一、Biochemistry of Melanization in Mosquitoes（论文文献综述）
于爽[1]（2020）在《苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造》文中研究表明害虫是影响农林生产力的主要因素之一。随着化学杀虫剂对环境的污染日益严重,生物杀虫剂的应用越来越普遍。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）能够产生杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins,ICPs）、营养期杀虫蛋白（Vegetative insecticidal proteins,Vips）等不同类型的杀虫蛋白,由于Vips与ICPs的杀虫谱和作用机制存在差异性,Vips一直是研究的热点。自发现Vip3A蛋白以来,虽然有大量的关于Vip3A蛋白的研究,但是其三维结构尚未解析,Vip3A蛋白结构与功能之间的关系知之甚少,而且还存在杀虫活性有待进一步提高等问题。本研究以对鳞翅目害虫具有广谱杀虫活性的Vip3Aa39为对象,通过构建嵌合蛋白和突变体确定了Vip3Aa39关键功能区和关键氨基酸位点。无活性的vip3Ad是本研究新筛选获得,用于与vip3Aa39构建嵌合基因,以期得到关键氨基酸片段。通过对比vip3Aa39和vip3Ad核苷酸序列,利用同源重组技术,采用重叠延伸PCR方法进行了Vip3Aa39与Vip3Ad的氨基酸片段互换,构建10个嵌合基因,诱导表达蛋白对棉铃虫（Helicoverpa armigera）、小菜蛾（Plutella xyllostella）和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）3种鳞翅目供试昆虫进行生物活性测定,并通过同源建模预测了Vip3Aa39改造蛋白的三维结构信息,对比分析嵌合蛋白的生物活性与结构关系得到Vip3Aa39关键氨基酸片段;为进一步研究Vip3Aa39蛋白杀虫关键氨基酸位点,对本实验室已验证杀虫活性有明显差异的Vip3Aa11与Vip3Aa39的氨基酸同源性进行分析,发现二者仅有39个氨基酸的差异,利用生物信息学方法,确定15个不同靶点,将Vip3Aa39蛋白中的相应氨基酸突变为Vip3Aa11相应的氨基酸,构建15个突变体。诱导表达后以棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾为供试昆虫进行生物活性测定,结合预测的Vip3Aa39突变体蛋白三维结构信息,确定影响Vip3Aa39蛋白活性的关键氨基酸位点5个。主要研究结果如下:1.筛选得到嵌合蛋白构建材料无活性的vip3Ad基因。为获得无活性Vip3A蛋白与已有高活性Vip3Aa39蛋白构建嵌合蛋白用以确定关键氨基酸片段,利用温度筛选法和PCR方法从4034份土样中筛选新基因。从菌株BJG810中得到了vip3Ad基因,vip3Ad基因的编码框长2361 bp,与vip3Ad2（CAI43276）核酸序列相似性达到99.36%,序列提交到Gen Bank并获得登录号KP346519。转化BL21（DE3）中,诱导表达,得到～88k Da的蛋白,生物活性测定表明蛋白对3种鳞翅目供试昆虫棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾均无杀虫活性,与Vip3Aa39序列比对表明两蛋白的氨基酸同源性为85%,获得了嵌合蛋白构建的基因材料。2.构建嵌合蛋白,获得了Vip3Aa39蛋白的关键氨基酸片段。成功构建以Vip3Ad蛋白N-端起始的Vip3Ad Aa类蛋白4个。将Vip3Aa39的N-端氨基酸片段替换为Vip3Ad蛋白的相应片段得到重组蛋白4个,分别为Vip3Ad Aa-1（氨基酸1-60被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-2（氨基酸1-116被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-3（氨基酸1-344被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-4（氨基酸1-455被Vip3Ad取代）。Vip3Ad Aa-1杀虫活性与Vip3Aa39相比对三种昆虫的LC50值均降低,杀虫活性显着增加,Vip3Ad Aa-1与Vip3Aa39只有3个差异氨基酸（T6,N45,E60）;Vip3Ad Aa-2对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性与Vip3Aa39相比没有显着差异,而显着降低了对甜菜夜蛾的杀虫活性;与Vip3Aa39相比,Vip3Ad Aa-3对棉铃虫的杀虫活性显着提高而降低了对甜菜夜蛾的杀虫活性;与Vip3Aa39相比,Vip3Ad Aa-4对小菜蛾的杀虫活性显着升高。成功构建Vip3Aa39的中间氨基酸片段替换为Vip3Ad相应片段的Vip3Aa Ad Aa类蛋白3个。分别为Vip3Aa Ad Aa-1（氨基酸116-210被Vip3Ad取代）,Vip3Aa Ad Aa-2（氨基酸210-345被Vip3Ad取代）,Vip3Aa Ad Aa-3（氨基酸455-632被Vip3Ad取代）。Vip3Aa Ad Aa-1对甜菜夜蛾杀虫活性的显着降低,几乎丧失了对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性,氨基酸比对发现Vip3Aa Ad Aa-1与Vip3Aa39只有3个差异氨基酸位点（A134V,I176M,S200P）;Vip3Aa Ad Aa-2显着提高对棉铃虫的杀虫活性,降低了对小菜蛾的杀虫活性;Vip3Aa Ad Aa-3对小菜蛾和甜菜夜蛾的杀虫活性均显着降低。成功构建以Vip3Ad蛋白C-端为结尾的Vip3Aa Ad类蛋白3个。分别为Vip3Aa Ad-1（氨基酸345-789被取代）,Vip3Aa Ad-2（氨基酸727-789被取代）;Vip3Aa Ad-3（氨基酸778-789被取代）。蛋白的杀虫活性表明:Vip3Aa Ad-1和Vip3Aa Ad-2对3种昆虫丧失了活性;Vip3Aa Ad-3对3种昆虫均具有杀虫活性,提高了对棉铃虫的杀虫活性而降低了对小菜蛾的杀虫活性。综合以上分析,Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210是维持对棉铃虫活性的关键氨基酸片段,可以通过改造Vip3Aa39的氨基酸片段1-60、210-345、778-789提升对棉铃虫的杀虫活性;Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210、210-345、455-632、778-789是维持对小菜蛾活性的关键氨基酸片段,可以通过改造Vip3Aa39的氨基酸片段1-60、1-455提升对小菜蛾的杀虫活性;Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210、1-344、455-632是维持对甜菜夜蛾活性的关键氨基酸片段;其中Vip3Aa39的氨基酸片段116-210是对这三种昆虫的关键氨基酸片段;可以通过改造Vip3Aa39的1-60提升对三种试虫的生物活性。明确了两个重要氨基酸位点组合,（A134V,I176M,S200P）组合改造后对3种试虫活性丧失,说明是Vip3Aa39的关键氨基酸位点组合;（T6A,N45D,E60D）组合改造后对3种试虫生物活性显着升高,说明可以通过改造此氨基酸位点组合提高对3种试虫的生物活性。3.获得了15个突变体蛋白,确定5个Vip3Aa39杀虫的关键氨基酸位点。成功构建了15个突变体（N9S、A10T、T193S、L194S、S200G、N543S、L544I、G546E、E547D、V681T、I685T、R686S、L780I、K782H和N784Y）。对突变体蛋白进行杀虫活性测定和结构分析,结果表明:与Vip3Aa39相比,突变体蛋白对三种昆虫的杀虫活性均发生了不同程度的变化。L544I、R686S和N784Y突变体蛋白对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性均有显着提高;N9S、S200G、N543S、L544I、E547D、V681T、I685T和K782H突变体蛋白均显着提高了对甜菜夜蛾的杀虫活性。从而确定了L194、N543、L544、K782、N784五个氨基酸位点可能是对Vip3Aa39蛋白杀虫活性起关键作用的位点。4.嵌合蛋白和突变体蛋白胰蛋白酶消化结果显示,除Vip3Aa Ad-2,A10T外,其余均被消化成稳定的62k Da片段,证实胰蛋白酶参与了改造蛋白的活化;该结果进一步表明,Vip3Aa Ad-2、A10T蛋白不具有杀虫活性的原因也可能是因为该蛋白不能够被胰蛋白酶消化出核心片段。综上,本研究基于Vip3Aa39和Vip3Ad、Vip3Aa39和Vip3Aa11杀虫蛋白活性的差异以及氨基酸序列的差异,对Vip3Aa39进行改造,构建Vip3Aa39嵌合蛋白及突变蛋白,获得了与杀虫活性相关的关键活性区信息,对深入研究Vip3Aa杀虫基因的功能及功能与结构关系具有指导意义。并获得了高活性的Vip3Aa杀虫蛋白,为高效工程菌的构建和转基因植物的培育、延缓昆虫抗性提供了遗传材料,也为该类基因在生物农药、基因修饰等领域的应用提供理论依据。
朱晓静[2]（2019）在《埃及伊蚊酚氧化酶PP06和PP010生化特性及功能研究》文中研究指明蚊虫是一种重要的外寄生虫,也是世界上第一大疫病传播生物媒介,在分类学上,蚊虫属于双翅目昆虫。昆虫酚氧化酶Prophenoloxidases（PPOs）是一种Ⅲ型铜蛋白,可以催化黑色素的合成,参与表皮与卵壳的形成、创口愈合和包裹,以及通过氧化产生的活泼自由基杀死入侵的病原体,所以研究蚊虫的酚氧化酶有助于理解蚊虫传播和防御病原的机制。昆虫体内的酚氧化酶通常先以酌酚氧化酶酶原（Prophenoloxidase,PPO）的形式存在,然后通过蛋白酶水解等过程激活。相比较于其他昆虫,蚊子体内有更多的PPO基因,但是这些PPO的具体生化功能尚不清楚。本实验主要为深入探究埃及伊蚊的PPO的功能机制,并为昆虫PPO的分类和注解提供实验依据。本实验通过MAGE 5构建系统进化树,种类分布分析证实,埃及伊蚊（Aedes aegypti）含有一种与非蚊类昆虫PPO密切相关的酚氧化酶PP06,而其余的PPO都是蚊虫特有的。实验挑选了PPO6和PPO10这两个埃及伊蚊的基因进行了表达并测定了其生化特性,通过qRT-PCR实验确定了PPO6基因在1龄幼虫和雄蚊中肠中表达量最高,PPO10基因在1龄幼虫和雌蚊头部中表达量最高。随后对这两个基因在大肠杆菌系统中进行原核表达,并将其表达的蛋白以多巴胺、L-DOPA和酪氨酸为底物进行酶活测定并计算酶动力学,结果表明PP06只对双酚化合物有酶活反应,PPO10对单酚和双酚化合物都有酶活反应。利用SWISS-MODEL构建PPO6和PPO10的三维模型,并用AutoDock将PPO构象与酪氨酸底物进行对接,通过比较其结构特征,表明可能由于PPO6上Glu-216的阻挡导致了PPO6无法与酪氨酸进行反应,PPO10上Asp-218这一残基可能是与酪氨酸作用的关键残基。本实验希望找出PPO10识别单酚化合物的关键氨基酸残基,为以后设计PPO抑制剂提供理论基础。
张惠[3]（2011）在《沙门氏菌诱导家蝇幼虫SSH文库构建及差异表达基因分析》文中研究表明家蝇抗菌肽是一类具有抗菌活性的黏性小分子多肽,其具有的特殊性质使其成为各种生物体先天免疫防御系统的重要组分。家蝇在病菌杂生的环境中,能够表现出超强的适应生存能力,这是因为其自身具有较为完善的先天免疫系统,并形成了特殊抵御外来有害微生物侵入的防御机制,因此,家蝇抗菌肽的研究已成为当前的热点和新方向,随着家蝇抗菌肽基因结构和功能研究的深入,人们认识到这些基因结构和功能应是基因差异表达的结果,为进一步揭示不同类型个体间基因的表达规律。本研究选取了相伺日龄、同一饲养条件下的家蝇幼虫,以三日龄家蝇幼虫为材料,利用抑制消减杂交技术构建了沙门氏菌诱导和未诱导的消减cDNA文库,并进行差异表达基因克隆,同时结合PCR技术和反Northern点杂交对抗性差异表达基因进行筛选；最后利用5’RACE和3’RACE钓取沙门氏菌诱导产生的家蝇防御素、攻击素的差异cDNA片段的全长基因,将获得的全长基因进行具体功能分析。现将本实验所得结果列下：（1）利用抑制消减杂交技术构建正向和反向抑制消减杂交文库。以沙门氏菌诱导家蝇幼虫为Tester、正常家蝇幼虫为Driver分别构建消减cDNA文库。正向与反向抑制消减杂交文库中分别随机挑选500个克隆经PCR鉴定,消减文库的单克隆重组率分别为92%和91%,差异基因片段大小为0.2kb-1.0kb。（2）利用正向和反向消减cDNA二次PCR扩增产物作探针,对两消减cDNA文库中的阳性克隆进行高通量筛选。在以沙门氏菌诱导家蝇幼虫为Tester、正常家蝇幼虫为Driver的消减cDNA文库中,选取194个差异表达克隆进行测序及同源性比较分析,筛选出30个与家蝇抗菌肽基因有同源性的序列,27个为未知序列,137个与其它相关基因有高同源性。在以正常家蝇幼虫为Tesetr、沙门氏菌诱导家蝇幼虫为Driver的消减cDNA文库中,选取71个单一有效cDNA序列进行分析,筛选出66个与家蝇基因有同源性的序列,5个为未知序列。（3）利用SMARTTMcDNA末端快速扩增技术,成功克隆了3个家蝇幼虫差异表达全长基因：defensinIcDNA全长489bp, ORF为282bp; defensinⅡcDNA全长474bp, ORF为276bp; attacincDNA全长883bp, ORF为719bp。（4）利用CLUSTALW等软件对家蝇幼虫defensinⅠ、defensinⅡ及attacin基因所编码的蛋白质结构与功能等特征进行了预测和分析。家蝇抗菌肽基因defensin与报道的家蝇、丝光绿蝇、厩蜇蝇的同源性比较高,与黑腹果蝇、Eristalis tenax defensin蛋白同源性较低,该编码蛋白在氨基酸水平上具有很高的保守性。attacin基因与果蝇、刺舌蝇、Harmonia a xyridis、家蚕、丝光绿蝇及绿棉铃虫基因编码的氨基酸与其它的双翅目昆虫的attacin相似性较低。
郝格非[4]（2011）在《农药合理设计的分子基础研究》文中研究说明农业在我国的国民经济中占有很大的比重,而农药是保障农业生产的重要“武器”,然而越来越普遍的抗性问题使农药陷入一种十分不利的境地。如何对付已经出现的抗性问题,又如何进行反抗性农药分子设计将是一项非常艰巨的任务,农药分子合理设计是解决以上问题的有效方法之一。然而合理设计是一项系统工程,其中包括多个环节,比如类农药性研究、农药分了作用机制研究、农药抗性预测研究和新型农药分子设计等。如何针对以上的诸多环节,采用有效的方法,并最终发现潜在的新型农药分子先导化合物是合理设计的关键和目标。因为提高新型先导化合物的发现效率,一方面可以极大地缩短农药研发的周期；另一方面可以免受现有抗性机制的困扰。随着结构生物学及计算化学等学科的不断发展,计算模拟的方法在农药分子合理设计中具有无可比拟的优势,并与实验科学形成很好的互补,在新农药的创制过程中扮演着越来越重要的角色。本论文采用计算模拟的方法围绕“农药合理设计的分子基础”这一关键的科学问题,系统地研究农药合理设计过程中的各个主要环节,其中包括类农药性研究、代表性农药分子的作用机制研究、农药抗性预测方法研究以及基于碎片的农药分子设计研究。提出了类农药性的规则；闸明了农药中多个重要靶标的分子作用机制；发展和完善了一些与农药分子合理设计相关的计算方法；并成功发现了一些全新结构的高活性分子。首先,以商品化农药分子为基础开展类农药性研究。对788个商品化农药分子的物理化学性质进行系统性地分析,重点考察了分子量（MW）、脂水分配系数（CLogP）、氢键供体数目（HBA）、氢键给体数目（HBD）、可旋转键数目（ROB）以及芳香键数目（ARB）的分布情况,本文首次将光稳定性引入到类农药性研究中；找出区分不同种类农药分子的关键物理化学参数,并考察了不同时期上市农药品种的物理化学性质随着年代的变化情况。在此基础上提出了类农药性规则,即：MW<435 Da,CLogP<6,HBA<6,HBD<2,ROB<9,ARB<17。其次,以农药上最新最重要的发现之一（生长素及赤霉素受体的发现）为基础,综合运用计算模拟的方法系统研究了生长素和赤霉素与各自受体相互作用的分子机制。在生长素受体TIR1蛋白中,辅因子InsP6扮演了“构象稳定剂”的角色,生长素及其类似物不仅发挥了“分子胶水”的作用,同时还可以诱导Phe82侧链发生构象变化以适应底物Aux/IAA蛋白的结合,并且Phe351的侧链构象变化对TIR1蛋白识别底物也起到了非常重要的作用。此外,在赤霉素受体GID1蛋白中,我们发现了赤霉素进出受体的新通道,并从理论上对赤霉素介导GID1氮端α螺旋变构的调节机制进行了驳斥,证明了赤霉素在通过新通道时并不介导GID1氮端α螺旋变构,而是通过稳定GID1与DELLA蛋白之间的氢键来起到调节作用的。这是关于赤霉素与受体相互作用的一种全新机制。这些研究为将来开展新型人工植物激素的合理设计奠定良好基础,同时对其它农药的作用机制研究具有借鉴意义。再次,针对农药分子抗性发展新型的抗性预测方法。首先通过多种分子模拟方法对近来出现的一例奇特抗性—水麻Gly210缺失导致的PPO酶除草剂的广谱抗性进行抗性机制研究,发现Gly210与Ser424之间重要氢键的丢火可以引起活性腔的局部结构发生微妙的变化,从而导致PPO酶除草剂与Arg128之间的氢键变弱是产生抗性的原因。此外,针对所用到的预测方法的弊端,发展了一种全新的抗性预测方法—计算突变扫描（Computational Mutation Scanning,CMS）,实现了在野生型复合物动力学轨迹基础上对氨基酸侧链的任意变换从而提高了预测的效率；相对于计算丙氨酸扫描（Computational Alanine Scanning, CAS）而言,由于引入了快速熵变计算,所以大大地提高了结合自由能计算的精度；在对模板体系的测试中,该方法的预测准确率达到了80%左右,是一种快速而有效的抗性预测计算工具。并且我们利用该方法对一些PPO酶商品化除草剂进行了抗性预测,并发现了一些潜在的抗性突变体。这些研究为今后其它农药分子的抗性预测提供了理论基础。最后,本文针对两个农药体系（以细胞色素bcl复合物为靶标的杀菌剂和以PPO酶为靶标的除草剂）自身的特点发展了新的基于碎片的农药分子设计策略。首先将商品化农药分子按照碎片筛选规则进行切割,并建立适于农药分子设计的碎片库；然后在细胞色素bcl复合物体系中固定现有抑制剂的药效团结构,采用碎片生长方法来优化其与Phe128及Phe274之间的疏水相互作用,成功发现了多个不同结构类型的高活性抑制剂（活性最高达到几十pM级别）；此外我们通过减少抑制剂与抗性位点之间的相互作用、同时引入与靶标内不可变位点（PPO酶辅因子FAD）的相互作用、并筛选与底物作用模式类似的碎片等反抗性策略,成功发现了新型作用模式的PPO酶高活性抑制剂（活性达到几十nM级别）。这些研究策略也可以为其它体系的新型农药分子设计提供理论方法上的借鉴。
周阳[5]（2010）在《家蚕核型多角体病毒（BmNPV）Bm5的基因分析及利用基因芯片筛选抗BmNPV相关基因》文中研究表明家蚕是重要的经济昆虫,也是家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）的天然宿主。家蚕核型多角体病毒是引起家蚕病毒严重感染的关键病原之一,病毒与宿主的相互博弈一直是研究者们关注的问题。家蚕抗NPV机制至今尚未完全明确,但究其病因可归因于宿主与致病病毒两方面因素。本研究以BmNPV核心基因Bm5为研究对象,从基因的转录、表达、亚细胞定位、病毒结构定位和基因缺失等方面,研究基因的基本特性及其功能。同时使用家蚕高密度Oligo表达谱芯片所提供了相关基因的基因组学的证据,突破了以往单个基因孤立研究的局限,在全基因组范围内筛选家蚕抗NPV相关基因,对筛选出基因进行GO和Pathway分析,并进一步用半定量PCR和荧光定量PCR进行验证,探讨家蚕抗NPV的途径和机理。论文主要结论如下：1.BmNPV的orf5（Bm5）位于基因组4,605--5,600 nt,全长993 bp,编码一个含331个氨基酸残基的蛋白,预测分子量约为39.3 kDa,Bm5是AcMNPV orf13的同源序列。在Bm5基因ATG上游存在杆状病毒晚期转录基序ATAAG,在终止密码子TAA下游发现转录终止信号AATAAA,暗示了该基因是晚期表达基因。根据Bm5基因序列设计引物,分别以BmNP基因组DNA为模板进行PCR扩增,将得到的基因克隆至原核表达载体pET30a（+）,在原核细胞中实现了基因的融合表达。纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备了BM5蛋白的多克隆抗体。2. RT-PCR分析发现,Bm5在病毒感染宿主细胞12 h开始转录,直到72 h。利用抗体进行Western blot分析,发现Bm5的表达产物在病毒感染宿主细胞后24 h被检测出来,一直持续72 h都有表达,大小为39.3kDa,与预测的大小一致,说明Bm5是一个晚期表达基因,而且没有转录后修饰。Western blot方法检测分离出的BV、ODV粒子,表明BM5不是病毒粒子的结构蛋白。利用抗体检测发现BM5定位在细胞质中。3.利用Red重组系统在大肠杆菌中成功地对BmNPV的Bm5基因进行了快速定点敲除。并BmNPV/Bac-to-Bac系统和Red重组系统结合在一起,对敲除了Bm5基因的BmNPV:进行了拯救。分别构建了野生型病毒vBm5-Wt、Bm5基因缺失病毒vBm5-Ko和Bm5基因拯救病毒vBm5-Re。4.应用基因芯片技术在家蚕抗NPV品系BC8、感性品系306中筛查抗性相关基因,结果发现93个差异表达基因其中表达上调基因44个,下调基因49个。GO分析表明93个基因中51个其中24个上调基因、27个下调基因具有功能注释。GO分析结果显示分子功能方面主要有酶活性、氧化还原活性、酶绑定、结构成分、转运活性等；生物进程方面主要有新陈代谢、蛋白质水解、电子转移、蛋白质定位、转移、蛋白质生物等功能；细胞组分方面主要有细胞内、膜核糖体、胞外区等。Pathway分析表明有新陈代谢、果糖和甘露糖代谢、丙酸代谢、核糖体、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、糖酵解/糖异和柠檬酸循环（TCA循环）等通路。5.为了验证芯片筛选出差异表达基因,从93个差异基因挑选14个表达量差异大基因（9个上调基因、5个下调基因）进行RT-PCR,依据结果再从14个基因中挑选10个差异基因（7个上调基因、3个下调基因）进行荧光定量PCR。结果表明了7个上调基因中5个基因在NB、BC8各时间点的表达量高于306,鉴定为抗性相关上调基因,2个基因在BC8表达量高于NB、306。3个下调基因在306的表达量要高于NB、BC8,鉴定为抗性相关下调基因。表明荧光定量PCR试验结果与芯片结果具有良好的一致性,进一步证实了芯片结果的可靠性。
刘晓勇[6]（2009）在《家蚕核型多角体病毒与家蚕抗病毒相关的蛋白质组分析》文中研究表明家蚕核型多角体病毒是引起家蚕病毒严重感染的关键病原之一,病毒与宿主的相互博弈一直是研究者们关注的问题。本论文主要从蛋白质组水平研究杆状病毒的ODV病毒粒子结构组分。通过构建近等基因系研究宿主对抗病毒感染的相关蛋白,希望筛选出一些与家蚕抗性或者感性相关的节点蛋白。同时也从DNA水平筛选抗性相关的分子标记。此外,论文中对构建的近等基因系从不同角度进行了评估,对利用家蚕EST数据库鉴定质谱结果也进行了分析。主要结果如下:通过蔗糖密度梯度离心得到了家蚕核型多角体的ODV病毒粒子,并首次使用SDS-PAGE,二维电泳和质谱技术鉴定了ODV病毒粒子或与之相关的蛋白。鉴定了可靠的19种蛋白,包括15种BmNPV编码的病毒粒子主要蛋白,分别是Polyhedrin,P78/83,BmOrf 40,BmOrf 54,GP41/P40,P95,VP39,P25,ODV-EC43,BmOrf 94,BmOrf 109,P74,P49,ODV-E56和PTP,和4种家蚕蛋白,热休克同源蛋白,Hsp21.4,谷胱甘肽硫转移酶,肽基脯氨酰异构酶。其中2种BmNPV的蛋白BmOrf40和PTP,为首次鉴定为ODV组成。并且我们提出一种假说,本研究鉴定的家蚕宿主来源的蛋白可能对ODV核衣壳包装和成熟有着重要的作用。在抗核型多角体病毒（NPV）病的家蚕品种NB和高敏感品种306及其近等基因系BC9中,采用500个RAPD随机引物分别在各个品系的DNA混合物进行扩增以筛选分子标记,获得了与家蚕抗NPV病有关的分子标记三个OPF-072023,OPJ-131300,OPM-161200。其中OPF-072023标记通过回交代检测,证明获得的标记真实、可靠,并对该分子标记的片段进行了克隆、测序。通过对该片段的生物信息学分析,推测在此分子标记处可能有DNA片段的插入,还在家蚕Z染色体上发现了一个逆转位子的编码序列。另外还介绍了一种PCR单一产物直接染色判断有或无的定性检测方法。为了利于研究NB品系家蚕这种突出的抗病毒特性相关的蛋白,我们对高抗,高敏感及近等基因系家蚕五龄起蚕中肠、血淋巴和脂肪体组织的蛋白质表达进行了二维电泳分析,并利用质谱对差异蛋白进行鉴定。对3个家蚕品系的差异蛋白表达进行了比较。在中肠中鉴定了5个差异蛋白,其中1和2在抗性品系NB和BC9表达量高于306,而3,4,5号这3种蛋白在306中表达较高,这些蛋白可能与家蚕中肠对BmNPV的抗性或感性有关。在血淋巴中,有两种差异表达的蛋白,分别是β-N已酰氨基葡糖苷酶2和氨基酰化酶,我们推测在抗性家蚕的血淋巴中过量表达的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶可能会干扰细胞膜上的GP64蛋白的N连接聚糖,从而阻止了启动二次感染的一个关键蛋白的功能,进而减少了产生有感染力病毒粒子。在脂肪体组织中鉴定了4种蛋白,其中2种可能与能量代谢有关,其中1号蛋白与磷酸甘油激酶（PGK）在序列上高度相似,2号蛋白是家蚕精氨酸激酶（AK）。第4号蛋白可能和整合酶的功能相似,第3号蛋白未能鉴定。为了从分子水平上评估我们构建的近等基因系的可靠性,尤其是对其与感性的轮回亲本之间遗传背景的相似性进行了评估。在本研究中,我们对随机多态性DNA和双向电泳的一些结果进行了分析,证明其相似性虽比理论的要低,但这个模型方法对研究抗性仍然是有价值的,对研究家蚕其它的差异基因也是有借鉴作用的。我们还利用收集的家蚕EST数据经转换格式后形成MASCOT软件识别的数据库,每个EST经6种阅读框翻译,然后通过MASCOT软件对质谱数据进行分析。还举例说明这种方法能鉴定那些在目前的蛋白序列数据库中没有的多肽。这对一些蛋白数据不够充分的物种蛋白鉴定也有参考价值。
李亮[7]（2004）在《乌骨鸡肝脏差异显示（DD）表达序列标签（ESTs）的筛选及分析鉴定》文中提出乌骨鸡是我国独特的家禽品种，丝羽乌骨鸡更以其特有的外貌特征而名列国际标准品种之一，国内长期以来都将乌骨鸡视为药用品种。基因及表达的差异是导致生物性状多样性的根本原因，乌骨鸡与其他鸡种相比所表现的各种独特性状必定也是由于基因及其表达的差异所引起。目前，差异显示逆转录聚合酶链式反应（DDRT-PCR）技术已经成为筛选差异表达基因的有效手段之一，在生物学领域中的应用范围不断扩大。本试验应用DDRT-PCR技术研究乌骨鸡与普通蛋鸡及肉鸡在成年阶段肝脏组织中基因表达的差异，筛选乌骨鸡差异表达的表达序列标签（ESTs），将所得ESTs与现有核酸序列数据库进行比对，找到与乌骨鸡特异性状表达的相关基因或者作为新的ESTs添加到现有核酸序列数据库，并通过电子延伸和电子定位等方法对乌骨鸡差异表达基因进行分析。 本试验成功地从丝羽乌骨鸡（SK）、常羽乌骨鸡（NP）、苏禽96型蛋鸡（SQ）以及爱拔益加肉鸡（AA）的成年鸡肝脏组织中提取到质量较高的总RNA，首次采用DDRT-PCR技术对四个家鸡品种肝脏中差异表达的基因进行了研究。试验采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法分离差异片段，利用单链构象多态性（SSCP）技术验证差异显示片段的重扩增产物成分的单一性，采用反向Northern斑点杂交和Northern斑点杂交技术相结合对获得的乌骨鸡差异显示cDNA片段进行差异真实性的鉴定。经过克隆测序，试验最终得到10条乌骨鸡差异表达的表达序列标签。将序列提交到Genbank中的dbEST数据库，分别获得登录号（CN606328～42N606329、CN606331～CN606338）。 将乌骨鸡差异显示的ESTs通过BLASTn工具对Genbank的nr数据库和dbEST数据库中所有家鸡（Gallus gallus）的核酸序列进行相似性搜索，发现所获得的10条乌骨鸡差异表达的EST中，有3条EST序列（CN606332、CN606333、CN606336）与家鸡2个已知基因具有很高的相似性，可认为是这2个已知基因的同源序列。其余7条EST序列中，有3条（CN606328、CN606331、CN606338）与家鸡已有核酸数据库中的cDNA克隆或EST具有较高相似性，可认为是家鸡已知EST，但功能未知；另外4条EST序列（CN606329、CN606334、CN606335、CN606337）在家鸡已有核酸数据库中未找到同源已知基因和EST，认为是家鸡四川农业大学博.士论文的新ESTs。 与已知基因同源的乌骨鸡差异表达ESTs中，CN606332和CN606336与家鸡的185 rRNA基因同源，差异显示片段CN606333与编码家鸡热休克蛋白70的基因（月叹只4J）同源。根据反向Northern杂交和Northem杂交的结果，CN606332仅在丝羽乌骨鸡中表达，CN606336和CN606333仅在丝羽乌骨鸡和常羽乌骨鸡中表达，表明与它们同源的2个基因的在成年乌骨鸡与普通鸡种（蛋鸡和快大型肉鸡）的肝脏中的表达情况有差异。对两个基因分别利用BLASTh对家鸡基因组数据库（Chicken wgs--contig）进行检索，发现家鸡的1 85核糖体rRNA基因在4、6、14和26号染色体上都有分布，家鸡产不夕剐J基因位于17号染色体上。 对三条与家鸡核酸序列同源但功能未知的EST序列（CN606328、CN606331、CN606338），分别利用电子延伸的方法寻找与它们同源的cDNA序列，各自获得长度为556bp、1276bp的两个重叠群（contigs）序列和一个长1374bP的开放阅读框（O盯）。对三条cDNA序列进行的功能分析表明，与CN606328同源的556bPcDNA片段所编码的151个氨基酸与人类、大鼠、小鼠等物种的核糖体蛋白513的氨基酸序列完全一致，表明该序列是鸡的核糖体蛋白513的cDNA序列，我们将其命名为c尺尸513（ehieken ribosomal protein 513）并提交到GenBank数据库，登录号为（AY626809）。通过与家鸡基因组数据库的比较，我们发现基因cRPS13位于家鸡的5号染色体上。分析与CN606331同源的1276bp的contigs序列，发现该序列的正向第二阅读框（Frame=十2）翻译得到的蛋白质序列（1 40个氨基酸）与人、大鼠、小鼠核糖体蛋白L19的196个氨基酸中的140个氨基酸上仅有一个氨基酸的变异，表明该序列为鸡的核糖体蛋白L19基因的一部分。根据与基因组数据库的比较结果，我们认为鸡的核糖体蛋白L19基因位于27号染色体上。对CN606338进行电子延伸的结果表明，它属于一个长为1374bp的开放阅读框 （ORF），根据该ORF翻译得到的蛋白质序列与恒河猴（Macaca mulatta）及其他生物的异常纺锤型小脑畸形症（abnormal sPindle mierocePhaiy，ASpM）蛋白有一定的相似性，表明该O舒有可能是家鸡ASPM基因序列的一部分，但根据现有数据，尚不能得到家鸡ASPM基因的全序列。 对于4条新EST序列（CN606329、CN606334、CN606335、CN606337），分别通过BLASTx和TBLASTx工具对nr数据库中所有蛋白质序列进行了相似乌骨鸡肝脏差异显示（DD）表达序列标签（E sTs）的筛选及分析鉴定性搜索，结果表明CN606329可能与一种细胞膜蛋白基因同源，CN606334可能与Y一谷氨酞转肤酶（gamma一glutamyl transpeptidase）基因同源，eN606335可能与ATp一binding cassette transporter基因同源，而eN606337与人的假设蛋白 （hyPothetieal Protein）MGC27019有一定的相似性。对这几个EST进行基因组序列的比较，发现CN606329、CN606335、CN606337
二、Biochemistry of Melanization in Mosquitoes（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Biochemistry of Melanization in Mosquitoes（论文提纲范文）
（1）苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 1.1.1 Bt的分布及特征 |
| 1.1.2 Bt菌株分离及杀虫基因的鉴定方法 |
| 1.1.3 杀虫晶体蛋白 |
| 1.1.4 抗癌晶体蛋白 |
| 1.2 Vip简述 |
| 1.2.1 Vip的命名 |
| 1.2.2 Vip的分类 |
| 1.2.3 Vip3的杀虫机理 |
| 1.2.4 Vip3蛋白的应用 |
| 1.3 Bt蛋白的改造方式 |
| 1.3.1 定点突变 |
| 1.3.2 重组蛋白 |
| 1.3.3 随机突变 |
| 1.4 重要的鳞翅目害虫 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 vip3A杀虫基因筛选的试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 vip3A嵌合基因构建的试验材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 vip3Aa39基因突变的试验材料与方法 |
| 2.3.1 试验材料 |
| 2.3.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 vip3A基因发掘 |
| 3.1.1 Bt菌株的分离鉴定 |
| 3.1.2 vip3A基因的鉴定 |
| 3.1.3 vip3Ad基因的克隆表达 |
| 3.1.4 室内杀虫活性测定 |
| 3.2 Vip3Aa39与Vip3Ad嵌合蛋白 |
| 3.2.1 嵌合基因的获得 |
| 3.2.2 Vip3Aa39 和嵌合蛋白的结构分析 |
| 3.2.3 嵌合蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.2.4 嵌合蛋白的胰蛋白酶消化处理 |
| 3.2.5 嵌合蛋白杀虫活性分析 |
| 3.3 Vip3Aa39定点突变 |
| 3.3.1 突变位点确定 |
| 3.3.2 含vip3Aa39的表达载体的构建 |
| 3.3.3 突变基因的克隆 |
| 3.3.4 Vip3Aa39与突变体蛋白的表达与分析 |
| 3.3.5 胰蛋白酶的敏感性分析 |
| 3.3.6 杀虫活性测定 |
| 3.3.7 Vip3Aa39突变蛋白结构分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 vip3A基因资源挖掘 |
| 4.2 Vip3Aa39 和 Vip3Ad 的嵌合蛋白 |
| 4.3 Vip3Aa39定点突变 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（2）埃及伊蚊酚氧化酶PP06和PP010生化特性及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 蚊虫的危害及所引起疾病 |
| 1.2 不同昆虫中酚氧化酶的研究进展 |
| 1.3 埃及伊蚊酚氧化酶的发展 |
| 1.4 目的及意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验工具 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 流行病学调查方法 |
| 2.4.2 昆虫酚氧化酶系统发育树建立方法 |
| 2.4.3 埃及伊蚊不同生长时期和不同身体部位的收集 |
| 2.4.4 提取埃及伊蚊总RNA |
| 2.4.5 获取埃及伊蚊用于qRT-PCR的cDNA |
| 2.4.6 qRT-PCR扩增 |
| 2.4.7 埃及伊蚊总RNA反转录为cDNA(第一条链) |
| 2.4.8 PCR进行PP06和PPO10基因的扩增 |
| 2.4.9 电泳检测及目的基因回收 |
| 2.4.10 目的片段连接克隆载体pMD18-T Vector |
| 2.4.11 质粒提取与测序 |
| 2.4.12 目的片段和连接载体双酶切 |
| 2.4.13 表达载体的构建及蛋白诱导表达 |
| 2.4.14 蛋白诱导表达 |
| 2.4.15 蛋白纯化 |
| 2.4.16 SDS-PAGE蛋白检测 |
| 2.4.17 酶活测定 |
| 2.4.18 埃及伊蚊PP06和PPO10蛋白的三维模型的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 流行病学调查结果 |
| 3.2 昆虫酚氧化酶系统发育分析 |
| 3.3 埃及伊蚊PPO基因的转录水平分析 |
| 3.4 埃及伊蚊PPO6和PPO10基因的原核表达及酶活测定 |
| 3.4.1 埃及伊蚊RNA的提取及PPO6和PPO10基因扩增结果 |
| 3.4.2 pTYB12-PPO6与pTYB12-PPO10重组质粒双酶切检测结果 |
| 3.4.3 重组质粒pTYB12-PPO6与pTYB12-PPO10原核表达结果 |
| 3.4.4 最适活化剂选择的结果 |
| 3.4.5 埃及伊蚊PPO6和PPO10的动力学结果 |
| 3.5 埃及伊蚊PPO6和PPO10分子模拟对接 |
| 3.5.1 PPO6蛋白和PPO10蛋白的三维模型构建结果 |
| 3.5.2 PPO6和PPO10分别与酪氨酸对接的结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 流行病学调查讨论 |
| 4.2 昆虫酚氧化酶系统发育分析讨论 |
| 4.3 埃及伊蚊PPO基因的转录水平讨论 |
| 4.4 埃及伊蚊PPO6和PPO10酶动力学讨论 |
| 4.5 埃及伊蚊PPO6和PPO10分子模拟对接讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 流行病学调查 |
| 5.1.2 酚氧化酶的系统发育分析 |
| 5.1.3 PPO6和PPO10在不同发育阶段和不同组织部位的表达分布 |
| 5.1.4 PPO6和PPO10基因的原核表达及酶活测定 |
| 5.1.5 埃及伊蚊PPO6和PPO10分子模拟对接 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）沙门氏菌诱导家蝇幼虫SSH文库构建及差异表达基因分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 昆虫抗菌肽的研究进展 |
| 1.1 昆虫抗菌肽概述 |
| 1.2 昆虫抗菌肽的分类和特点 |
| 1.3 昆虫抗菌肽的作用机理 |
| 1.4 昆虫抗菌肽的应用 |
| 1.5 昆虫抗菌肽存在的问题 |
| 1.6 家蝇抗菌肽的研究现状 |
| 1.7 家蝇基因差异表达的研究 |
| 第二部分 实验部分 |
| 试验一 沙门氏菌诱导家蝇幼虫cDNA消减文库构建及差异基因筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 试验二 沙门氏菌诱导家蝇幼虫部分差异基因RACE全长克隆与分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）农药合理设计的分子基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本论文主要创新点 |
| 第一章 前言 |
| §1.1 引言 |
| §1.2 农药品种的发展现状 |
| 1.2.1 除草剂的发展 |
| 1.2.2 杀菌剂的发展 |
| 1.2.3 杀虫剂的发展 |
| §1.3 抗性产生的分子机制 |
| §1.4 合理分子设计策略 |
| 1.4.1 农药作用的分子机制研究 |
| 1.4.2 抗性预测 |
| 1.4.3 基于碎片的分子设计 |
| §1.5 课题的提出 |
| 参考文献 |
| 第二章 分子类农药性研究 |
| §2.1 引言 |
| §2.2 农药分子结构库的构建、统计方法及物化参数选择 |
| §2.3 除草剂,杀菌剂和杀虫剂物理化学性质比较 |
| §2.4 农药分子的物理化学性质随时间的变化 |
| §2.5 类农药性与类药性的差别 |
| §2.6 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 生长素及赤霉素的作用机制研究 |
| §3.1 引言 |
| §3.2 关键位点在生长素分子识别机制中的重要作用 |
| 3.2.1 计算方法 |
| 3.2.2 结果与讨论 |
| §3.3 赤霉素调控植物生长分子机制的新见解 |
| 3.3.1 计算方法 |
| 3.3.2 结果与讨论 |
| §3.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 农药抗性的分子机制及抗性预测方法学研究 |
| §4.1 引言 |
| §4.2 基因缺失型PPO酶产生抗性的分子机制 |
| 4.2.1 计算方法 |
| 4.2.2 结果与讨论 |
| §4.3 计算突变扫描(CMS)方法的发展及其在农药抗性预测中的应用 |
| 4.3.1 计算方法 |
| 4.3.2 结果与讨论 |
| §4.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于碎片的农药分子设计 |
| §5.1 引言 |
| §5.2 农药分子碎片库的构建 |
| §5.3 以细胞色素bc1复合物为靶标的新型抑制剂的设计 |
| 5.3.1 计算方法 |
| 5.3.2 结果与讨论 |
| §5.4 以PPO酶为靶标的新型抑制剂的设计 |
| 5.4.1 计算方法 |
| 5.4.2 结果与讨论 |
| §5.5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录1 缩写对照 |
| 在读期间发表论文及参与章节编写目录 |
| 后记 |
（5）家蚕核型多角体病毒（BmNPV）Bm5的基因分析及利用基因芯片筛选抗BmNPV相关基因（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 杆状病毒的分类 |
| 1.1.2 杆状病毒的形态和结构 |
| 1.1.3 杆状病毒的生活周期 |
| 1.1.4 杆状病毒基因组研究进展 |
| 1.2 昆虫和杆状病毒的相互关系 |
| 1.2.1 昆虫抗病毒研究 |
| 1.2.2 对病毒的遗传抗性 |
| 1.2.3 对病毒感染的物理和生理屏障 |
| 1.2.4 细胞免疫 |
| 1.2.5 细胞凋亡 |
| 1.2.6 体液免疫 |
| 1.3 家蚕抗NPV的研究 |
| 1.3.1 杆状病毒侵染昆虫的机理 |
| 1.3.2 BmNPV的增殖曲线及病毒增殖与蚕体生理代谢的变化 |
| 1.3.3 家蚕对BmNPV抵抗性的遗传规律研究 |
| 1.3.4 家蚕中肠在抗NPV的作用 |
| 1.3.5 家蚕抗BmNPV的相关基因 |
| 1.4 基因芯片研究进展及应用 |
| 1.4.1 芯片的发展及研究步骤 |
| 1.4.2 芯片分类 |
| 1.4.3 芯片的应用领域 |
| 1.4.4 基因芯片技术在家蚕中的应用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 1.6 主要研究内容和研究路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 研究路线 |
| 第二章 Bm5基因序列分析、原核表达和多克隆抗体制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Bm5的核苷酸和其编码的氨基酸的序列特征 |
| 2.2.2 BM5的氨基酸同源性分析 |
| 2.2.3 Bm5的克隆 |
| 2.2.4 Bm5基因的原核表达及检测 |
| 2.2.5 BM5蛋白的纯化 |
| 2.2.6 融合蛋白6×His接头的鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Bm5基因的转录、表达研究及表达产物的定位 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Bm5的转录时相 |
| 3.2.2 Bm5的表达时相 |
| 3.2.3 BM5的亚细胞定位 |
| 3.2.4 BM5蛋白在病毒结构中的定位 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 家蚕核型多角体病毒Bm5的缺失和拯救 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 大肠杆菌菌株BW25113-Bac的获得 |
| 4.2.2 Bm5基因打靶线性化片断的鉴定 |
| 4.2.3 重组质粒pUC-US-Cm-DS的酶切鉴定 |
| 4.2.4 Bm5缺失重组Bacmid的构建和验证 |
| 4.2.5 vBm-wt、vBm5-ko和vBm5-re三种Bacmid的获得 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基因芯片的筛选抗BmNPV相关基因 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 RNA提取的浓度和纯度鉴定 |
| 5.2.2 高密度家蚕Oligo芯片杂交结果 |
| 5.2.3 芯片的图像处理及数据采集结果 |
| 5.2.4 筛选差异基因 |
| 5.2.5 GO分析结果 |
| 5.2.6 Pathway分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 部分差异基因的验证 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 RT-PCR检测抗性相关基因 |
| 6.2.2 QRT-PCR检测相关抗性基因 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 实时相对定量荧光RT-PCR技术 |
| 6.3.2 验证材料的特异性 |
| 6.3.3 验证差异基因的时间、空间特异性 |
| 6.3.4 验证方法的特异性 |
| 6.3.5 鉴定的基因功能分析 |
| 6.4 结论 |
| 总结和展望 |
| 总结 |
| 展望 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的研究论文和参加的课题 |
| 致谢 |
（6）家蚕核型多角体病毒与家蚕抗病毒相关的蛋白质组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 图表清单 |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 核型多角体病毒结构蛋白及其与宿主相互作用的研究进展 |
| 1.1 杆状病毒分类 |
| 1.2 杆状病毒的生活史 |
| 1.3 核型多角体病毒与宿主的相互作用 |
| 1.4 核型多角体病毒ODV结构蛋白 |
| 1.5 小结与展望 |
| 第二章 家蚕和家蚕抗病毒的研究 |
| 2.1 家蚕基因组和蛋白质组研究概况 |
| 2.2 昆虫抗病毒研究 |
| 2.3 抗BmNPV家蚕品种研究 |
| 2.4 小结与展望 |
| 第三章 研究目的、研究内容和技术路线 |
| 3.1 研究目的 |
| 3.2 研究内容 |
| 3.3 技术路线 |
| 第四章 家蚕核型多角体病毒ODV粒子蛋白组分分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒繁殖与纯化 |
| 4.1.2 SDS-PAGE和2-DE分离 |
| 4.1.3 蛋白鉴定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 病毒纯化 |
| 4.2.2 蛋白分离 |
| 4.2.3 蛋白鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 病毒蛋白的鉴定 |
| 4.3.2 宿主来源蛋白的鉴定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 家蚕抗BmNPV病分子标记 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料及近等基因系的建立 |
| 5.1.2 DNA的提取 |
| 5.1.3 PCR扩增 |
| 5.1.4 分子标记在回交代中的验证 |
| 5.1.5 分子标记的克隆、测序 |
| 5.1.6 特异引物的扩增 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 RAPD分析结果 |
| 5.2.2 分子标记在各回交代中的验证 |
| 5.2.3 OPF-07_(2023)DNA片段的克隆及测序 |
| 5.2.4 特异引物的扩增 |
| 5.2.5 OPF—07_(2023)序列生物信息学分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 家蚕抗BmNPV病蛋白质组分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 家蚕亲本 |
| 6.1.2 构建近等基因系 |
| 6.1.3 二维电泳 |
| 6.1.4 胶内消化 |
| 6.1.5 质谱分析 |
| 6.1.6 蛋白鉴定 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 二维电泳的比较分析 |
| 6.2.2 质谱数据分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 中肠组织差异蛋白 |
| 6.3.2 血淋巴差异蛋白 |
| 6.3.3 脂肪体组织差异蛋白 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 相关研究 |
| 7.1 近等基因系的评估 |
| 7.1.1 材料与方法 |
| 7.1.2 结果与分析 |
| 7.2 利用EST数据对质谱结果进行鉴定 |
| 7.2.1 方法 |
| 7.2.2 讨论 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 研究结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 论文的主要创新点 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文和参加课题 |
（7）乌骨鸡肝脏差异显示（DD）表达序列标签（ESTs）的筛选及分析鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 基因表达差异的研究方法 |
| 1 前言 |
| 2 基因表达差异的研究方法 |
| 3 mRNA差异显示技术的应用 |
| 4 小结 |
| 第二节 表达序列标签的研究及应用 |
| 1 前言 |
| 2 表达序列标签的研究及应用 |
| 3 畜禽表达序列标签的研究概况 |
| 4 小结 |
| 第三节 乌骨鸡遗传特性研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 乌骨鸡的营养价值研究 |
| 3 乌骨鸡的药用价值研究 |
| 4 乌骨鸡遗传多样性研究 |
| 5 乌骨鸡特异性状遗传研究进展 |
| 6 小结 |
| 第四节 本试验的总体研究思路及意义 |
| 1 本试验的研究思路 |
| 2 本研究的目的意义 |
| 第二章 四个品种鸡肝脏差异表达cDNA片段的筛选 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1 试验材料 |
| 2 肝脏组织总RNA的提取及纯化 |
| 3 差异显示逆转录PCR (DDRT-PCR) |
| 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) |
| 5 差异片段的切取与再扩增 |
| 第二节 试验结果 |
| 1 肝脏组织总RNA的提取及纯化 |
| 2 差异显示逆转录PCR (DDRT-PCR)产物的电泳结果 |
| 3 差异片段的切取 |
| 4 差异片段的再扩增与回收 |
| 第三节 讨论与分析 |
| 1 总RNA的抽提 |
| 2 关于DNase Ⅰ处理 |
| 3 反应条件对试验结果的影响 |
| 4 差异条带的回收和再扩增 |
| 第四节 小结 |
| 第三章 差异表达cDNA片段真实性的验证 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1 试验材料 |
| 2 单链构象多态性(SSCP)分析差异条带单一性 |
| 3 反向Northern杂交验证差异条带的真实表达 |
| 4 Northern杂交 |
| 第二节 试验结果 |
| 1 SSCP筛选结果 |
| 2 反向Northern杂交筛选结果 |
| 3 乌骨鸡差异表达条带的Northern杂交结果 |
| 第三节 讨论与分析 |
| 1 SSCP的原理及特点 |
| 2 Northern杂交和反向Northern杂交 |
| 第四节 小结 |
| 第四章 乌骨鸡肝脏差异表达cDNA片段的克隆和测序 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1 试验材料 |
| 2 真实差异cDNA片段的克隆 |
| 3 转化子的筛选 |
| 4 质粒DNA提取及纯化 |
| 5 序列测定 |
| 6 确定差异显示cDNA片段序列 |
| 第二节 试验结果 |
| 1 阳性片段的克隆与筛选 |
| 2 质粒提取和鉴定 |
| 3 阳性克隆的序列测定 |
| 4 差异显示cDNA片段的序列 |
| 第三节 讨论与分析 |
| 1 PCR产物与载体的连接与克隆效率 |
| 2 关于测序结果 |
| 3 单引物扩增现象 |
| 第四节 小结 |
| 第五章 乌骨鸡肝脏特异的表达序列标签的初步分析鉴定 |
| 第一节 分析方法 |
| 1 向GENEBANK递交序列 |
| 2 序列相似性搜索 |
| 3 与差异显示片段同源的已知基因的分析 |
| 4 未知功能差异显示片段的分析 |
| 第二节 分析结果 |
| 1 序列递交结果 |
| 2 相似性搜索结果 |
| 3 乌骨鸡差异表达已知基因分析 |
| 4 未知功能ESTs分析 |
| 第三节 讨论与分析 |
| 1 关于ESTs的分析方法 |
| 2 关于乌骨鸡差异显示的基因 |
| 第四节 小结 |
| 第六章 总结 |
| 主要参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1 常用词语缩写 |
| 附录2 主要仪器设备 |
| 附录3 所用差异显示引物的序列信息 |
| 附录4 作者简介 |
四、Biochemistry of Melanization in Mosquitoes（论文参考文献）
- [1]苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造[D]. 于爽. 东北农业大学, 2020
- [2]埃及伊蚊酚氧化酶PP06和PP010生化特性及功能研究[D]. 朱晓静. 海南大学, 2019(05)
- [3]沙门氏菌诱导家蝇幼虫SSH文库构建及差异表达基因分析[D]. 张惠. 吉林农业大学, 2011(11)
- [4]农药合理设计的分子基础研究[D]. 郝格非. 华中师范大学, 2011(10)
- [5]家蚕核型多角体病毒（BmNPV）Bm5的基因分析及利用基因芯片筛选抗BmNPV相关基因[D]. 周阳. 江苏大学, 2010(05)
- [6]家蚕核型多角体病毒与家蚕抗病毒相关的蛋白质组分析[D]. 刘晓勇. 江苏大学, 2009(09)
- [7]乌骨鸡肝脏差异显示（DD）表达序列标签（ESTs）的筛选及分析鉴定[D]. 李亮. 四川农业大学, 2004(01)