一、用 Digoxigenin 标记核酸探针检测 EDS-76 病毒核酸的研究（论文文献综述）
布日额,王君伟,吴金花,马波,Ulrich Neumann[1]（2005）在《鹅细小病毒VP1-VP3非重叠序列地高辛探针的制备和应用》文中研究表明根据 GPV H1株核苷酸序列 ,设计了扩增 VP1- VP3基因非重叠序列的 1对引物 ,对其结构蛋白 VP1与 VP3非重叠核苷酸序列进行 PCR扩增 ,将 PCR产物纯化、回收后制备出 GPV VP1- VP3基因 DIG标记核酸探针 ,其标记效率达到0 .1pg/μl。特异性检测结果表明 ,该探针能与 GPV不同毒株核酸发生特异性杂交 ,而与对照的 DPV、GPMV等病毒的核酸杂交反应均为阴性 ;敏感性检测结果表明该探针对 GPV的最低检出量为 0 .0 32 ng。上述试验结果表明该探针可以用于 GPV感染临床病料的检测
布日额,王君伟,吴金花,孙红梅,Ulrich Neumann[2]（2004）在《用地高辛标记核酸探针检测鹅细小病毒的研究》文中研究表明从带有鹅细小病毒（GPV）NS1基因的重组质粒pMD18T NS1用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切回收1880bp大小片段,并制备出地高辛标记的GPV核酸探针。其标记效率达到0 01pg/μl。特异性检测结果表明,该探针能与GPV不同毒株核酸发生特异性杂交,而与对照的DPV、GPPV等病毒的核酸杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对GPV的最低检出量为0 0224pg。该探针对不同方法处理的GPV感染病料进行检测,均出现杂交阳性。表明所研制的标记探针用于GPV的检测是可行的。
布日额[3]（2005）在《GPV VP及NS基因克隆及其原核表达产物的研究和应用》文中进行了进一步梳理小鹅瘟（Goose plague, GP）是由鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）所引起的主要侵害4～20 日龄雏鹅的急性或亚急性败血性传染病,其造成的死亡率高达90-100%,是危害养鹅业最严重传染病之一。自1956 年中国学者方定一在我国扬州地区发现并进行首次报道后,世界许多养鹅国家和地区均有陆续报道。GPV 属于细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒属（Parvovirus）的成员。病毒整个基因组为5.1kb,含有两个阅读框,左侧阅读框编码NS1、NS2 非结构蛋白,右侧阅读框编码VP1、VP2 及VP3 结构蛋白,其中VP3 结构蛋白能够诱导机体产生中和抗体,因此VP3 基因片段是研究防治小鹅瘟基因工程苗和检测抗原的首选基因。在防治小鹅瘟实践中,GPV 全毒疫苗曾发挥了重要作用,但全毒苗的应用的确存在散毒、潜伏感染,以及对GPV 自然感染与GPV 全毒苗免疫抗体无法进行鉴别等不足,致使该病长期以来无法得到有效检测,直接影响到对小鹅瘟的有效控制。国内外学者先后建立了琼脂扩散试验、中和试验、免疫荧光抗体试验等血清学诊断方法,在一定程度上为防治小鹅瘟发挥了重要作用,但同时也存在灵敏度差、操作烦琐、检测所需时间长等不足,已不适应更有效地控制该病的需要。国外学者建立了根据GPV 核酸PCR 产物酶消化片段的大小来区别小鹅瘟与番鸭细小病毒感染的方法,但未见进一步深入应用的报道。本论文以建立完善、有效的分子生物学和免疫学检测方法,更加有效地控制小鹅瘟为目的,应用扩增GPV 部分核酸片段的特异性引物及其克隆产物分别研究和建立了对GPV DNA进行定性和半定量检测的PCR 及DIG 核酸标记探针方法。利用部分核酸片段的原核表达产物研究建立了定量及定性检测GPV 感染抗体及鉴别VP3 亚单位抗体的间接ELISA 及斑点ELISA 方法。本论文的研究内容和结果如下: 1. 克隆了GPV H1 株的VP1-VP3 核苷酸非重叠序列片段。测序结果为,克隆产物由534bp个核苷酸组成,编码178 个氨基酸残基。扩增产物测序结果与Gen Bank 公布的GPV B 参考毒株同区段序列同源性达100%。2. 利用扩增VP1-VP3 及NS1 核酸片段的两对引物建立了检测GPV 核酸的PCR 方法。两对引物只扩增GPV 模板DNA,对GPMV、AIV 等对照病毒核酸模板的PCR 呈阴性。扩增VP1-VP3 及NS1 核酸片段引物分别能从系列稀释至4.4fg、44pg 或0.01LD50、10LD50的GPV 感染鹅脏器DNA 中扩增出GPV DNA。对7 组感染鹅脏器检测结果表明,两对引物均能快速、准确地扩增出病鹅脏器中的GPV DNA,阳性检出率达100%。2001-2004 年间对多起送检病鹅的PCR 检测均获得一致的结果。但由于扩增NS1 片段引物的检出灵敏度比扩增VP1-VP3 核酸片段引物低1000 倍,因此选择扩增VP1-VP3 核酸片段的一对引物作为建立GPV PCR 检测方法的特异性引物。由于PCR 具有强大的扩增效应,能够从病鹅脏器提取DNA中直接扩增GPV DNA,从而为准确地检测GPV 提供了一项快捷、有效的方法。3. 对VP1-VP3 及NS1 核苷酸片段的扩增产物利用Digoxigenin 进行标记,建立了检测GPV 核酸的DIG 标记探针方法。两个标记探针均能与各自相应核酸片段PCR 产物、重组质粒及不同毒株的GPV 核酸发生特异性杂交,而与GPMV、AIV 核酸杂交呈阴性。VP1-VP3
韩丽珍,曹蔚,吴彤[4]（2000）在《减蛋综合征贵州分离毒全基因组探针的制备及检测》文中研究说明为准确检测鸡群中减蛋综合征病毒感染情况 ,从减蛋综合征病毒 （EDS）贵州分离毒株HS- 1中提纯病毒DNA后 ,用地高辛标记制备了全基因组探针。在Dot -blot中该探针不与正常鸭胚尿囊液核酸提取物及马立克氏病病毒 （MDV）DNA发生反应 ,只与 3株EDS病毒 （国际标准毒AV - 12 7、贵州分离毒HS - 1、南京分离毒GC2 ）DNA呈阳性反应 ,具有较高的特异性 ;可检测出 30pg的同源DNA ,具有较强的灵敏度。人工感染母鸡于 2 4h后即可用该探针从泄殖腔棉拭子中检测到病毒 ,能早期诊断该病的发生 ,检测阳性率为 88 89% ;并可检测到EDS病毒的隐性传播情况
孙刚,潘兴广,刘尚高[5]（1998）在《用 Digoxigenin 标记核酸探针检测 EDS-76 病毒核酸的研究》文中提出用ＥＤＳ７６病毒标准ＡＶ１２７株和分离株（Ｂ９６株）感染鸭胚，提取病毒核酸，分别经ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ双酶切，获得图形和大小相似的酶切片段。分别进行ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ单酶切，也得到相似结果。病毒ＤＮＡ经ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ双酶切后，与ＰＵＣ１９质粒载体重组，并转化到ＥｃｏｌｉＪＭ１０１中，筛选出一个插入片段（Ｇ片段）约为２７ｋｂ的重组质粒。用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｍｉｎ标记ＥＤＳ７６ＤＮＡＧ片段（ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ双酶切片段）及含该片段的重组质粒分别制备探针，对ＥＤＳ７６病毒ＤＮＡ进行斑点杂交，两种探针均为阳性，而对照组ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＤＶ正常鸭胚尿囊液的核酸为阴性。且后一种探针的敏感性高于前者，它的ＤＮＡ检出限量为４ｐｇ水平。结果表明，两种探针具有高度的特异性、敏感性。
高绪慧,刁有祥,唐熠,于春梅,张大丙,岳澄滨[6]（2012）在《探针检测鸭黄病毒的地高辛标记DNA的制备与应用》文中研究说明利用RT-PCR方法扩增鸭黄病毒的NS3基因406bp的特异性片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备核酸探针。特异性试验结果表明,该探针仅与鸭黄病毒的核酸特异性杂交,而与鸭瘟病毒、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的核酸杂交均为阴性。敏感性试验表明,该探针对鸭黄病毒的RNA最低检出限量为100μg/L。对疑似黄病毒感染鸭的肝脏、肺脏、脾脏、输卵管、卵泡膜和泄殖腔棉拭子进行检测,以卵泡膜的检出率最高。该研究为鸭黄病毒感染的诊断和流行病学调查提供了一种可靠的方法。
王瑞明[7]（2018）在《鸭坦布苏病毒核酸斑点杂交方法的建立及E蛋白的原核表达》文中进行了进一步梳理鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu Virus Disease,DTVD）为一种由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）引起的传染病,鸭感染该病后主要表现出发育缓慢、产蛋率下降和瘫痪等特征。坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）属于黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群,它对包括人类在内的哺乳动物具有潜在的健康威胁。建立快速、特异、敏感的TMUV诊断方法,研发高保护效力的新型疫苗,是防控该病流行的有效措施之一。本研究首先建立了基于TMUV NS5基因的核酸斑点杂交方法,该方法特有良好的特异性和灵敏度。随后,使用该方法对疑似病料进行检测,并在检测结果为阳性的病料中分离到一株TMUV毒株SD1601。最后,构建了TMUV E蛋白原核表达质粒,通过大肠杆菌表达系统获得了GST-E融合蛋白。1.TMUV核酸斑点杂交方法的建立本研究根据病毒NS5基因序列,利用地高辛制备DNA探针,建立了TMUV病毒的核酸杂交检测方法。运用Primer 5.0软件设计引物,使用地高辛标记试剂盒,通过PCR扩增制备NS5基因核酸探针。结果表明,本研究所建立的基于NS5的核酸斑点杂交方法具有良好的特异性和灵敏度。该方法可特异性检出TMUV核酸,对DPV、AIV、NDV等常见病毒核酸样品呈阴性;其最低检出量为10pg,高于常规RT-PCR方法。随后,本研究收集40份山东省内种鸭场疑似TMUV感染病料,使用本研究建立的核酸斑点杂交方法进行检测,共检测到4份阳性样品,结果与经典RT-PCR方法一致。本研究所建立的核酸斑点杂交方法为DTVD的防控和流行病学调查奠定了基础。2.TMUV SD1601株的分离与鉴定及其全基因组碱基序列的分析取斑点杂交检测阳性的病料,研磨过滤后接种到BHK-21细胞,经鉴定分离得到一株TMUV野毒株,将其命名为SD1601株。通过扩增SD1601株的全基因组序列并对其进行分析,结果表明,SD1601株病毒的基因组中含有开放阅读框,并且其基因组大小为10990nt,编码的一个多聚蛋白是通过3426个氨基酸构成的。把SD1601株与参考毒株的TMUV的全基因组序列进行核苷酸的同源性与遗传进化树的比较分析,系统发育进化树显示,该毒株属于Ia分枝,SD1601与本研究选取的不同参考株序列的同源性高达96.9%-99.4%。其中,TMUV SD1601株与JS804株和BYD-1株的核苷酸序列同源性最高,为99.4%;与HZ3-2015同源性最低,仅96.9%。E蛋白氨基酸同源性比对结果表明,SD1601株蛋白与SDHS、SDMS、TA2010三个毒株E基因编码蛋白的同源性最高,与早期分离到的经典毒株亲缘关系较远。SD1601株的分离鉴定为进一步了解TMUV的遗传进化提供了理论依据。3.TMUV SD1601株E蛋白的原核表达扩增TMUV SD1601全长E基因,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,鉴定正确后将其转化受体菌E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导进行表达并通过SDS-PAGE电泳分析表达蛋白的可溶性。通过改变诱导时间、诱导温度以及IPTG浓度确定最佳诱导条件,通常我们要对可溶性蛋白进行纯化分析可以借助谷胱甘肽凝胶性树脂,并通过western-blot进行验证。结果成功对SD1601的E蛋白进行了表达,诱导表达温度为30℃、IPTG浓度为0.8mM、诱导时间为4h,该重组蛋白同时存在于包涵体和上清中,但是最主要的是在包涵体中。通过上面所介绍的方法我们纯化到了可溶性GST-E蛋白。该蛋白可被抗TMUV的阳性抗体特异性识别。TMUV E蛋白的表达为ELISA检测方法和疫苗等的研制奠定了基础。
王汉雷[8]（2007）在《用核酸探针和分子斑点杂交技术检测家禽病毒的核酸》文中研究说明在鸡群中同一个体同时存在不同的病毒感染是普遍现象,因此如何能同时检测同一份病料中不同的病毒,对于疫病的鉴别诊断和流行病学研究甚为重要。本研究试图运用分子斑点杂交技术,同时用不同的病毒核酸探针检测同一批病料中的不同病毒,它们分别是禽网状内皮组织增生症病毒（REV）、马立克氏病病毒（MDV）、鸡传染性贫血病毒（CAV）、呼肠孤病毒（ARV）和传染性支气管炎病毒（IBV）。本实验从泰安某市场采集地方品种鸡的脾脏200份、羽毛囊200份;从莱阳某商品肉鸡场采集脾脏200份、鸡胚100枚,共计700份样品。用REV LTR序列和pol基因标记的核酸探针、MDV PP38基因标记的核酸探针、CAV VP1基因标记的核酸探针、ARVδ3基因标记的核酸探针、IBV N基因标记的核酸探针,分别检测REV、MDV、CAV、ARV和IBV。检测结果如下:200份地方品种鸡脾脏样品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的检测结果:MDV阳性123份, CAV阳性91份,ARV阳性21份,IBV阳性23份,用REV LTR序列标记的核酸探针检出REV阳性194份,用REV pol基因标记的核酸探针检出REV阳性10份。200份地方品种鸡脾脏样品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的共感染情况:MDV和REV共感染为7份,MDV和CAV共感染为60份,MDV和ARV共感染为17份,MDV和IBV共感染为10份,CAV和REV共感染为9份,CAV和ARV共感染为14份,CAV和IBV共感染为13份,MDV、CAV和REV的三重感染为6份,MDV、CAV和ARV的三重感染为13份,MDV、CAV和IBV的三重感染为7份（REV的感染数据来自pol基因标记的核酸探针检测结果）。200份地方品种鸡羽毛囊样品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的检测结果:CAV、ARV和IBV全部阴性, MDV阳性121份,用REV LTR序列和pol基因标记的核酸探针检测REV全部阴性。200份商品肉鸡脾脏样品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的检测结果:MDV阳性177份, CAV阳性143份, ARV和IBV全部阴性,用REV LTR序列标记的核酸探针检出REV阳性103份,用REV pol基因标记的核酸探针检测REV全部阴性。200份商品肉鸡脾脏样品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的共感染情况:MDV和CAV的共感染为137份（REV的感染数据来自pol基因标记的核酸探针检测结果）。100份莱阳鸡胚样品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的检测结果:MDV、ARV和IBV全部阴性,CAV阳性100份,用REV LTR序列和pol基因标记的核酸探针检测REV全部阴性。在对200份地方品种鸡和200份商品肉鸡的脾脏样品用REV LTR序列和pol基因标记的核酸探针同时检测REV时,两种核酸探针对REV的检出率差异极大:在200份地方品种鸡脾脏样品中,用REV LTR序列标记的核酸探针检出REV阳性194份,而用REV pol基因标记的核酸探针检出REV阳性仅为10份,并且这10份阳性样品包含在上面的194份阳性样品中;在200份商品肉鸡脾脏样品中,用REV LTR序列标记的核酸探针检出REV阳性103份,而用REV pol基因标记的核酸探针检测REV全部阴性。对比结果表明,用REV LTR序列标记的核酸探针,对REV的检测结果大部分是非特异性的,可能是由LTR序列整合到其它病毒或宿主基因组造成的REV假阳性,因此在应用分子斑点杂交技术检测REV时,不能选用REV LTR序列标记探针,而应选择REV的其它基因标记探针,如pol基因,这样很大程度上可以提高REV检测的特异性。从莱阳某种鸡场送检的疑似鸡传染性贫血的病鸡骨髓、胸腺和法氏囊中提取组织DNA和RNA,斑点杂交检测REV、MDV、CAV、ARV和IBV。检测结果显示:CAV全部阳性,REV、MDV、ARV和IBV全部阴性。以CAV阳性组织DNA为模板,设计一对特异性引物,对病料中的CAV的VP1基因进行了克隆和序列测定。序列测定结果显示其VP1基因全长为1350bp,在与其它CAV参考株VP1基因比较后发现其与America株同源性最高（98.7%）。
谢芝勋,MazharI.Khan[9]（2000）在《应用PCR检测禽腺病毒》文中提出根据禽腺病毒 CELO株的基因序列 ,设计合成了 1对引物 :上游引物为 5′-CCCTCCCACCGC-TAACCA-3′,下游引物为 5′-CACGTTGCCCTTATCTTGC-3′。用这对引物对 群禽腺病毒中 1 2个血清型病毒和 1 9个分离野毒株、 群 4个血清型病毒、 群禽腺病毒株的核酸模板进行了 PCR扩增 ,结果均特异性地扩增出了与设计片段大小相一致的 4 2 1 bp片段 ,而对其他 5种禽病病原体和哺乳动物腺病毒血清 2型核酸模板的扩增均为阴性。该 PCR能检出 1 fg禽腺病毒 DNA模板
王爱华[10]（2005）在《EDS-76病毒检测方法的研究 ——双夹心ELISA、胶体金试纸条和PCR方法》文中研究指明减蛋综合征病毒（egg drop syndrome-76 virus,EDS-76 virus）经过鸭胚增殖、氯仿抽提、聚乙二醇-6000（PEG-6000）浓缩处理,免疫110日龄鸡和成年兔,制备了高效价的鸡抗EDS-76、兔抗EDS-76病毒血清抗体;用健康兔纯化血清IgG免疫绵羊,制备了羊抗兔血清抗体。制备的血清抗体采用辛酸-硫酸铵分步沉淀法纯化。 用鸡抗EDS-76病毒、兔抗EDS-76病毒和羊抗兔三种特异性高免血清IgG,建立了双夹心酶联免疫吸附试验（Eenzyme-linked immunosorbent assay ELISA）检测法,试验确定的鸡抗EDS-76病毒、兔抗EDS-76病毒和HRP-羊抗兔抗体的最佳工作浓度分别为1:160、1:300和1:1000。本法对纯化EDS-76病毒的最低检出量约为5ng/孔。对EDS-76试验感染鸡脏器带毒、排毒情况和临床样本的检测表明,双夹心ELISA方法对EDS-76病毒的检测特异性强、敏感度高、适合于成批样本的检测。 采用柠檬酸三钠还原氯金酸,制备胶体金颗粒。根据不同粒径的胶体金颗粒在检测时所呈现的颜色鲜艳程度,选择15nm的胶体金颗粒作为标记物。试验测得待标记抗体最低稳定量为40μg/mL;确定鸡抗EDS-76抗体和羊抗兔抗体的合适点样量为1μg。用试纸条能检出浓度约为1.35μg/mL的纯化病毒,该试纸条的研制为进一步研究和开发一系列畜禽疾病快速诊断奠定了试验基础。 为了更敏感的检测EDS-76病毒,以及监测病毒在鸡体内的存在时问,使用了PCR方法。按照EDS-76基因组保守序列设计合成一对特异性引物,用该引物对EDS-76基因组DNA进行了PCR检测,扩增出一条约300bp的片段,与预期结果一致。PCR方法检测的最低病毒DNA含量达到2.5×10-2pg,PCR检测表明,从感染鸡的心脏中不能检出病毒,肝脏和肾脏只有在排毒高峰期检出,在试验感染后4～21d的子宫、血液和4～17d的脾中均能检测到。 用双夹心ELISA、胶体金免疫试纸条、PCR和传统的HA-HI方法,分别对135份自然感染鸡样本进行了检测,其阳性检出率分别为66.7%、52.6%、74.8%和58.5%。用双夹心ELISA和PCR检测79例阳性样品（HA-HA方法检出的）,均为阳性;试纸条检出71例阳性;与HA-HI法相比其阳性符合率分别为79/79=100%、79/79=100%、71/79=89.5%。由结果可以看出,4种方法阳性检出率由高到低的顺序依次为:PCR、双夹心ELISA、HA-HI、免疫胶体金试纸条。
二、用 Digoxigenin 标记核酸探针检测 EDS-76 病毒核酸的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用 Digoxigenin 标记核酸探针检测 EDS-76 病毒核酸的研究（论文提纲范文）
（2）用地高辛标记核酸探针检测鹅细小病毒的研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒及鹅胚 |
| 1.2 细菌 |
| 1.3 仪器和试剂 |
| 1.4 重组质粒pMD-T-NS1的转化和鉴定 |
| 1.5 探针的纯化及地高辛标记 |
| 1.6 标记效率检测 |
| 1.7 斑点杂交及检测程序 |
| 1.8 特异性试验 |
| 1.9 敏感性试验 |
| 1.10 标记探针检测感染病料 |
| 2 结 果 |
| 2.1 重组质粒pMD-T-NS1的转化及鉴定 |
| 2.2 NS1 DNA的纯化及酶切鉴定 |
| 2.3 标记效率检测 |
| 2.4 特异性检测 |
| 2.5 敏感性检测 |
| 3 讨 论 |
（3）GPV VP及NS基因克隆及其原核表达产物的研究和应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 鹅细小病毒研究进展 |
| 1.1.1 小鹅瘟概述 |
| 1.1.2 鹅细小病毒病原学研究 |
| 1.1.3 小鹅瘟的流行病学、征候学及病理学 |
| 1.1.4 小鹅瘟常规诊断方法 |
| 1.1.5 小鹅瘟特异性治疗 |
| 1.1.6 小鹅瘟的疫苗免疫预防 |
| 1.2 鹅细小病毒分子生物学研究 |
| 1.2.1 GPV 病毒粒子 |
| 1.2.2 GPV 基因组结构特点 |
| 1.2.3 基因组开放阅读框及编码区排布 |
| 1.2.4 倒置末端重复序列 |
| 1.2.5 GPV 的转录与复制 |
| 1.3 鹅细小病毒结构蛋白与非结构蛋白 |
| 1.3.1 GPV 结构蛋白 |
| 1.3.2 GPV 非结构蛋白 |
| 1.4 GPV 与其它细小病毒的关系 |
| 1.4.1 GPV 与MDPV 的关系 |
| 1.4.2 GPV 与依赖病毒属成员的关系 |
| 1.4.3 GPV 与红病毒属成员的关系 |
| 1.5 GPV 结构基因及非结构基因克隆和表达产物研究与应用意义 |
| 1.5.1 结构蛋白与非结构蛋白基因克隆和表达研究 |
| 1.5.2 小鹅瘟实验室诊断方法研究 |
| 1.5.3 本课题研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病鹅脏器处理及病毒的增殖 |
| 2.2.2 VP1-VP3 核酸片段克隆 |
| 2.2.3 GPV VP1-VP3 核酸重组原核表达载体的构建 |
| 2.2.4 VP1-VP3 核酸片段在大肠杆菌的诱导表达 |
| 2.2.5 VP1-VP3 核酸片段表达蛋白的亲合层析纯化及鉴定 |
| 2.2.6 GPV 核酸检测方法的建立 |
| 2.2.7 间接 ELISA 检测 GPV 抗体方法的建立 |
| 2.2.8 斑点ELISA 检测GPV 抗体方法的建立 |
| 2.2.9 间接ELISA 鉴别GPV 抗体和VP3 亚单位抗体方法的建立 |
| 2.2.10 斑点ELISA 鉴别GPV 抗体和VP3 亚单位抗体方法的建立 |
| 2.2.11 GPV 中和试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 GPV H1 株VP1-VP3 核酸片段的克隆与序列分析 |
| 3.2 VP1-VP3 核酸片段重组原核表达载体的构建 |
| 3.3 VP1-VP3 核酸片段在大肠杆菌中的表达及产物的纯化鉴定 |
| 3.4 GPV DNA 检测方法的建立 |
| 3.4.1 GPV DNA PCR 检测方法的建立 |
| 3.4.2 DIG 标记核酸探针检测GPV 核酸方法的建立 |
| 3.5 检测GPV 抗体方法的建立 |
| 3.5.1 间接ELISA 检测GPV 抗体方法的建立及应用 |
| 3.5.2 斑点ELISA 检测GPV 抗体方法的建立及应用 |
| 3.6 间接ELISA 鉴别GPV 抗体和VP3 亚单位抗体检测方法 |
| 3.6.1 间接ELISA 鉴别GPV 抗体和抗VP3 亚单位抗体方法的标准化 |
| 3.6.2 间接ELISA 鉴别GPV 抗体与VP3 亚单位抗体检测方法应用 |
| 3.7 斑点ELISA鉴别GPV抗体和VP3 亚单位抗体的方法 |
| 3.7.1 斑点ELISA鉴别GPV抗体和VP3亚单位抗体方法的标准化 |
| 3.7.2 斑点ELISA 鉴别GPV 抗体和VP3 亚单位抗体方法的应用 |
| 3.8 病毒中和试验 |
| 3.8.1 疫苗毒GPV 的LD50 值测定 |
| 3.8.2 中和试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCR 检测GPV 核酸方法的研究 |
| 4.2 DIG 标记核酸探针检测 GPV DNA 的研究 |
| 4.3 间接ELISA 和斑点ELISA 检测GPV 抗体的研究 |
| 4.3.1 候选检测抗原蛋白的表达、分离、复性及纯化 |
| 4.3.2 GPV 抗体检测方法的应用及分析 |
| 4.4 间接ELISA 及斑点ELISA 鉴别GPV 抗体及VP3 亚单位抗体方法的研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（4）减蛋综合征贵州分离毒全基因组探针的制备及检测（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 EDS病毒的提纯 |
| 1.2.2 病毒核酸的纯化及浓缩 |
| 1.2.3 病毒DNA的鉴定 |
| 1.2.4 随机引物法制备地高辛标记全基因组探针 |
| 1.2.5 Dot-Blot测定探针的特异性 |
| 1.2.5.1 点样 |
| 1.2.5.2 杂交 |
| 1.2.5.3 检测过程 |
| 1.2.6 标记探针灵敏度的测定 |
| 1.2.7 人工感染EDS病毒试验 |
| 2 结 果 |
| 2.1 DNA的纯度和浓度 |
| 2.2 探针的特异性 |
| 2.3 灵敏度测定 |
| 2.4 对人工感染鸡输卵管的检测结果 |
| 2.5 对人工感染鸡泄殖腔棉拭子的检测结果 |
| 2.6 几何平均效价的测定 |
| 3 讨 论 |
（6）探针检测鸭黄病毒的地高辛标记DNA的制备与应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株及病料 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 探针的制备 |
| 1.3.1 引物的设计与合成 |
| 1.3.2 病毒RNA的提取 |
| 1.3.3 RT-PCR |
| 1.3.4 PCR产物的克隆与测序 |
| 1.3.5 探针的标记 |
| 1.4 斑点杂交检测程序的建立 |
| 1.5 特异性试验 |
| 1.6 敏感性试验 |
| 1.7 与RT-PCR方法对已知样品检测的比较 |
| 1.8 标记探针对鸭黄病毒疑似病例的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR电泳结果 |
| 2.2 特异性试验 |
| 2.3 敏感性试验 |
| 2.4 与RT-PCR方法对已知样品检测的比较结果 |
| 2.5 标记探针对鸭黄病毒疑似病例的检测 |
| 3 讨论 |
（7）鸭坦布苏病毒核酸斑点杂交方法的建立及E蛋白的原核表达（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 病原 |
| 1.1.1 病名定义与历史概述 |
| 1.1.2 坦布苏病毒的病原特点 |
| 1.1.3 坦布苏病毒的宿主 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 鸭坦布苏病临床特征 |
| 1.3.1 临床病理变化 |
| 1.3.2 开产种(蛋)禽 |
| 1.3.3 后备种(蛋)禽 |
| 1.3.4 雄性家禽 |
| 1.4 病理组织学变化 |
| 1.5 鸭坦布苏病的检测和诊断 |
| 1.5.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.5.2 乳胶凝集试验(LAT) |
| 1.5.3 RT-PCR技术 |
| 1.5.4 实时荧光定量RT-PCR技术 |
| 1.5.5 环介导等温扩增(RT-LAMP)技术 |
| 1.5.6 核酸探针技术 |
| 1.6 鸭坦布苏病毒的潜在威胁 |
| 1.7 防治措施 |
| 1.8 展望 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料及毒株来源 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DTMUV斑点杂交方法的建立 |
| 2.2.2 一株TMUV野毒的分离鉴定与全基因组序列分析 |
| 2.2.3 鸭坦布苏病毒全基因序列的分析 |
| 2.2.4 鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 核酸斑点杂交方法的建立与应用 |
| 3.1.1 TMUVNS5基因的扩增 |
| 3.1.2 探针的制备 |
| 3.1.3 核酸斑点杂交方法灵敏度检测 |
| 3.1.4 核酸斑点杂交方法特异性检测 |
| 3.1.5 核酸斑点杂交方法的应用 |
| 3.2 一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定和全基因组序列分析 |
| 3.2.1 一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定 |
| 3.2.2 TMUVSD1601株全基因组序列的分析 |
| 3.3 E蛋白的原核表达 |
| 3.3.1 E基因的扩增结果 |
| 3.3.2 重组质粒pGEX-E的酶切鉴定 |
| 3.3.3 GST-E融合蛋白的诱导表达 |
| 3.3.4 重组E蛋白最佳表达条件的探索 |
| 3.3.5 重组E蛋白的Westernblot鉴定 |
| 3.3.6 GST-E融合蛋白纯化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（8）用核酸探针和分子斑点杂交技术检测家禽病毒的核酸（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 核酸探针的概念 |
| 2 核酸探针的种类 |
| 3 核酸探针的标记 |
| 4 核酸探针的斑点杂交方法 |
| 实验一、各种核酸探针的标记和敏感性、特异性检测 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 仪器和试剂 |
| 1.1.2 毒株 |
| 1.1.3 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 REV LTR 序列550bp DNA 和pol 基因约3500bp DNA 的克隆及序列测定 |
| 1.2.1.1 前病毒cDNA的提取 |
| 1.2.1.2 扩增LTR序列550bp DNA的PCR反应 |
| 1.2.1.3 扩增pol基因3500bp DNA的PCR反应 |
| 1.2.1.4 PCR 产物的克隆及序列测定 |
| 1.2.2 MDV PP38 基因的克隆及序列测定 |
| 1.2.2.1 基因组DNA 的提取 |
| 1.2.2.2 扩增PP38 基因的PCR 反应 |
| 1.2.2.3 PCR 产物的克隆及序列测定 |
| 1.2.3 CAV VP1 基因的克隆及序列测定 |
| 1.2.3.1 基因组DNA 的提取 |
| 1.2.3.2 扩增VP1 基因的PCR 反应 |
| 1.2.3.3 PCR 产物的克隆及序列测定 |
| 1.2.4 ARV δ3 基因的克隆及序列测定 |
| 1.2.4.1 病毒RNA 的提取 |
| 1.2.4.2 扩增δ3 基因的RT-PCR 反应 |
| 1.2.4.3 RT-PCR 产物的克隆及序列测定 |
| 1.2.5 核酸探针的标记 |
| 1.2.5.1 核酸片段的定量 |
| 1.2.5.2 探针标记步骤 |
| 1.2.6 IBV 核酸探针的标记 |
| 1.2.7 标记探针的敏感性检测 |
| 1.2.8 标记探针的特异性检测 |
| 2. 结果 |
| 2.1 PCR和RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 PCR和RT-PCR扩增产物的序列测定结果 |
| 2.3 核酸探针的敏感性试验结果 |
| 2.4 核酸探针的特异性试验结果 |
| 3、讨论 |
| 实验二、利用斑点杂交反应检测采集样品中的REV、MDV、CAV、ARV和IBV |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 样品组织DNA 的提取 |
| 1.2.2 样品组织RNA的提取 |
| 1.2.3 应用斑点杂交反应检测REV、MDV、CAV、ARV 和IBV |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 CAV 的斑点杂交检测及其VP1 基因序列分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 病料的采集和处理 |
| 1.2 应用斑点杂交检测REV、MDV、CAV、ARV 和IBV |
| 1.3 病料中CAV VP1 基因的克隆及序列测定 |
| 1.3.1 引物设计 |
| 1.3.2 扩增VP1 的PCR 反应 |
| 1.3.3 PCR产物的回收 |
| 1.3.4 DNA 定量 |
| 1.3.5 连接 |
| 1.3.6 PCR 产物的克隆 |
| 1.3.6.1 氯化钙法制备感受态大肠杆菌 |
| 1.3.6.2 转化 |
| 1.3.7 质粒DNA 的提取 |
| 1.3.8 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.3.9 序列测定与分析 |
| 1.3.10 病料中的CAV与CAV其它参考株VP1基因序列比较 |
| 2 结果 |
| 2.1 病料的斑点杂交检测结果 |
| 2.2 PCR 扩增结果 |
| 2.3 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 2.4 病料中CAV 的VP1 基因核苷酸序列 |
| 2.5 病料中的CAV 与其它CAV 参考株VP1 基因序列比较 |
| 2.6 病料中的CAV 与其它CAV 参考株VP1 基因推导氨基酸序列比较 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（9）应用PCR检测禽腺病毒（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒及其繁殖 |
| 1.2 DNA提取 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 PCR扩增 |
| 1.5 特异性和敏感性试验 |
| 1.6 PCR扩增产物检测分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增条件的优化 |
| 2.2 特异性试验 |
| 2.3 敏感性试验 |
| 3 讨论 |
（10）EDS-76病毒检测方法的研究 ——双夹心ELISA、胶体金试纸条和PCR方法（论文提纲范文）
| 引言 |
| 第一章 双夹心ELISA方法检测EDS-76病毒的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 病毒和抗体 |
| 1.3 材料与仪器 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.4.1 辛酸-硫酸铵盐析法提纯IgG用溶液的配制 |
| 1.4.2 双夹心ELISA所用试剂 |
| 1.4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒增殖和纯化 |
| 2.2 高免血清的制备 |
| 2.2.1 鸡抗EDS-76病毒抗体制备 |
| 2.2.2 兔抗EDS-76病毒抗体制备 |
| 2.2.3 羊抗兔抗体制备 |
| 2.3 试验鸡人工感染EDS-76病毒 |
| 2.4 血清纯化和分析 |
| 2.4.1 辛酸-硫酸铵法纯化血清IgG |
| 2.4.2 血清纯度分析 |
| 2.5 双夹心ELISA方法的建立 |
| 2.5.1 方阵法确定最佳工作条件 |
| 2.5.2 方阵滴定法测定包被抗体和病毒抗原的最佳工作浓度 |
| 2.5.3 方阵滴定法测定兔抗EDS-76病毒抗体和酶标羊抗兔抗体的最佳工作浓度 |
| 2.6 双夹心ELISA方法的操作程序 |
| 2.7 特异性试验 |
| 2.7.1 交叉试验 |
| 2.7.2 阻断试验 |
| 2.8 敏感性试验 |
| 2.9 人工感染鸡带毒、排毒试验 |
| 2.10 临床样本检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒及抗体指标 |
| 3.2 EDS-76病毒免疫电镜 |
| 3.3 纯化抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 |
| 3.4 最佳反应条件的确定 |
| 3.4.1 最佳反应条件选择结果 |
| 3.4.2 包被抗体和抗原最佳工作浓度试验结果 |
| 3.4.3 兔抗EDS-76病毒抗体和酶标羊抗兔抗体的最佳工作浓度 |
| 3.5 双夹心ELISA特异性试验结果 |
| 3.5.1 交叉试验结果 |
| 3.5.2 阻断试验结果 |
| 3.6 敏感性试验结果 |
| 3.7 人工感染鸡组织脏器带毒检测 |
| 3.8 人工感染鸡排毒持续期检测 |
| 3.9 临床样本检测 |
| 4 讨论 |
| 第二章 胶体金试纸条检测EDS-76病毒的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与试验材料 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 胶体金颗粒的制备 |
| 2.1.1 制备前器皿的清洁和硅化 |
| 2.1.2 柠檬酸三钠还原法制备胶体金 |
| 2.1.3 胶体金颗粒的质量鉴定及直径测定 |
| 2.2 胶体金标记抗体制备 |
| 2.2.1 抗体标记前的处理 |
| 2.2.2 抗体最低稳定量选择 |
| 2.2.3 抗体的标记 |
| 2.2.4 胶体金颗粒的选择 |
| 2.2.5 胶体金标记抗体浓度的确定 |
| 2.3 胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维 |
| 2.4 胶体金标记抗体稳定剂的选择 |
| 2.5 胶体金免疫电镜 |
| 2.6 胶体金试纸条的装配 |
| 2.7 胶体金试纸条的检测方法和结果判断 |
| 2.8 胶体金试纸条的性能测定试验 |
| 2.8.1 特异性试验 |
| 2.8.2 灵敏度试验 |
| 2.8.3 稳定性试验 |
| 2.9 临床样本检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 胶体金制备 |
| 3.1.1 不同粒径的胶体金溶液呈现的颜色 |
| 3.1.2 胶体金质量 |
| 3.2 抗体最低稳定量的选择 |
| 3.3 胶体金颗粒的选择和胶体金标记抗体浓度的确定 |
| 3.4 胶体金标记抗体稳定剂的选择 |
| 3.5 胶体金试纸条检测样品的结果显示 |
| 3.6 特异性试验 |
| 3.6.1 交叉试验 |
| 3.6.2 阻断试验 |
| 3.7 胶体金免疫电镜 |
| 3.8 稳定性试验 |
| 3.9 临床样本检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 PCR方法检测EDS-76病毒的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 PCR引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒DNA提取 |
| 2.1.1 病毒DNA提取的简单流程 |
| 2.1.2 具体操作程序 |
| 2.2 病毒DNA的快速提取 |
| 2.2.1 缓冲液及溶液 |
| 2.2.2 样品准备： |
| 2.2.3 具体操作程序 |
| 2.3 DNA浓度测定及残存蛋白质和RNA的检测 |
| 2.3.1 浓度测定 |
| 2.3.2 纯度测定 |
| 2.4 DNA分子检测 |
| 2.5 PCR最优条件选择 |
| 2.6 PCR产物的检验 |
| 2.7 PCR敏感性试验 |
| 2.8 EDS病毒DNA和病毒尿囊液直接加热煮沸的PCR结果比较 |
| 2.9 特异性试验 |
| 2.10 试验感染鸡组织和血液带毒检测 |
| 2.11 试验感染鸡组织和血液排毒检测 |
| 2.12 临床样本检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PCR反应最适条件的确定： |
| 3.2 病毒DNA检测 |
| 3.3 PCR敏感性检验 |
| 3.4 EDS病毒DNA和病毒尿囊液直接加热煮沸PCR的结果比较 |
| 3.5 特异性检测结果 |
| 3.6 人工试验鸡组织和血液中病毒的检测 |
| 3.7 人工感染鸡排毒检测 |
| 3.8 临床样本PCR检测结果 |
| 3.9 四种检测方法比较 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
四、用 Digoxigenin 标记核酸探针检测 EDS-76 病毒核酸的研究（论文参考文献）
- [1]鹅细小病毒VP1-VP3非重叠序列地高辛探针的制备和应用[J]. 布日额,王君伟,吴金花,马波,Ulrich Neumann. 中国兽医杂志, 2005(01)
- [2]用地高辛标记核酸探针检测鹅细小病毒的研究[J]. 布日额,王君伟,吴金花,孙红梅,Ulrich Neumann. 畜牧兽医学报, 2004(01)
- [3]GPV VP及NS基因克隆及其原核表达产物的研究和应用[D]. 布日额. 东北农业大学, 2005(08)
- [4]减蛋综合征贵州分离毒全基因组探针的制备及检测[J]. 韩丽珍,曹蔚,吴彤. 山地农业生物学报, 2000(03)
- [5]用 Digoxigenin 标记核酸探针检测 EDS-76 病毒核酸的研究[J]. 孙刚,潘兴广,刘尚高. 中国畜禽传染病, 1998(01)
- [6]探针检测鸭黄病毒的地高辛标记DNA的制备与应用[J]. 高绪慧,刁有祥,唐熠,于春梅,张大丙,岳澄滨. 中国兽医学报, 2012(04)
- [7]鸭坦布苏病毒核酸斑点杂交方法的建立及E蛋白的原核表达[D]. 王瑞明. 山东农业大学, 2018(09)
- [8]用核酸探针和分子斑点杂交技术检测家禽病毒的核酸[D]. 王汉雷. 山东农业大学, 2007(01)
- [9]应用PCR检测禽腺病毒[J]. 谢芝勋,MazharI.Khan. 中国兽医学报, 2000(04)
- [10]EDS-76病毒检测方法的研究 ——双夹心ELISA、胶体金试纸条和PCR方法[D]. 王爱华. 河北农业大学, 2005(06)