLGA为载体的氟苯尼考纳米粒给药系统是非常有发展前景的新型药物制剂。
何吉鑫[3]（2020）在《检测滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原的研制和间接ELISA方法的建立》文中提出滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）是危害家禽养殖业的重要病原之一。家禽感染后呈长期带菌状态,导致生产性能下降,造成严重经济损失。目前针对MS抗体的检测方法主要有血凝抑制试验（Hemagglutination inhibition test,HI）及酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）等方法。HI 试验操作简便、成本低、特异性高,但目前缺少可长期稳定保存的商品化抗原;ELISA灵敏度高、适合大量样品的检测,但进口商品化试剂盒的价格昂贵,检测成本较高。为了给我国MS感染的综合防控与净化提供技术支持,本研究拟研制一种可长期稳定保存的MS冻干血凝抑制试验抗原;同时,以基因工程表达的重组MSPB抗原（rMSPB）作为包被抗原,建立一种可替代国外同类产品的检测MS抗体的间接ELISA方法。1冻干MS血凝抑制试验抗原的研制及应用从本实验室MS流行菌株库中筛选出一株复制能力强、血凝特性稳定的分离株JS2018-4,通过优化抗原灭活工艺、浓缩工艺和冻干工艺,研制出一种稳定性好、特异性强的MS冻干血凝抑制试验抗原,进而优化确定了检测MS抗体的HI试验方法。使用本方法检测了 148份参考血清样品（包含47份SPF鸡阴性血清样品和101份经MS人工感染SPF鸡制备的阳性血清样品）,通过受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）分析结果,确定了相应的判定标准:HI效价≥1:80,判为阳性;1:40≤HI效价<1:80,判为疑似阳性;HI效价<1:40则判为阴性。经检验,该冻干血凝抑制试验试验抗原具有良好的特异性和稳定性,与鸡毒支原体（MG）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）多种病原阳性血清均不发生交叉反应,且于4℃条件下保存12个月仍可维持效价不变。使用该血凝抑制试验抗原建立的HI试验方法和商品化ELISA试剂盒平行检测453份临床血清样品和40份不同抗体滴度的血清样品,结果显示,两者阴阳性符合率分别为100%和77.07%;且两者检测结果呈现的抗体高低趋势一致,表明本研究建立的HI试验方法具备较高的临床应用价值。2基于重组蛋白rMSPB的MS抗体间接ELISA检测方法的建立通过对MS流行株JS2018-4的vlhA基因序列以及氨基酸序列进行分析,选取了抗原性较好的MSPB（6aa-312aa）和MSPA（485aa-720aa）分别进行PCR扩增。通过pET表达系统进行原核表达,获得了 2个携带His标签的融合蛋白。SDS-PAGE鉴定结果显示,2个融合蛋白在BL21（DE3）中均以包涵体形式表达,大小分别为54 kDa和46 kDa,与预期相符;Western-Blot鉴定显示两者均能与MS单因子阳性血清发生特异性反应,分别命名为rMSPB和rMSPA。经过变性、纯化、复性,获得高纯度的重组蛋白作为包被抗原进行ELISA方法的建立。通过比较,使用rMSPB作为包被抗原检测效果优于rMSPA。将重组蛋白rMSPB作为包被抗原,经条件优化建立了检测MS抗体的间接ELISA方法。并制备了 MS标准血清和用于ELISA试验的阴阳性对照样品。使用本方法检测了 676份参考血清样品,通过ROC曲线分析确定了 S/P判定阴阳性的最佳临界值为:S/P=0.45;使用终点滴定法测定其中65份参考血清样品,通过回归分析获得样品最佳稀释倍数处的S/P值与抗体滴度的直线方程:Log10（抗体滴度）=1.148×Log10（1:800 处 S/P 值）+3.247（R2=0.9030）,从而实现了对样品中 MS 抗体的快速定量检测。经检验,该方法具有良好的特异性和重复性,与MG、AIV、NDV、IBV等多种病原阳性血清均不发生交叉反应,批内重复和批间重复变异系数均小于10%。使用本方法和商品化抗体检测试剂盒平行检测178份临床血清样品和207份同一鸡群不同日龄的血清样品,结果显示,两者阴阳性符合率分别为99.04%和98.65%;抗体消长趋势基本一致,表明该方法具备良好的检测效果。
苍枫[4]（2020）在《激流式生物反应器制备猪瘟活疫苗（细胞源）及其免疫效果研究》文中指出为了改进猪瘟转瓶生产工艺,提高抗原含量与产能,本研究采用激流式生物反应器进行猪瘟活疫苗（细胞源）生产工艺中细胞和病毒的培养,连续制备了三批猪瘟耐热保护剂活疫苗（细胞源）,研究结果表明,采用激流式生物反应器生产的猪瘟疫苗,其纯净性、理化特性、安全性、效力检验等各项产品质量指标均符合国家标准;同时与市售的三类主要猪瘟活疫苗（细胞源苗、ST细胞苗和脾淋苗）进行了抗体评价对比试验,本研究疫苗组抗体阳性率均高于市售疫苗组;本研究中采用了定量PCR方法对猪瘟病毒含量进行测定,有效地控制了检测中BVDV的污染,降低了兔热法因动物个体因素对检测结果的影响,同时为产业化生产积累了疫苗效价精准评价的数据和经验。试验结果表明,采用激流式生物反应器生产的病毒液病毒含量均大于等于100万RID/ml,较原转瓶生产标准的5万RID/ml有大幅度的提升。其定量PCR方法检测病毒拷贝数均达到106 Copies/头份,高于8种市售商品疫苗105 Copies/头份,的平均水平,且批培养可连续收获20收次,是转瓶工艺5～6收次的3-4倍,有效地提高了产能。在疫苗免疫效果评价对比试验中,与牛睾丸细胞苗进行对比,二免后30天试验组的平均抗体阳性率87.82%,优于5个细胞源商品苗的平均抗体阳性率74.33%;与传代ST细胞活疫苗比较试验中,试验组二免后30天的平均抗体阳性率79.93%,优于7个ST传代细胞商品苗的平均抗体阳性率70.74%;与脾淋活疫苗对比试验中,试验组二免后30天的平均抗体阳性率88.89%,优于3个脾淋商品苗的平均抗体阳性率66.98%。
韩丽媛[5]（2020）在《女性阴道正常菌群分布调查及微生态制剂制备》文中指出目的调查女性阴道正常菌群分布,筛选优势生长细菌,制备阴道微生态制剂,为细菌性阴道病微生态治疗提供实验依据。方法采集2018年10月至2019年3月华北理工大学附属医院及唐山妇幼保健院妇科体检中心健康体检女性阴道分泌物,通过常规镜检和细菌性阴道病联合检测试剂盒检测剔除非健康女性阴道分泌物标本。将符合标准的标本进行细菌培养,观察并记录菌落特点后纯培养,生化鉴定仪对分离细菌初步鉴定,应用实时荧光定量PCR进一步分子生物学鉴定。绘制健康女性阴道细菌频数分布直方图,选择健康女性阴道优势生长细菌作为阴道微生态制剂候选种子菌。传代培养确定种子菌最佳培养条件以及收获时间,采用冷冻干燥技术将混合种子菌制成粉末状阴道微生态制剂。采用均匀设计法对微生态制剂的保护剂进行优化以得到最高活菌率。从微生态制剂的耐酸性、含水量、保存条件等方面对其进行评估。结果1细菌分布调查249例健康体检女性阴道分泌物高倍镜镜检和细菌性阴道病联合检测中,有4例白细胞>15/HP,9例在高倍镜下发现孢子,1例在高倍镜下发现滴虫。1例标本唾液酸苷酶呈阳性,10例标本分泌物p H值>4.7,故剔除此25例标本。对符合条件的224例健康女性阴道分泌物标本细菌培养后生化反应初步鉴定,结果为:嗜酸乳杆菌123例,分离率54.9%;发酵乳杆菌98例,分离率43.8%;短小棒状杆菌68例,分离率30.4%;缓症链球菌37例,分离率16.5%;表皮葡萄球菌32例,分离率14.3%;马胃葡萄球菌28例,分离率12.5%;粪肠球菌19例,分离率8.5%。根据生化反应鉴定结果,选择相应引物进行基因鉴定,结果为:嗜酸乳杆菌122例,分离率54.5%;发酵乳杆菌98例,分离率43.8%;短小棒状杆菌59例,分离率26.3%;缓症链球菌37例,分离率16.5%;表皮葡萄球菌29例,分离率12.9%;马胃葡萄球菌28例,分离率12.5%;粪肠球菌19例,分离率8.5%。健康女性阴道细菌分布频数直方图显示,健康女性阴道优势菌为发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌及短小棒状杆菌,这三种细菌可以作为作为阴道微生态制剂的候选种子菌。2微生态制剂制备（1）细菌生长曲线表明,嗜酸乳杆菌与发酵乳杆菌在18～22h时,细菌生长处于平台期,短小棒状杆菌在20～24h时,细菌生长处于平台期。（2）通过冷冻干燥技术得到了乳白色无味的阴道微生态制剂。（3）微生态制剂保护剂单因素分析结果表明,脱脂乳粉在添加浓度14.0%时,得到最大活菌率70.30±0.28%,海藻糖在添加浓度4.0%时,得到最大活菌率60.40±0.41%,甘油在添加浓度1.5%时,得到最大活菌率64.40±0.37%,均匀设计实验显示复合保护剂最大活菌率为79.68%。（4）嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、短小棒状杆菌在溶液环境p H为4.0时,活菌率最高,分别为76.34%、74.32%和71.3%。（5）对阴道微生态制剂5个批次的含水量进行测定,结果分别为3.86%、4.42%、3.73%、4.06%、2.62%。（6）在温度为-20℃,时长为240天的条件下,微生物制剂中的活菌数大致维持不变,为1×1010cfu/g。当温度保持在4℃时,活菌的数量会逐渐减少,但仍然远高于国家对于益生菌制品里关于菌数的不少于106 cfu/g的要求。而在室温情况,即25-30℃下,制剂中的乳酸菌数量会迅速减少,在一个月内可以降至106cfu/g。结论1细菌分布调查嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、短小棒状杆菌为健康女性阴道内的优势生长细菌,可作为阴道微生态制剂的候选种子菌株。2微生态制剂制备（1）嗜酸乳杆菌与发酵乳杆菌在20h收获、短小棒状杆菌在24h收获,冷冻干燥后存活率最高。（2）复合阴道微生态保护剂脱脂乳粉、海藻糖、甘油浓度分别为14.0%、4.0%、1.5%条件下,活菌率最高（79.68%）。（3）在溶液p H为4.0的环境下,三种细菌的成活率最高。（4）所制备的阴道微生态制剂的含水量符合国家标准（≤5%）。（5）本次实验所制备的阴道微生态制剂在-20℃和4℃条件下可保存8个月。图11幅;表17个;参83篇。
蔡丽蓉[6]（2021）在《载BLfcin壳聚糖纳米粒温敏水凝胶的制备、表征及体外抑菌作用研究》文中认为奶牛乳房炎是一种由多种因素引起的奶牛乳头或乳腺组织发生炎症的疾病,病原微生物和环境共同作用可引起该疾病,其中,金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus,S.aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是奶牛乳房炎的常见致病菌。目前,奶牛乳房炎的治疗仍依靠抗生素,但长期滥用抗生素会导致耐药菌株的产生、治疗效果下降、乳汁中药物残留等问题,最终会威胁人类的健康。牛乳铁蛋白肽（Bovine lactoferricin,BLfcin）是一种具有广谱抗菌作用、免疫调节、抗病毒、抗肿瘤以及抗氧化等多重生物学功能的抗微生物肽。本研究旨在开发一种可用于治疗因细菌引起的奶牛乳房炎的纳米复合制剂,因此,选择BLfcin为原料药,制备负载BLfcin纳米粒的复合温敏水凝胶,为抗生素替代物以及奶牛乳房炎治疗提供新选择。本文的研究内容和结果如下:（1）以低分子量壳聚糖（LCS）为载体,三聚磷酸钠（TPP）为交联剂,釆用离子凝胶法制备了壳聚糖纳米粒（LCS-NPs）,通过正交试验得到最优制备方案:在交联环境温度为0-4℃的条件下,将浓度为1 mg/m L的LCS溶液预热至60℃,随后滴加1 mg/m L的TPP溶液（LCS:TPP=3:1）,继续搅拌30分钟。所制得的LCS-NPs粒径在98～122 nm,呈单峰粒径分布,聚合物分散系数为0.225±0.015,LCS-NPs的平均表面电荷为+14.48±1.02 m V。（2）将BLfcin负载到LCS-NPs中,制成载牛乳铁蛋白肽纳米粒（BLfcin-NPs）,并研究了其表征、细胞毒性以及体外抑菌活性。结果表明,BLfcin添加量为1 mg时,药物包封率为72.18±0.78%,载药量为2.17±0.03%,BLfcin-NPs平均粒径为103.9±2.08 nm,PDI为0.223±0.004,电位为+20.57±0.80 m V,纳米体系较稳定,粒径较小,在透射电子显微镜下为近似球形。细胞毒性试验表明BLfcin-NPs对奶牛乳腺上皮细胞（BMSCs）无细胞毒性,且具有促进增殖的作用。BLfcin-NPs可通过持续的药物释放,抑制细菌增殖。向BLfcin-NPs水分散体系中加入等体积的5%蔗糖水溶液,经冷冻干燥后的纳米粒冻干粉呈饼状,再分散性好,且粒径、PDI变化率最小,便于储存和临床应用。（3）制备中分子量壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶（MCS/β-GP Hydrogel）,向其中添加BLfcin-NPs制成载纳米粒复合温敏水凝胶（BLfcin-NPs Hydrogel）,对其表征进行研究,并研究其生物降解性和体外抑菌活性。MCS/β-GP的最佳制备处方为:以0.1 mol/L稀盐酸溶液配制2%MCS溶液后,与β-GP溶液按7:3混合,其胶凝时间为4′12″±19.6″,p H值为7.09±0.14。冷冻电镜显示纳米复合水凝胶呈相互交联的网状结构。傅里叶红外变换光谱结果显示,MCS和β-GP之间形成氢键和络合物,而BLfcin-NPs Hydrogel的红外吸收光谱中没有观察到BLfcin、BLfcin-NPs的特征吸收带。XRD结果表明BLfcin-NPs对水凝胶的结晶性能影响不大。通过流变学试验发现,BLfcin-NPs Hydrogel有较快的成胶时间,其相变点为24℃。体外降解试验发现BLfcin-NPs Hydrogel的剩余重量在21天后为30.54±3.82%,表明其生物降解性较好。细胞毒性试验表明载BLfcin-NPs水凝胶对BMSCs的增殖无明显的负面影响。体外抑菌试验证明该纳米复合水凝胶具有良好的体外抗菌活性。综上所述,本试验优化了壳聚糖基纳米颗粒的制备条件,可制成粒径可控、分散性较好的壳聚糖纳米颗粒;制备的BLfcin-NPs具有良好的物理化学表征及体外抑菌作用,可作为一种有前途的抗微生物肽药物释放系统;制备的具有载牛乳铁蛋白肽纳米粒复合水凝胶温敏成胶化、可降解性、无细胞毒性和体外抑菌活性,该复合材料可成为临床治疗细菌性奶牛乳房炎的新选择。
董炳梅[7]（2019）在《鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用》文中提出鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）可在多种原代或传代细胞系上复制增殖,但不同毒株或亚型对宿主细胞均存在偏嗜性。为了筛选适于鸡新城疫（Newcastle disease,ND）疫苗生产的传代细胞系,本研究将我国ND疫苗株NDVⅠ系与Lasota株分别接种BHK-21、Vero、Hela、鸡肝癌细胞（LMH细胞）与DF-1细胞,通过对细胞病变的观察,结合对细胞培养物细胞半数感染量(Median cell culture infective dose,TCID50)和HA效价的测定,对比确定适于NDVⅠ系与Lasota株生长的传代细胞系。结果显示,NDVⅠ系与Lasota株在Vero、BHK-21、DF-1、Hela与LMH细胞上均可增殖,并引起典型的细胞病变,但不同毒株适应细胞的能力不同。较适于NDVⅠ系增殖的细胞系依次为Hela、BHK-21与DF-1细胞;较适于NDV Lasota株增殖的细胞系依次为Hela、LMH与BHK-21细胞。本研究证明了NDVⅠ系与Lasota株均可在LMH细胞上增殖,并产生典型的细胞病变,且LMH细胞更适于NDVⅠ系的增殖培养。NDV侵染细胞的第一步是病毒与细胞膜表面的唾液酸受体结合,NDV的唾液酸受体主要包括Neu5Ac-α-2,3Gal-β-1,4Glc（SAα2,3Gal）和Neu5Ac-2-S-α-2,6Gal10Me（SAα2,6Gal）,两种受体在宿主组织器官中的分布及表达丰度的不同对病毒的宿主范围和毒力等方面具有重要影响。为了在分子水平解释NDVⅠ系与Lasota株对不同细胞系的偏嗜性,本研究首先应用激光共聚焦显微镜对2种唾液酸受体在BHK-21等5种细胞上的分布进行了观察,结果显示,BHK-21、LMH、DF-1、Hela与Vero细胞内均存在TSA-R SAα2,6Gal与SAα2,3Gal,且主要分布于细胞膜与细胞质中;在细胞核部分,BHK-21细胞核有SAα2,3Gal受体分布,而DF-1细胞核中两种受体均有分布。其次,本研究应用流式细胞仪对5种细胞膜表面的两种唾液酸受体进行了定量分析,结果显示5种细胞表面SAα2,3Gal受体的含量显着高于SAα2,6Gal受体,提示5种细胞主要以SAα2,3Gal受体为主;按由多到少排列,SAα2,3Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、BHK-21、DF-1、LMH与Vero细胞;SAα2,6Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、LMH、BHK-21、Vero与DF-1细胞。结合NDVⅠ系与Lasota株在不同细胞上的增殖特性的比较,可判断NDVⅠ系更易与SAα2,3Gal受体结合,NDV Lasota株更易与SAα2,6Gal受体结合。NDV虽然可在多种细胞上增殖培养,但效价普遍较低,不能达到生产要求。NDV的两种唾液酸受体分别为SAα2,3Gal和SAα2,6Gal,而介导两种唾液酸受体形成的酶类分别是ST3Gal转移酶和ST6Gal转移酶,因此唾液酸转移酶对唾液酸受体在细胞表面的表达具有重要作用,而细胞表面受体表达丰度的高低对病毒入侵与增殖具有决定性作用。因此,为了提高NDV细胞培养效价及进一步确定不同唾液酸受体对NDV细胞培养的影响,本研究以PCI-neo为载体,在成功构建唾液酸转移酶PCI-neo-ST3与PCI-neo-ST6质粒的基础上,应用脂质体转染的方法将其分别转染BHK-21细胞,共获得22株BHK-ST3细胞与17株BHK-ST6细胞;进而将NDV Lasota株分别接种以上细胞,通过HA效价及TCID50的测定,分别获得了较适于NDV Lasota株增殖的BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞克隆株。流式细胞仪检测发现,BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞表面相应的唾液酸受体表达丰度均有显着提高,且BHK-ST6-15细胞较BHK-ST3-22细胞更适合于NDV Lasota株的增殖。为了提高NDV在BHK-ST6-15细胞株的增殖效价,本研究在对应用BHK-ST6-15贴壁细胞增殖培养NDV Lasota株的条件进行优化的基础上,一方面将BHK-ST6-15细胞进行低血清悬浮培养的驯化;另一方面对NDV Lasota株在悬浮培养的BHK-ST6-15细胞上增殖条件进行了优化。结果显示,成功实现了BHK-ST6-15细胞的低血清悬浮培养,应用该细胞增殖培养NDV Lasota株,其细胞培养液效价可达108.375 TCID50/0.1 mL,显着高于BHK-ST6-15贴壁细胞,从而为实现NDV Lasota株细胞悬浮培养产业化生产奠定了良好基础。我国家禽活疫苗的生产主要依靠接种SPF鸡胚制备而成,该工艺主要存在批次间稳定性差、家禽外源病毒污染的风险和鸡胚废弃物无害化处理等问题,因此,影响着家禽活疫苗的生产。为替代传统鸡胚生产工艺、提升产品质量与效益,本研究应用全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗,并根据《中华人民共和国兽药典》2015年版三部的要求对其进行检测。结果显示,NDV Lasota株活疫苗各项指标均符合要求,可完全替代传统鸡胚生产工艺。同时,该技术具有技术成熟、自动化程度高、安全性强、产品质量稳定等优点,且显着降低了生产成本、提高了经济效益,从而为全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗奠定了良好基础。
许建军[8]（2019）在《BT细胞微载体悬浮培养技术生产猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）及安全免疫性能研究》文中进行了进一步梳理猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（CSF virus,CSFV）引起的猪的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病,其临床特征为发病急、高热稽留和细小血管壁变性,从而引起全身泛发性小点出血和脾脏梗死的典型症状。CSF被世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health,OIE）列为法定报告疫病,在我国被列为一类传染病,对养猪业危害巨大。疫苗接种是目前防控CSF感染最有效和最经济的手段。目前我国临床应用的CSF疫苗毒种均为C株疫苗毒制备,根据不同工艺可分为CSF活疫苗（脾淋源）、CSF活疫苗（乳兔源）、CSF活疫苗（细胞源）、CSF活疫苗（传代细胞源）,其中CSF活疫苗（传代细胞源）被广泛应用。抗原生产是疫苗制造的关键环节,抗原含量及免疫原性是决定疫苗质量的关键因素。目前国内生产疫苗抗原主要采用传统的转瓶工艺,但是该工艺生产中存在易污染、批间差异大的缺陷。建立以生物反应器为基础的微载体悬浮培养技术将是动物疫苗生产的主流趋势。基于此,本研究对利用牛睾丸传代细胞（Bovine testicular passage cells,BT）微载体悬浮培养技术生产CSF活疫苗的关键工艺参数进行优化,并对利用该工艺生产的3批次实验制品的安全性、免疫效力的质量进行评价,为采用BT细胞微载体悬浮培养技术生产安全、低成本、高效的猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）奠定技术基础。1.BT细胞微载体悬浮培养CSFV的增殖工艺研究本研究对微载体悬浮培养BT细胞的生长条件及CSFV的增殖条件进行研究,确定其关键参数为:细胞接种密度为1.5×105个/mg～2.0×105个/mg,搅拌转速为40～45 rpm（2L生物反应器）、45～50 rpm（10L生物反应器）,感染复数（Multiplicity ofinfection,MOI）为0.1～0.5,接种后第5d第一次收获病毒液并更换维持液,以后每隔4d收获病毒液并更换维持液,可连续收获8次,CSFV抗原平均含量达到107.2 FAID50/mL以上。2.BT细胞微载体悬浮培养生产猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）实验室制品的成品检验对利用BT细胞微载体悬浮培养制备的3批次猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）试制品进行成品检验,结果显示,3个批次实验室制品的病毒含量分别为105.0、104.9、105.1 FAID50/头份,每头份剂量为7500兔体感染量（RID）;性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、鉴别检验、剩余水分检验和真空度检验结果均符合《猪瘟活疫苗制造及检验规程（Ⅱ）》质量标准要求。3.BT细胞微载体悬浮培养生产猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）实验室制品的安全性检验为评价采用微载体悬浮培养工艺生产的猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）的安全性,本研究采用实验室试制的3批次疫苗（批次分别为:CSFXF001、CSFXF002、CSFXF003）,选择4-6周龄CSF抗体阴性健康仔猪,对15头单剂量接种（1头份/头）、对15头单剂量重复接种（2次接种间隔14 d）,同时设阴性对照组;选择4～6周龄不同品种的CSF抗体阴性健康仔猪（长白、大白、杜洛克）,对15头进行超剂量接种（30头份/头）,设阴性对照组;选择2周龄CSF抗体阴性健康仔猪,对15头超剂量（30头份/头）接种,设阴性对照组;选择妊娠前期（妊娠20～30 d）、中期（妊娠50～70 d）、后期（妊娠80～95 d）的母猪各10头,分别5头超剂量（30头份/头）接种,5头做为阴性对照组。结果显示,实验室试制的3批次猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）对CSF抗体阴性健康仔猪单剂量单次接种、单剂量重复接种、对不同品种仔猪超剂量接种以及对2周龄日龄仔猪超剂量接种,免疫组和对照组仔猪的体温均在正常范围之内、动物精神状态及食欲良好,未见不良反应,疫苗注射部位未见红肿、化脓等症状。对妊娠前、中、后期母猪超剂量接种,免疫组和对照组母猪精神状态及食欲均良好,均未流产,未见临床不良反应,断奶后仔猪平均成活率达97%以上,免疫组仔猪与对照组仔猪从出生到断奶体重增重无差异。4.BT细胞微载体悬浮培养生产猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）实验室制品效力检验为评价采用BT细胞微载体悬浮培养工艺生产的猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）的免疫效力,本研究对试制的CSFXF001批产品,分别按105.0 FAID50/头、101.5 FAID50/头、100.5 FAID50/头免疫4-6周龄CSF抗体阴性健康仔猪,每组5头,设阴性对照组,免疫后14 d攻击检验用强毒CSFV石门系血毒1 mL,观察16 d,确定CSF活疫苗的最小免疫剂量;将CSFXF002批产品与市售同类制品CSF活疫苗（转瓶工艺传代细胞源C株）产品,按101.5 FAID50/头免疫4-6周龄CSF抗体阴性健康仔猪,每组5头,设阴性对照,免疫后14 d攻击检验用强毒CSFV石门系血毒1 mL,观察16 d后对比两种工艺的产品免疫保护效果;将CSFXF003批产品,按1头份/头免疫4-6周龄CSF抗体阳性健康仔猪10头,同时设CSF母源抗体阳性对照组和CSF抗体阴性对照组,免疫后14 d攻击检验用强毒CSFV石门系血毒1 mL,观察16 d后统计各组保护情况,分析CSF母源抗体对疫苗免疫的干扰。试验结果显示猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）的最小免疫剂量为100.5FAID50/头份;悬浮工艺与传统转瓶细胞传代工艺生产的CSF活疫苗免疫攻毒后,免疫组均5/5保护,对照组5/5死亡,说明两种工艺生产的CSF活疫苗免疫效果无差异;携带母源抗体的免疫组实验动物10/10保护,未免疫疫苗的CSF母源抗体阳性组5/10保护,CSF抗体阴性对照组实验动物5/5发病,5/5死亡,说明猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）可以突破母源抗体,对实验动物起到良好的保护效果。结果表明,采用BT细胞微载体悬浮培养技术生产猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）,批间稳定,抗原含量及免疫原性好,安全、有效,为后续的CSF活疫苗的悬浮工艺研究提供技术参考。
毕津豪[9]（2019）在《犬瘟热弱毒疫苗耐热冻干保护剂的研究》文中提出生物制品的效力易受温度影响,在储存及运输过程中需保持低温。而依托高成本的冷链运输一直是疫苗配送所面临的巨大问题,若无法将疫苗有效保存,可带来免疫失败等巨大经济损失。根据我国2001版《兽用生物制品质量标准》,冻干活毒疫苗在2-8℃有效保存期多为3-9个月。有限的保存期限制了疫苗的持续效力,同时也为我国无法提供良好保存条件的偏远地区带来诸多不便。生物制品的稳定保存主要依赖于保护剂的添加。目前我国传统冻干保护剂配方多为明胶、蔗糖、乳糖、脱脂乳等基础成分,但是它们大都存在配方简单,保护功能差等诸多问题。因此开发新型活病毒保护剂,对解决传统配方稳定性差,延长疫苗的持续效力具有重要意义。犬瘟热（Canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的一种高度接触性动物传染病,病死率高达80%以上,是当前威胁宠物健康,毛皮经济动物饲养及野生动物保护业的重要疫病之一。目前主要通过疫苗接种预防CD,其中CD疫苗使用的Ondersteport株多为Vero细胞适应株,是较为成熟的标准弱毒疫苗株,是目前常见的商品化疫苗所用毒株,其体外培养存在滴度低且无眼观细胞病变等问题。同时CDV为单股负链RNA病毒,对温度及外界环境十分敏感,不易长期有效保存。基于以上问题,研发一种耐热冻干保护剂为CDV疫苗的稳定保存提供物质基础具有重要意义。第一部分:犬瘟热病毒（Ondersteport株）培养条件优化首先比较不同接毒量对CDV滴度的影响,设置感染复数（Multiplicity of infection,MOI）为0.5,0.1,0.01和1%,2%的接毒量接种Vero细胞后检测病毒滴度;选取1%,2%接毒量接种Vero细胞,绘制1至5d的生长动力学曲线;分别比较冻融及超声波破碎两种收毒方法,对CDV滴度的影响;利用各组实验的最佳条件建立基础种子批毒。结果表明,2%接毒量所收获病毒液滴度最高可达106.38 TCID50/mL。病毒生长曲线表明,接毒后第4天CDV滴度达到最高点为106.681.681 TCID50/mL。传统冻融收毒方法优于超声波破碎方法,其滴度高达107.38 TCID50/mL。扩大培养所建三批基础种子毒,无菌检验及支原体检测合格,为后续耐热冻干保护剂的筛选及优化提供物质基础。第二部分:犬瘟热弱毒疫苗耐热冻干保护剂的筛选及进一步优化基于各类成分的保护机制,根据耐热冻干保护剂的基本构成原则,分别设计A1、B2、C3、D4四种配方;利用耐老化实验37℃保存7d,筛选出最优基础配方;利用Plackett-Burman试验（简称PB试验）确定最优基础配方中各成分含量影响病毒存活率的显着性;建立回归分析,利用软件Minitab 18确定最大响应值下各成分的最优组合并进行冻干验证。结果表明,经耐老化实验后,C3配方病毒存活率最高可达72.82%;PB试验（N=12）模型不显着,最大响应值为97.12%;病毒经最优配方冻干后滴度可达106.335 TCID50/mL。综上所述,本研究成功筛选出一种适用于CDV（Ondersteport株）的耐热冻干保护剂,可为今后CDV疫苗的研发及保存提供参考。
张茜[10]（2019）在《替米考星纳米结构脂质载体处方优化、质量评价及在肠上皮细胞上的吸收机制研究》文中研究表明替米考星（TMS）是一种大环内酯类动物专用抗生素,其以强大的抗菌作用成为畜禽呼吸道感染防治的首选药,还具有潜在的抗病毒和抗炎作用。由于其注射给药易导致心脏与肾脏毒性,因此其口服给药是兽医临床上应用最广泛的给药途径。然而,替米考星的溶解度低、适口性差、在胃酸中不稳定等均影响其临床疗效。纳米结构脂质载体（NLCs）作为一种新型药物递送载体,具有载药量高、稳定性好、避免药物泄漏、增加药物渗透性和提高口服生物利用度等特性。故而,本研究通过正交设计获得替米考星纳米结构脂质载体（TMS-NLCs）的最优处方,然后对高剪切-超声分散法制备的TMS-NLCs进行理化性质和药学性能的表征,并探究其在肠细胞模型上的吸收作用与机制。首先利用单因素法筛选影响较大的处方与工艺因素,然后采用L9（34）正交试验设计表安排试验,筛选NLCs的最优处方及制备工艺。确定的最适制备方案为固液脂质比1:9,乳脂比3:10,药脂比3:10和冷水分散稀释比1:1;其他条件为:吐温80（T80）在油相中,油水混合时将油相加入水相,超声20 min后将热的初乳在60 s内分散入冷水中以形成TMS-NLCs。获得TMS-NLCs最优处方的粒径为283.03±6.64 nm,多分散系数（PDI）为 0.219±0.027,zeta 电位为-30.04±1.36 mV,包封率（EE）高达（93.46±0.50）%,载药量（DL）为（9.23±0.08）%。透射电镜下观察 TMS-NLCs 表面光滑呈球形,粒度分布相对均匀,且无团聚。然后对筛选的最优处方TMS-NLCs进行质量评价。先将其冷冻干燥获得冻干粉,利用X射线衍射（XRD）、差示扫描量热（DSC）以及傅立叶变换红外光谱（FT-IR）等技术考察药物与载体脂质基质的相互作用,同时对储存、高低温高速离心、稀释以及模拟胃肠液稳定性进行综合评价。采用超滤离心（UC）法分离TMS-NLCs与游离TMS,并通过高效液相色谱（HPLC）法测定包封率与载药量。选择透析袋法研究其体外释放行为。结果显示,使用10%蔗糖作为保护剂冻干效果最好。XRD、DSC和FT-IR表征结果揭示,TMS是以分子形式溶解在处方的脂质基质中,使得非晶体结构的TMS包裹于NLCs中。综合理化性质评价,表明TMS-NLCs具有良好的稳定性。建立UC-HPLC法测定TMS-NLCs包封率与载药量,替米考星在1～20 μg/mL范围内,峰面积与浓度呈良好线性关系（R2=0.9999）,日内及日间精密度RSD均小于5%,超滤膜吸附率、加样处理回收率以及超滤加样回收率均满足方法学要求,同时此法重复性好、准确度高、操作简便且快速易行。体外释放研究表明,无论在模拟胃液还是肠液中,TMS-NLCs均呈现出缓释特性。以上结果说明,NLCs是可用于TMS经口给药制剂的一种新载体。最后利用Caco-2和MDCK-cbAbcg2/Abcb1细胞单层模型评价TMS-NLCs的渗透性及其吸收机制。通过完整性、通透性以及单层细胞形态观察确证细胞单层模型的成功建立,而后利用MTT法筛选药物转运适宜浓度范围及评价示踪剂与抑制剂的毒性作用;最后进行一系列单、双向转运试验评价TMS-NLCs渗透性并阐明吸收机制。结果显示,MDCK-chAbcg2/Abcb1细胞培养6天后跨上皮电阻（TEER）值可达1700 Ω·cm2以上;Caco-2细胞培养21天后的TEER值稳定在450Ω·cm2以上;转运前后TEER值均无明显变化;FE-TEM观察发现,两种细胞均分化成类肠上皮细胞样结构;荧光黄Papp值在两种细胞上均<0.50×10-6 cm/s,普奈洛尔Papp值均之10×10-6 cm/s,证实了两种细胞单层模型的成功构建。MTT分析显示,转运试验所选择的药物浓度均无明显细胞毒性,可保证转运结果可靠。在Caco-2和MDCK-chAbcg2/Abcb1细胞单层模型上进行渗透性评价显示,TMS为外排转运蛋白P-gp的底物,NLCs对P-gp作用效果与维拉帕米类似,有抑制P-gp外排的作用。双向转运结果揭示NLCs在提高Caco-2或MDCK-chAbcg2/Abcbl细胞吸收TMS的同时还降低P-gp的外排作用,从而提高TMS的渗透性。进一步研究发现,TMS-NLCs通过一种能量依赖性的主动跨细胞方式进行转运。利用不同内吞抑制剂预处理Caco-2或MDCK-chAbcg2/Abcb1细胞单层,研究发现TMS-NLCs主要是通过小窝蛋白/脂筏介导的内吞途径进行胞转,且可使TMS逃避肠道屏障上P-gp外排以及避免溶酶体降解,使其得以完整形式进行跨细胞转运。
二、支原体冻干保护剂的比较试验（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、支原体冻干保护剂的比较试验（论文提纲范文）
（1）基于CRISPR技术的副溶血性弧菌核酸现场检测系统的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号清单 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.1.1 食品安全概况 |
| 1.1.2 食源性致病菌的危害 |
| 1.1.3 食源性致病菌现场检测的重要性 |
| 1.2 副溶血性弧菌的研究进展 |
| 1.2.1 副溶血性弧菌的生物特性及危害 |
| 1.2.2 副溶血性弧菌的检测方法 |
| 1.2.2.1 传统生物学诊断 |
| 1.2.2.2 分子生物学检测 |
| 1.3 核酸扩增检测方法基本流程及其存在的问题 |
| 1.4 冷冻干燥技术原理概述 |
| 1.5 基于CRISPR技术的核酸检测方法研究进展 |
| 1.6 研究目的、内容和技术路线 |
| 1.6.1 研究目的和内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 1.7 本章小结 |
| 第二章 基于热循环仪的荧光PCR检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.1.1 实验材料 |
| 2.2.1.2 常用试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.3.1 实验细菌培养及核酸提取 |
| 2.2.3.2 实时荧光PCR引物设计与体系建立 |
| 2.2.3.3 基于打开热盖的热循环仪的荧光PCR可视化检测 |
| 2.2.3.4 特异性与灵敏度评估 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 实时荧光PCR引物设计及体系建立 |
| 2.3.2 基于热循环仪的PCR扩增可行性评估 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于CRISPR/Cas12a的现场可视化检测方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.1.1 实验材料 |
| 3.2.1.2 常用试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.3.1 副溶血性弧菌核酸快速提取 |
| 3.2.3.2 基于CRISPR/Cas12a的可视化检测体系建立 |
| 3.2.3.3 CRISPR-PCR一体化检测 |
| 3.2.3.4 特异性与灵敏度评估 |
| 3.2.3.5 实际样本的检测分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 CRISPR/Cas12a体系的设计 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas12a体系用于PCR扩增的兼容性评估 |
| 3.3.3 CRISPR-PCR的特异性和灵敏度评估 |
| 3.3.4 CRISPR-PCR在实际样本中的检测应用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 应用于现场检测的核酸扩增试剂冷冻干燥方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和试剂 |
| 4.2.1.1 实验材料 |
| 4.2.1.2 常用试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.3.1 副溶血性弧菌核酸提取及PCR扩增 |
| 4.2.3.2 冻干PCR试剂的制备 |
| 4.2.3.3 冻干工艺的优化 |
| 4.2.3.4 冻干PCR试剂的性能测试 |
| 4.2.3.5 包裹钢珠的冻干PCR试剂的制备及性能测试 |
| 4.2.3.6 冻干PCR试剂的保存稳定性评估 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 冻干工艺的优化 |
| 4.3.1.1 冻干保护剂的优化与筛选 |
| 4.3.1.2 冻干参数的优化 |
| 4.3.2 包裹钢珠的冻干PCR试剂的制备 |
| 4.3.3 包裹钢珠的冻干PCR试剂的性能测试 |
| 4.3.4 冻干PCR试剂的保存稳定性评估 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 主要特色及创新点 |
| 5.3 进一步研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）以聚乳酸-羟基乙酸为载体的氟苯尼考药物控制释放体系及抗菌性能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 第二章 制剂处方前研究 |
| 2.1 仪器与试药 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 试药与耗材 |
| 2.2 方法与结果 |
| 2.2.1 含量测定方法的建立 |
| 2.2.2 FF平衡溶解度的测定 |
| 2.2.3 纳米粒包封率和载药量测定方法的建立 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 第三章 FF-PLGA NPs制备、优化及理化性质研究 |
| 3.1 仪器与试药 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 试药与耗材 |
| 3.2 方法与结果 |
| 3.2.1 乳化溶剂法制备FF-PLGA NPs |
| 3.2.2 制备工艺的考察 |
| 3.2.3 单因素考察FF-PLGA NPs制备处方 |
| 3.2.4 正交试验设计优化 |
| 3.2.5 FF-PLGA NPs理化性质的研究 |
| 3.2.6 FF-PLGA NPs平衡溶解度及体外释放行为的研究 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 第四章 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs制备、优化及理化性质研究 |
| 4.1 仪器与试药 |
| 4.1.1 实验仪器 |
| 4.1.2 试药与耗材 |
| 4.2 方法与结果 |
| 4.2.1 2-HP-β-CD加入方法的考察 |
| 4.2.2 单因素考察FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs制备处方 |
| 4.2.3 正交试验设计优化 |
| 4.2.4 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs理化性质的研究 |
| 4.2.5 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs平衡溶解度及体外释放行为的研究 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 第五章 PEG改性的FF-PLGA NPs制备、优化及理化性质研究 |
| 5.1 仪器与试药 |
| 5.1.1 实验仪器 |
| 5.1.2 试药与耗材 |
| 5.2 方法与结果 |
| 5.2.1 单因素考察PEG改性的FF-PLGA NPs制备处方 |
| 5.2.2 正交试验设计优化 |
| 5.2.3 FF-PEG_(4000)-PLGA NPs理化性质的研究 |
| 5.2.4 FF-PEG_(4000)-PLGA NPs平衡溶解度及体外释放行为的研究 |
| 5.3 讨论与小结 |
| 第六章 三种冻干纳米粒制剂的制备及理化性质的研究 |
| 6.1 仪器与试药 |
| 6.1.1 实验仪器 |
| 6.1.2 试药与耗材 |
| 6.2 方法与结果 |
| 6.2.1 冻干粉末的评价指标 |
| 6.2.2 冻干工艺的考察 |
| 6.2.3 冻干工艺的确定 |
| 6.2.4 冻干处方的筛选 |
| 6.2.5 三种冻干纳米粒制剂理化性质的研究 |
| 6.2.6 冻干纳米粒制剂初步稳定性考察 |
| 6.3 讨论与小结 |
| 第七章 体外抑菌活性研究及初步安全性评价 |
| 7.1 仪器与试药 |
| 7.1.1 实验仪器 |
| 7.1.2 试药与耗材 |
| 7.2 方法与结果 |
| 7.2.1 普通琼脂培养基的制备 |
| 7.2.2 菌种活化、培养、计数 |
| 7.2.3 抑菌圈测定 |
| 7.2.4 MIC测定 |
| 7.2.5 MBC测定 |
| 7.3 体外溶血评价 |
| 7.3.1 红细胞悬液的制备 |
| 7.3.2 实验方法与结果 |
| 7.3.3 溶血百分率的测定 |
| 7.4 讨论与小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
（3）检测滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原的研制和间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 滑液囊支原体感染净化监测技术研究进展 |
| 1 病原学概述 |
| 2 致病性及其危害 |
| 3 流行病学 |
| 4 防控与净化措施 |
| 4.1 疫苗免疫 |
| 4.2 种群净化 |
| 4.3 健全生物安全体系 |
| 4.4 药物防治 |
| 5 检测技术 |
| 5.1 分离鉴定 |
| 5.2 分子生物学检测 |
| 5.3 血清学检测 |
| 5.3.1 血清平板凝集试验 |
| 5.3.2 血凝抑制试验 |
| 5.3.3 酶联免疫吸附试验 |
| 6 MS感染净化监测技术研究展望 |
| 第一章 冻干MS血凝抑制试验抗原的研制及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要实验仪器 |
| 1.1.4 其他生物材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 菌种复苏 |
| 1.2.2 血凝抑制试验抗原备用菌株的筛选 |
| 1.2.3 血凝抑制试验抗原的制备 |
| 1.2.3.1 菌液培养时间的确定 |
| 1.2.3.2 灭活方式的筛选 |
| 1.2.3.3 浓缩方式的优化 |
| 1.2.3.4 冻干保护剂的初筛 |
| 1.2.3.5 冻干抗原的制备 |
| 1.2.3.6 抗原成品的检验 |
| 1.2.4 HI试验方法的优化 |
| 1.2.5 血凝抑制试验抗原在临床样品检测中的应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 血凝抑制试验抗原制备条件的确定 |
| 2.1.1 血凝抑制试验抗原备用菌株的筛选 |
| 2.1.2 菌液培养时间的确定 |
| 2.1.3 灭活方式的确定 |
| 2.1.4 冻干抗原成品检验 |
| 2.1.4.1 物理性质检验 |
| 2.1.4.2 效价测定 |
| 2.1.4.3 特异性检验 |
| 2.1.4.4 稳定性检验 |
| 2.2 HI试验方法的优化 |
| 2.3 血凝抑制试验抗原在临床样品检测中的应用 |
| 3 讨论 |
| 第二章 基于重组蛋白rMSPB的MS抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与载体 |
| 1.1.2 MS分离株 |
| 1.1.3 主要生物试剂 |
| 1.1.4 主要实验仪器 |
| 1.1.5 其他生物材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 MSPB和MSPA蛋白的原核表达 |
| 1.2.1.1 引物设计 |
| 1.2.1.2 基因组的提取 |
| 1.2.1.3 MSPB和MSPA片段的扩增 |
| 1.2.1.4 MSPB和MSPA蛋白原核表达质粒的构建 |
| 1.2.1.5 rMSPB和rMSPA蛋白的诱导表达 |
| 1.2.1.6 rMSPB和rMSPA蛋白的纯化、鉴定以及复性 |
| 1.2.1.7 rMSPB和rMSPA蛋白的Western-Blot鉴定 |
| 1.2.2 检测MS抗体的间接ELISA方法的建立 |
| 1.2.2.1 包被抗原的选择 |
| 1.2.2.2 抗原包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 1.2.2.3 封闭液和封闭条件的确定 |
| 1.2.2.4 抗体稀释液的确定 |
| 1.2.2.5 一抗孵育时间的确定 |
| 1.2.2.6 酶标二抗工作浓度和孵育时间的确定 |
| 1.2.2.7 显色时间的确定 |
| 1.2.2.8 阴阳性临界值的初步确定 |
| 1.2.3 酶标板的储存条件优化 |
| 1.2.3.1 干燥方式优化 |
| 1.2.3.2 储存条件优化 |
| 1.2.4 MS多抗血清和阴性血清的制备 |
| 1.2.5 MS标准血清的标定和阴性血清的检验 |
| 1.2.5.1 ELISA效价测定 |
| 1.2.5.2 交叉反应性测定 |
| 1.2.5.3 Western-Blot分析 |
| 1.2.6 ELISA试验阴阳性对照样品的制备 |
| 1.2.6.1 防腐剂的筛选 |
| 1.2.6.2 阴阳性对照样品的制备 |
| 1.2.6.3 对照样品重复性检验 |
| 1.2.7 阴阳性临界值的确定 |
| 1.2.8 终点滴度的测定 |
| 1.2.9 特异性试验 |
| 1.2.10 重复性试验 |
| 1.2.11 间接ELISA方法在临床样品检测中的应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 MSPB和MSPA基因片段的原核表达 |
| 2.1.1 MSPB和MSPA基因片段的扩增 |
| 2.1.2 原核表达质粒的酶切鉴定 |
| 2.1.3 诱导表达的SDS-PAGE鉴定 |
| 2.1.4 rMSPB和rMSPA蛋白的纯化鉴定 |
| 2.1.5 rMSPB和rMSPA蛋白的Western-Blot鉴定 |
| 2.2 检测MS抗体的间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.1 包被抗原的确定 |
| 2.2.2 抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 2.2.3 封闭液和封闭条件的确定 |
| 2.2.4 抗体稀释液的确定 |
| 2.2.5 一抗孵育时间的确定 |
| 2.2.6 酶标二抗工作浓度和孵育时间的确定 |
| 2.2.7 显色时间的确定 |
| 2.2.8 阴阳性临界值的初步确定 |
| 2.3 酶标板的储存条件优化 |
| 2.3.1 干燥方式优化 |
| 2.3.2 储存条件优化 |
| 2.4 MS标准血清的标定及阴性血清的检验 |
| 2.4.1 ELISA效价测定 |
| 2.4.2 交叉反应性测定 |
| 2.4.3 Western-Blot分析 |
| 2.5 ELISA试验阴阳性对照样品的制备 |
| 2.5.1 ELISA对照样品防腐剂的筛选 |
| 2.5.2 对照样品重复性检验 |
| 2.6 临界值的确定 |
| 2.7 终点滴度测定方法的建立 |
| 2.8 特异性试验 |
| 2.9 重复性试验 |
| 2.10 间接ELISA方法在临床样品检测中的应用 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）激流式生物反应器制备猪瘟活疫苗（细胞源）及其免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪瘟的流行历史 |
| 1.2 猪瘟病毒 |
| 1.3 猪瘟的临床表现及特征 |
| 1.3.1 典型猪瘟症状 |
| 1.3.2 亚急性、慢性猪瘟的表现 |
| 1.4 致病机理 |
| 1.5 猪瘟疫苗 |
| 1.5.1 猪瘟疫苗的分类 |
| 1.5.2 猪瘟疫苗研制历史 |
| 1.5.3 猪瘟组织弱毒活疫苗 |
| 1.5.4 猪瘟弱毒细胞活疫苗 |
| 1.5.5 亚单位疫苗 |
| 1.5.6 核酸疫苗 |
| 1.5.7 标记疫苗 |
| 1.6 猪瘟疫苗的生产工艺 |
| 1.6.1 贴壁细胞工艺 |
| 1.6.2 纯悬浮细胞培养工艺 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 血清 |
| 2.1.3 细胞 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 仪器设备 |
| 2.1.7 主要耗材 |
| 2.1.8 细胞培养基及溶液 |
| 2.1.9 检测试剂盒 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 溶液的配制 |
| 2.2.2 病毒的制备 |
| 2.2.3 种细胞培养 |
| 2.2.4 反应器细胞培养 |
| 2.2.5 反应器的病毒培养 |
| 2.2.6 病毒接种比例的摸索 |
| 2.2.7 疫苗的制备 |
| 2.2.8 成品疫苗的检验 |
| 2.2.9 疫苗免疫效果评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 种毒的制备与检测结果 |
| 3.1.1 脾毒制备家兔定型热结果 |
| 3.1.2 脾毒病毒含量检测结果 |
| 3.1.3 脾毒纯净性和外源病毒检测结果 |
| 3.1.4 脾毒感染性、特异性检测结果 |
| 3.1.5 脾毒安全性检测结果 |
| 3.2 种细胞培养检测结果 |
| 3.2.1 冻存种细胞复苏活力结果 |
| 3.2.2 上罐种细胞筛选检测结果 |
| 3.3 反应器细胞培养种细胞计数结果 |
| 3.4 反应器病毒培养结果 |
| 3.4.1 收获毒液病毒含量和纯净性检验结果 |
| 3.4.2 反应器半成品安全性检测结果 |
| 3.5 接种病毒含量测定结果 |
| 3.6 成品疫苗的检验 |
| 3.6.1 疫苗无菌性等检验结果 |
| 3.6.2 安全检验结果 |
| 3.6.3 疫苗的效力检验结果 |
| 3.6.4 疫苗耐老化检验结果 |
| 3.7 试验苗与商品苗效价检测对比结果 |
| 3.8 疫苗免疫效果评价结果 |
| 3.8.1 与细胞源(牛睾丸细胞)活疫苗组对比试验结果 |
| 3.8.2 与ST细胞活疫苗组对比试验结果 |
| 3.8.3 与脾淋苗活疫苗对比试验结果 |
| 3.8.4 仔猪一次性免疫试验结果 |
| 3.8.5 母源抗体消长对比试验结果 |
| 3.8.6 免疫评价试验结果汇总 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）女性阴道正常菌群分布调查及微生态制剂制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 女性阴道正常菌群分布调查 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.3 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 常规高倍镜镜检结果 |
| 1.2.2 细菌性阴道病联合测定试剂盒检测结果 |
| 1.2.3 细菌培养及生化反应初步鉴定结果 |
| 1.2.4 实时荧光定量PCR鉴定结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 阴道微生态制剂制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 三种菌株的生长曲线测定 |
| 2.2.2 冷冻干燥法制备阴道微生态制剂 |
| 2.2.3 均匀设计方法选择保护剂水平组合 |
| 2.2.4 阴道微生态制剂一般性状检查 |
| 2.2.5 阴道微生态制剂耐酸性试验结果 |
| 2.2.6 阴道微生态制剂含水量测定 |
| 2.2.7 阴道微生态制剂的保存期限检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第3章 综述 |
| 3.1 影响阴道微生态平衡的因素 |
| 3.1.1 内源性因素 |
| 3.1.2 外源性因素 |
| 3.2 乳酸杆菌的研究现状 |
| 3.2.1 乳杆菌的作用机制 |
| 3.2.2 非培养法检测乳酸杆菌 |
| 3.3 阴道微生态环境失调与生殖道感染 |
| 3.4 生殖道感染的治疗 |
| 3.5 微生态制剂的发展现状 |
| 3.5.1 国外微生态制剂的发展现状 |
| 3.5.2 国内微生态制剂发展现状 |
| 3.6 微生态制品制备中常用干燥技术 |
| 3.6.1 喷雾干燥技术 |
| 3.6.2 冷冻干燥技术 |
| 3.7 微生态制品保护剂选择常用设计方法-均匀设计法 |
| 3.8 阴道微生态制剂的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（6）载BLfcin壳聚糖纳米粒温敏水凝胶的制备、表征及体外抑菌作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文略缩词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 奶牛乳房炎的研究概况 |
| 1.1 奶牛乳房炎的简介 |
| 1.2 奶牛乳房炎的发病原因 |
| 1.3 奶牛乳房炎的诊断 |
| 1.4 奶牛乳房炎的防治措施 |
| 2 牛乳铁蛋白肽的研究进展 |
| 2.1 抗微生物肽的概述 |
| 2.2 牛乳铁蛋白肽的来源 |
| 2.3 牛乳铁蛋白肽的生物学活性 |
| 2.4 BLfcin在奶牛乳房炎防治方面的应用进展 |
| 3 壳聚糖载药系统 |
| 3.1 壳聚糖的简介 |
| 3.2 壳聚糖纳米载药体系的发展现状 |
| 3.3 壳聚糖水凝胶的研究进展 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二章 试验研究 |
| 第一节 壳聚糖纳米粒的制备及工艺优化 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 壳聚糖纳米粒的制备 |
| 2.2 LCS-NPs粒径、PDI的测定 |
| 2.3 LCS-NPs制备工艺的优化 |
| 2.4 LCS-NPs的重现性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 LCS-NPs制备的结果 |
| 3.2 纳米粒制备工艺优化的结果 |
| 3.3 重现性试验结果 |
| 4 小结 |
| 第二节 载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的制备和表征 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 试验菌株及细胞 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 载BLfcin纳米粒的制备和表征 |
| 2.2 BLfcin-NPs冻干粉制备工艺优化 |
| 2.3 细胞毒性试验 |
| 2.4 BLfcin-NPs的体外抑菌作用 |
| 3 结果 |
| 3.1 BLfcin-NPs的制备和表征结果 |
| 3.2 BLfcin-NPs冻干粉制备工艺优化的结果 |
| 3.3 细胞毒性试验结果 |
| 3.4 BLfcin-NPs的体外抑菌作用结果 |
| 4 小结 |
| 第三节 载BLFCIN-NPS温敏水凝胶的制备和体外抑菌作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 试验菌株及细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 载BLfcin-NPs温敏水凝胶的制备 |
| 2.2 载BLfcin-NPs温敏水凝胶的表征 |
| 2.3 载BLfcin-NPs温敏水凝胶的体外降解 |
| 2.4 细胞毒性试验 |
| 2.5 体外抑菌试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 载BLfcin-NPs温敏水凝胶的制备结果 |
| 3.2 纳米复合水凝胶的表征结果 |
| 3.3 水凝胶的体外降解结果 |
| 3.4 细胞毒性试验的结果 |
| 3.5 纳米复合水凝胶的体外抑菌结果 |
| 4 小结 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡新城疫病毒研究进展 |
| 1.1 副黏病毒概述 |
| 1.2 NDV的病原学概述 |
| 1.3 NDV分子生物学特性 |
| 1.4 NDV在宿主细胞内的复制增殖 |
| 第二章 新城疫病毒受体研究进展 |
| 2.1 病毒受体特性 |
| 2.2 NDV的唾液酸受体 |
| 2.3 与唾液酸受体相关的酶类 |
| 2.4 影响NDV与受体结合的因素 |
| 2.5 NDV唾液酸受体的分布 |
| 2.6 NDV培养特性 |
| 第三章 新城疫疫苗研究概况 |
| 3.1 常规疫苗 |
| 3.2 新型疫苗--基因工程疫苗 |
| 第二篇 实验研究部分 |
| 第一章 不同细胞系培养NDV特性的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 唾液酸受体SAα2,3Gal和 SAα2,6Gal在不同细胞系表达的比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达唾液酸转移酶细胞株的建立与筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 NDV Lasota株在BHK-ST6-15 细胞上培养条件的优化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基于BHK-ST6-15 全悬浮细胞培养的NDV Lasota株活疫苗的试验研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）BT细胞微载体悬浮培养技术生产猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）及安全免疫性能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分文献综述 |
| 1 CSFV特性 |
| 2 CSF的传播与流行 |
| 3 CSF疫苗研究进展 |
| 4 悬浮培养技术研究进展 |
| 5 牛睾丸细胞的特性及在大规模细胞培养方面的应用 |
| 6 悬浮生产工艺在CSF活疫苗工艺研究方面的展望 |
| 7 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 BT细胞微载体悬浮培养条件的优化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第二章 悬浮培养猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)实验室试制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第三章 悬浮培养猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)安全性评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第四章 悬浮培养猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫效力试验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附表 |
| 致谢 |
（9）犬瘟热弱毒疫苗耐热冻干保护剂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 冷冻干燥技术概述 |
| 1.2 冷冻干燥过程及原理 |
| 1.3 冷冻干燥对病毒的影响 |
| 1.4 保护剂的定义及分类 |
| 1.5 保护剂组成成分及作用机理 |
| 1.6 犬瘟热活疫苗耐热冻干保护剂 |
| 1.7 耐热冻干保护剂的作用机理 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犬瘟热病毒(Ondersteport株)培养条件优化 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 犬瘟热弱毒疫苗耐热冻干保护剂的筛选及进一步优化 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）替米考星纳米结构脂质载体处方优化、质量评价及在肠上皮细胞上的吸收机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略符号 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 替米考星概况 |
| 1.1 替米考星简介 |
| 1.2 替米考星的药理作用 |
| 1.3 替米考星临床应用存在的问题 |
| 2 纳米药物递送系统在口服吸收方面的研究概述 |
| 2.1 脂质纳米粒 |
| 2.2 研究纳米粒子吸收体外细胞模型 |
| 2.3 纳米粒转运及吸收机制 |
| 2.4 纳米载体性质对胞饮作用的影响 |
| 3 本课题的主要研究内容和研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 替米考星纳米结构脂质载体的处方与工艺优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料与设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 单因素考察 |
| 2.2 正交设计优化试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 替米考星纳米结构脂质载体的质量评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料与设备 |
| 1.2 主要工作溶液配制 |
| 1.3 TMS-NLCs进一步质量评价 |
| 1.4 稳定性研究 |
| 1.5 超滤离心结合高效液相色谱(UC-HPLC)法测定TMS-NLCs包封率及载药量 |
| 1.6 体外释放 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 制备TMS-NLCs冻干粉 |
| 2.2 XRD分析 |
| 2.3 DSC分析 |
| 2.4 FT-IR分析 |
| 2.5 稳定性研究 |
| 2.6 UC-HPLC法测定TMS-NLCs包封率及载药量 |
| 2.7 体外释放 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 替米考星纳米结构脂质载体在肠道细胞模型上的渗透性与吸收机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料与设备 |
| 1.2 主要工作溶液配制 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.4 细胞单层模型验证 |
| 1.5 多种转运药物对3种细胞单层毒性检测 |
| 1.6 TMS-NLCs跨膜转运机理研究 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞单层模型验证 |
| 2.2 多种转运药物对3种细胞单层毒性检测 |
| 2.3 Transwell~(?)跨膜转运试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的文章 |
四、支原体冻干保护剂的比较试验（论文参考文献）
- [1]基于CRISPR技术的副溶血性弧菌核酸现场检测系统的研究[D]. 张梦垚. 浙江大学, 2021(01)
- [2]以聚乳酸-羟基乙酸为载体的氟苯尼考药物控制释放体系及抗菌性能的研究[D]. 李姝琪. 广东药科大学, 2021
- [3]检测滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原的研制和间接ELISA方法的建立[D]. 何吉鑫. 扬州大学, 2020
- [4]激流式生物反应器制备猪瘟活疫苗（细胞源）及其免疫效果研究[D]. 苍枫. 内蒙古农业大学, 2020(02)
- [5]女性阴道正常菌群分布调查及微生态制剂制备[D]. 韩丽媛. 华北理工大学, 2020(02)
- [6]载BLfcin壳聚糖纳米粒温敏水凝胶的制备、表征及体外抑菌作用研究[D]. 蔡丽蓉. 北京农学院, 2021(08)
- [7]鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用[D]. 董炳梅. 吉林大学, 2019
- [8]BT细胞微载体悬浮培养技术生产猪瘟活疫苗（传代细胞源C株）及安全免疫性能研究[D]. 许建军. 扬州大学, 2019(06)
- [9]犬瘟热弱毒疫苗耐热冻干保护剂的研究[D]. 毕津豪. 吉林农业大学, 2019(03)
- [10]替米考星纳米结构脂质载体处方优化、质量评价及在肠上皮细胞上的吸收机制研究[D]. 张茜. 南京农业大学, 2019