一、红细胞有望成为药物转运的理想载体（论文文献综述）
沈美丽[1]（2021）在《具有活性氧和剪切应力双重响应药物递送系统及用于动脉粥样硬化治疗的研究》文中研究说明动脉粥样硬化是心血管疾病的关键发病机制,可导致心肌梗死、心绞痛、缺血性心脏病、缺血性脑卒中、中风等心血管疾病的发生。动脉粥样硬化性心血管疾病已成为全球主要的公共卫生问题,即使在医疗水平十分发达的现在,心血管疾病在全球的死亡率依然没有降低,反而成为全球人口发病率和死亡率最高的主要原因。未来10年心血管病患病人数仍将快速增长,因此吸引了越来越多的研究人员参与到了这场遏制动脉粥样硬化发展的“战斗”中。研究表明,炎症贯穿了动脉粥样硬化发展的整个过程,脂质也为其发展起到了重要的推动作用,这些因素赋予了动脉粥样硬化的特殊微环境,如高水平的活性氧（ROS）、高的剪切应力以及高含量的脂质,ROS和脂质水平的降低起到延缓动脉粥样硬化发展进程的作用。本论文以高水平的ROS和高的剪切应力为研究对象,以红细胞（RBCs）作为仿生载体,探究了具有ROS和剪切应力响应的载药纳米粒子和载药胶束的构建方法,及对动脉粥样硬化的治疗效果。主要研究内容如下:（1）构筑了具有剪切应力和ROS双重响应的仿生纳米载药系统,该系统由动脉粥样硬化治疗药物阴离子型辛伐他汀酸（SA）、巯基修饰的阳离子型聚乙烯亚胺（PEI-SH）和RBCs组成,利用静电吸附得到了自组装式载药纳米粒子SA PEI,并将其吸附到红细胞膜上得到了SA PEI@RBCs。SA PEI的载药量为44.4±2.7%,能够响应ROS实现药物释放,体外剪切模型结果证明SA PEI@RBCs具有剪切应力响应。Fe Cl3模型结果证明SA PEI@RBCs具有最佳的治疗效果且拥有良好的体内安全性。（2）设计了负载辛伐他汀酸（SA）的交联树枝状大分子纳米粒子（SA PAM）,并将其吸附于RBCs表面,成功制备了具有ROS和剪切应力双重敏感的给药系统SA PAM@RBCs,并将其用于动脉粥样硬化的治疗。同SA PEI@RBCs相比,在SA PAM@RBCs体系中,纳米颗粒的载药量提高到65.3±2.1%,并能以H2O2触发的方式持续释放SA,能显着降低LPS刺激的RAW 264.7细胞中过量的H2O2水平。剪切敏感模型证明,在低剪切应力（20 dynes/cm2）作用下,SA PAM@RBCs上的SA PAM极少发生解吸附,而在高剪切应力（100 dynes/cm2）的刺激下,SA PAM的解吸附比较彻底,只有很少的SA PAM仍然吸附在红细胞上,表明SA PAM具有较好的剪切应力刺激下的解吸附能力。兔子的Fe Cl3模型和Apo E-/-小鼠模型均显示,SA PAM@RBCs具有比游离SA更好的治疗效果,并且在体内具有极好的安全性。上述结果表明,具有ROS和剪切应力双重敏感的仿生给药系统能为动脉粥样硬化的治疗提供一种比较有前景的策略。（3）开发了可以同时响应动脉粥样硬化斑块处ROS和剪切应力微环境的智能响应系统（SV MC@RBCs）,该系统由RBCs和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-聚硫化丙烯（PGED-PPS）装载辛伐他汀（SV）形成的阳离子胶束（SV MC）组成。该载药系统同SA PEI@RBCs和SA PAM@RBCs相比,作为载体的PGED-PPS还具有降低ROS的作用,可以与辛伐他汀起到协同治疗动脉粥样硬化的作用。体外和体内实验结果表明,SV MC@RBCs可以有效治疗动脉粥样硬化,不仅避免了出血的风险,而且具有出色的体内安全性。这些结果表明,SV MC@RBCs是有望用于治疗ROS相关疾病的治疗性纳米药物。
潘莉莉[2]（2021）在《PON2在急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）发生中的作用及其机制的研究》文中指出【目的】Ph样急性B淋巴细胞白血病（Ph-like B-ALL）,是一种特殊类型的B-ALL,缺乏Ph染色体或BCR-ABL1融合基因,但具有与Ph阳性B-ALL（Ph+B-ALL）相似的基因表达谱。虽然酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的应用极大地改善了Ph-like B-ALL和Ph+B-ALL患者的预后,但相对于其他亚型B-ALL患者,前两者预后仍较差。PON2（对氧磷酶2）在Ph-like B-ALL中表达明显增高,并被列为该类型ALL的诊断分子标志之一。但是,目前关于PON2在B-ALL中的作用及机制尚不明确。课题组前期研究已发现,Pon2敲除可抑制小鼠白血病细胞的体内、外增殖。本文将继续探讨PON2在B-ALL中的临床意义;并以Pon2缺失型小鼠及人PON2缺失型B-ALL细胞株为模型,研究PON2是否通过调节葡萄糖代谢而参与白血病发生,及PON2如何参与葡萄糖代谢;此外,本文尚探讨了针对PON2作用机制的潜在治疗策略。这些研究有助于加深人们对PON2基因的功能及其在B-ALL发病中的作用及机制的认识,为靶向药物的开发奠定理论基础。【方法】1.利用临床试验数据库及多个基因表达公共数据库中有关B-ALL及成熟B细胞恶性肿瘤的基因表达数据及临床预后数据,分析PON2的表达量及其对患者临床预后的影响;2.在病人来源的B-ALL细胞中利用western blot分析PON2蛋白表达量;3.将野生型与Pon2缺失型小鼠来源的供体B细胞分别经尾静脉移植入成熟B细胞缺陷小鼠,植入成功后腹腔注射NP抗原,研究Pon2在小鼠体内B细胞发育成熟与NP抗原特异性B细胞形成中的作用;4.利用野生型与Pon2缺失型小鼠来源的骨髓细胞,经体外培养,并转入BCR-ABL1和NRASG12D等癌基因后构建出小鼠B-ALL细胞模型;检测与比较野生型与Pon2缺失型小鼠B-ALL细胞的葡萄糖摄入、能量生成、乳酸产生与糖酵解效率;5.分别在野生型与Pon2缺失型小鼠B-ALL细胞上构建可诱导型（Tet-on）Pon2过表达系统,利用多西环素诱导Pon2的表达,检测Pon2对B-ALL细胞葡萄糖代谢的作用;6.在野生型与Pon2缺失型小鼠来源的B-ALL细胞中,利用以慢病毒为载体的RNA干扰技术下调Stom基因,检测Stom敲低对Pon2缺失型细胞的葡萄糖代谢的影响;7.在人B-ALL细胞（BV173）中,利用电穿孔介导的CRISPR/Cas9导入技术（RNP）敲除PON2,并利用流式细胞分选术进行单细胞分选,后扩增细胞形成单细胞克隆;在明确PON2被完全敲除后,检测PON2缺失对B-ALL细胞的细胞学与代谢学表型的影响;8.在人野生型与PON2缺失型的B-ALL细胞中,利用CRISPR/Cas9敲除STOM,检测STOM的敲除对PON2缺失型细胞的葡萄糖摄入与细胞克隆形成能力的影响;9.检测PON2敲除或过表达对STOM与GLUT1蛋白表达量的影响;10.利用co-IP检测内源性及PON2过表达下,PON2与STOM及GLUT1的相互作用,并检测PON2敲除对STOM与GLUT1的相互作用的影响;11.利用流式细胞术检测PON2的细胞膜表面表达;12.检测Pon2敲除的小鼠与PON2敲除的人的B-ALL细胞对糖皮质激素（GCs）的敏感性。【结果】1.在Ph+B-ALL和Ph-like B-ALL患者中PON2 mRNA和蛋白表达量增高;2.PON2 mRNA高表达提示B-ALL患者临床预后差,而对成熟B细胞系肿瘤的生存预后无影响;3.Pon2对B细胞的发育成熟与NP抗原特异性B细胞形成无影响;4.Pon2敲除小鼠B-ALL细胞的葡萄糖摄入减少,ATP生成减少,乳酸产生减少,糖酵解速率下降;在野生型BCR-ABL1小鼠B-ALL细胞中,Pon2的过表达显着增加ATP的生成;在Pon2缺失型BCR-ABL1小鼠B-ALL细胞中,Pon2的回复表达亦显着回复其ATP的生成;5.Stom mRNA表达的降低部分回复了Pon2缺失型BCR-ABL1小鼠B-ALL细胞的ATP生成;6.PON2敲除导致人B-ALL细胞（BV173）的克隆形成能力降低,细胞周期阻滞在G0/1期;7.PON2敲除导致人B-ALL细胞（BV173）的葡萄糖摄入减少,ATP生成减少;8.PON2敲除或过表达均不影响GLUT1与STOM的表达;9.免疫共沉淀实验证实PON2可结合STOM与GLUT1,PON2的敲除导致STOM与GLUT1的相互作用增加;10.STOM的敲除完全回复了PON2缺失型细胞的葡萄糖摄入,部分回复了PON2缺失型细胞的能量ATP生成与细胞克隆形成能力;11.PON2可表达于HEK293T细胞与小鼠B-ALL细胞膜表面;12.PON2的敲除明显增强了小鼠(BCR-ABL1 B-ALL和NRASG12D B-ALL)及人白血病细胞（BV173）对GCs的敏感性。【结论】1.PON2的高表达对B-ALL患者的生存影响具有独特的意义;2.PON2通过分别与GLUT1和STOM结合,物理阻断GLUT1与STOM的相互作用,可促进葡萄糖摄入与能量ATP生成,使B细胞得以克服能量关卡限制而发生恶性转变;3.PON2的敲除明显增强了小鼠及人白血病细胞对葡萄糖转运抑制剂GCs的敏感性。靶定PON2对糖代谢的调节通路有望成为Ph-like B-ALL治疗的新途径,以便改善PON2高表达的难治/复发B-ALL患者的预后。
石家愿[3]（2021）在《靶向线粒体的蛋白质无载体递送及应用》文中指出蛋白质是生命活动的主要承担者,机体多种疾病的发生、发展和细胞内蛋白质的活性丧失与功能异常有关,因此向胞内递送功能蛋白质是干扰和治疗相关疾病最直接有效的方式。近十年来,蛋白质药物由于活性高、靶标明确、副作用小和良好的生物相容性逐渐成为医药市场的主导者。然而,天然蛋白质无法自主跨越细胞膜制约着蛋白质作为药物的应用。目前蛋白质递送系统存在着通用性差、载体依赖、制备复杂等缺点。因此,我们致力于发展一种简单通用的非载体依赖的蛋白质递送系统,并通过引入光刺激响应释放机制进一步提高蛋白质递送系统在时间和空间上的可控性。活性氧（Reactive oxygen species,ROS）是一类氧化能力强、化学性质活泼的含氧物总称,主要产生于线粒体及NADPH氧化酶系统等。ROS的功能取决于其胞内水平,处于内稳态的ROS与细胞的生长、代谢、增殖紧密相关,过低水平的ROS造成细胞代谢失衡,高水平的ROS引发细胞癌变及促进肿瘤的发展,过高水平的ROS导致细胞氧化损伤、凋亡及坏死。通过抗氧化酶的细胞递送,可以直接高效地调控胞内ROS水平,起到干扰疾病进程的重要作用,如抗癌等。由于线粒体既是ROS产生的主要部位,又是ROS作用的重要位点,向线粒体靶向递送抗氧化酶将有效调控线粒体功能,为线粒体相关疾病的治疗提供依据。综上所述,功能蛋白质无载体递送系统的开发及利用抗氧化酶干扰疾病进程对蛋白质药物的应用和发展具有重要的意义。因此,本论文在这两个方面进行了系统研究,取得了以下成果:1.利用生物模拟转氨反应将线粒体靶向荧光基团罗丹明B（RhB）特异性修饰在蛋白质的N末端,在不影响蛋白质结构和活性的基础上,构建了一个不依赖任何外源载体的蛋白质递送系统,能够将多种蛋白质通过有机阳离子转运蛋白介导的非内吞途径递送进细胞并靶向线粒体。进入细胞后的抗氧化酶（铜锌超氧化物歧化酶、过氧化氢酶）依旧保持活力,调控胞内相关ROS物种水平。这实现了仅通过简单的化学修饰,就在不依赖物理工具、化学或生物载体的条件下将功能蛋白质递送进细胞并保持活力地靶向线粒体。此外,通过引入香豆素光笼,我们在细胞质及线粒体中成功实现了蛋白质的光控释放,使蛋白质递送在时间和空间上变得更加可控。2.癌细胞为了维持快速的生长、代谢和增殖,相关氧化还原信号通路处于持续激活状态,癌细胞内的ROS处于高位水平,因此癌细胞对ROS内稳态失调更为敏感。通过向胞内递送高活性的抗氧化酶（铜锌超氧化物歧化酶、过氧化氢酶）使癌细胞内ROS水平在短时间内显着变化,达到了选择性杀死癌细胞的目的。小鼠实验结果表明RhB特异性修饰抗氧化酶生理毒性低,能够在高表达有机阳离子转运蛋白的器官中富集,如肝、肾等,这些器官也是容易受到氧化损伤的器官。不仅如此,RhB特异性修饰抗氧化酶还可以穿透血脑屏障进入脑组织。和小分子N-RhB相比,RhB特异性修饰抗氧化酶具有更低的肾清除率及更久的体内停留时间。RhB特异性修饰过氧化氢酶在肿瘤组织中的富集,通过抑制肿瘤细胞增殖,发挥了抑制肿瘤生长的功效。3.线粒体代谢紊乱与功能异常和多种疾病如肿瘤、神经退行性疾病、Ⅱ型糖尿病、肥胖以及衰老紧密相关。向A549癌细胞线粒体靶向递送过氧化氢酶,我们发现癌细胞线粒体功能受损,出现ATP合成受阻、三羧酸循环紊乱、膜电位降低、膜通透性转换孔开放及细胞色素C外流等;而向COS-7细胞线粒体靶向递送过氧化氢酶能够使该类正常细胞的DNA和线粒体避免H2O2造成的氧化损伤。这两种结果在抗氧化酶、ROS水平和线粒体功能三者之间建立了关系,为预防和干扰ROS导致的线粒体相关疾病奠定了基础。
杜鹃[4]（2021）在《CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究》文中研究表明1 研究背景急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）是以肾滤过功能快速丧失为特点的临床综合征,表现为尿素氮、肌酐等代谢产物的蓄积和/或尿量的减少,其病理特点主要为急性肾小管坏死。研究发现住院患者的发生率约为2-21%,其在社区医院发病率约为2%,而在大型医院发病率可达20%,重症监护病房（Intensive care unit,ICU）的发病率可达50%以上。AKI导致死亡率增加,住院时间延长,以及慢性肾病（Chronic kidney disease,CKD）的发病率增加。总之,AKI给公共卫生及社会资源带来巨大的压力,成为严重的健康问题。传统与新发现的肾病生物学标志物,如血尿素氮、血肌酐、尿NGAL、KIM-1及TIMP2-IGFBP7乘积等,可协助进行AKI的预测和诊断。但它们都仅仅指向预测肾功能降低或肾损伤的发生,缺乏预测肾功能恢复的能力。患者肾损伤的持续时间及肾功能转归可显着影响患者远期预后,因此,早期预测、识别患者的恢复表型,及早干预,促进肾功能早期恢复、改变恢复表型,或能显着改善AKI患者的预后。在预测肾功能恢复的生物学标志物方面,存在较大空白。目前临床亟需理想的生物标志物预测AKI肾功能的转归。外泌体是由细胞分泌的直径为30-150nm的微小囊泡,其中包含完整的膜蛋白（尤其是糖蛋白）、外周膜蛋白、胞质、核蛋白以及细胞内组分,如miRNA,mRNA和代谢产物。同时外泌体通过受体与配体的相互作用,与靶细胞膜的附着/融合或被受体细胞内化,来进行细胞间通讯以及蛋白质和核酸的细胞间交换,从而发挥细胞间信使的作用,参与增殖、凋亡、免疫、凝血等多种生理及病理过程。尿液外泌体主要起源于肾单位管腔和泌尿道内衬的细胞,循环外泌体难以穿过肾小球滤过膜。多项研究发现,尿液外泌体RNA,miRNA和蛋白质可以较尿液其他生化成分更早的反映肾脏疾病中基因表达的变化。尿液外泌体有望成为一种有效且非侵入性的肾脏疾病生物标记物。同时,临床前研究提示外源性外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进修复,提示外泌体可能直接参与肾脏损伤与修复过程。因此,较其他尿液中的分子,外泌体更及时、更直接地体现肾脏细胞的病理生理状态,在预测预后方面更具有优势。CD26,又称为二肽基肽酶 Ⅳ（Dipeptidyl-peptidase 4,DPP4）,是广泛表达于多种细胞表面的一种糖蛋白,可以裂解多种底物的N端二肽基,包括神经肽、肽激素、血管活性肽、趋化因子以及一些生长因子和细胞因子。另外CD26是多功能蛋白,除蛋白水解作用外,以多种方式发挥多种促增殖、免疫和炎症调节等作用。但CD26在AKI中的作用仍待阐明。最近的一项蛋白组学研究发现,与其他尿液及血清蛋白相比,尿CD26在AKI后发生显着变化,推荐尿CD26,尤其尿细胞外囊泡的CD26,为AKI候选生物标志物,值得进一步研究。多项尿液外泌体的组学研究也发现尿液外泌体富含CD26,主要由CD26表达极为丰富的远端肾小管上皮细胞及其他肾脏细胞所释放。尿液中外泌体结合CD26较尿液游离CD26更具有肾脏特异性,且已证实与外泌体结合是尿CD26的主要存在形式,因此,尿外泌体CD26可能对肾功能转归的预测更具有优势。综上,与AKI的早期预测相比,预测肾功能转归的生物标志物仍有较大空白,为临床所亟需。尿外泌体有可能成为新的肾损伤、肾功能转归预测的生物标志物,尿外泌体CD26能否作为AKI的预后标志物有待进一步研究。2目的（1）比较重症AKI患者与重症非AKI患者之间尿外泌体CD26水平的变化,探索尿外泌体CD26是否与AKI相关;（2）探讨尿外泌体CD26是否与AKI分期相关;（3）探讨尿外泌体CD26是否与90天内主要肾脏不良事件相关;（4）（4）探讨尿外泌体CD26是否与AKI肾功能恢复相关;（5）探讨尿外泌体CD26对AKI肾脏功能恢复的预测价值。3方法3.1研究设计该研究为单中心前瞻队列观察性研究。我们同时也收取了入住ICU的非AKI患者作为对照,首先比较两组间尿外泌体CD26表达的差异,以探讨尿外泌体CD26表达与AKI发生是否相关,并通过多元线性回归分析各临床因素对尿外泌体CD26表达有无影响。在AKI患者中按CD26+尿外泌体比率分为CD26高表达和低表达组,首先通过双向比较研究尿外泌体CD26与AKI分期、住院死亡率的关系,继而用生存分析的方法比较尿外泌体CD26表达的高/低与90天内主要肾脏不良事件（MAKE）的关系。其中MAKE包含3个成分,即死亡、接受肾脏替代治疗及肾功能持续恶化,对3个终点和组合终点分别进行分析及检验。应用同样的方法分析尿外泌体CD26表达水平与28天内肾功能恢复的关系,并进一步应用Cox回归分析进行多因素分析;进而在AKI存活者中对3个肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复）进行分析,通过单因素和多因素分析验证尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复和院内肾功能恢复之间的关系。最后,在AKI存活者中检验尿外泌体CD26对早期肾功能恢复,出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测价值,并进行亚组分析。3.2研究对象研究连续纳入2017年1月至2018年1月入住山东大学齐鲁医院ICU,符合AKI诊断的成年患者,构成研究队列。AKI的诊断按照2012 KIDIGO指南推荐的诊断标准。排除标准为:（1）无尿;（2）严重的尿路感染;（3）泌尿系结石或肿瘤;（4）既往应用CD26/DPP4抑制剂;（5）患者或法定代表人拒绝。对照组的患者通过连续筛查2017年1月-2017年3月入住ICU的不符合AKI诊断标准的成年重症患者。排除标准同AKI组。入选患者均按照2012 KIDIGO指南的推荐进行治疗。3.3临床资料的采集采集患者的一般情况,包括:性别,年龄,身高、体重;采集患者的慢性病史及急性合并症;采集患者用药史;生命体征;采集入住ICU 24h内的Scr、尿量,及血常规、血生化、肝功能等数值。计算入住ICU第一天的APACHEII评分及非肾脏APACHE II。3.4临床终点的定义及随访本研究定义的主要终点是90天主要肾脏不良事件（MAKE）,包含:死亡、接受肾脏替代治疗（RRT）和持续肾功能恶化（较入组时肌酐≥200%）。次要终点为肾功能恢复。肾功能恢复的定义为不再符合AKI和CKD的任何一条诊断标准。肾功能恢复终点包含:早期肾功能恢复（7天内）,出院肾功能恢复（出院时处于肾功能恢复状态）和院内肾功能恢复（住院期间发生过肾功能恢复）。随访患者至90天,随访其存活与否,有无接受肾脏替代治疗（RRT）及肌酐数值等。若发生以上事件,记录事件发生的时间,以进行分析。3.5标本采集及保存入组患者在入住ICU的24小时内留取新鲜尿液15ml。常温下,以300g转速离心10min,弃沉渣,取上清,放入-80℃冰箱备用。3.6外泌体分离纯化通过差速超速离心法对尿液标本中的外泌体进行分离和纯化。3.7电镜观察外泌体显微结构样品前处理后,透射电镜观察AKI患者尿液外泌体的超微表征。3.8检测外泌体特征性蛋白利用Western blot及流式细胞术检测外泌体特征性蛋白。3.9乳胶微球辅助的流式细胞术检测尿液外泌体中CD26醛/硫酸盐乳胶微球吸附分离提纯的尿液外泌体,荧光素标记的流式抗体孵育结合的乳胶微球,流式细胞仪检测CD26阳性的尿液外泌体的阳性率。3.10统计学方法对采集的临床资料及检验数据,连续变量用中位数及四分位间距描述,分类变量的描述为病例数（n）和百分比（%）。对于连续变量,采用Student’s t-test检验用于呈正态分布的数据比较,Mann-Whitney检验和Kolmogorov-Smirnov检验用于呈非正态分布的数据比较。对于分类变量,用Pearson’s chi-squared检验进行数据间的比较。首先对AKI组和对照组间进行CD26+尿外泌体比率进行比较,探讨在AKI发生时尿外泌体CD26表达是否发生改变。进而纳入所有患者,以CD26+尿外泌体比率为因变量,纳入临床因素为自变量,进行相关及多元线性回归分析,来除外各临床因素对尿外泌体CD26表达的影响。为研究尿外泌体CD26与90天内MAKE及28天内肾功能恢复间的关系,我们应用类似生存分析KM曲线的方法,并对28天内肾功能恢复应用Cox进行多元回归分析,探讨其独立影响因素。在AKI存活者中进行双向比较,按临床终点分类（早期肾功能恢复/早期肾功能未恢复,出院肾功能恢复/出院肾功能未恢复,院内肾功能恢复/无院内肾功能恢复）,比较两个结局间CD26+尿外泌体比率;分别应用单因素和多因素的方法研究尿外泌体CD26与三个AKI肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复、院内肾功能恢复）的关系。单因素分析将尿外泌体CD26表达水平与三个肾功能恢复终点分别进行单因素chi-squared检验,多因素分析分别以三个肾功能恢复终点为因变量,自变量纳入尿外泌体CD26表达水平和各临床因素进行多元Logistic回归分析。最后进行敏感性分析,在AKI存活者中,通过制作ROC曲线,研究尿外泌体CD26对三个肾功能恢复终点的预测能力,并分亚组进行分析。以上分析,生存分析和ROC曲线应用GraphPad Prism 8进行分析,余统计过程均应用SPSS 17.0进行。4 结果4.1研究对象纳入研究对象为山东大学齐鲁医院重症医学科住院的成年患者,共入组AKI队列133人,非AKI对照组68人。4.2提取的外泌体形态与大小应用透射电镜和动态光散射测量结果显示提取的尿液外泌体形态与大小符合文献报道的经典外泌体特征,不含细胞碎片、微粒等其他细胞成分,可以用于下一步检测。4.3提取的外泌体生物标志物Western blot与流式细胞检测术显示 CD63,CD81,GRP94,Calnexin,CD61以及TSG101在所提取的外泌体中表达丰富。4.4 AKI队列与对照组临床特征及尿外泌体CD26的比较基线特征进行比较:两组间年龄、性别、非肾脏APACHEII评分匹配。AKI组住院死亡率显着增高。两组间住院时间和住ICU时间相比较,均无明显差异。AKI组CD26+尿外泌体比率显着低于对照组,6.4%（1.2%-22.0%）vs.23.9%,（6.6%-64.5%）;p<0.001。4.5尿外泌体CD26与临床指标的相关性分析CD26+尿外泌体比率与非肾脏APACHE II评分、糖尿病、慢性肾病（CKD）及AKI呈负相关,与外科术后呈正相关,与余临床指标不相关。多元线性相关分析显示,仅AKI与CD26+尿外泌体比率独立相关adjusted β=-15.95（-23.60,-8.29）,p<0.001。4.6尿外泌体CD26表达高/低两组间临床特点的比较以中位数为界值,定义CD26+尿外泌体比率≥6.4%为尿外泌体CD26高表达（n=67）,CD26+尿外泌体比率<6.4%为尿外泌体CD26低表达（n=66）。尿外泌体高表达和低表达组之间进行临床特点的比较,显示两组间年龄、性别、APACHEII评分及非肾脏APACHE II评分相匹配。比较两组间住院时间、住ICU时间及住院死亡率无显着性差异。高表达组院内接受RRT比率显着低表达组（p=0.016）,早期肾功能恢复、院内肾功能恢复显着高于低表达组（p<0.05）,而出院肾功能恢复率无显着性差异。4.7尿外泌体CD26表达与AKI分期之间的关系尿外泌体CD26表达高/低两组间比较AKI 3个分期的构成,结果显示无统计学差异（p=0.084）。将CD26+尿外泌体比率作为连续变量,在AKI 3个分期间进行比较,两两比较各组无差异。因此,尿外泌体CD26与AKI的分期无显着性关系。提示,尿外泌体CD26表达与肾损伤的严重程度无关。4.8尿外泌体CD26表达与AKI患者预后的关系4.8.1尿外泌体CD26与MAKE 90的关系针对复合终点MAKE的组成成分逐一进行分析。为分析尿外泌体CD26与死亡终点的关系,首先在出院存活与死亡患者间比较CD26+尿外泌体比率无显着性差异。尿外泌体CD26表达高/低两组间比较住院死亡率无显着差异。最后在高表达组和低表达组间比较90天死亡率,Kaplan-Meier分析显示CD26高表达组与CD26低表达组90天死亡率无显着差异（p=0.907）。以上结果提示,尿外泌体CD26与近期死亡无关。对MAKE的另一成分——接受RRT治疗,与尿外泌体CD26的关系进行分析。CD26高表达组较低表达组院内应用RRT的比率显着降低（p=0.016）。KM分析显示,CD26高表达组90天内接受RRT比率显着低于低水平组（p=0.013）。提示,CD26高表达预示90天内RRT应用风险较低。对MAKE的最后一个成分——持续肾功能恶化进行分析。KM分析显示,90天内持续肾功能恶化在两组间无统计学差异（p=0.717）。对复合终点MAKE进行分析,CD26高表达组90天内MAKE的发生率显着低于CD26低表达组,具有统计学差异（p=0.018）,主要是RRT应用这一结局的影响。提示,尿外泌体CD26高表达预示近期内MAKE发生风险较低,较好的肾脏相关预后。4.8.2尿外泌体CD26与肾功能恢复的关系4.8.2.1尿外泌体CD26与28天内肾功能恢复的关系Kaplan-Meier分析比较AKI患者尿外泌体CD26高/低表达组间28天内肾功能恢复发生率,结果显示高表达组28天内肾恢复率显着高于CD26低表达组（p<0.001）。进一步的多因素Cox回归分析,尿外泌体CD26 表达水平进入方程（HR,1.90;95%CI,1.15-3.14;p=0.012）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进AKI肾功能恢复。4.8.2.2 AKI存活者中尿外泌体CD26与肾功能恢复终点的关系AKI组81名存活者,依据3个肾功能结局进行分组,分别为早期肾功能恢复组/早期肾功能未恢复组、出院肾功能恢复组/出院肾功能未恢复组、院内恢复组/院内肾功能未恢复组,分别比较3组CD26+尿外泌体比率,显示各良好结局组CD26+尿外泌体比率均显着高于不良结局组（p<0.05）。在CD26表达高/低两组间比较肾功能早期恢复的差异,高表达组29（72.5%）例患者早期恢复,而低表达组仅有15（3 6.6%）例患者早期恢复,卡方检验显示两组间早期肾功能恢复存在显着差异（OR=4.57,p=0.001）。逐步多元Logistic回归分析显示,早期肾功能恢复与AKI分期及尿外泌体CD26表达水平独立相关（OR=4.67,p=0.007）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进早期肾功能恢复的因素。在CD26高/低表达两组间比较肾功能出院恢复的差异,高表达组34（85.0%）名患者出院恢复,而低表达组有23（56.1%）名患者出院恢复,卡方检验显示两组间出院肾功能恢复存在显着差异（OR=4.44,p=0.004）。以出院肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期和尿外泌体CD26表达水平（OR=3.50,p=0.039）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进出院肾功能恢复的因素。在CD26表达高/低两组间比较院内肾功能恢复,高表达组35（87.5%）例患者院内肾功能恢复,低表达组有23（56.1%）例患者在院期间肾功能恢复,存在显着差异（OR=5.48,p=0.002）。以院内肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期以及CD26表达水平（OR=4.66,p=0.019）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进院内肾功能恢复。4.8.3尿外泌体CD26对肾功能恢复终点的预测价值CD26+尿外泌体比率在AKI存活者中分别预测早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复,经ROC方法检测仅对早期肾功能恢复的预测具有统计学意义,曲线下面积（AUROC）为0.65（0.53-0.77）,p=0.021。对于出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测不能达到统计学意义。利用预测早期肾功能恢复的ROC曲线选取曲线上最佳截断值,为6.8%。利用该值计算尿外泌体CD26对3个肾功能恢复终点的预测能力,显示其对出院肾功能恢复和院内肾功能恢复有较高的特异性和阳性预测值。分析显示,大于此截断值的患者其中90%的患者将在院期间发生肾功能恢复。提示,尿外泌体CD26对肾功能转归的预测具有一定的临床应用价值。进一步在亚组中检测尿外泌体对3个肾功能恢复终点的预测能力。因为脓毒症是AKI最重要的病因,按是否合并脓毒症分类后,显示在非脓毒症相关AKI的患者中尿外泌体CD26的预测价值显着提高,预测早期肾功能恢复:AUROC=0.71,p=0.046;预测出院肾功能恢复:AUROC=0.79,p=0.009;预测院内肾功能恢复:AUROC=0.83,p=0.003。提示,在非脓毒症相关AKI患者,尿外泌体CD26对肾功能恢复有较强的预测价值,值得进一步研究。5结论（1）尿外泌体CD26表达的降低与重症患者AKI的发生相关,但尿外泌体CD26表达水平与AKI肾损伤的严重程度不相关;（2）尿外泌体CD26与近期死亡率不相关,但尿外泌体CD26与90天内主要肾脏不良事件发生率相关,尿外泌体CD26高表达预示着较低的90天内主要肾脏不良事件发生风险;（3）尿外泌体CD26与肾功能恢复独立相关,尿外泌体CD26高表达可预测AKI早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复。利用尿外泌体CD26早期预测肾功能转归,实现个体化精准治疗,以期能改善患者的长期预后。1 研究背景急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是住院患者尤其重症患者的严重并发症,除导致住院死亡率显着升高外,会导致长期死亡率升高和慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）及终末期肾病的发病率增加,造成沉重的疾病负担。目前对于AKI尚无有效的预防或治疗措施,仍为支持治疗。外泌体是一种细胞外囊泡,广泛存在于各种体液中。其脂质双分子层携带来源细胞的蛋白及核酸的结构使其作为一种细胞间信使,通过与受体细胞结合,广泛参与各种生理及病理过程的调节。外泌体作为疾病诊断和预后标志物越来越受到重视,已发现数种外泌体蛋白及RNAs与AKI有关。晚近的几项研究发现,外源性的外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进肾功能恢复,但其作用机制及关键分子尚不清楚。论文I的研究发现,与对照组相比,AKI患者尿外泌体CD26表达显着降低;而AKI患者队列内部,尿外泌体CD26高表达组比低表达组有更高的出院肾功能恢复率;经过校正性别、年龄、慢性合并症、急性病因、危重程度、AKI分期之后,尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复等肾脏预后仍有独立的关联。因肾小球滤过膜的存在,尿外泌体较少来自于循环,肾脏细胞是尿外泌体的主要来源。由此我们推断表达CD26的肾脏细胞来源的外泌体可能有减轻肾脏损伤、促进肾脏修复的功能。CD26是细胞表面的跨膜糖蛋白,通常也被称作Dipeptidyl peptidase-4（DPP4）。其具备丝氨酸蛋白酶活性,广泛表达于多种类型的细胞中,在肾脏其表达于肾小球足细胞的基底膜,并高度表达于远端肾小管上皮细胞（TEC）的刷状缘微绒毛。研究发现CD26与细胞增殖、炎症调节等过程相关。TEC的再生是AKI修复的主要环节,研究发现CD26有促进细胞增殖的作用。并且CD26参与炎症反应的调节,其底物包含一些系列趋化性细胞因子。AKI主要病理过程发生于TEC,尤其远端TEC的损伤、坏死或凋亡,进而炎症细胞浸润、间质炎症反应的发生。肾脏修复主要过程为TEC的增生,替代丧失的TEC、修复肾小管上皮组织,炎症反应参与调控这一过程。良好的增生和调控,导致完全的修复和肾功能的恢复;反之则导致纤维化的加重,最终导致CKD。因此,我们假设CD26+外泌体可能通过促进TEC增生,抑制炎症反应,减轻纤维化,减轻肾损伤、促进肾脏修复。由此,我们拟通过体外培养小鼠肾小管上皮细胞系TCMK1,通过体外模拟AKI的主要致病过程缺血再灌注（ischemia/reperfusion injury,IR）,获取培养基上清中的生理外泌体（ExoNormal）,IR程序获取ExoIR,探索生理与IR条件下尿液中CD26的表达。过表达CD26腺病毒载转染TCMK1,构建TEC来源的CD267过表达的外泌体（ExoCD26）;利用手术构建IR相关的AKI小鼠动物模型,进一步利用外泌体进行干预,通过与对照组在肾脏功能、组织病理及增生、炎症等指标对照间的比较,探讨CD26+外泌体对AKI肾脏修复的影响,及其可能的机制。2 目的（1）体外实验中探讨缺血再灌注对肾小管上皮细胞（TEC）外泌体中CD26表达的影响;（2）利用CD26过表达的腺病毒载体转染肾小管上皮细胞,构建CD26过表达的TEC外泌体;（3）IR-AKI动物体内,示踪TEC外泌体能否被肾脏细胞摄取;（4）通过体内实验,探讨CD26过表达外泌体能否减轻肾损伤、促进肾脏修复,并探讨其可能的机制。3方法3.1细胞培养及病毒转染TCMKI细胞分别常规培养及缺血缺氧程序培养,两种培养条件下的细胞均按标准程序转染CD26过表达腺病毒与空载体。留取细胞培养基上清。3.2外泌体分离纯化及表达鉴定用超速差速离心法提取TCMK-1小鼠肾小管细胞上清中的外泌体。分别对常规培养细胞释放的外泌体ExoNormal,缺氧培养细胞释放的外泌体ExoIR,正常培养条件下CD26转染后细胞释放外泌体ExoCD26,及缺氧培养并转染的细胞释放的外泌体ExoIR+CD26,分别进行CD26表达的检测。外泌体与抗CD26抗体和荧光素结合的二抗充分反应后,加入流式细胞分析。3.3 AKI（IR）动物模型的建立C57BI/6雄性成年小鼠（8周）,戊巴比妥麻醉后,显微镜下,一侧肾蒂紧密结扎后,将肾脏切除;对侧肾动脉用动脉夹夹闭,观察肾脏变色,呈缺血改变,覆盖湿润纱布,夹闭30分钟。3.4外泌体的体内示踪避光条件下操作,使用PKH26标记外泌体,经尾静脉注入IR小鼠体内;分别于注射15分钟、2小时及12小时在麻醉下取肾脏组织;OCT包埋组织块,制成冰冻切片;切片经双蒸水水化、PBS清洗后,应用BSA终止反应;加入AQP1一抗,4度湿盒孵育过夜后,PBS清洗,加入荧光素偶联的AQP1二抗,37℃孵育30分钟,PBS清洗,DAPI染色、封片,即刻荧光显微镜下观察。3.5 IR小鼠干预措施及分组分为对照组,IR+BSA 组,IR+ExoNormal 组,1IR+ExoIR组,IR+ExoCD26组,每组各10只;对照组不做肾脏处理,余操作同IR手术各组;IR各组于手术后12h分别经尾静脉注入等蛋白质量的BSA,ExoNormal,ExoIR及ExoCD26进行干预。3.6 肾功能指标检测干预后72h,取血样。各血样离心后,保存血清。分别应用尿素氮和肌酐试剂盒进行检测,以得出尿素氮和肌酐的浓度数值。3.7 肾脏组织病理学检测干预后72h,进行肾脏取材。各肾脏组织分别进行HE染色和PAS染色,显示肾小管上皮损伤情况,并用半定量的方法,在各组间进行比较。3.8 肾脏增殖指标的检测免疫荧光技术检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）在各组肾脏的表达;Western blot的方法检测p21和p53在肾脏的表达。3.9 肾脏炎症指标的检测免疫荧光技术分别应用抗MOMA2抗体、抗neutrophil抗体及抗CXCR4抗体显示巨噬细胞、中性粒细胞在肾脏的浸润和趋化性细胞受体CXCR4在肾脏的表达。并应用Western blot的方法检测趋化性细胞因子SDF-1（CXCR4的配体）在肾脏的分布。3.10肾脏纤维化指标的检测Western blot的方法测定1型胶原在各组肾脏中的表达。4 结果4.1 外泌体鉴定电镜下可见纯化成分为双凹圆盘状的高电子密度囊泡,大多直径位于30-150nm;使用动态光散射技术检测微粒的粒径大小,结果提示分离纯化的囊泡直径呈单峰分布,平均直径在30-100nm左右。结果提示,使用经典的超速差速离心方法获得的为典型的外泌体囊泡,可用于下一步功能试验。4.2外泌体中CD26表达分析流式细胞分析显示,生理条件下TCMK-1细胞培养液上清中分离纯化的外泌体ExoNormal中CD26表达量较少,经过IR程序的TCMK-1细胞上清外泌体ExoIR中CD26表达轻度增加。分别向TCMK-1细胞系（常规条件培养）转染空载体病毒Vector和过表达CD26的病毒（VirusCD2）。病毒转染后,细胞系培养液上清分离纯化外泌体,流式测得该外泌体高度表达CD26,阳性率大于70%,即ExoCD26。同样方法转染缺氧条件下培养的TCMK-1细胞系,从细胞培养液上清采集的外泌体（ExoIR+CD26）,也高度表达CD26,与ExoCD26相似。各组外泌体进行western blot检测,显示ExoNormal对CD26的表达均少,ExoIR对CD26的表达较ExoNormal轻度增加;常规培养的细胞系转染VirusCD26后释放的外泌体（ExoCD26）对CD26表达显着增加;缺氧条件下培养的细胞系,转染VirusCD26后,其外泌体（ExoIR+CD26）对CD26的表达也显着增加,与ExoCD26无明显差异。4.3 AKI动物模型的鉴定经过一侧肾动脉钳夹,对侧肾脏切除,72h后小鼠血尿素氮、肌酐显着升高,肾脏组织出现IR病理学改变,证实AKI造模成功。4.4动物体内外泌体示踪PKH26标记的外泌体通过尾静脉注入IR小鼠体内,2h后取材,制冰冻切片,荧光标记AQP1。显示肾小管上皮细胞内可见外泌体荧光标记,肾脏其他类型细胞内未见外泌体荧光标记。提示,肾小管上皮细胞（TEC）来源的外泌体选择性的被TEC所摄取。4.5外泌体对肾脏功能指标的影响IR小鼠血清尿素尿素氮及肌酐水平显着增高:与BSA相比,ExoNormal及ExoIR对肾功能指标无影响,而ExoCD26显着降低了血清尿素氮和肌酐水平。4.6外泌体对肾脏组织损伤的影响HE染色及PAS染色显示,IR小鼠肾脏出现明显损伤,包含肾小管扩张,刷状缘缺失,肾小管上皮细胞的坏死,管型的形成等;与BSA相比,ExoNomal及ExoIR未能减轻肾脏损伤,而ExoCD26显着降低了肾损伤评分和损伤肾小管分数,减轻了肾脏组织损伤。4.7外泌体对TECs增生的影响免疫荧光染色示,IR小鼠肾脏增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）显着降低;与 BSA 相比,ExoNormal 及 ExoIR 未能增加PCNA的表达,而ExoCD26显着增加了 PCNA的表达,PCNA沿肾小管分布。此外,IR小鼠肾脏p21和p53表达显着升高,提示细胞分裂增生的阻滞;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能降低p21和p53的表达,但ExoCD26显着降低了两者的表达。以上结果提示,ExoCD26促进了 TECs细胞的增生。4.8外泌体对肾脏炎症反应的影响免疫荧光显示,IR肾脏中性粒细胞、巨噬细胞浸润显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着降低中性粒细胞和巨噬细胞的浸润,而ExoCD26显着降低了两种炎症细胞的浸润。同时,Western blot和免疫荧光结果显示,SDF-1和CXCR4这一对趋化因子及受体在IR肾脏表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能明显改变其表达,但ExoCD26显着降低了两者表达。提示,ExoCD26能降低趋化性细胞因子及受体的表达,并改善炎症细胞的浸润。4.9外泌体对肾脏纤维化的影响Western blot结果显示,IR肾脏1型胶原表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着改变其表达,而ExoCD26显着降低了 1型胶原表达。提示,ExoCD26抑制早期肾纤维化。5.结论（1）缺血再灌注使肾小管上皮细胞系来源的外泌体CD26的表达增加;（2）肾小管上皮细胞系来源的外泌体在IR-AKI小鼠动物模型体内,可被TEC摄取;（3）ExoCD26可改善AKI小鼠肾脏功能指标,减轻肾脏损伤,其可能的机制是ExoCD26被TEC摄取后,促进TEC增殖,减轻肾脏炎症反应和纤维化,从而促进肾脏的修复。
吴迪[5]（2020）在《负载过氧化钙的纳米塑效体系及其抗前列腺癌应用研究》文中研究表明目的本研究旨在构建负载过氧化钙（CaO2）的纳米塑效体系并发挥理想的抗前列腺癌作用,同时显着降低对正常组织的损伤,从而为前列腺癌的临床治疗提供崭新的理念与策略。方法（1）负载CaO2纳米塑效体系的构建及表征:通过选择性蚀刻法合成中空介孔硅纳米颗粒（HMSNs）,并在氨基功能化后负载CaO2,再经被覆聚丙烯酸（PAA）从而合成CaO2@HMSNs-PAA;采用系统的表征手段监测合成过程,应用电感耦合等离子体-质谱法计算装载量并绘制不同模拟环境下的释放曲线。（2）CaO2@HMSNs-PAA的体外抗前列腺作用评估:应用异硫氰酸荧光素标记CaO2@HMSNs-PAA,经激光扫描共聚焦显微镜观察PC-3前列腺癌细胞对其的摄取及其入胞后的分布情况;采用CCK-8试验评估CaO2@HMSNs-PAA对PC-3前列腺癌细胞活性的影响。（3）CaO2@HMSNs-PAA的体内抗前列腺作用评估:经BALB/c小鼠尾静脉注射CaO2@HMSNs-PAA,观察小鼠体重、主要血液指标及重要脏器组织学的变化;在PC-3皮下移植瘤模型中分析CaO2@HMSNs-PAA经静脉注射后的组织分布情况,并评估给药后荷瘤裸鼠体重、肿瘤相对体积、肿瘤质量、肿瘤及重要脏器组织学的变化。（4）CaO2@HMSNs-PAA抗前列腺癌机制的初步探讨:将PC-3前列腺癌细胞与CaO2@HMSNs-PAA共孵育,通过活性氧检测试剂盒评估其胞内活性氧水平的变化,并应用流式细胞术检测其凋亡率;采用免疫组织化学染色评价荷瘤裸鼠肿瘤组织中Bax、Bcl-2及cleaved Caspase-3的表达变化。结果（1）成功合成CaO2@HMSNs-PAA,其装载量为20.34%,且能够在模拟正常体液、肿瘤微环境及溶酶体pH值条件下响应性释放CaO2。（2）CaO2@HMSNs-PAA经PC-3前列腺癌细胞摄入后定位于溶酶体,并可在模拟肿瘤微环境的pH值条件下产生显着的细胞毒性作用。（3）静脉应用CaO2@HMSNs-PAA可有效抑制PC-3荷瘤裸鼠肿瘤的生长,并严重破坏肿瘤的组织结构,同时对于重要脏器的结构与功能无明显影响。（4）在模拟肿瘤微环境的pH值条件下,CaO2@HMSNs-PAA可明显提升PC-3前列腺癌细胞的胞内活性氧水平,并显着诱导前列腺癌细胞凋亡,且可使荷瘤裸鼠肿瘤组织中Bax及cleaved Caspase-3表达明显上调、Bcl-2表达显着下调。结论通过将CaO2负载于HMSNs并被覆PAA可最终构建CaO2@HMSNs-PAA,其能够在酸性的肿瘤微环境下响应性释放活性氧,并诱导前列腺癌细胞发生凋亡,从而使自身并不具备显着抗肿瘤效应的CaO2能够发挥理想的抗前列腺癌作用,同时最大程度地避免对于正常组织的副损伤。这一“纳米塑效医学”理念为精准、安全、有效的抗前列腺癌治疗提供了极具前景的纳米医学策略。
沈逸怀[6]（2020）在《三级胺氮氧化物聚合物纳米递药体系与微流控分步可控制备纳米复合物的研究》文中指出本论文包括聚合物纳米载体输送化疗药物应用于肿瘤治疗的研究和基因输送聚合物纳米载体的构建两个方面的工作。本论文第一部分工作是三级胺氮氧化物聚合物纳米递药体系的研究。基于水溶性聚合物等载体的抗癌纳米药物可有效提升疏水药物的溶解度、延长体内循环时间和提高药物瘤内的浓度,并能显着降低化疗药物的毒副作用,因此在临床上有着迫切且广泛的需求。但目前临床用纳米药物未能显着提升药物疗效和延长患者生存时间,为突破这一瓶颈,亟需进一步优化其特性以提升抗癌效果。纳米药物获得高抗肿瘤疗效的关键是能够高效完成“CAPIR”这一五步级联过程（体内循环、肿瘤蓄积、肿瘤渗透、细胞内化和药物释放）。为此,纳米药物表面一般被设计具有“隐形-粘附”的转变:体内循环时,它与所有血浆组分和细胞不相互作用、呈现“隐形”状态;一旦它积聚在肿瘤处,就应变为能够粘附细胞膜以触发细胞内化。目前文献已报道多种手段来实现该转变,包括PEG化/去PEG化、电荷反转、屏蔽/裸露肿瘤靶向配体等。然而这些结构复杂的纳米药物在化学表征、药代动力学评价及可重复性制备等方面难以实现,严重限制了其临床转化。因此,利用“一体化”策略设计结构简单、功能完备的载体,是纳米药物的发展方向。同时,入胞后的纳米药物如何靶向释药也是其治疗肿瘤的关键。线粒体作为细胞的能量工厂,参与肿瘤的发生、发展及凋亡,因此线粒体靶向的递药能有效提升纳米药物的疗效。但传统的线粒体靶向基团表面为带正电荷的疏水分子,在体内会被免疫系统迅速识别和清除。为实现其体内应用,须对基团加以修饰以遮蔽正电荷,并在其入胞内后脱除遮蔽层以实现靶向线粒体功效,而复杂的载体结构及有限的脱除率影响了其靶向能力。因此,开发电中性或带负电的线粒体靶向纳米载体同样意义重大。为此,本论文第一部分研究了 一类三级胺氮氧化物两亲嵌段聚合物载药胶束:负载阿霉素（DOX）的聚[2-（N-氧化-N,N-二甲基胺基）乙基甲基丙烯酸酯]-聚（ε-己内酯）（OPDMA-PCL/DOX）和聚[2-（N-氧化-N,N-二乙基胺基）乙基甲基丙烯酸酯]-聚（ε-己内酯）（OPDEA-PCL/DOX）纳米胶束。三级胺氮氧化物结构是一种易溶于水、电荷中性的离子对基团,基于其结构设计的两亲嵌段聚合物载药胶束OPDMA-PCL/DOX和OPDEA-PCL/DOX可在水溶液中形成尺寸约30nm、表面电势微负的纳米颗粒。其不仅展现出类似于PEG的血液长循环特质,还可有效附着于红细胞表面来躲避免疫系统的识别、清除。在体内外肿瘤渗透模型中,其展现出优异的渗透性能,在远离血管的肿瘤内部依然具有较高的药物浓度。此外,该类胶束以巨胞饮途径整合入胞,可有效避免被溶酶体降解。快速入胞后,部分药物展现出高效的线粒体靶向特性,造成线粒体功能障碍进而诱导细胞凋亡,其余药物则进入核内通过抑制核酸的合成来杀伤癌细胞。在耐阿霉素人乳腺癌细胞系 MCF-7/ADR 模型中,OPDMA-PCL/DOX 和 OPDEA-PCL/DOX 显现出比传统载药胶束PEG-PCL/DOX和DOX更高的抑瘤效果及更弱的毒副作用。本论文第二部分工作是微流控分步可控制备纳米复合物的研究。阳离子聚合物如聚乙烯亚胺（PEI）可有效压缩DNA形成纳米复合物、防止DNA被核酸酶降解,是基因输送的优良载体。但形成的纳米复合物表面带正电荷,限制了其体内应用。因此,必须在其表面引入电中性或带负电的遮蔽层如透明质酸（HA）来克服体内血液屏障。然而,目前传统制备手段（涡旋震荡及移液枪吹打混合等）在制备HA/PEI/DNA纳米复合物时,形成的复合物一般存在尺寸偏大、均一性低等问题。为此,本文第二部分初步探索了利用微流控技术制备尺寸大小均一、表面电势为负的基因输送纳米复合物的方法。首先对微流控装置进行优化制备,选择出适宜管道内径的微流控芯片。然后将PEI与DNA注入微流控芯片自组装形成PEI/DNA纳米复合物,该复合物颗粒于另一微流控芯片中与HA再次组装获得HA/PEI/DNA纳米复合物。系统考察了溶液流速及流速比R、PEI与DNA氮磷比（N:P）、HA与DNA质量比（HA:DNA）等参数对制备的复合物的尺寸、均一性及表面电势的影响。流速比R、N:P、HA:DNA能有效调节HA/PEI/DNA纳米颗粒的尺寸及均一性。相较于传统的涡旋震荡法,微流控法制备的该复合物稳定性好、可重复性高,尺寸较小且更为均一。
莫晓云[7]（2021）在《埃洛石纳米管载药递送系统的构建及其抗肿瘤靶向的研究》文中研究说明纳米医学是一门交叉学科,近年来在肿瘤治疗中发展迅速。常规药物纳米化,能够有效提高药物的生物利用度,降低剂量和减少药物毒副作用。纳米药物递送系统具有肿瘤微环境响应性,能够定点释放药物,改变药物体内分布,从而有效提高抗肿瘤作用,已经成为纳米医学的研究热点。本论文将天然无机纳米材料-埃洛石纳米管（HNTs）分别用叶酸靶向分子（FA）和透明质酸靶向分子（HA）进行功能化,初步研究其抗肿瘤活性。具体内容如下:（1）埃洛石纳米管的尺寸调节:埃洛石纳米管具有良好的生物相容性、亲水性和化学稳定性,已逐渐应用于生物医学领域。但是HNTs的尺寸大小不一,尺寸较大的纳米管容易损伤细胞,引起炎症反应。我们将HNTs调节到合适的尺寸,使其更容易被细胞吞噬。（2）本研究构建了叶酸分子（FA）功能化埃洛石纳米管的载药递送系统,用于靶向叶酸受体高表达的肿瘤细胞,提高肿瘤药物的生物利用度。首先,缩水甘油利用HNTs表面少量的羟基原位开环聚合生成HNTs-PG,使得HNTs表面富含大量的羟基。羟基可以与靶向分子叶酸（FA）进一步缩合,构建HNTs-PG-FA纳米载药体系。经过FT-IR、TEM、XPS、TGA和DLS对HNTs–PG-FA进行了全面表征,证实HNTs-PH-FA靶向载体的成功构建。阿霉素（DOX）负载到新型靶向肿瘤递送系统HNTs-PG-FA上,靶向肿瘤细胞,通过叶酸受体介导进入细胞释放药物。采用细胞毒性实验和流式细胞术检测纳米药物抗肿瘤活性。体外细胞毒性实验初步证明,HNTs-PG-FA/DOX纳米药物比游离DOX对肿瘤细胞具有更显着的抑制作用。流式细胞术检测结果显示,HNTs-PG-FA/DOX可有效增加He La细胞凋亡率,诱导细胞死亡。（3）本研究设计了一种基于透明质酸（HA）修饰埃洛石纳米管（HNTs-NH-HA）的靶向递送系统,通过CD44受体靶向肿瘤细胞,提高抗肿瘤药物效率。通过13C固体核磁、FT-IR、XPS和TGA等表征技术来证实HNTs-NH-HA复合物的成功制备。用HNTs-NH-HA纳米载体搭载抗肿瘤药物阿霉素（HNTs-NH-HA/DOX）。通过体外细胞毒性分析表明,HNTs-NH-HA/DOX纳米药物能够有效靶向CD44受体过表达的肿瘤细胞,提高了DOX的治疗效果,而对正常细胞和CD44受体低表达的肿瘤细胞影响不大。此外,共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示,HNTs-NH-HA/DOX纳米药物比DOX或HNTs/DOX更加容易被CD44受体高表达的He La细胞摄取。与CD44受体低表达细胞相比较,CD44受体高表达细胞更容易摄取HNTs-NH-HA/DOX纳米药物。可见,HNTs-NH-HA给药系统有望靶向CD44过表达的肿瘤。
张润军[8]（2019）在《pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究》文中提出研究背景:心血管疾病（CVD）是全世界发病率和死亡率的主要原因。据估计,心血管病每年可导致1790万人死亡,约占全球死亡总数的31%。研究表明,血管炎症与多种心血管疾病的发病机制密切相关,如动脉粥样硬化、心肌梗死、再狭窄、颅内动脉瘤和主动脉瘤、卒中和外周动脉疾病。通过调节参与炎症反应的不同分子和细胞过程,已经有大量的治疗方法被研究用来预防和治疗心血管病。尽管在临床前研究方面取得了重大成果,但大多数已检测的抗炎药物的理想疗效尚未在临床实践中得到充分证明。在很大程度上,这可能与治疗分子递送到血管炎症部位的效率低下有关,这是由于它们的非特异性分布和从循环中被快速消除造成的。即使是炎症血管内局部吸收的药物,由于扩散不受控制,滞留时间也很短。近年来,基于纳米粒的靶向治疗被认为是一种很有前景的策略,可以特异性地递送不同的治疗和成像药物,用于检测或治疗血管炎症。尤其广泛的纳米粒已被设计作为靶向载体治疗动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭、缺血再灌注损伤、严重的肢体缺血、再狭窄、腹主动脉瘤和缺血性卒中。在这些例子当中,聚合脂质纳米粒、脂质体、重组高密度脂蛋白、来源于细胞的囊泡、无机纳米粒和金属纳米粒以及混合纳米粒被用于递送治疗药物,从小分子药物、多肽/蛋白质到核酸,治疗与血管炎症相关的心血管疾病。除了通过受损的内皮细胞层或EPR效应被动靶向到血管病变部位,纳米粒还可通过调节它们的物理性质（如几何结构和顺应性）,分子基团的修饰或特殊细胞膜的功能化,使血管靶向效率得到进一步提高。另一方面,可以根据血管炎症部位异常变化的生物化学信号,设计合成纳米粒的组成成份,有针对性地释放药物载荷。然而,这些血管靶向纳米治疗的转化仍然具有很大的挑战性。虽然直接调控抗原特异性亲和力可以增强纳米粒在血管的聚集,但仅用分子基团修饰后,纳米粒的靶向效率仍然非常有限。对于以细胞膜为基础的仿生策略衍生的纳米药物治疗,其相对复杂的配方流程和不明确的成分可能会妨碍其后续的大规模生产和临床研究。此外,需要进一步改进对感兴趣的血管病变部位的不可控的释放。越来越多的证据表明,双重或多重刺激响应性纳米粒能够在其作用的部位更精准地控制负载药物的释放,大大提高了药物的递送效率。在这方面,对多种生物化学信号或生物化学/物理信号敏感的纳米粒已被广泛用于肿瘤、糖尿病、炎症等多种疾病的靶向治疗。然而,基于这些响应性纳米粒治疗的临床转化并不简单,在很大程度上主要是由于更复杂的药物研发,尤其是在可重复性和质量控制方面。此外,针对目前大多数靶向血管的响应性纳米载体,体内安全性是另外一个重要的问题,尤其对于慢性疾病的治疗,因为大多数静脉注射纳米粒被单核吞噬细胞系统清除并聚集于肝脏和脾脏等器官。因此,亟待开发能够响应与血管炎症相关的生物化学信号,具有理想的靶向能力和良好的药物控释性能且更为有效和安全的纳米药物递送平台。通过对环糊精的化学功能化,最近开发了一系列在酸性和氧化应激条件下具有高度可调控水解行为的响应性材料。体外细胞培养和不同动物模型的在体实验研究结果证明,基于这些载体材料构建的纳米粒对低pH值和高ROS刺激具有较好的响应性及良好的生物安全性。鉴于血管内皮损伤后局部存在炎症微酸性环境和增高的氧化应激,通过整合优化活性氧和pH响应性的环糊精材料的比例,构建活性氧和pH双响应性纳米粒,可以作为一种新型有效和安全的纳米平台,用于血管炎症部位的药物递送。此外,结合分子靶向策略还可以进一步增强血管的靶向性和体内双响应性纳米粒治疗的有效性。本研究课题基于前期合成的pH响应性和活性氧（ROS）响应性的载体材料,以雷帕霉素为模型药物,构建了pH和ROS双响应的纳米药物递送系统,在大鼠颈动脉球囊损伤的血管炎症模型中,通过与非响应性、pH或ROS单一响应性纳米粒治疗比较,考察和评价了pH和ROS双响应性纳米粒的治疗优势以及双响应性主动靶向载药纳米粒在体防治血管再狭窄的效果。研究内容:1.基于β-CD的载体材料的合成1.1 pH响应性β-环糊精材料（ACD）的合成先将1 g β-CD 溶解在8 mL无水DMSO中,然后加入4 mL的2-甲氧基丙烯（MP）,磁力搅拌溶解并与有机试剂充分混匀,最后加入16 mg的吡啶对甲苯磺酸盐（PTS）。室温条件下反应3 h,然后加入0.3 mL三乙胺终止反应。得到的产物加超纯水沉淀,离心,洗涤3次冻干得到白色粉末。1.2 活性氧响应性β-环糊精材料（OCD）的合成将5.55 g 4-PBAP加入到36 mL无水二氯甲烷（DCM）中充分溶解,然后加入7.65 g 1,1’-羰基二咪唑（CDI）。室温条件下磁力搅拌反应0.5 h,再加入40 mL DCM,用30 mL超纯水洗涤三次。再用饱和NaCL洗涤有机相,无水Na2SO4干燥,真空浓缩得到 CDI 活化的 PBAP（CDI-PBAP）。随后,将 250 mg β-CD 和 1.52 g CDI-PBAP 加入至20 mL无水二甲基亚砜中,再加入800 mg DMAP反应过夜。最后,加入超纯水沉淀、离心收集,洗涤三次后冻干得到白色粉末。采用FT-IR和1H NMR对合成的上述两种响应性载体材料进行表征。2.不同纳米粒的制备采用纳米沉淀/自组装法制备基于不同材料的载RAP纳米粒。具体过程如下:精确称取 50 mg PLGA,ACD,OCD或ACD/OCD以不同的质量比混合（80:20、60:40、50:50、40:60、20:80）的载体材料和10 mg RAP共同溶于2 mL有机溶剂中,得到有机相。对于PLGA和ACD纳米粒,使用乙腈;OCD纳米粒,使用无水甲醇;ACD/OCD采用1:1（v/v）无水甲醇和乙腈混合溶剂制备有机相。另将0.6 mL卵磷脂无水乙醇溶液（10mg/mL）和9 mg DSPE-PEG2000溶解在10 mL的去离子水中,油浴加热至65℃ 1 h。然后,将有机相缓慢加入至上述的预热溶液中,磁力搅拌2 h。最后获得的纳米粒溶液用去离子水透析24 h,冻干后即得到不同的载RAP纳米粒（RAP/ACD NP,RAP/AOCD NP,RAP/OCD NP及RAP/PLGA NP）。空白纳米粒,Cy5或Cy7.5荧光标记的纳米粒均通过类似的方法制备获得3.不同纳米粒的表征不同NPs在水溶液中的粒径及粒径分布,Zeta电位通过马尔文粒径仪检测。取新鲜制备的纳米混悬液,滴加到载膜铜网上,室温晾干后透射电子显微镜下观察纳米粒子形态并拍照采集图像。同样将制备好的纳米粒混悬液滴加至云母片,喷金晾干后采用透射电子显微镜观察纳米粒形态并拍照采集图像。载RAP纳米粒在加入适量无水甲醇和乙腈混合溶液后离心,取上清通过高效液相色谱法（HPLC）检测RAP载药量。此外,Cy5或Cy7.5的含量通过荧光光谱仪测定。4.不同空白纳米粒体外水解实验将不同的纳米粒分别分散于pH 5、pH 6、pH 7.4以及加入1 mM H202 0.01 M的PBS缓冲液中。37℃孵育不同时间后,于设定时间点采集样品测定纳米粒溶液在500 nm波长处的透光率。最后,根据透光率计算纳米粒的水解百分比。5.载雷帕霉素纳米粒的体外药物释放实验将新鲜制备冻干的pH/ROS双响应性载RAP纳米粒5 mg分别分散在8 mL不同pH值（pH 5、pH 6、pH 7.4）以及加入 1 mM H2O2 0.01 M 的 PBS 缓冲液中,置于37℃孵箱内震荡混匀。在既定的不同时间点,将含有纳米粒的溶液以19118 g离心,取适量上清液并补充等量相同介质。HPLC检测RAP药物浓度,绘制纳米粒的药物累积释放曲线。单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP仍用相同的方法检测其不同时间点的累积药物释放量,绘制相应药物释放曲线。6.纳米粒的细胞吞噬实验将鼠主动脉血管平滑肌细胞株（MOVAS）以2×105个/孔的密度接种于12孔板中,孵育24小时后,去除培养基并加入相同浓度的Cy5荧光标记的不同纳米粒,在37℃条件下与平滑肌细胞孵育不同的时间。观察前,用溶酶体探针LysoTracker Green染色标记晚期核内体和溶酶体,DAPI染色细胞核。采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察并采集荧光图像。同样,在平滑肌细胞孵育24小时后,加入不同浓度梯度的Cy5标记基于不同载体制备的纳米粒与细胞共同孵育6小时后,考察细胞对纳米粒的剂量依赖性吞噬。另外,通过流式细胞术定量细胞对Cy5标记的不同纳米粒的吞噬,荧光活化细胞分选（FACS）测定荧光强度。考察孵育时间及纳米粒剂量对血管平滑肌细胞吞噬行为的影响。7.不同载雷帕霉素纳米粒体外抑制rVSMCs增殖和迁移的作用研究MOVAS细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组仅加入PDGF-BB,继续培养24h后,用CCK-8法检测细胞活性。采用8 μm孔径的Transwell小室评价载不同RAP纳米粒对PDGF-BB诱导的大鼠VSMCs迁移的影响。将MOVAS细胞以2×105个/孔的密度接种于12孔板中。37℃卵孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP 及 RAP/AOCD NP）与平滑肌细胞共同孵育。阳性对照组加入PDGF-BB,而正常对照组不加PDGF-BB和游离的雷帕霉素。6 h后,胰酶消化收集细胞,200μL培养基重悬,将不同治疗组的细胞分别加至Transwell上室,下室则加入600 μL含0.5%FBS和20 ng/mL PDGF-BB的培养基。孵箱内静置8 h后,用棉签轻轻擦去Transwell膜上方未迁移的细胞。4%多聚甲醛固定细胞,0.1%结晶紫染色。最后光学显微镜下观察拍照,随机选取5个视野计数染色细胞的数量并进行统计学分析。8.细胞周期检测MOVAS细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组加入PDGF-BB。细胞与不同载药纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化并收集细胞,70%乙醇固定,4℃孵育过夜。通过洗涤后,将不同载药纳米粒干预的细胞与RNase在37℃条件下孵育30分钟,然后用碘化丙啶在4℃避光条件下进行细胞染色30分钟。最后通过流式细胞术检测平滑肌细胞在G1、S、G2/M期的比例并进行统计分析。9.免疫印迹分析将MOVAS细胞分别与不同载RAP纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化细胞,加入细胞裂解液,使细胞完全裂解,然后4℃条件下,12000 g离心30 min,收集上清,用BCA试剂盒测定蛋白浓度,进一步通过Western blotting检测细胞周期相关蛋白的表达水平。将含有50 μg蛋白的样本在10%十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上分离,电泳转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭,在4℃条件下,将膜与一抗体孵育过夜:（1）Cyclin D1 抗体,稀释1:200;（2）p27kip1抗体,稀释1:250;（3）β-actin抗体,稀释1:1000。然后在37℃条件下,将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗共同孵育1 h,二抗稀释倍数为1:1500。洗涤三次后,通过增强型化学发光试剂盒荧光成像显示特异性条带,同时进行半定量分析。10.不同纳米粒的细胞毒性实验研究将MOVAS细胞以10000个/孔的密度接种于96孔板,培养24 h后,加入不同浓度梯度的空白纳米粒（PLGA NP,ACD NP,OCD NP及AOCD NP）,共同孵育24 h后,CCK-8法检测细胞的活性。11.SD大鼠颈动脉球囊损伤再狭窄模型的建立雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉起效后,颈部脱毛备皮,消毒,行颈前部正中切口,钝性分离皮下软组织及颈前肌肉组织,暴露颈动脉分叉,游离左侧颈总动脉及颈内、颈外动脉,将2F Fogarty取栓球囊导管由颈外动脉切口插入至颈总动脉近心端,PTCA压力泵以适当压力充盈球囊,旋转并回撤球囊至颈外动脉,重复三次,完全剥脱颈总动脉血管内皮。然后,尾静脉注射伊文思蓝评价血管内皮损伤情况。12.颈动脉损伤部位酸性炎症微环境和氧化应激水平的考察与评价采用细胞内pH荧光探针BCECF-AM对颈动脉损伤部位组织的pH值变化进行定性评价。在颈动脉球囊损伤模型建立后,于不同时间点取材损伤的颈动脉组织,O.C.T.包埋后,冰冻组织切片（8 pm）。然后,用10 μM ROS荧光探针DCFDA或5μM超氧阴离子荧光探针DHE分别对组织切片进行染色,检测球囊损伤局部组织ROS及超氧阴离子水平。另外,采用相应诊断试剂盒分别对损伤局部组织过氧化氢（H202）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性进行检测。ELISA试剂盒分别检测丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）的表达水平。同样,典型促炎细胞因子α-肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素1 β（IL-1 β）的表达水平也通过ELISA试剂盒分别检测。13.靶向Ⅳ型胶原的双响应性载RAP纳米粒的构建将靶向血管内皮下Ⅳ型胶原的多肽（KLWVLPKGGGC-Am）溶解在含有5 mmol/L EDTA的中性PBS缓冲液中,以二硫键/TCEP摩尔比1:1的比例,加入适量的TCEP断键溶液还原。然后,将多肽和DSPE-PEG-MAL以5:4的摩尔比,在4%乙醇溶液中,室温条件下磁力搅拌反应4h,合成KLWVLPKGGGC-DSPE-PEG三嵌段共聚物,未结合的游离肽通过透析去除。最后,将载体材料OCD/ACD以80:20质量比,DSPE-PEG-peptide/DSPE-PEG以1:9摩尔比混合,采用纳米沉淀自组装的方法,制备靶向IV型胶原的双响应性载RAP纳米粒。14.靶向纳米粒体外胶原结合实验的研究将Ⅳ型胶原溶解在0.25%醋酸中,配制浓度为0.5 mg/mL的胶原溶液。将100μL胶原溶液加入到96孔板中,4℃条件下孵育过夜。在胶原涂层或没有胶原涂层的孔板中先用50%血清封闭1 h后,再加入100μL用25%牛血清配制的Cy7.5荧光标记的双响应性靶向纳米粒（Cy7.5/TAOCD NP）,纳米粒浓度（0.2 mg/ml）。孵育1 h后,用包含0.05%吐温20的PBS缓冲液洗板3次。最后,通过IVIS光谱系统观察并拍摄孔板荧光图像。15.纳米粒体内靶向血管内皮损伤部位的研究大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉分别注射Cy7.5荧光标记的不同纳米粒（Cy7.5/PLGA NP,Cy7.5/ACD NP,Cy7.5/OCD NP 及 Cy7.5/AOCD NP）,在体循环8 h后,取材完整的颈动脉及主要脏器,进行小动物活体荧光成像（IVIS）观察纳米粒在血管内皮损伤部位的荧光强度及组织分布情况并进行定量分析。另外,在颈动脉球囊损伤后,经尾静脉注射Cy7.5荧光标记的双响应性纳米粒（Cy7.5/AOCD NP）,在预设不同观察时间点取材损伤的颈动脉组织,离体成像观察和定量分析荧光强度,评价纳米粒的靶向和滞留时间变化情况。16.靶向纳米颗粒与损伤颈动脉的特异性结合的评价在大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉注射Cy5荧光标记的靶向纳米粒（Cy5/TAOCD NP,25 μg/kg）。在体循环0.5 h后,给予安乐死,取材颈动脉组织,Tissue-Tek O.C.T.包埋,冰冻组织切片（5μm）,FITC标记的抗体染色血管内皮下IV型胶原,DAPI染核后,盖玻片封片,通过CLSM观察颈动脉组织荧光分布及靶向纳米粒与胶原共定位情况。17.不同载雷帕霉素纳米粒对SD大鼠颈动脉球囊损伤的疗效评价将30只雄性SD大鼠随机分为6组（n=5）,包括假手术组（正常组）、生理盐水治疗组（模型组）,以及RAP/PLGA纳米粒组、RAP/ACD纳米粒组、RAP/OCD纳米粒组及RAP/AOCD纳米粒组。除假手术组外,其余各组大鼠均按上述方法实施颈动脉球囊损伤。在颈动脉球囊血管成形术后,分别于术后即刻（0d）,4 d,8 d,12 d尾静脉注射RAP终浓度为1 mg/kg的不同载RAP纳米粒。在另一项单独设计的实验研究中,RAP/AOCD纳米粒或RAP/TAOCD纳米粒在大鼠颈动脉球囊损伤后即刻（0 d）,5 d,10 d分别以终浓度1 mg/kg的RAP经尾静脉注射给药。在血管成形术后第14 d,给予大鼠安乐死。原位灌注后取材损伤的颈动脉段及主要脏器,进行组织学和免疫组化研究,考察相关标志物表达水平。18.双响应性纳米粒的急性毒性和载雷帕霉素纳米药物治疗对SD大鼠的长期毒性评价实验12只雄性SD大鼠（180-250g）随机分为4组（n=3）。在AOCD纳米粒组,尾静脉注射不同剂量（250、500或1000 mg/kg）AOCD纳米粒。正常对照组给予尾静脉注射生理盐水。仔细观察各组动物的相关毒性症状和行为活动状况。在规定的时间点称量检测体重变化。在给药后第14 d,给予大鼠实施安乐死,即刻采集血样进行血液学和生化相关指标分析。收集主要脏器并称重,分析计算脏器指数（每只大鼠的器官重量与体重之比）,同时制作组织切片H&E染色观察其病理变化。健康雄性SD大鼠16只,体重（180-250 g）随机分为4组（n=4）。空白纳米粒组按11.5 mg/kg AOCD NP治疗（相当于RAP纳米粒的治疗剂量1 mg/kg）,另外两组分别按1 mg/kg RAP/AOCD NP或 3 mg/kg RAP/AOCD NP,尾静脉注射,每周 2 次,连续 12周。正常对照组大鼠则给予静脉注射生理盐水。治疗期间,每天动态观察各组动物死亡率、外貌、全身状况和行为异常等情况。每周记录食物和水的消耗以及体重变化情况。第12周,给予安乐死。采集血液样本,化验分析具有代表性的血液学和生化指标。取主要脏器包括心、肝、脾、肺、肾并称重计算脏器指数。同时制备组织学切片,H&E染色观察病理变化。另外,用抗CD3抗体和抗CD19抗体对脾脏组织切片进行免疫组化染色,评价长期载RAP纳米药物对SD鼠免疫功能的影响。19.双响应性载雷帕霉素纳米粒长期治疗后小鼠脾脏T、B淋巴细胞的定量研究实验将24只雄性C57BL/6J小鼠（18-22 g）随机分为4组（n=6）。正常对照组给予生理盐水,空白纳米粒组按11.5 mg/kg（相当于载RAP纳米粒治疗剂量1 mg/kg）剂量尾静脉注射AOCD NP。另外两组小鼠分别给予RAP/AOCD NP,1 mg/kg或3 mg/kg,尾静脉注射,每周2次,连续给药12周。在治疗期间,观察小鼠的一般身体状况的任何变化,包括外貌,摄食、饮水,行为活动及死亡率等。第12周,对小鼠实施安乐死。取脾脏并将分离的脾脏组切成小块,加入无菌PBS缓冲液,对组织进行彻底研磨,然后在淋巴细胞分离培养基中离心收集细胞。将FITC标记的抗CD3抗体及PE标记的抗CD19抗体在4℃条件下,与脾脏组织提取的淋巴细胞共同避光孵育30 min后,用流式细胞染色缓冲液洗涤细胞2次,PBS缓冲液重悬细胞。最后,采用流式细胞仪对脾脏组织中T细胞和B细胞的百分率进行定量分析,评价RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统的影响。研究结果:1.pH和ROS双响应性纳米粒的制备基于β-环糊精（β-CD）,通过单步缩醛化反应合成pH响应性的载体材料（ACD）,傅里叶红外光谱和核磁共振氢谱检测证实ACD被成功合成。根据ACD 1H NMR谱计算,环缩醛与线性缩醛的摩尔比约为0.62,缩醛化度约为90%。此外,（OCD）通过在β-CD分子上将氧化敏感性苯硼酸酯单元4-PBAP以羰基键合的方式引入β-CD合成ROS响应性载体材料,1H NMR谱证实,每个β-CD分子大约有7个PBAP单元。采用改良的纳米沉淀/自组装法制备基于上述两种不同响应性的载体材料的双响应性纳米粒,将ACD和OCD以不同重量配比,构建了 pH/ROS双响应性纳米粒。基于ACD/OCD的不同纳米粒,在质量比为 100:0、80:20、60:40、50:50、40:60、20:80、0:100 时,分别命名为 ACD NP、AOCD8020 NP、AOCD6040 NP、AOCD5050 NP、AOCD4060 NP、AOCD2080 NP和OCD NP。透射电镜（TEM）观察,在不考虑组成分差异的情况下,所制备的纳米粒均为球形,形态规则,粒径均一。马尔文粒径电位检测显示所有制备的纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到186±4 nm。不同纳米粒的粒径分布相对较窄。提示ACD与OCD载体材料具有良好的混合相容性。2.不同双响应性纳米粒的体外水解特性基于载体材料ACD和OCD构建的pH/ROS双响应纳米粒的体外水解,在含有1mM H2O2及不同pH值的PBS缓冲液中进行。对于ACD NP,在pH 5或pH 6的微酸性条件下均表现出明显的快速水解,而H2O2的存在对其水解几乎无任何影响,具有良好的响应低pH的特性。相对于ACD NP,OCD NP的水解则与pH无关,在H202存在的条件下,OCD NP水解迅速。相比在不同的pH值,OCD NP在pH值为5、6或7.4时均表现出类似的水解特性。基于载体材料ACD和OCD构建的双响应性纳米粒,它们的水解行为依赖于pH和H202,通过在含有1 mM H2O2及不同pH条件的PBS缓冲液中,比较基于不同比例ACD和OCD载体材料制备的双响应性纳米粒水解试验的结果,提示基于ACD/OCD的纳米粒具有pH和ROS双重响应的能力。AOCD2080 NP和AOCD8020 NP在1 mM H2O2和pH 5、6或7.4环境中,表现出更为理想的双响应的特性。此外,在H202存在的情况下,AOCD2080 NP在不同pH值条件下表现出较好的水解行为,因此,AOCD2080纳米粒进一步被用于后续的课题研究。采用基于ACD和OCD的复合材料,成功地构建了 pH/ROS双响应性纳米药物递送平台。值得注意的是,通过改变ACD/OCD的质量比,可以很容易地调控制备得到的纳米载体的精确的水解敏感性。3.pH和ROS双响应性载药纳米粒的制备和表征通过不同响应性空白纳米粒制备响应的载RAP纳米粒。同时,利用PLGA制备了非响应性载药纳米粒作为对照。与相应的空白纳米粒相似,四种载药纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到179±6 nm。RAP/PLGA纳米粒、RAP/ACD纳米粒、RAP/OCD纳米粒、RAP/AOCD纳米粒的载药量分别为4.5±0.4%、9.4±0.2%、8.2±0.1%、8.7±0.4%。通过体外药物释放实验研究检测了不同纳米药物的响应性释放行为。对于RAP/AOCD NP,与中性（pH=7.4）PBS缓冲液相比,RAP的释放在微酸性（pH=5或pH=6）PBS缓冲液中明显加快。同时,无论在上述三种不同pH值的PBS缓冲液中,在1mM H2O2存在的条件下都显着增加了载药纳米粒的药物释放速度。因此,RAP/AOCD NP表现出理想的pH/ROS双响应的释药能力,这与相应的空白纳米粒AOCD2080 NP的双响应性水解特性相吻合。另外,单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP药物释放也同样符合相应纳米载体的水解性能。通过利用基于pH响应性和ROS响应性材料设计的纳米复合材料可以简单、成功地构建出pH/ROS双响应性载RAP纳米粒。4.体外rVSMCs对双响应纳米粒的摄取Cy5标记的双响应性纳米粒（Cy5/AOCD NP）与VSMCs孵育1 h后,VSMCs中的荧光信号随着Cy5/AOCD纳米粒的剂量的增加而明显增强,提示细胞对纳米粒的内吞呈现剂量依赖性的特点。与激光共聚焦显微镜观察结果一致,流式细胞术荧光激活细胞分选（FACS）定量进一步证实了 VSMCs对Cy5/AOCD NP的有效细胞摄取呈剂量依赖的方式。在相同剂量的Cy5/AOCD NP下,随着孵育时间的延长,Cy5荧光在VSMCs中的分布也随之增加。而且,通过溶酶体探针Lysotracker对晚期核内体和溶酶体进行染色,发现血管平滑肌中内吞Cy5/AOCD NP从核内体/溶酶体转运到细胞质中（核内体/溶酶体逃逸现象）。同样,FACS的分析表明,随着孵育时间的增加,VSMCs内吞Cy5/AOCDNP的作用增强。这些结果充分表明,大鼠VSMCs可以有效地内吞基于ACD和OCD材料构建的pH/ROS双响应性纳米粒。在酸性和氧化应激微环境的亚细胞细胞器中,与pH响应性或ROS响应性的纳米粒相比,双响应性纳米粒能够更快地释放负载的药物分子。5.双响应性载药纳米粒的体外生物学效应不同响应性纳米粒的细胞毒性均较PLGA纳米粒低。载雷帕霉素纳米粒在相对低剂量下具有较低的细胞毒性。经RAP原料药和不同的RAP纳米粒治疗24小时,可显着抑制VSMCs的迁移。值得注意的是,与游离RAP相比,所有载药纳米粒都显示出明显更强的抑制VSMCs迁移效果。此外,响应性载药纳米粒对VSMCs迁移的抑制作用比非响应性载药纳米粒（RAP/PLGA NP）更为显着。值得注意的是,双响应性纳米药物治疗（RAP/AOCD NP）的抑制血管平滑肌细胞增殖的效果最好,与单一响应性纳米粒治疗相比差异显着。而且,不同载药纳米粒治疗对细胞周期的影响的实验表明,载RAP纳米粒主要通过抑制细胞G1/S的转化从而抑制VSMCs的增殖。载RAP纳米粒使细胞周期停滞在G1期的机制研究表明,双响应性载RAP纳米粒抑制VSMCs增殖通过上调p27Kip1和下调cyclin D1表达使细胞停滞于G1期。6.双响应性载RAP纳米粒在体靶向治疗血管再狭窄以大鼠颈动脉球囊损伤为模型,建立大鼠血管炎症性疾病模型,并通过Evan’s蓝染色证实明显的内皮剥脱损伤。pH敏感性荧光探针检测颈动脉损伤局部pH值的变化显示:正常动脉显示明显的绿色荧光,而球囊损伤后第1、7、14天分离的动脉组织荧光信号明显较弱,表明损伤动脉中存在相对酸性的微环境。用DHE和DCFHDA荧光探针对大鼠颈动脉冰冻组织切片进行染色,与正常动脉相比,球囊损伤后第1天颈动脉荧光强度轻度升高。而在损伤后第7天和第14天,可以观察到明显的增强荧光。这些结果证实动脉损伤部位存在氧化应激,很大程度与炎症的进展有关。双响应性纳米粒对损伤颈动脉的靶向性研究表明,纳米粒对内皮损伤的颈动脉具有靶向性,定量分析显示,非响应性纳米粒和响应性纳米粒治疗组间差异并无统计学意义。载RAP纳米粒给血管再狭窄治疗带来不同程度的获益,颈动脉管腔面积显着增加,而内膜面积和增殖指数明显减少,中膜面积无明显变化。在各组载RAP纳米粒的治疗中,双响应性载药纳米粒疗效最佳。在不同的载RAP纳米粒治疗后,免疫组织化显示:总α-SMA阳性细胞数量明显减少。此外,所有纳米药物治疗组的PCNA均显着降低,但以RAP/AOCD NP组的效果最好。MMP-2结果与PCNA相似。而且,在给予响应性载药纳米粒治疗的大鼠动脉中的8-OHdG表达显着降低。定量分析显示,在双响应性载药纳米粒治疗后,动脉组织中典型的氧化应激相关标志物,包括H202、MDA和MPO的水平显着降低。另一方面,损伤颈动脉SOD活性明显降低,经RAP/AOCD NP治疗后,SOD活性得到有效恢复。同时,与模型组相比,组织损伤部位的促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素（IL）1 β的表达水平在RAP/AOCD NP治疗后也发生了显着降低。7.pH和ROS双响应性靶向Ⅳ型胶原的载药纳米粒的制备与表征通过巯基-马来酰亚胺键合,将多肽KLWVLPKGGGC与DSPE-PEG结合。通过类似改良的纳米沉淀法/自组装法成功构建了靶向Ⅳ型胶原、p H-/RO S-双响应性纳米粒（TAOCDNP）。经TEM和SEM检测,TAOCDNP呈球形,具有较窄的粒径分布。平均流体力学直径131 nm,Zeta电位-27.2±0.3 mV。雷帕霉素可以包载到TAOCD NP中,形成一种靶向、双响应性载药纳米粒（RAP/TAOCD NP）,球形结构、粒径分布窄,能够有效负载雷帕霉素。8.TAOCD NP的体内外靶向能力评价与非靶向NPs（AOCD NP）相似。共聚焦显微镜观察和流式细胞术定量分析均显示VSMCs对Cy5/TAOCD NP的吞噬呈剂量依赖性和时间依赖性方式。这些结果证实了靶向肽的加入对AOCD NP的细胞摄取行为没有显着影响。Cy7.5/TAOCD NP在体外对ⅣV型胶原的粘附表明,引入到TAOCD NP上的靶向肽维持了其对ⅣV型胶原的特异性结合能力。TAOCD NP在体靶向能力表明,Cy7.5/TAOCD NP组在血管内皮损伤部位的荧光强度明显高于Cy7.5/AOCD NP组。动脉组织切片的显微镜观察也显示Cy5/TAOCD NP有相对较强的荧光。大鼠颈动脉冰冻组织切片Ⅳ型胶原抗体免疫荧光染色显示损伤动脉中Ⅳ型胶原（绿色荧光）与红色Cy5荧光共定位,而正常动脉中未见Cy5荧光。总之,这些结果证明,经靶向Ⅳ型胶原多肽修饰可显着增强pH和ROS双响应性纳米载体对损伤颈动脉的被动靶向聚集。9.双响应性载RAP靶向纳米粒靶向治疗血管再狭窄颈动脉H&E染色显示,RAP/AOCD NP或RAP/TAOCD NP治疗均能明显抑制血管新生内膜增生。与RAP/AOCD NP治疗组相比,RAP/TAOCD NP组在增加管腔面积、减少内膜面积及降低增殖指数方面均有显着差异。同样,免疫组化分析显示,与RAP/AOCD NP相比,RAP/TAOCD NP能更有效抑制VSMCs在血管内膜的增殖,显着降低了 MMP-2和8-OHdG的表达。这些结果表明,pH-/ROS-双响应性纳米药物治疗的体内防治血管再狭窄效果可以通过靶向单元修饰进一步增强。10.安全性评价将不同浓度的AOCD NP与红细胞孵育2 h,即使在浓度为2 mg/mL时,直接观察和定量分析均未见溶血。体内急性毒性试验显示,所有AOCD NP组均正常摄食和饮水,无异常行为。所有AOCD NP治疗大鼠的脏器指数（主要脏器）均与生理盐水组相当。此外,AOCD NP组血常规及肝功能,生化等相关指标与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义此外,对主要脏器的病理组织切片H&E染色表明,AOCD NP治疗的大鼠没有明显的病理改变。另外,对双重响应性载药纳米粒（RAP/AOCD NP）也进行了体内安全性研究。生理盐水组与空白纳米粒（AOCDNP）组及RAP/AOCDNP组脏器指数无显着差异。同样,经AOCD NP或RAP/AOCD NP治疗的大鼠在血常规及肝肾功能相关的生物标志物方面与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义。主要脏器的H&E染色切片显示几乎没有损伤。此外,鉴于RAP的免疫抑制活性,长期应用双响应载RAP纳米粒对大鼠脾脏T、B淋巴细胞数量无明显影响。而且,对C57BL6J小鼠进行类似的纳米粒长期给药治疗后,流式细胞术检测小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量,结果显示在RAP/AOCD NP作用下,小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量并没有显着变化。这些结果提示,相对低剂量的RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统没有显着的负面影响。总体而言,AOCDNP和RAP/AOCD NP均具有出良好的生物安全性。研究结论:1.通过联合基于β环糊精合成的pH响应性和ROS响应性材料,同时设计了一种简单和有效的方法成功构建了 pH和ROS双响应的纳米载体。2.通过优化pH响应性材料（ACD）和ROS响应性材料（OCD）的投料质量比,制备了最佳的pH和ROS响应能力的纳米粒。3.双响应性纳米粒AOCD NP能够有效地负载RAP,在低pH值或ROS较高的环境下,触发RAP/AOCD NP释放负载的RAP。RAP/AOCD NP可以通过被rVSMCs有效内吞并在亚细胞细胞器的敏感释放,增强药物分子在细胞内的递送。相比于游离RAP,非响应性和单响应性载RAP纳米粒,RAP/AOCD NP显着的抑制了血管平滑肌细胞的增殖和迁移。4.AOCD NP能够靶向聚集在大鼠颈动脉球囊损伤的部位,通过在动脉损伤部位被动靶向和触发释放RAP,与其他载药纳米粒比较,RAP/AOCD NP在大鼠中表现出更理想的抗再狭窄作用。5.通过靶向ⅣV型胶原多肽的修饰,进一步提高了AOCD NP的靶向能力,成功制备了 pH/ROS双响应的靶向纳米递送平台TAOCD NP。负载RAP的TAOCD NP比相比RAP/AOCD NP,更有效地抑制了大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成。6.AOCD NP和RAP/AOCD NP均具有良好的生物安全性。本课题研究设计的pH/ROS双响应纳米载体和构建的纳米药物递送系统有望进一步用于治疗血管再狭窄和其他与血管炎症相关的心血管疾病。
常晓丛[9]（2019）在《共融型化学驱动微米机器人的交互作用研究》文中指出微纳技术是影响世界国防、政治以及经济的前沿技术之一。作为微纳技术的核心执行元件,微米机器人能够将介质环境中的光能、电能、磁能、超声能以及化学能转化成驱动自身运动的机械能。其中化学驱动微米机器人是研究最早且应用最为广泛的微米机器人之一,功能化后的化学驱动微米机器人能实现在生物医疗、靶向运输、环境修复等领域的应用。然而,单一化学驱动微米机器人不具有协作、互助以及协同作业等能力,且存在自主性差、智能化程度低、多模态环境感知能力差等不足。针对上述问题,亟需研究不同种类化学驱动微米机器人之间的交互协作、互帮互助以及协同作业的能力,提高化学驱动微米机器人的智能化程度。然而,化学驱动微米机器人的尺寸在微米范围,无法像宏观机器人一样集成传感器等宏观器件,因此研究不同种类的化学驱动微米机器人之间的交互协作将面临方向操控精度低、集成度低、交互通讯困难等挑战。针对上述问题,本文通过机械、材料、生物、物理以及化学等多学科交叉,围绕人-机-环境共融型化学驱动微米机器人,根据仿生学原理与微米机器人自身特性,通过实验研究和仿真分析相结合的方法研究化学驱动微米机器人与环境、人以及机器人之间的交互作用机理以及交互协作行为,开展不同种类化学驱动微米机器人之间的协作互助研究,从而提升不同种类化学驱动微米机器人之间的交互协作、互帮互助以及协同作业的能力,实现货物转运、微纳图案构型、自主避障以及协作提速等复杂任务与应用。基于化学驱动微米机器人之间的交互作用,研究不同种类化学驱动微米机器人之间通过协作进行货物定向转运的机理。通过仿真分析与实验研究相结合的方法分析了不同种类货物载体与货物受体微米机器人之间货物转运过程及转运前后微米机器人的运动行为。不同种类微米机器人之间进行货物转运的关键是微米机器人与货物之间相互作用力大小的较量。同时,通过货物受体PS/Ni/Pt微米机器人与货物载体PS/Pt微米机器人之间的交互协作,不仅能够实现货物的单次转运还能够实现货物的连续转运;基于化学驱动微米机器人之间的交互作用,通过仿真分析与实验研究相结合的方法对两种不同化学驱动微米机器人通过离子信号交互进行协助加速的机理进行研究。采用物理气相沉积技术制备信号载体PS/Ni/Au/Ag微米机器人与信号受体Si O2/Pt微米机器人,研究信号载体与信号受体交互作用前后的运动行为。信号载体微米机器人在自驱动的同时会向介质环境中释放银离子,当信号载体在外界磁场导向下定向运动至信号受体附近时,银离子作为交互通信的离子信号能够被Si O2/Pt微米机器人感知,并在其Pt端进行欠电位沉积,增强信号受体微米机器人的催化活性,最终实现信号受体运动速度的提升。同时,通过外界磁场的导向作用可实现选择性或连续性地加速特定信号受体微米机器人。基于化学驱动微米机器人与环境之间的交互作用,通过将可自主运动的微米机器人与传统的微泵系统结合,设计一种基于PS/Ni/Zn O双面球微米机器人的可移动微泵系统,采用仿真分析与实验研究相结合的方法研究微米机器人与环境协同进行微图案构型的机理。PS/Ni/Zn O微米机器人能够在惰性粒子沉降层环境中进行自驱动的同时,在电场力和电渗透力的共同作用下与环境中惰性粒子相互作用,从而沿着微米机器人的运动轨迹构型出微纳尺度的图案。通过改变PS/Ni/Zn O双面球微米机器人的直径可以调节可移动微泵系统构型的图案宽度以及构型速度。在外界磁场作用下,通过化学驱动微米机器人与环境的协同交互作用可构型出复杂的几何图案以及可用于信息传递的字母图案。基于化学驱动微米机器人与人之间的交互作用,通过图像识别技术、路径规划技术以及磁场控制系统相结合,研究化学驱动微米机器人与人之间的协同避障功能。人机交互协作系统主要包括图像识别模块、路径规划模块、磁场控制系统等三部分组成。其中图像识别模块主要用于识别微米机器人、障碍物、目标物体的轮廓及位置;路径规划模块根据图像识别模块提供的位置信息进行微米机器人的路径规划;磁场控制系统主要通过反馈的位置及障碍物信息实现对微米机器人运动方向的实时控制。在人机交互协作系统作用下,化学驱动微米机器人能够准确避开简单静态障碍物以及复杂动静态障碍物,并按照预定轨迹进行癌细胞的靶向定位。
牛世伟[10]（2019）在《基于壳聚糖的乳腺癌靶向治疗纳米载药系统》文中进行了进一步梳理癌症是威胁人类健康的一大难题,据统计,全世界每年有数以百万计的人死于癌症。特别是乳腺癌,其不仅是女性人群中发病率最高的恶性肿瘤,也是致死率最高的疾病之一,严重危害着女性身体健康。由于开发新型治疗药物的成本高、周期长且风险大,因此针对现有药物研制新型传输系统成为首选治疗方案。现阶段大多数临床抗癌药物,如紫杉醇（PTX）、甲氨蝶呤（MTX）、5-氟脲嘧啶（5-FU）、阿霉素（DOX）等,在水溶液中溶解度非常低。且由于化疗药物在治疗过程中全身分布,而导致其存在许多的毒副作用,如其对正常组织细胞的毒害以及其它的机体不良反应,这些都是一直困扰着化疗药物临床应用的限制因素。为提高药物的水溶性及靶向性,降低毒副作用,纳米智能载药的设计及应用越来越受到人们的关注。纳米载体应用于药物靶向传递和药物控制释放的策略可以解决化疗药物的众多局限性,例如:增强水溶性,减少副作用,增加肿瘤组织中药物的被动积累和延长血液循环时间等。本项目从肿瘤组织特定的pH、温度和低氧等生理环境出发,以具有良好生物相容性和pH敏感性的壳聚糖为基材,结合温敏性聚合物和靶向多肽,设计合成一系列多层次靶向治疗的智能载药颗粒,实现被动（第一层次）靶向、主动（第二层次）靶向和细胞微环境（第三层次）响应性释放药物的新型乳腺癌靶向治疗系统。该载药体系作为抗肿瘤药物的传递系统具有较好的应用前景,也可以为乳腺癌的治疗提供可行的技术方案和夯实的理论基础。本论文分为六个章节,总共介绍了四种乳腺癌靶向智能纳米载药系统,并对它们的疗效进行了验证。根据肿瘤组织低高热和偏酸性的特点,我们将温敏性聚合物PNIPAM通过RAFT聚合的方法与pH敏感性材料壳聚糖结合,使接枝复合物（CS-g-PNIPAM）可在水溶液中自组装成大小均一的纳米球,利用其形成的疏水核心可以将疏水性药物PTX载入纳米材料中,得到的载药复合材料可以在肿瘤微环境pH/温度响应性释放药物。另外,将靶向于乳腺癌细胞表面标志物GRP78的新型靶向多肽L肽修饰在载药纳米材料表面,来增加载药颗粒的主动靶向性和化疗效率。实验结果证明,合成的靶向纳米载药颗粒（L-CS-g-PNIPAM-PTX NPs）具有较高的载药量（13.5%）和包封率（74.3%）,平均尺寸在275 nm左右,且分散性良好,非常适合体内静脉注射。PTX的释放速率在pH7.4和25°C时缓慢,但在pH 5.0和37°C时释放速率大大加快。体外共聚焦和MTT实验检测表明,L-CS-g-PNIPAM-PTX纳米颗粒对GRP78过表达的人乳腺癌细胞MDA-MB-231具有较高的靶向性,且可通过多种途径诱导强效的抗肿瘤作用。L-CS-g-PNIPAM-PTX纳米颗粒对癌细胞的杀伤作用比游离PTX更有效,说明该纳米颗粒可以进一步增强协同治疗的效果。体内实验同样证明。L-CS-g-PNIPAM-PTX纳米颗粒能有效治疗乳腺癌MDA-MB-231荷瘤小鼠,高效抑制肿瘤生长,副作用小,大部分荷瘤小鼠的存活率提高到60天以上。综合证明,L-CS-g-PNIPAM-PTX纳米颗粒是一种很有前途的抗肿瘤纳米载药系统,具有很大的乳腺癌靶向化疗潜力,可在未来乳腺癌临床试验中加以利用。在乳腺癌患者中,某些肿瘤细胞类型由于缺少表达许多关键的生物标记物,而这些受体通常用于肿瘤的靶向治疗,因此对于此类肿瘤细胞的靶向治疗非常困难。在本文中,我们针对此类肿瘤细胞的靶向治疗选择了一种级联响应,穿膜靶向的方式。同样,我们根据肿瘤低高热和微酸性微环境的特点,将温敏性材料PNVCL与壳聚糖接枝。通过调整PNVCL的接枝比例,使得复合物的低临界温度（LCST）达到肿瘤细胞温度附近。这样,在纳米颗粒到达肿瘤位置的时候,由于温度升高引起PNVCL的物理相变,而pH降低又引发了壳聚糖结构的崩塌,达到药物控释的效果。然后,我们将一种具有细胞穿膜效果的小肽CPP通过酰胺键与接枝复合物CS-co-PNVCL结合。因为肿瘤细胞周围是致密的细胞外基质充满着基质金属蛋白酶（MMPs）和高渗透压,使得纳米颗粒很难穿透肿瘤细胞。MMPs可以引发酰胺键的断裂解除CPP的穿膜作用,使载药纳米颗粒留在癌细胞内,从而达到了主动靶向癌细胞的作用。我们的实验结果也表明,合成的载药纳米颗粒CPP-CS-co-PNVCL@DOX具有较高的DOX载药率（14.8±1.8%）和药物包封率（85.3±9.7%）。尺寸小于200 nm,分散性良好。并且观察到纳米颗粒CPP-CS-co-PNVCL@DOX在酸性和低高热条件下药物释放加速,乳腺癌细胞MCF-7对纳米颗粒的摄取增加,引起癌细胞在体外程序性死亡。MCF-7荷瘤小鼠体内实验也显示,合成的纳米颗粒在静脉给药后积累于肿瘤部位,在抑制和逆转癌细胞生长方面效果明显。此外,CPP-CS-co-PNVCL@DOX显示出良好的体内外血液相容性和生物相容性,无不良毒副作用。因此,本研究开发的纳米载药体系适用于缺乏生物标志物表达的乳腺癌靶向治疗（例如三阴性乳腺癌）,对于不易治愈的癌症有潜在的治疗价值。多药耐药性（MDR）主要与膜转运蛋白P-糖蛋白（P-gp）和多药耐药蛋白（MRP）的过表达有关,两者可以将癌细胞内的抗癌药物外排,这大大减少了肿瘤对化疗的敏感性。在本论文中,我们应用了一种可以降低癌细胞MDR的天然化疗增敏剂——齐墩果酸（OA）,以此来增加纳米药物的化疗效果。我们将齐墩果酸与壳聚糖接枝,并在壳聚糖外部修饰能够靶向于肿瘤的叶酸,在接枝聚合物自组装形成的核壳结构中心负载抗肿瘤药物DOX,对乳腺癌细胞进行联合治疗。实验结果证明,我们开发的这种OA和DOX的靶向共给药系统（FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒）具有较高的载药率（15.6%w/w DOX;5.1%w/w OA）。并且纳米颗粒的粒径大小适合肿瘤治疗（180nm）,分散性良好（PDI<0.45）,展现出pH响应性释药特点。体外实验观察到乳腺癌MDA-MB-231细胞对FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒的吸收比游离DOX更有效,且FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒对乳腺癌细胞展现出更高的细胞毒性,对正常细胞的毒性较小。体内研究也表明,FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒比游离DOX具有更长的血液循环时间,并可以有效靶向MDA-MB-231荷瘤小鼠的肿瘤部位。当使用FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒时,小鼠全身毒性降低,存活时间增加。OA的存在可以下调与MDR相关的P-gp和MRP-1蛋白表达,增加化疗敏感性。通过抑制肝/肾损伤、抗氧化和抗炎作用来减轻化疗引起的组织损伤。总而言之,我们合成的FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒对癌细胞具有联合治疗的作用,在缓解MDR方面具有很大的潜力,并进一步提供了一个多功能平台,可以治疗其他癌症。在众多乳腺癌致死的病例中,癌细胞扩散是导致肿瘤相关死亡最多、治疗效果最差的主要原因,因为在这种情况下,癌细胞从原发肿瘤中分离出来,漫无目的地扩散到附近的器官和组织,使其难以追踪和准确治疗。解决这一难题的有效策略是应用诊疗一体化纳米系统,该平台同时包含抗肿瘤药物和成像剂。在本研究中,我们将抗肿瘤化疗药物PTX接枝到壳聚糖上组成前药CS-PTX,并修饰以靶向于扩散肿瘤细胞的小肽K237,利用接枝聚合物K237-CS-PTX自组装形成的疏水中心负载光热以及成像试剂二硫化钼（MoS2）。合成的药物递送系统K237-CS-PTX@MoS2不仅提高了PTX和MoS2的溶解度和血液循环时间,而且在生理条件下为细胞毒性药物PTX提供了“隐藏”效果。实验结果显示,肿瘤的微环境刺激例如:谷胱甘肽（GSH）和pH等,可以使这种前药从生理环境中的“沉默状态”转化为肿瘤内的“激活状态”。体内外实验证明,我们合成智能纳米材料表现出对乳腺癌细胞较高的亲和力和特异性,能够有效的杀死肿瘤细胞。另外,由于MoS2独特的光热性能,我们还对荷瘤小鼠进行了光热治疗,光声成像,CT成像等实验,都取得了不错的效果。说明我们设计的多功能纳米颗粒可以显着提高乳腺癌的协同治疗效率,达到诊疗一体化的效果。综上所述,我们成功利用壳聚糖的优良性能制备了多种智能纳米材料,实现了抗肿瘤药物的肿瘤微环境响应性释放,主动靶向与被动靶向的结合,解决了不同类型乳腺癌的高效治疗。根据肿瘤组织偏酸性环境的特点,我们以壳聚糖为药物递送系统的基底材料,着重研究了壳聚糖纳米材料pH响应性释药的特点。二硫键的加入可以使合成的纳米材料,体现出对肿瘤氧化还原微环境响应性释药的行为。而对于肿瘤细胞低高热的特征,我们分别使用PNIPAM和PNVCL与壳聚糖接枝,使得载药体系能够在温度升高时,加速释药。分别使用叶酸,L肽,CPP和K237肽来修饰壳聚糖材料,以提高载药体系的主动靶向能力,结果都显示出了不错的效果。而齐墩果酸可以作为化疗增敏剂增加治疗的效率,抑制肿瘤细胞耐药性。另外,MoS2的加入可以使我们的材料具备光热性能,从而对肿瘤组织进行光热治疗,光声成像,CT成像等一系列诊疗一体化应用。希望本研究可以为后续更多且更有价值的壳聚糖纳米诊疗材料的制备和应用提供一定的参考,为乳腺癌的治疗提供一定的理论支持。
二、红细胞有望成为药物转运的理想载体（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、红细胞有望成为药物转运的理想载体（论文提纲范文）
（1）具有活性氧和剪切应力双重响应药物递送系统及用于动脉粥样硬化治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 动脉粥样硬化的概述 |
| 1.2.1 动脉粥样硬化的形成与发展 |
| 1.2.2 动脉粥样硬化的致病因素 |
| 1.2.2.1 血脂 |
| 1.2.2.2 炎症 |
| 1.2.2.3 血液动力学 |
| 1.2.2.4 血压 |
| 1.2.2.5 糖尿病 |
| 1.2.2.6 吸烟 |
| 1.2.3 动脉粥样硬化的临床诊断和治疗 |
| 1.2.3.1 动脉粥样硬化的临床诊断 |
| 1.2.3.2 动脉粥样硬化的临床治疗 |
| 1.3 纳米技术在动脉粥样硬化中的应用 |
| 1.3.1 纳米药物在动脉粥样硬化治疗中的应用 |
| 1.3.1.1 pH响应型 |
| 1.3.1.2 活性氧响应型 |
| 1.3.1.3 靶向递送 |
| 1.3.1.4 光热敏感型 |
| 1.3.2 纳米探针在动脉粥样硬化诊断中的应用 |
| 1.3.2.1 近红外(NIR)荧光成像纳米探针 |
| 1.3.2.2 光声成像纳米探针 |
| 1.3.2.3 多模态成像纳米探针 |
| 1.4 活性氧敏感型纳米载体的应用 |
| 1.4.1 内源性ROS敏感药物释放 |
| 1.4.2 外源性ROS敏感药物释放 |
| 1.5 机械应力敏感型纳米载体的应用 |
| 1.5.1 内源机械应力刺激型纳米载体 |
| 1.5.2 外源机械应力刺激型纳米载体 |
| 1.6 本论文的研究思路和主要内容 |
| 第二章 具有ROS和剪切应力双重响应的SA PEI@RBCs用于动脉粥样硬化的治疗 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验原料 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 PEI-SH的合成 |
| 2.2.4 SA的合成 |
| 2.2.5 SA PEI的制备 |
| 2.2.6 SA PEI@RBCs的制备 |
| 2.2.7 SA PEI和 SA PEI@RBCs的表征 |
| 2.2.8 SA PEI的载药量及药物释放 |
| 2.2.9 SA PEI的血液相容性 |
| 2.2.10 SA PEI的细胞毒性 |
| 2.2.11 细胞内ROS的水平 |
| 2.2.12 NR PEI@RBCs的细胞内吞 |
| 2.2.13 体外剪切模型 |
| 2.2.14 FeCl_3诱导的兔颈动脉血栓形成模型 |
| 2.2.15 体内安全性评价 |
| 2.2.16 统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 SA PEI和 SA PEI@RBCs的制备与表征 |
| 2.3.2 体外药物释放 |
| 2.3.3 体外溶血分析 |
| 2.3.4 细胞毒性 |
| 2.3.5 细胞内ROS的含量 |
| 2.3.6 细胞内吞 |
| 2.3.7 体外剪切应力响应 |
| 2.3.8 体内治疗 |
| 2.3.9 体内安全性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 具有高载药量的 ROS和剪切应力双重响应的 SA PAM@RBCs用于动脉粥样硬化的治疗 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验原料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 4.0G PAMAM的合成 |
| 3.2.4 PAM-SH的合成 |
| 3.2.5 SA PAM的合成 |
| 3.2.6 SA PAM@RBCs的合成 |
| 3.2.7 SA PAM和 SA PAM@RBCs的表征 |
| 3.2.8 SA PAM的载药量与药物释放 |
| 3.2.9 细胞与动物 |
| 3.2.10 血液相容性 |
| 3.2.11 MTT |
| 3.2.12 细胞内ROS的检测 |
| 3.2.13 流式细胞术 |
| 3.2.14 体外细胞摄取研究 |
| 3.2.15 体外剪切模型 |
| 3.2.16 FeCl_3诱导的兔颈动脉血栓形成模型 |
| 3.2.17 ApoE~(-/-)小鼠模型 |
| 3.2.18 药代动力学 |
| 3.2.19 安全性评价 |
| 3.2.20 统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 辛伐他汀酸、4.0G PAMAM和 PAM-SH的表征 |
| 3.3.2 SA PAM和 SA PAM@RBCs的表征 |
| 3.3.3 体外H_2O_2敏感性药物释放曲线 |
| 3.3.4 体外溶血分析 |
| 3.3.5 体外细胞存活率 |
| 3.3.6 巨噬细胞中ROS的含量 |
| 3.3.7 巨噬细胞对SA PAM@RBCs的体外细胞摄取 |
| 3.3.8 剪切应力模型 |
| 3.3.9 药代动力学 |
| 3.3.10 FeCl_3诱导兔颈动脉血栓形成模型 |
| 3.3.11 ApoE~(-/-)小鼠体内模型 |
| 3.3.12 SA PAM@RBCs的体内安全性评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 具有ROS和剪切应力响应的仿生胶束药物递送系统通过消耗活性氧有效地治疗动脉粥样硬化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验原料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 PGED的合成 |
| 4.2.4 PGED-PPS的合成 |
| 4.2.5 SV MC@RBCs的合成 |
| 4.2.6 SV MC@RBCs的表征 |
| 4.2.7 体外载药量和药物释放曲线的测定 |
| 4.2.8 活性氧清除能力的测定 |
| 4.2.9 溶血试验 |
| 4.2.10 体外细胞毒性试验 |
| 4.2.11 剪切力诱导的FITC MC@RBCs的体外解吸附 |
| 4.2.12 细胞摄取 |
| 4.2.13 细胞内ROS的测量 |
| 4.2.14 流式细胞仪分析 |
| 4.2.15 动物 |
| 4.2.16 体内FeCl_3诱导的颈动脉血栓模型 |
| 4.2.17 体内药代动力学研究 |
| 4.2.18 SV MC@RBCs体内生物安全性评价 |
| 4.2.19 统计分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 SV MC@RBCs的合成与表征 |
| 4.3.2 体外药物释放曲线的测定 |
| 4.3.3 活性氧清除能力的测定 |
| 4.3.4 溶血试验 |
| 4.3.5 体外细胞毒性试验 |
| 4.3.6 体外剪切力诱导的FITC MC@RBCs解离 |
| 4.3.7 SV MC@RBCs的细胞摄取 |
| 4.3.8 细胞内ROS水平的测量 |
| 4.3.9 SV MC@RBCs的抗血栓活性 |
| 4.3.10 体内药代动力学研究 |
| 4.3.11 SV MC@RBCs的体内生物安全性评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）PON2在急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）发生中的作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 临床数据来源 |
| 1.2 病人样本 |
| 1.3 小鼠 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要引物及gRNA序列 |
| 1.6 抗体 |
| 1.7 主要仪器 |
| 1.8 主要软件及数据库 |
| 2 方法 |
| 2.1 NP抗原特异性反应的小鼠体内实验 |
| 2.2 骨髓细胞的获取与前体B细胞的体外扩增 |
| 2.3 质粒的克隆 |
| 2.4 质粒的突变引入 |
| 2.5 逆转录病毒与慢病毒的包装与感染 |
| 2.6 小鼠B-ALL模型的建立 |
| 2.7 诱导性Pon2 表达模型(Tet-on)的建立 |
| 2.8 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除 |
| 2.9 单细胞克隆 |
| 2.10 流式细胞术分析 |
| 2.11 细胞内染色 |
| 2.12 细胞周期检测 |
| 2.13 细胞ROS检测 |
| 2.14 药物处理与细胞活性检测 |
| 2.15 2-NBDG染色法检测细胞葡萄糖摄入 |
| 2.16 葡萄糖摄入检测试验 |
| 2.17 细胞总ATP检测试验 |
| 2.18 乳酸产生检测试验 |
| 2.19 糖酵解检测试验 |
| 2.20 western blot分析 |
| 2.21 免疫共沉淀 |
| 2.22 RNA提取、反转录及荧光定量PCR |
| 2.23 小鼠基因分型的鉴定 |
| 2.24 统计分析方法 |
| 结果 |
| 1 PON2 高表达提示B-ALL患者预后差 |
| 1.1 PON2在Ph~+B-ALL和 Ph-like B-ALL患者中高表达 |
| 1.2 PON2 mRNA高表达提示B-ALL患者临床预后差 |
| 1.3 PON2 mRNA高表达对B-ALL患者的生存预后具有独特的意义 |
| 2 PON2 通过调控葡萄糖代谢参与B-ALL细胞增殖调控 |
| 2.1 Pon2 影响早期B细胞发育 |
| 2.2 Pon2 促进小鼠B-ALL细胞的葡萄糖摄入与ATP产生 |
| 2.3 Pon2 通过Stom调节小鼠B-ALL细胞的葡萄糖代谢 |
| 3 PON2 通过干扰GLUT1-STOM相互作用而参与葡萄糖代谢的调控 |
| 3.1 人白血病细胞中PON2 基因的敲除再现了小鼠Pon2 敲除的细胞学表型 |
| 3.2 PON2 通过干扰GLUT1-STOM相互作用促进葡萄糖代谢 |
| 3.3 PON2 表达于细胞表面 |
| 3.4 PON2 敲除增强B-ALL细胞对激素的敏感性 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 关于PON2研究进展的综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间学术成果 |
| 博士期间主持的国家级课题 |
（3）靶向线粒体的蛋白质无载体递送及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本论文主要创新点 |
| 主要缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质药物的细胞递送 |
| 1.1.1 蛋白质作为治疗药物面临的问题 |
| 1.1.2 载体依赖的蛋白质细胞递送 |
| 1.1.3 蛋白质的无载体细胞递送 |
| 1.2 线粒体 |
| 1.2.1 线粒体功能 |
| 1.2.2 ROS的产生及生理作用 |
| 1.2.3 抗氧化酶 |
| 1.2.4 线粒体相关病症 |
| 1.3 靶向线粒体的蛋白质递送 |
| 1.3.1 靶向线粒体的小分子 |
| 1.3.2 靶向线粒体的蛋白质递送 |
| 1.4 蛋白质修饰 |
| 1.4.1 N末端特异性修饰 |
| 1.4.2 可断裂修饰 |
| 1.5 本论文选题依据、研究内容和意义 |
| 1.5.1 选题依据 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 研究意义 |
| 第二章 蛋白质的化学修饰及表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂、仪器与溶液配制 |
| 2.2.2 合成路线 |
| 2.2.3 蛋白质修饰路线 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 N末端RhB特异性修饰蛋白质的表征 |
| 2.3.2 香豆素光笼修饰蛋白质的表征 |
| 2.3.3 香豆素光笼修饰抗氧化酶的表征 |
| 2.3.4 香豆素光笼-RhB修饰蛋白质的表征 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 修饰蛋白质的无载体细胞递送 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂、仪器与溶液配制 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 RhB特异性修饰蛋白质的细胞无载体递送 |
| 3.3.2 RhB特异性修饰蛋白质的细胞分布及跨膜途径 |
| 3.3.3 香豆素光笼修饰蛋白质的细胞无载体递送 |
| 3.3.4 香豆素光笼修饰蛋白质的细胞分布及跨膜途径 |
| 3.3.5 香豆素光笼-RhB修饰蛋白质的无载体细胞递送及跨膜途径 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 修饰抗氧化酶的体内分布及抗肿瘤研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 RhB特异性修饰抗氧化酶的溶血活性 |
| 4.3.2 RhB特异性修饰抗氧化酶的生理毒性 |
| 4.3.3 RhB特异性修饰抗氧化酶的体内分布 |
| 4.3.4 RhB特异性修饰抗氧化酶的体内抗肿瘤活性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 修饰抗氧化酶对癌细胞线粒体功能的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 修饰过氧化氢酶对癌细胞ATP含量的影响 |
| 5.3.2 修饰过氧化氢酶对癌细胞辅酶I的影响 |
| 5.3.3 修饰过氧化氢酶对癌细胞线粒体膜电位的影响 |
| 5.3.4 修饰过氧化氢酶对癌细胞线粒体细胞色素C外流的影响 |
| 5.3.5 修饰过氧化氢酶对癌细胞线粒体通透性转换孔的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 修饰抗氧化酶保护正常细胞免受氧化损伤 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 试剂 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 正常细胞氧化损伤模型的建立 |
| 6.3.2 修饰过氧化氢酶保护正常细胞DNA免受氧化损伤 |
| 6.3.3 修饰过氧化氢酶保护正常细胞线粒体免受氧化损伤 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 相关化合物的核磁谱图 |
| 附录Ⅱ 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ CD26阳性尿外泌体与重症患者急性肾损伤预后关系的前瞻性队列研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2 方法与材料 |
| 3 结果 |
| 4 讨沦 |
| 5 结论 |
| 6 局限性 |
| 附图与附表 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ CD26阳性外泌体对急性肾损伤后肾脏修复作用的机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5.结论 |
| 6.局限性 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞外囊泡与肾脏疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 发表论文1 |
| 发表论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）负载过氧化钙的纳米塑效体系及其抗前列腺癌应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1.研究背景 |
| 1.1 活性氧的抗肿瘤应用 |
| 1.2 介孔硅基纳米载体的开发与应用 |
| 1.3 介孔硅基活性氧可控释放纳米体系及其抗肿瘤应用 |
| 1.3.1 响应性靶向释放活性氧 |
| 1.3.2 辅助强化传统抗肿瘤治疗 |
| 1.3.3 纳米催化抗肿瘤 |
| 1.4 小结 |
| 2.本研究的目的、意义、方法及技术路线 |
| 2.1 本研究的目的与意义 |
| 2.2 本研究的研究方法及技术路线 |
| 第二章 CaO_2@HMSNs-PAA的合成及表征 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验试剂与材料 |
| 2.1.2 主要实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HMSNs的合成 |
| 2.2.2 CaO_2@HMSNs-PAA的合成 |
| 2.2.3 被覆PAA的 HMSNs-NH_2(HMSNs-PAA)的合成 |
| 2.2.4 负载CaO_2的HMSNs(CaO_2@HMSNs)的合成 |
| 2.2.5 CaO_2@HMSNs-PAA的表征 |
| 2.2.6 CaO_2@HMSNs及CaO_2@HMSNs-PAA装载量的测定 |
| 2.2.7 CaO_2@HMSNs及CaO_2@HMSNs-PAA释放曲线的绘制 |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 CaO_2@HMSNs-PAA的合成 |
| 3.2 CaO_2@HMSNs-PAA的表征 |
| 3.3 CaO_2@HMSNs及CaO_2@HMSNs-PAA的装载量及释放曲线 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三章 CaO_2@HMSNs-PAA的体外抗前列腺癌作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验试剂与材料 |
| 2.1.3 主要实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CaO_2@HMSNs-PAA的细胞摄取试验 |
| 2.2.2 CaO_2@HMSNs-PAA的细胞毒性试验 |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 PC-3前列腺癌细胞系对CaO_2@HMSNs-PAA的摄取 |
| 3.2 CaO_2@HMSNs-PAA的体外抗前列腺癌作用 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第四章 CaO_2@HMSNs-PAA的体内抗前列腺癌作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.1.3 主要实验试剂与材料 |
| 2.1.4 主要实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CaO_2@HMSNs-PAA的体内安全性评估 |
| 2.2.2 裸鼠皮下移植瘤模型的构建 |
| 2.2.3 CaO_2@HMSNs-PAA的组织分布 |
| 2.2.4 CaO_2@HMSNs-PAA的体内抗前列腺癌试验 |
| 2.2.5 组织学分析 |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 CaO_2@HMSNs-PAA的体内安全性 |
| 3.2 CaO_2@HMSNs-PAA的组织分布 |
| 3.3 CaO_2@HMSNs-PAA的体内抗前列腺癌作用 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第五章 CaO_2@HMSNs-PAA抗前列腺癌机制的初步研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.1.3 主要实验试剂与材料 |
| 2.1.4 主要实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PC-3前列腺癌细胞的胞内活性氧检测 |
| 2.2.2 PC-3前列腺癌细胞的凋亡检测 |
| 2.2.3 免疫组织化学分析 |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 CaO_2@HMSNs-PAA在肿瘤微环境下响应性释放活性氧 |
| 3.2 CaO_2@HMSNs-PAA响应性诱导PC-3前列腺癌细胞凋亡 |
| 3.3 CaO_2@HMSNs-PAA激活线粒体介导的凋亡通路 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第六章 结论 |
| 1.主要结论 |
| 2.创新点 |
| 3.存在不足 |
| 4.研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的学术论文和科研成果目录 |
（6）三级胺氮氧化物聚合物纳米递药体系与微流控分步可控制备纳米复合物的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 三级胺氮氧化物聚合物纳米递药体系 |
| 1.1 癌症及其治疗手段 |
| 1.2 肿瘤微环境及其血管异常 |
| 1.2.1 肿瘤微环境 |
| 1.2.2 肿瘤血管异常 |
| 1.3 纳米药物递送系统 |
| 1.3.1 纳米制剂的种类及其特性 |
| 1.3.2 纳米药物临床表现及其困境 |
| 1.3.3 纳米药物递送历程 |
| 1.3.4 目前纳米递药系统的局限性与突破口 |
| 1.4 提升纳米药物瘤内渗透能力的方法 |
| 1.4.1 调整肿瘤微环境 |
| 1.4.2 多级尺寸转变 |
| 1.4.3 跨细胞转运模式 |
| 1.4.4 电荷反转 |
| 1.4.5 低氧响应 |
| 1.5 增强纳米药物细胞器靶向及定位释放 |
| 1.5.1 细胞核靶向 |
| 1.5.2 溶酶体靶向 |
| 1.5.3 高尔基体/内质网靶向 |
| 1.5.4 线粒体靶向 |
| 1.6 课题一的提出 |
| 第二章 三级胺氮氧化物聚合物的合成及表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及仪器 |
| 2.2.1 实验药品和试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 工作溶液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 三级胺氮氧化物两亲嵌段聚合物OPDMA-PCL/OPDEA-PCL的合成 |
| 2.3.2 对照聚合物PEG-PCL的合成 |
| 2.3.3 荧光标记的聚合物载体的合成 |
| 2.3.4 聚合物胶束的制备 |
| 2.3.5 氮氧化物聚合物胶束粒径及电位的测定 |
| 2.3.6 透射电镜观测氮氧化物聚合物胶束 |
| 2.3.7 氮氧化物聚合物胶束的临界胶束浓度测定 |
| 2.3.8 氮氧化物聚合物胶束在不同介质中的稳定性测试 |
| 2.3.9 氮氧化物聚合物胶束体外药物释放测定 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 三级胺氮氧化物两亲嵌段聚合物OPDMA-PCL/OPDEA-PCL的合成及表征 |
| 2.4.2 对照聚合物PEG-PCL的合成及表征 |
| 2.4.3 聚合物胶束的制备及表征 |
| 2.4.4 疏水染料尼罗红检测临界胶束浓度 |
| 2.4.5 氮氧化物聚合物胶束在不同介质中的粒径变化 |
| 2.4.6 氮氧化物聚合物胶束在不同pH环境中的药物释放 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 三级胺氮氧化物聚合物的体内外生物学考察 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及仪器 |
| 3.2.1 实验药品和试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 细胞系及实验动物 |
| 3.2.4 工作溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 氮氧化物聚合物胶束细胞毒性实验 |
| 3.3.2 氮氧化物聚合物胶束在体外肿瘤模型中的研究 |
| 3.3.3 氮氧化物聚合物胶束入胞速率研究 |
| 3.3.4 氮氧化物聚合物胶束内吞行为研究 |
| 3.3.5 内吞抑制剂对氮氧化物聚合物胶束内吞的影响 |
| 3.3.6 氮氧化物聚合物胶束的血浆清除 |
| 3.3.7 氮氧化物聚合物胶束与红细胞的附着能力 |
| 3.3.8 氮氧化物聚合物胶束在裸鼠体内的组织分布 |
| 3.3.9 氮氧化物聚合物胶束在裸鼠肿瘤组织的渗透 |
| 3.3.10 荷瘤裸鼠皮下移植瘤抑瘤实验 |
| 3.3.11 肿瘤组织病理学检测 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 氮氧化物聚合物胶束细胞毒性及肿瘤球毒性分析 |
| 3.4.2 氮氧化物聚合物胶束在肿瘤球中的渗透分析 |
| 3.4.3 氮氧化物聚合物胶束入胞速率比较 |
| 3.4.4 氮氧化物聚合物胶束的内吞行为分析 |
| 3.4.5 内吞抑制剂对氮氧化物聚合物胶束内吞的影响 |
| 3.4.6 氮氧化物聚合物胶束的血浆清除考察 |
| 3.4.7 氮氧化物聚合物胶束与红细胞的附着性能考察 |
| 3.4.8 氮氧化物聚合物胶束在裸鼠体内的组织分布分析 |
| 3.4.9 氮氧化物聚合物胶束在裸鼠肿瘤组织中的渗透探究 |
| 3.4.10 氮氧化物聚合物胶束的体内抑瘤评价 |
| 3.4.11 肿瘤及脏器切片病理研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 微流控分步可控制备纳米复合物 |
| 4.1 基因递送纳米复合物的制备困境 |
| 4.2 微流控技术及其制备优势 |
| 4.2.1 微流控在纳米递药系统中的应用 |
| 4.2.2 微流控分步可控制备基因递送纳米复合物 |
| 4.3 课题二的提出 |
| 4.4 实验材料及仪器 |
| 4.4.1 实验药品和试剂 |
| 4.4.2 实验仪器 |
| 4.4.3 工作溶液 |
| 4.5 实验方法 |
| 4.5.1 微流控芯片的制备 |
| 4.5.2 质粒的扩增与提取 |
| 4.5.3 涡旋震荡法制备HA/PEI/DNA纳米复合物 |
| 4.5.4 微流控法制备HA/PEI/DNA纳米复合物 |
| 4.5.5 纳米复合物尺寸和电势的表征 |
| 4.5.6 纳米复合物尺寸和电势的统计学分析 |
| 4.6 实验结果与讨论 |
| 4.6.1 微流控芯片制备条件的优化 |
| 4.6.2 涡旋震荡法制备的HA/PEI/DNA纳米复合物的尺寸及表面电势分析 |
| 4.6.3 微流控法制备的HA/PEI/DNA纳米复合物的尺寸及表面电势分析 |
| 4.7 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在校期间获得的科研成果 |
（7）埃洛石纳米管载药递送系统的构建及其抗肿瘤靶向的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 纳米材料的生物应用 |
| 1.3 天然无机纳米材料埃洛石纳米管的概述 |
| 1.4 埃洛石纳米材料的毒性研究 |
| 1.4.1 体外毒性 |
| 1.4.2 体内毒性 |
| 1.5 埃洛石纳米管在生物医学领域的研究 |
| 1.5.1 埃洛石在生物酶固载方面的研究 |
| 1.5.2 用于组织工程的埃洛石纳米复合支架 |
| 1.5.3 药物递送及其基因靶向递送 |
| 1.6 埃洛石作为载体的机制 |
| 1.7 纳米载药系统靶向修饰 |
| 1.7.1 叶酸(FA)在靶向纳米抗肿瘤系统的研究 |
| 1.7.2 透明质酸(HA)在靶向纳米抗肿瘤系统的研究 |
| 1.8 阿霉素的抗肿瘤机制及研究进展 |
| 1.9 本课题的研究目的,意义和研究内容 |
| 1.9.1 选题的目的与意义 |
| 1.9.2 主要研究内容 |
| 第二章 叶酸功能化埃洛石纳米管载药体系的制备及体外细胞靶向性的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 埃洛石纳米管的短管化 |
| 2.3.2 HNTs-PG纳米复合物的合成 |
| 2.3.3 HNTs-PG-FA纳米复合物的合成 |
| 2.3.4 纳米复合物的表征 |
| 2.3.5 HNTs/DOX和HNTs-PG-FA/DOX的合成 |
| 2.3.6 药物DOX释放研究 |
| 2.3.7 溶血性实验 |
| 2.3.8 细胞培养 |
| 2.3.9 体外细胞毒性研究 |
| 2.3.10 细胞凋亡测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 HNTs-PG-FA的合成路线 |
| 2.4.2 HNTs-PG-FA复合物的表征 |
| 2.4.3 溶血性实验 |
| 2.4.4 体外释放实验 |
| 2.4.5 HNTs-PG-FA/DOX的体外细胞毒性 |
| 2.4.6 HNTs-PG-FA/DOX对HeLa细胞凋亡的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 透明质酸修饰的载阿霉素埃洛石纳米管递送系统的制备及抗肿瘤研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.3.1 HNTs-NH-HA的合成路径 |
| 3.3.2 HNTs-NH-HA的表征 |
| 3.3.3 HNTs-NH-HA的载药与释放 |
| 3.3.4 HNTs-NH-HA的溶血性实验 |
| 3.3.5 细胞培养 |
| 3.3.6 体外细胞毒性试验 |
| 3.3.7 HNTs-NH-HA/DOX细胞摄取实验 |
| 3.4 .结果与讨论 |
| 3.4.1 HNTs-NH-HA的合成与表征 |
| 3.4.2 HNTs-NH-HA血液相容性 |
| 3.4.3 HNTs-NH-HA和HNTs载药与释放 |
| 3.4.4 HNTs-NH-HA/DOX的细胞毒性 |
| 3.4.5 HNTs-NH-HA/DOX的细胞摄取 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（8）pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一章 pH和 ROS双响应性纳米粒的构建及其表征 |
| 1.1 pH响应性和ROS响应性β-环糊精载体材料的合成及其理化性质表征 |
| 1.2 pH和 ROS双响应性纳米粒的构建及其表征 |
| 1.3 pH和 ROS双响应性纳米药物的体外水解及药物释放 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 pH和 ROS双响应性纳米药物的体外生物学功能评价 |
| 2.1 SD大鼠主动脉VSMCs对纳米粒的吞噬作用研究 |
| 2.2 双响应性载RAP纳米粒对SD大鼠VSMCs增殖和迁移的影响 |
| 2.3 双响应性载RAP纳米粒对PDGF-BB诱导大鼠的VSMCs相关蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 pH和 ROS双响应性纳米药物在SD大鼠颈动脉球囊损伤部位的靶向能力及抑制血管新生内膜增生的疗效评价 |
| 3.1 SD大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立 |
| 3.2 p H和 ROS双响应性纳米粒对大鼠颈动脉内皮损伤部位的靶向能力评价 |
| 3.3 pH和 ROS双响应性载RAP纳米粒对SD大鼠颈动脉球囊损伤部位炎症及氧化应激水平的影响 |
| 3.4 pH和 ROS双响应性载RAP纳米药物在SD大鼠颈动脉球囊损伤模型中抑制血管新生内膜增生的疗效观察 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物的构建、靶向性及其防治PTA术后再狭窄的疗效 |
| 4.1 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物的构建及表征 |
| 4.2 pH和 ROS双响应性靶向纳米粒对SD大鼠颈动脉内皮损伤部位的靶向研究 |
| 4.3 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物在SD大鼠颈动脉PTA术后血管再狭窄防治中的疗效评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 pH和 ROS双响应性载RAP纳米药物的初步安全性评价 |
| 5.1 pH和 ROS双响应性空白纳米粒的急性毒性评价 |
| 5.2 pH和 ROS双响应性纳米药物的长期毒性评价 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 纳米药物递送系统在血管再狭窄防治中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）共融型化学驱动微米机器人的交互作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 化学驱动微米机器人驱动机理的研究现状 |
| 1.2.1 自电泳驱动机理 |
| 1.2.2 自扩散泳驱动机理 |
| 1.2.3 气泡驱动机理 |
| 1.3 化学驱动微米机器人制备方法的研究现状 |
| 1.3.1 棒状结构化学驱动微米机器人的制备方法 |
| 1.3.2 双面球结构化学驱动微米机器人的制备方法 |
| 1.3.3 管状结构化学驱动微米机器人的制备方法 |
| 1.4 共融型化学驱动微米机器人交互作用研究现状 |
| 1.4.1 化学驱动微米机器人与环境之间的交互作用 |
| 1.4.2 化学驱动微米机器人之间的交互作用 |
| 1.4.3 化学驱动微米机器人与人之间的交互作用 |
| 1.5 本文的主要研究内容 |
| 第2章 化学驱动微米机器人之间的协作转运研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 化学驱动微米机器人之间协作货物转运机理 |
| 2.2.1 货物载体PS/Pt与货物受体PS/Ni/Pt微米机器人的可控合成 |
| 2.2.2 PS/Pt与PS/Ni/Pt微米机器人之间的货物转运机理 |
| 2.3 货物转运前后微米机器人的运动行为研究 |
| 2.3.1 选择性地单次货物转运 |
| 2.3.2 连续性地多次货物转运 |
| 2.3.3 货物直径对货物转运的影响 |
| 2.3.4 货物载体与货物受体数量对货物转运的影响 |
| 2.4 货物载体与货物之间作用力种类对货物转运的影响 |
| 2.4.1 PS-Amidine/Pt与PS/Ni/Pt微米机器人之间的货物转运 |
| 2.4.2 Au/Pt线型与PS/Ni/Pt双面球微米机器人之间的货物转运 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 化学驱动微米机器人之间的协助提速研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 信号载体及信号受体的可控合成与形貌表征 |
| 3.2.1 PS/Ni/Au/Ag和SiO_2/Pt微米机器人的可控合成 |
| 3.2.2 PS/Ni/Au/Ag和SiO_2/Pt微米机器人的形貌表征 |
| 3.3 化学驱动微米机器人之间的协助增速机理研究 |
| 3.3.1 信号载体与信号受体微米机器人之间的欠电位沉积 |
| 3.3.2 微米机器人进行离子信号交互机理 |
| 3.3.3 信号载体与信号受体交互作用后的表面形貌表征 |
| 3.3.4 信号受体SiO_2/Pt微米机器人的X射线光电子能谱分析 |
| 3.3.5 离子信号交互时间对信号受体表面形貌的影响 |
| 3.4 离子信号交互前后微米机器人的运动行为研究 |
| 3.4.1 单次选择性交互协作前后微米机器人的运动行为研究 |
| 3.4.2 多次连续性交互协作前后微米机器人的运动行为研究 |
| 3.4.3 过氧化氢浓度对微米机器人协助增速效果的影响 |
| 3.4.4 信号载体与线型微米机器人的协助增速研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 化学驱动微米机器人与环境之间的协同微图案构型研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 PS/Ni/ZnO微米机器人的可控合成与形貌表征 |
| 4.2.1 PS/Ni/ZnO微米机器人的可控合成 |
| 4.2.2 PS/Ni/ZnO微米机器人的形貌表征 |
| 4.3 微米机器人与介质环境的协同作用机理 |
| 4.3.1 PS/Ni/ZnO微米机器人的运动机理 |
| 4.3.2 介质环境中SiO_2微球的离散行为机理 |
| 4.4 微米机器人与环境协同微图案构型 |
| 4.4.1 PS/Ni/ZnO微米机器人构造的微图案宽度 |
| 4.4.2 PS/Ni/ZnO微米机器人的构型速度 |
| 4.4.3 PS/Ni/ZnO微米机器人的运动方向调控 |
| 4.4.4 PS/Ni/ZnO微米机器人的信息化图案构型 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 化学驱动微米机器人与人之间的协作避障研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 化学驱动微米机器人与人之间的交互协作系统研究 |
| 5.2.1 人机交互协作系统设计 |
| 5.2.2 人机交互协作系统的控制原理 |
| 5.3 SIO_2/PT微米机器人与人之间的交互协作研究 |
| 5.3.1 简单静态障碍物环境中基于人机交互协作的自主导航 |
| 5.3.2 复杂静态障碍物环境中基于人机交互协作的自主导航 |
| 5.3.3 动态障碍物环境中基于人机交互协作的自主导航 |
| 5.4 人机交互协作系统在生物医疗领域的应用 |
| 5.4.1 癌细胞的靶向定位原理 |
| 5.4.2 癌细胞的体外靶向定位 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）基于壳聚糖的乳腺癌靶向治疗纳米载药系统（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳腺癌研究现状和治疗药物 |
| 1.1.1 乳腺癌的发病现状 |
| 1.1.2 乳腺癌治疗药物 |
| 1.2 基于壳聚糖的乳腺癌靶向纳米药物 |
| 1.2.1 壳聚糖性能 |
| 1.2.2 壳聚糖材料的靶向修饰 |
| 1.2.3 壳聚糖材料的安全性 |
| 1.3 肿瘤微环境响应药物递送体系 |
| 1.3.1 pH响应性释药体系 |
| 1.3.2 温度响应性材料 |
| 1.3.3 温度-/pH-双敏感材料 |
| 1.4 靶向治疗纳米材料 |
| 1.4.1 多肽靶向 |
| 1.4.2 叶酸靶向 |
| 1.4.3 适配体靶向 |
| 1.5 诊疗一体化材料 |
| 1.5.1 诊疗材料研究现状 |
| 1.5.2 MoS_2 纳米材料 |
| 1.6 本论文的研究目标和主要研究内容 |
| 1.6.1 研究目标和课题提出 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 1.7 本论文的创新点和研究意义 |
| 1.7.1 创新点 |
| 1.7.2 研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 L-肽功能化的用于治疗乳腺癌的双响应药物释放纳米颗粒的制备及性能评价 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验细胞培养 |
| 2.2.4 实验动物 |
| 2.2.5 L-肽修饰的CS-g-PNIPAM纳米颗粒的合成 |
| 2.2.6 药物载药率和包封率 |
| 2.2.7 纳米颗粒的表征 |
| 2.2.8 体外药物释放 |
| 2.2.9 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.2.10 体外细胞毒性试验 |
| 2.2.11 体外细胞摄取 |
| 2.2.12 细胞凋亡的分子水平检测 |
| 2.2.13 溶血实验 |
| 2.2.14 L-CS-g-PNIPAM-PTX纳米颗粒的体内抗癌效率研究 |
| 2.2.15 TUNEL和组织病理学检查 |
| 2.2.16 数据分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 纳米颗粒合成路线 |
| 2.3.2 各种纳米颗粒的制备和表征 |
| 2.3.3 MTT细胞毒性分析 |
| 2.3.4 L-CS-g-PNIPAM-PTX纳米颗粒诱导细胞凋亡的分子机制 |
| 2.3.5 Western blot检测 |
| 2.3.6 各种纳米颗粒的细胞摄取能力 |
| 2.3.7 流式细胞术检测 |
| 2.3.8 PTX的缓控释放 |
| 2.3.9 血液相容性 |
| 2.3.10 体内抗癌效果 |
| 2.3.11 肿瘤凋亡的组织病理学检查 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 CPP介导的壳聚糖级联响应药物靶向递送系统的制备及性能评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验细胞培养 |
| 3.2.4 实验动物 |
| 3.2.5 CPP-CS-co-PNVCL@DOX的合成 |
| 3.2.6 LCST的测定 |
| 3.2.7 载药方法和载药率计算 |
| 3.2.8 纳米颗粒表征 |
| 3.2.9 体外DOX释药 |
| 3.2.10 体外细胞摄取 |
| 3.2.11 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测 |
| 3.2.12 细胞生存率检测 |
| 3.2.13 血液相容性和血液循环时间 |
| 3.2.14 活体和离体器官药物分布成像 |
| 3.2.15 体内抗癌效率 |
| 3.2.16 组织病理学检查 |
| 3.2.17 实时逆转录酶聚合酶链反应(RT-qPCR) |
| 3.2.18 生化指标检测 |
| 3.2.19 数据统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 CPP-CS-co-PNVCL共聚物的相变行为 |
| 3.3.2 CPP-CS-co-PNVCL1@DOX纳米颗粒的结构表征 |
| 3.3.3 响应性药物释放 |
| 3.3.4 细胞摄取 |
| 3.3.5 细胞毒性 |
| 3.3.6 血液相容性 |
| 3.3.7 药物代谢动力学 |
| 3.3.8 生物体内分布 |
| 3.3.9 体内抗癌疗效 |
| 3.3.10 组织病理学检查结果 |
| 3.3.11 促凋亡的分子水平效果 |
| 3.3.12 生物安全性评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 用于治疗多药耐药性乳腺癌的壳聚糖纳米药物的制备及性能评价 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验细胞培养 |
| 4.2.4 实验动物和MDA-MB-231 荷瘤小鼠模型构建 |
| 4.2.5 FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒的合成 |
| 4.2.6 纳米颗粒的表征 |
| 4.2.7 体外药物释放 |
| 4.2.8 体外细胞毒性和抗肿瘤活性 |
| 4.2.9 细胞凋亡的分子水平评价 |
| 4.2.10 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和流式细胞术 |
| 4.2.11 体外溶血实验 |
| 4.2.12 体内药代动力学研究 |
| 4.2.13 体内生物分布 |
| 4.2.14 体内抗癌效率 |
| 4.2.15 组织病理学和免疫组织学检查 |
| 4.2.16 细胞因子检测 |
| 4.2.17 蛋白质免疫印迹(western blot)检测 |
| 4.2.18 数据统计分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 FA-CS-g-OA@DOX纳米颗粒的制备和表征 |
| 4.3.2 体外药物释放 |
| 4.3.3 体外细胞毒性和抗癌效果 |
| 4.3.4 体外细胞摄取 |
| 4.3.5 药物代谢动力学 |
| 4.3.6 血液相容性 |
| 4.3.7 体内和离体生物荧光成像 |
| 4.3.8 体内抗癌疗效和安全性评价 |
| 4.3.9 离体器官抗癌效率和系统安全性评价 |
| 4.3.10 纳米颗粒对相关蛋白质表达水平影响 |
| 4.3.11 毒副作用评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 多模式成像介导乳腺癌化疗/光热联合治疗壳聚糖纳米颗粒的制备及应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验细胞培养 |
| 5.2.4 实验动物和MDA-MB-231 荷瘤小鼠模型构建 |
| 5.2.5 K237-CS-PTX@MoS_2 纳米颗粒的合成 |
| 5.2.6 聚合物纳米颗粒的表征 |
| 5.2.7 体外药物释放 |
| 5.2.8 体外细胞毒性 |
| 5.2.9 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察 |
| 5.2.10 体外溶血实验 |
| 5.2.11 PA、CT、红外热成像 |
| 5.2.12 体内抗癌效率 |
| 5.2.13 组织病理学和免疫组织学检查 |
| 5.2.14 数据统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 K237-CS-PTX@MoS_2 纳米颗粒的制备和表征 |
| 5.3.2 体外药物释放 |
| 5.3.3 体外细胞毒性和抗癌效果 |
| 5.3.4 体外细胞摄取实验 |
| 5.3.5 血液相容性 |
| 5.3.6 多模态成像 |
| 5.3.7 体内抗癌疗效评价 |
| 5.3.8 离体器官抗癌效率和系统安全性评价 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 攻读博士期间论文发表情况 |
| 致谢 |
四、红细胞有望成为药物转运的理想载体（论文参考文献）
- [1]具有活性氧和剪切应力双重响应药物递送系统及用于动脉粥样硬化治疗的研究[D]. 沈美丽. 吉林大学, 2021(01)
- [2]PON2在急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）发生中的作用及其机制的研究[D]. 潘莉莉. 福建医科大学, 2021(02)
- [3]靶向线粒体的蛋白质无载体递送及应用[D]. 石家愿. 华中师范大学, 2021(02)
- [4]CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究[D]. 杜鹃. 山东大学, 2021(11)
- [5]负载过氧化钙的纳米塑效体系及其抗前列腺癌应用研究[D]. 吴迪. 上海交通大学, 2020(01)
- [6]三级胺氮氧化物聚合物纳米递药体系与微流控分步可控制备纳米复合物的研究[D]. 沈逸怀. 浙江大学, 2020(03)
- [7]埃洛石纳米管载药递送系统的构建及其抗肿瘤靶向的研究[D]. 莫晓云. 广东药科大学, 2021(02)
- [8]pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究[D]. 张润军. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [9]共融型化学驱动微米机器人的交互作用研究[D]. 常晓丛. 哈尔滨工业大学, 2019
- [10]基于壳聚糖的乳腺癌靶向治疗纳米载药系统[D]. 牛世伟. 东华大学, 2019(06)