一、Epstein-Barr病毒在人上皮细胞中的增殖和表达（论文文献综述）
孙乐[1]（2020）在《LMP1在鼻咽癌的增殖、转移及放疗敏感性中的机制研究》文中研究指明前言:鼻咽癌（NPC）是一种来源于鼻咽上皮的恶性肿瘤,按其发病率排在常见癌症的第24位,70%的鼻咽癌新发病例均出现在东亚和东南亚地区,尤其是我国南方,如中国广东、广西、湖南、福建、江西、香港地区为鼻咽癌的高发区,男性的发病率一般是高于女性的2-3倍,40-50岁为高发的年龄段。由于患者鼻咽部的恶性肿瘤位置较隐匿,导致其早期临床症状不典型,约70%的患者在被确诊时己是Ⅲ期或Ⅳ期。此外,鼻咽癌大部分患者属于低分化或未完全分化的鳞状上皮细胞癌,恶性程度较高,容易在鼻咽部以外出现远处肿瘤转移。NCCN指南推荐同步放化疗和辅助放化疗或诱导化疗后同步放化疗作为治疗手段。据统计几乎98%的NPC与EBV密切相关,其中EBV的潜伏膜蛋白1（LMP1）在控制和促进鼻咽癌的发生、发展的细胞分化过程中己经被证实起到了重要的作用。它能通过鼻咽癌细胞内多种信号直接传导细胞通路,如TRAFs&NF-κB、PI3K-A kt/PK B、MAPK、转运蛋白PRA1等,调节和控制鼻咽癌细胞的正常增殖、生长、迁移、分化、免疫与细胞凋亡,从而控制癌变细胞的发生和发展。对于LMP1的鼻咽癌最新的研究结果表明,miR-155在体外能够促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,但对于鼻咽癌细胞放疗的影响尚不清楚;而高迁移率族蛋白B1（HMGB1）最近被发现在人鼻咽癌组织中过表达,而且其表达的高低与患者的总生存期和无病生存期有关,且关于促进HMGB1的机制以及促进的HMGB1在NPC中的作用却知之甚少;此外,循环肿瘤细胞（CTC）及EBVDNA和RNA作为鼻咽癌的一个有前途的生物标志物也不断的被重视起来,但这几种标志物与鼻咽癌的转移关系还没有研究。目的:为了进一步深入探讨EBV LMP1及其相关因子miR-155、HMGB1在鼻咽癌发生、发展的分子机制,分析EBV的DNA和RNA、CTC在鼻咽癌转移诊断中的作用,寻找基因治疗和判断鼻咽癌预后的分子靶标。我们首先设计和构建了 LMP1真核表达载体转染的鼻咽癌稳定细胞系,并评估LMP1对鼻咽癌细胞增殖、迁移的影响。通过检测LMP1转染的鼻咽癌细胞中miR-155的表达及miR-55基因抑制对鼻咽癌细胞放疗的敏感性,评估miR-155对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭和体外放疗的影响,探讨miR-155与LMP1的相关性。通过检测人鼻咽癌标本及EBV感染的鼻咽癌细胞中HMGB1,评估LMP1对HMGB1的促进作用及HMGB1在体外对鼻咽癌细胞增殖的调控作用。检测鼻咽癌患者血浆中的EBV DNA和RNA（LMP1、LMP2、BART和EBER1）水平,评估患者外周血液循环CTC细胞中EBVDNA、RNA与CTC和肿瘤转移之间的关系。方法:（1）构建重组LMP1表达载体,并对CNE-2细胞进行转染,之后以实时定量PCR法、蛋白印迹观察转染率及LMP1转录和蛋白表达水平的变化;对pEGFP-LMP1转染CNE-2鼻咽癌细胞进行克隆,CCK8检测细胞活性,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力;蛋白印迹法对HMGB1和P65蛋白进行表达定量分析;之后采用qPCR测定LMP1过表达的CNE-2细胞中miR-155的转录水平;用miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,并进行细胞侵袭实验判断miR-155对于鼻咽癌侵袭的影响;使用RNeasy Mini试剂盒从CNE-2细胞中分离并提取细胞总mRNA,使用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒提取CNE-2细胞中的miRNA;CCK8检测miR-155模拟转染CNE-2细胞后的增殖情况,及使用miR-155抑制剂后的细胞增殖情况;测定miR-155抑制后的正常CNE-2细胞或CNE-2（LMP1）细胞在放疗下的存活率。（2）遵循知情原则,对84例鼻咽癌患者进行活检,血清学检查52例为EBV阳性,32例为EBV阴性,并记录了这些患者放疗或化疗前完整的临床资料。检测这些标本的HMGB1表达以及其与LMP1 DNA水平的关系。之后评估感染EBV的CNE-2细胞从细胞核向细胞质的转移和释放HMGB1的情况,测定HMGB1对CNE-2细胞的增殖影响,以及RAGE特异性siRNA转染对HMGB1在CNE-2细胞增殖中的作用。（3）遵循知情原则,收集250名鼻咽癌患者资料,其中伴有转移者136例,不伴有转移者114例,治疗前取外周静脉血,进行CTC计数,并采用实时定量PCR方法检测血浆LMP1、LMP2、BART和EBER1水平,评估DNA/RNA和肿瘤转移之间的关系。结果:（1）pEGFP-LMP1质粒转染CNE-2细胞后14天时,重组载体转染的LMP1蛋白表达明显高于对照组,pEGFP-LMP1真核载体构建成功;CCK8检测显示LMP1过表达的CNE-2细胞的增殖活性比对照组高,具有统计学差异;细胞划痕实验中,LMP1过表达的CNE-2细胞在12h、24h时间点均大于对照组,有统计学差异,P<0.01;细胞侵袭实验中,LMP1过表达的CNE-2细胞穿过胶膜的细胞数在12h、24h明显多于对照组,有统计学差异,P<0.01;LMP1过表达CNE-2细胞组HMGB1和P65蛋白表达均高于对照组,单因素方差分析均有统计学差异,分别为P=0.0058;P=0.02;比较miR-155在CNE-2与HONE1之间的转录水平,发现并无明显的统计学差异,P>0.05,但在LMP1过表达CNE-2细胞中miR-155的转录水平是CNE-2的4.5倍,P<0.001。采用miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,miR-155转录水平分别增加11.22和11.63倍。细胞侵袭实验中,miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,24h后染色计数穿越基质膜的细胞数明显高于转染对照组的细胞越膜数量,统计学有显着差异,P<0.001。通过CCK-8检测,miR-155模拟转染可显着促进CNE-2细胞增殖,P<0.05。与miR-Con细胞相比,转染miR-155抑制剂显着降低了 CNE-2细胞中miR-155的水平P<0.05;P<0.01,细胞增殖也显着下降,P<0.05。在0或4.0Gy辐射处理后,转染miR-155抑制剂后,CNE-2（LMP1）细胞与转染miR-Con的细胞相比,形成的菌落更少,P<0.01。在转染了miR-155抑制剂的CNE-2（LMP1）)细胞中比在转染了 miR-Con细胞中更显着,P<0.01。无论是否暴露于4.0Gy辐射,miR-155敲低对CNE-2（Con）细胞的集落数量减少不显着,P>0.05。（2）EBV阳性组的HMGB1蛋白水平也显着高于EBV阴性组（P<0.001）。HMGB1 mRNA水平与52个EBV阳性人样本中LMP1 DNA水平显着相关,R2=0.5640,P<0.0001。感染EBV的CNE-2细胞的上清液中的HMGB1在感染后12小时至48小时内也有显着的升高（P<0.05、P<0.01或P<0.001）,大于0.5 mg/mL HMGB1的处理促进CNE-2细胞增殖（0.5、1、3 mg/mL HMGB1的P<0.05或P<0.01）,且有剂量依赖性（P<0.05）。这种促进细胞增殖的作用也具有时间依赖性（治疗后36或48小时,P<0.05或P<0.01）。在60 nM转染siRNA-RAGE后,HMGB1促进CNE-2细胞的增殖被显着抑制（36 或 48 h 后,P<0.05 或P<0.01）。（3）转移组的平均CTC数值为显着高于非转移组,P<0.0001。转移性鼻咽癌患者血浆EBV DNA和RNA水平明显高于非转移性鼻咽癌患者。CTC、LMP1 DNA、BART或EBER1相对水平与肿瘤分期和结节分期均有显着相关性（R2>0.25,无论是肿瘤期还是淋巴结期,四种生物标志物）。结论:（1）pEGFP-LMP1的重组质粒能够有效地转染CNE-2细胞,并在CNE-2细胞中稳定表达。EBV LMP1在鼻咽癌发生、发展中起重要作用,其促进鼻咽癌增殖、侵袭和迁徙可能通过激活HMGB1/NF-kb信号途径完成。miR-155与EBV阳性鼻咽癌相关,其上调与LMP1相关,而miR-155在在体外可以促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制miR-155可以使得鼻咽癌细胞对放疗更加敏感。（2）在体内或体外鼻咽癌组织中HMGB1均显着增高,HMGB1与鼻咽癌的恶性状态相关,EBV感染导致的LMP1高表达通过HMGB1/RAGE信号促进在鼻咽癌细胞体外增殖。（3）转移的鼻咽癌患者血中CTC、EBVDNA和RNA水平均明显升高。LMP1 DNA和EBER1 RNA与鼻咽癌转移具有相关性。
汪文杰[2]（2020）在《长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究》文中研究表明背景和目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别位于全球癌症的第四位和第五位。中国的GC发病率和死亡率占到了全世界一半以上。总的来说,GC的发生是遗传因素和环境因素交互作用的结果。目前,手术切除仍然是GC治疗的主要方式。在中国,通常超过80%的患者在初诊时就被诊断为进展期GC,术后5年生存率不到30%。尽管近年来在GC的治疗方面取得了很大的进步,但GC患者的生存率仍然很低。因此,亟需寻找GC新的分子生物标记物和特异的治疗靶点。随着高通量测序技术的发展,以往被认为是转录“噪音”和“垃圾”的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）引起了许多科学家的关注。研究发现lncRNA具有高度的组织特异性,并且参与了肿瘤细胞的多种生物学过程。此外,lncRNA可以通过表观遗传修饰、转录调控、转录后调控等多种方式参与肿瘤的发生和发展。尽管lncRNA在GC的研究中仍然属于探索阶段,但还是发现了一些lncRNA可能在GC的病变过程中起关键作用,这也为GC的诊断和治疗提供了新思路。因此,lncRNA具有成为GC诊断生物标记物和治疗靶标的巨大潜力。本研究选择lncRNA癌症易感候选物19（Cancer susceptibility candidate 19,CASC19）作为研究对象,CASC19位于被称为基因沙漠的染色体8q24.21区域,目前在GC中的功能未见报道。我们前期对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库进行深入挖掘,发现CASC19在GC中上调,并且与GC的浸润深度、TNM分期、远处转移和总体生存期（Overall survival,OS）显着相关。然后,利用cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）实验获得了CASC19在GC细胞中存在的717bp全长序列,并通过UCSC确认这是个新的转录本。我们在临床样本,细胞模型和动物模型中对CASC19在GC中作用和调控机制进行一系列实验验证,以期为GC的诊断和治疗提供参考。研究方法:1.通过TCGA数据库获取了375位GC患者的RNA测序和临床性状数据,利用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）和差异基因表达分析相结合的方法,筛选与GC进展和预后相关的lncRNA。然后,分析目的lncRNA表达与临床病理参数和预后的关系。最后,进行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）探索lncRNA相关的信号通路。2.收集了联勤保障部队第九四〇医院普通外科和兰州大学第一医院肿瘤外科从2019年9月1日至2020年1月30日手术切除的80对新鲜GC组织和癌旁对照组织。利用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测CASC19在GC组织和癌旁对照组织中的表达水平,并分析CASC19的表达与患者临床病理参数之间的关系以及与下游靶基因NPM1的相关性。采用受试者工作特征（Receiver operator characteristic,ROC）曲线评估CASC19在GC诊断中的意义。3.采用qRT-PCR检测CASC19在人GC细胞系（AGS,BGC-823,MGC-803,HGC-27和MKN-45）和正常胃粘膜上皮细胞系（GES-1）中的表达水平。采用RACE实验鉴定CASC19在GC细胞中的全长序列。制备CASC19 shRNA和过表达慢病毒,shRNA慢病毒感染MKN-45和BGC-823细胞,过表达慢病毒感染HGC-27和AGS细胞,用qRT-PCR检测敲减和过表达效率。采用CCK-8实验、细胞克隆形成实验和EdU细胞增殖实验检测CASC19对GC细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测CASC19对GC细胞迁移和侵袭能力的影响。采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响。采用WB实验检测CASC19对上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin,Vimentin和N-cadherin表达的影响。4.用带有Luciferase标签的CASC19 shRNA慢病毒和MKN-45细胞构建稳转细胞株。选用4-5周龄BALB/c-nu雄性裸鼠用于动物实验,将10只裸鼠随机分为sh-CASC19组和sh-NC组两个组,每组5只。将两组细胞注射于裸鼠肩胛下构建裸鼠皮下移植瘤模型,每天测量肿瘤体积,期间利用小动物活体成像仪监测肿瘤生长状态。饲养4周处死裸鼠,取下肿瘤后一半用10%中性福尔马林溶液固定,另一半放入液氮罐保存。采用qRT-PCR实验检测移植瘤中HDAC1和NPM1mRNA的表达。采用IHC实验和WB实验检测移植瘤中Ki-67,PCNA,HDAC1和NPM1蛋白的表达。5.通过基因芯片技术检测CASC19敲减后下游功能基因的表达,进而鉴定CASC19可能调控的下游靶基因,并结合创新途径分析（Ingenuity pathway analysis,IPA）软件进行经典通路分析,上游调控分析,疾病和功能分析,调控效应分析和相互作用网络分析。然后选择30个差异表达的基因（Differentially expressed gene,DEG）进行qRT-PCR验证。6.通过核质分离实验来确定CASC19在GC细胞中的亚细胞定位。采用RNA pull-down实验检测与CASC19相互作用的蛋白质。采用RNA纯化染色质分离（Chromatin Isolation by RNA Purification,ChIRP）实验检测与CASC19同时作用的蛋白质和基因,分别用质谱分析（Mass spectrometry,MS）和测序（Sequencing,Seq）鉴定下游蛋白质和基因。采用WB实验检测RNA pull-down洗脱产物中HDAC1蛋白的表达。采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP）实验来反向验证HDAC1蛋白与CASC19的相互作用。采用HDAC1的染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测与HDAC1相互作用的基因。采用ChIP-qPCR实验验证HDAC1与NPM1启动子的结合。采用双荧光素酶报告基因实验验证CASC19和HDAC1同时与NPM1启动子的结合。采用ChIP-qPCR实验验证MYC与CASC19启动子的结合。研究结果:1.通过WGCNA方法确定CASC19作为核心lncRNA用于接下来的分析和验证。CASC19在TCGA数据库GC样本中上调,其过表达与T分期（P=0.034）,TNM分期（P=0.022）和淋巴结转移（P<0.001）显着相关。CASC19过表达GC患者的OS明显短于CASC19低表达的患者（P=0.015）。Cox分析显示CASC19过表达是影响GC患者OS的独立危险因素（HR=1.524,95%CI=1.003-2.316,P=0.049）。GSEA分析显示CASC19过表达引起变化的下游大多数基因富集在癌症相关信号通路和经典信号通路上。2.CASC19在GC组织中显着上调,其表达量是癌旁对照组织中的4.2倍。CASC19表达与GC肿瘤大小（P<0.001）,浸润程度（P=0.011）,TNM分期（P<0.001）和淋巴结转移（P=0.003）呈正相关。CASC19的结合蛋白HDAC1在GC组织中上调,而CASC19的下游靶基因NPM1在GC组织中下调,并且NPM1的表达与CASC19负相关（R=-0.361,P=0.001）。相对于癌旁对照组织,HDAC1mRNA和蛋白在GC组织中过表达,而NPM1 mRNA和蛋白在GC组织中低表达。CASC19在ROC曲线下的面积（Area under the curve,AUC）为0.952（95%CI:0.920-0.984,P?<?0.0001）,提示CASC19对GC的诊断效果较好。3.CASC19在人GC细胞系中表达上调,其在GC细胞中的全长为717bp。UCSC网站、CPAT工具和ORFfinder网站均显示CASC19不具备蛋白质编码能力。shRNA慢病毒在MKN-45和BGC-823细胞中成功下调CASC19的表达,过表达慢病毒在AGS和HGC-27细胞中成功上调CASC19的表达。CASC19下调会抑制MKN-45和BGC-823细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而促进MKN-45和BGC-823细胞的凋亡。相反,CASC19上调会促进HGC-27和AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而抑制HGC-27和AGS细胞的凋亡。此外,CASC19下调后MKN-45和BGC-823细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和间质蛋白Vimentin和N-cadherin表达降低,而凋亡蛋白Casepase-3,Casepase-7和Casepase-9以及上皮蛋白E-cadherin表达升高。CASC19上调后HGC-27和AGS细胞中Bcl-2,Vimentin和N-cadherin蛋白表达升高,而Casepase-3,Casepase-7,Casepase-9和E-cadherin蛋白表达降低。4.sh-CASC19组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量明显小于sh-NC组,HE染色发现sh-NC组肿瘤细胞出现的核体积增大、核分裂像增多、瘤巨细胞等恶性增殖现象明显多于sh-CASC19组。Ki-67和PCNA蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显低于sh-NC组。HDAC1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平与sh-NC组无显着差异。NPM1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显高于sh-NC组。5.CASC19敲减引起1,433个DEG上调,369个DEG下调。IPA分析显示CASC19可能与THBS1和TGFBR2作用,进而影响GC细胞的增殖和凋亡。选择30个DEG进行qRT-PCR验证,与芯片实验结果一致。6.CASC19主要分布于GC细胞核内,提示CASC19可能通过表观遗传调控起作用。RNA pull-down和ChIRP-MS实验确定了96个与CASC19可能结合的蛋白,生物信息学预测到CASC19与组蛋白修饰蛋白HDAC1之间存在结合区域。WB和RIP实验证明HDAC1可直接与CASC19结合,上下调CASC19后HDAC1mRNA和蛋白的表达没有显着差异,证明HDAC1不受CASC19的调控。ChIRP-seq和HDAC1的ChIP-seq实验确定了281个HDAC1与CASC19在基因组上可能共同调控的基因。生物信息学分析表明NPM1基因启动子区域出现peak-calling峰,提示CASC19可能结合在NPM1启动子上。ChIP-qPCR实验发现下调CASC19降低了HDAC1与NPM1启动子的结合。上下调CASC19和HDAC1,qRT-PCR和WB实验证明NPM1受CASC19和HDAC1的调控。双荧光素酶报告基因实验确认CASC19通过招募HDAC1共同结合到NPM1启动子上,从而抑制NPM1的表达。此外,ChIP-qPCR实验表明MYC可结合在CASC19启动子上,qRT-PCR实验证明MYC增加CASC19的表达。结论:本课题通过挖掘TCGA数据库,发现位于染色体8q24.21区域的lncRNA CASC19在GC中上调,并且与GC的进展和预后相关。通过RACE发现CASC19在GC细胞中存在717bp的长度。我们在GC细胞系,GC临床样本和动物模型中对CASC19进行了一系列体外体内验证,证明了CASC19在GC中是一个癌基因。CASC19主要分布于GC细胞核内。在机制上,CASC19通过募集HDAC1至NPM1的启动子区域,使NPM1的启动子区域组蛋白去乙酰化,抑制了NPM1的转录活性,从而降低进NPM1的表达。此外,我们还发现CASC19在上游受到转录因子MYC的调控。我们的研究发现了CASC19通过表观修饰抑制NPM1表达的一种新机制,为更好地理解lncRNA在GC中的作用和机制增加了新的证据。CASC19有望成为GC潜在的诊断标志物和治疗靶点。
王维文[3]（2020）在《CXCR4在EBV相关胃癌中的表达和调控作用研究》文中研究表明EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）是一种双链DNA病毒,与多种肿瘤的发生相关。约有90%以上的健康人群在幼儿时期曾感染EBV,呈持续性潜伏感染状态,且在其体内均可检测到EBV抗体。EBV相关胃癌（EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC）约占胃癌总数的3%-8%,临床病理学特征与其他胃癌不同,其发病机制尚未明了。CXCR4属于高度保守的7次跨膜G蛋白偶联受体,已有研究发现CXCR4在多种肿瘤组织中表达升高,可影响多种肿瘤的发生发展过程,如促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导细胞迁移和侵袭以及上皮间质转化等多种生物学活性。CXCR4与病毒感染密切相关,如CXCR4可作为共受体辅助HIV感染并进入宿主细胞。CXCL12可与CXCR4的N端特异性结合,并与CXCR4的第2胞外环相互作用后启动下游信号通路,调控相关肿瘤的发生和发展。目的:明确CXCR4在EBVaGC组织中的表达及其调控机制,并探讨CXCR4在EBVaGC发生发展中的作用以及可能的作用机制,为进一步阐明EBV在EBVaGC发生发展过程中的作用提供理论基础。材料和方法:（1）实时荧光定量PCR检测EBV阳性和EBV阴性胃癌细胞系中CXCR4及相关microRNA的表达。（2）Western blot检测细胞系中CXCR4及相关蛋白的表达;免疫组化检测EBV阳性和EBV阴性胃癌组织中CXCR4表达。（3）亚硫酸氢盐基因组测序法检测CXCR4基因启动子和第1外显子甲基化状态。（4）在EBV阴性胃癌细胞系中分别过表达LMP1或LMP2A,检测microRNA-146a,PI3K/AKT和CXCR4的表达水平。（5）在EBV阳性胃癌细胞系中分别敲减LMP1或LMP2A的表达,检测microRNA-146a,PI3K/AKT和CXCR4表达水平的变化。（6）通过转染microRNA-146a的模拟物和抑制物,提取不同作用条件处理的蛋白,检测CXCR4蛋白表达的变化。（7）PI3K抑制剂LY294002处理细胞,检测CXCR4蛋白表达的变化。（8）采用小干扰RNA靶向沉默CXCR4表达,Western blot检测细胞自噬蛋白LC3B表达的变化,透射电镜和荧光共聚焦显微镜检测自噬小体的形成。（9）流式细胞分析检测靶向沉默CXCR4和自噬激活剂作用对细胞表型的影响。（10）采用小干扰RNA靶向沉默CXCR4表达和自噬激活剂诱导细胞自噬,检测EBV即刻早期基因BZLF1的表达。结果:（1）EBV阳性胃癌细胞系（GT38和GT39）中CXCR4 mRNA和蛋白水平均低于EBV阴性胃癌细胞系（BGC823和SGC7901）（P<0.05）;AGS-EBV细胞系中CXCR4 mRNA转录和蛋白表达水平则明显高于AGS细胞系（P<0.05）;EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中CXCL12和CXCR7 mRNA转录水平无明显差异;EBVaGC组织中CXCR4表达率较高（与AGS-EBV细胞系的潜伏类型一致）。（2）EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中CXCR4基因启动子和第一外显子均呈现低甲基化状态。（3）EBV阳性胃癌细胞系（GT38和GT39）microRNA-146a的表达水平高于EBV阴性胃癌细胞系（BGC823,SGC7901,AGS）。（4）转染LMP1重组表达质粒可上调EBV阴性胃癌细胞系microRNA-146a的表达,同时下调CXCR4的表达;且干扰EBV阳性胃癌细胞系LMP1表达后可表现出相反的调控模式。（5）microRNA-146a可通过结合CXCR4的3’-UTR区,随着模拟物转染浓度的增加,CXCR4表达水平依次下降,且作用48h的抑制效果明显强于24h（P<0.05）。（6）转染LMP2A重组表达质粒可诱导AKT发生磷酸化,并上调CXCR4的表达;且敲减LMP2A后可表现出相反的调控模式。（7）以不同浓度的PI3K抑制剂LY294002处理AGS-EBV细胞,发现PI3K/AKT通路可以剂量依赖的方式诱导CXCR4的表达。（8）干扰CXCR4蛋白表达,可降低LC3B蛋白表达,同时抑制自噬小体的形成。（9）CXCR4可诱导细胞发生自噬,增加细胞进入G2/M期,促进细胞增殖,同时减少细胞发生凋亡的数量。（10）CXCR4可抑制BZLF1mRNA和蛋白的表达,参与EBV持续性潜伏感染的过程,但细胞自噬并不介导CXCR4-BZLF1-EBV潜伏感染的调控过程。结论:（1）LMP1可通过上调microRNA-146a的表达,抑制靶基因CXCR4的表达。（2）LMP2A可通过PI3K/AKT通路上调CXCR4的表达。（3）LMP1和LMP2A可在不同阶段调控CXCR4的表达,参与EBVaGC的发生和发展过程。
吴硕[4]（2019）在《EB病毒对MUS81基因表达调控机制的研究》文中指出目的:探讨EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染对MUS81（methl methanesulfonate and UV sensitive isolate number 81,对乙烷磺酸盐及紫外线敏感的第81号独立序列）表达的影响,研究MUS81基因在EBVaGC发生中的作用和作用机制。方法:（1）采用实时荧光定量PCR技术（Real time quantitative PCR,qRT-PCR）检测EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中MUS81、EME2（essential meiotic structure-specific endonuclease subunit 2,必需减数分裂结构-特异性内切酶亚基2）及其相关基因在转录水平上的差异;（2）Western blot技术检测两种细胞系中MUS81和EME2蛋白表达的差异;（3）分别构建稳定转染EBV潜伏膜蛋白1（Latent membrane protein1,LMP1）、潜伏膜蛋白2A（Latent membrane protein 2A,LMP2A）、EBV编码小RNA（Epstein-Barr virus coded small RNA,EBER）的SGC7901细胞系,检测外源性LMP1、LMP2A、EBER表达对MUS81表达的影响;（4）免疫组化技术检测EBV阳性胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVa GC）和EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVn GC）组织中MUS81蛋白的表达;（5）亚硫酸氢盐基因组测序法（Bisulfite genomic sequencing,BGS）检测EBV阳性和阴性胃癌细胞系中MUS81基因启动子区Cp G岛甲基化状态,并用去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理BGC823、SGC7901和稳定转染LMP1的SGC7901细胞系,观察对MUS81表达的影响,分析EBV对MUS81表达和MUS81甲基化状态的影响;（6）检测si RNA靶向沉默MUS81和EME2表达后对细胞周期和凋亡的影响。结果:（1）qRT-PCR结果显示,EBV阴性胃癌细胞系中MUS81基因、EME2基因和SLX4基因转录水平明显高于EBV阳性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中SLX1基因转录水平明显高于EBV阴性胃癌细胞系;两种细胞系中EME1的转录水平没有明显差异。（2）Western blot技术检测结果显示,EBV阴性胃癌细胞系MUS81和EME2蛋白表达水平均明显高于EBV阳性胃癌细胞系。（3）与SGC7901-NC（稳定转染空载质粒的SGC7901细胞系）比较,SGC7901-LMP1、SGC7901-LMP2A和SGC7901-EBER细胞系（稳定转染LMP1、LMP2A、EBER的SGC7901细胞系）MUS81转录水平没有发生明显变化。Western blot检测显示,SGC7901-LMP1,SGC7901-LMP2A,SGC7901-EBER细胞系MUS81蛋白表达与SGC7901-NC细胞系比较没有显着性差异。（4）q RT-PCR检测结果显示,用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理SGC7901-LMP1细胞系MUS81的转录水平及蛋白表达水平没有发生明显变化。（5）EBV阴性胃癌细胞系MUS81基因启动子区甲基化水平明显高于EBV阳性胃癌细胞系。Western blot检测结果显示5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理EBV阴性胃癌细胞系后MUS81蛋白表达水平没有发生明显变化。（6）EBV阳性胃癌组织中MUS81蛋白表达水平明显低于阴性胃癌组织。（7）SGC7901细胞沉默MUS81蛋白表达,与对照组相比,细胞发生G2/M期阻滞（P<0.05）,而凋亡率无明显差异（P>0.05）;沉默EME2表达后,与对照组相比,G2/M期细胞比值增高（P<0.05）,凋亡细胞比例增高（P<0.05）。结论:（1）EBV可抑制胃癌细胞系MUS81及其异二聚体EME2表达,MUS81基因启动子区的甲基化可能不参与其蛋白表达调控。（2）外源性LMP1、LMP2A和EBER表达对MUS81转录和蛋白表达没有明显影响。（3）沉默MUS81和EME2表达可使胃癌细胞系SGC7901阻滞在G2/M期,而下调EME2表达可促进SGC7901细胞凋亡,下调MUS81表达则对SGC7901细胞凋亡无明显影响。
石茜竹[5]（2020）在《EBV相关胃癌中Smad2功能及调控机制的研究》文中认为背景:爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barrvirus,EBV）是一种人类γ疱疹病毒,感染95%以上的成年人。EBV感染与淋巴细胞源性和上皮细胞源肿瘤的发生密切相关。EBV 相关胃癌（EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC）是胃癌的一个独特类型,占所有GC病例的近10%,但其发病机理仍不清楚。有研究表明,EBV编码的潜伏膜蛋白2A（Latent membrane protein 2A,LMP2A）可通过几条重要通路调节下游基因和miRNA的表达,在EBV相关肿瘤进展中发挥重要作用。LMP2A蛋白可能影响LMP1介导的NF-κB信号传导,从而增加miR-155的转录表达;LMP2A还可以激活PI3K/AKT途径抑制TGF-β1介导的细胞凋亡。同时,LMP2A蛋白N末端具有富含脯氨酸的区域,可以与Nedd4家族泛素蛋白连接酶的WW结构域结合。Smad家族成员2（Smad2）已被确定为TGF-β信号通路下游的关键元件;且Smad2可以作为酵母ATG6同源物（beclin1,BECN1）启动子区域上游的阻遏物抑制自噬的发生。可见,Smad2是具有调节细胞增殖、分化、凋亡以及自噬等多种生物学活性的多功能转录因子。目的:探讨EBV对Smad2转录因子的影响,进一步明确其调控机制以及Smad2在EBVaGC发生发展中的作用。材料和方法:①采用实时定量PCR（real-time quantitative PCR,qRT-PCR）和蛋白质印迹技术分别检测EBV阳性胃癌细胞系（GT39,SNU719,GT38）以及EBV阴性胃癌细胞系（BGC823,SGC7901,HGC27）中Smad2和miR-155-5p的转录表达。②采用CCK-8和流式分析检测miR-155-5p对EBV阳性细胞系增殖、凋亡和周期的影响。③miRNA-155-5p模拟物或抑制剂分别转染SGC7901和GT39细胞后,Western blotting检测Smad2和p-Smad2的表达。④将LMP2A重组表达质粒和对照质粒分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,筛选出稳定表达外源性LMP2A的细胞克隆SGC7901-LMP2A,Western blotting 和 qRT-PCR 检测对Smad2 和 miR-155-5p 转录表达的影响。⑤采用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理SGC7901-LMP2A细胞,Western blotting和qRT-PCR检测Smad2蛋白和miR-155-5p转录表达的变化。⑥PI3K抑制剂 LY294002 处理后 Western blotting 检测 SGC7901-LMP2A 细胞克隆中 Smad2 及相关蛋白的表达。⑦蛋白酶体抑制剂MG132处理后检测SGC7901-LMP2A细胞克隆中Smad2及相关蛋白的表达。⑧在SGC7901细胞系中分别转染50nm siSmad2和阴性对照,采用CCK-8和流式分析检测干扰Smad2蛋白后细胞增殖和凋亡的改变。⑨Western blotting检测干扰Smad2基因表达后,BECN1和LC3B蛋白的表达。结果:①与EBV阴性胃癌细胞比较,EBV阳性胃癌细胞中Smad2蛋白表达水平较低;而与Smad2的表达不同,EBV阳性胃癌细胞系中miR-155-5p的转录表达较高。②CCK-8和流式细胞分析结果表明,与对照组比较,miR-155-5p过表达可降低细胞活力,并提高细胞凋亡率,而miR-155-5p转录表达下调则与之相反。③转染miR-155-5p抑制剂作用GT39细胞后,Smad2蛋白表达上调,明显高于对照组细胞（t=2.897,P<0.05）。与对照组细胞比较,转染miR-155-5p模拟物的SGC7901细胞中Smad2蛋白水平显着降低（t=3.835,P<0.05）。④与对照组细胞比较,转染LMP2A重组表达质粒的SGC7901-LMP2A细胞中Smad2蛋白表达明显降低（t=5.835,P<0.05）,而miR-155-5p的转录表达则明显升高（t=6.874,P<0.05）。⑤与DMSO对照组比较,采用BAY11-7082处理稳定过表达LMP2A的SGC7901-LMP2A细胞克隆后,miR-155-5p 转录表达水平明显降低（2.5μM:t=5.748,P<0.05;36h:t=5.433,P<0.05;48h:t=6.175,P<0.05）,但 Smad2 表达水平则明显升高（2.5μM:t=3.764,P<0.05;5μM:t=5.761,P<0.05;10μM:t=4.379,P<0.05）。⑥与对照组比较,采用PI3K抑制剂LY294002处理稳定表达LMP2A的SGC7901-LMP2A细胞克隆后,Smad2和p-Smad2 蛋白表达明显上调（Smad2:30μM:t=6.374,P<0.05;40μM:t=4.853,P<0.05;50μM:t=7.143,P<0.05.p-Smad2:30μM:t=3.786,P<0.05;40μM:t=6.630,P<0.05;50μM:t=3.694,P<0.05）。⑦MG132 处理稳定表达 LMP2A 的 SGC7901-LMP2A 细胞克隆后,Smad2和p-Smad2表达明显高于对照组（Smad2:6h:t=5.383,P<0.05;10h:t=3.693,P<0.05;12h:t=6.725,P<0.05.p-Smad2:6h:t=6.293,P<0.05;10h:t=5.164,P<0.05;12h:t=4.463,P<0.05）。⑧CCK-8和流式细胞分析显示在SGC7901细胞中干扰Smad2表达后细胞活力增强而细胞凋亡率下降。⑨Western blotting显示在SGC7901细胞中干扰Smad2表达后自噬相关基因BECN1和LC3B蛋白表达上调。结论:LMP2A可抑制EBVaGC中转录因子Smad2蛋白表达。①LMP2A可通过NF-κB信号通路上调miR-155-5p的转录表达,进而靶向抑制Smad2及相关蛋白表达。②LMP2A可激活PI3K/AKT通路以抑制Smad2表达,并降低磷酸化Smad2的表达水平。③LMP2A可能调节Smad2泛素化降解。④Smad2和p-Smad2的低表达可阻断TGF-β信号通路进而调节细胞增殖、凋亡以及自噬的发生。
马玺[6]（2020）在《致瘤性γ疱疹病毒裂解复制相关宿主蛋白的筛选：PTK7促进病毒释放》文中提出背景:在器官移植受者中,Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染可诱导致死性移植术后并发症——移植后淋巴增殖性疾病（post-transplant lymphoproliferative disorders,PTLD）的发生,严重影响受者和移植物的预后。EBV是一种人类γ疱疹病毒,也是人们发现的首个致瘤病毒,其感染与一些恶性肿瘤的发生发展密切相关,包括B细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等淋巴细胞或上皮细胞来源的恶性肿瘤。在免疫抑制如医源性免疫抑制的情况下,EBV的致瘤风险大大上升。另一种常见的人类γ疱疹病毒卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV）也是重要的致瘤病毒。γ疱疹病毒致瘤机制复杂,阐明病毒和宿主之间的相互作用和调控机制对认识和治疗相关恶性肿瘤意义重大。EBV和KSHV由于其种属特异性只能感染人类或部分灵长类动物,不利于体内实验的开展,且EBV和KSHV缺乏可进行有效的体外裂解性复制的细胞系,极大地限制了病毒的研究工作。鼠γ疱疹病毒68（murine gammaherpesvirus 68,MHV-68）同属γ疱疹病毒亚科,在基因序列上与EBV和KSHV高度同源,其生物学特性也与EBV和KSHV高度相似,既可在多个实验室常用细胞系中建立体外感染模型,也可稳定感染小鼠建立有效的体内感染模型,因此MHV-68是研究人类γ疱疹病毒的常用模型。本课题旨在研究宿主蛋白对MHV-68裂解性复制的调控,进一步认识病毒-宿主相互作用,为致瘤性γ疱疹病毒相关肿瘤的预防和治疗提供支持。方法:构建包含千余种细胞激酶和细胞转录因子的c DNA文库,系统性筛选出调控MHV-68裂解性复制的宿主蛋白,根据其促进或抑制裂解性复制将其分为促进因子和限制因子。利用STRING、Metascape等数据库探究病毒裂解性复制相关的蛋白功能、相互作用和信号转导通路。将23种细胞蛋白进行两两共表达,探究相关因子在病毒裂解性复制中的交互影响。我们对促进因子酪氨酸蛋白激酶7（protein tyrosine kinase 7,PTK7）进一步深入研究,检测其对病毒裂解性基因转录和表达、基因组复制和子代病毒产量的影响,分析其作用机制。结果:本研究共筛选出105个MHV-68裂解性复制的促进因子（54个细胞激酶,51个细胞转录因子）和164个限制因子（66个细胞激酶,98个细胞转录因子）,涉及多条重要信号通路。通过构建蛋白-蛋白相互作用网络,发现167个调控因子之间存在417对相互作用关系。MAP3K5+Fos、MAP2K3+Fos、MAX+Fos等共表达组合在调控病毒裂解性复制中表现出协同效应,显着增强裂解性复制,而过表达CREB1和Myc则拮抗大多数促进因子对病毒裂解性复制的增强作用。MHV-68裂解性复制的促进因子PTK7的过表达不影响病毒裂解相关基因的转录和表达,不影响病毒基因组复制,但可促使细胞向胞外释放病毒。PTK7这种促病毒释放作用同样适用于一种α疱疹病毒——人类单纯疱疹病毒-1（herpes simplex virus type 1,HSV-1）。结论:本研究通过高通量筛选系统性分析了细胞激酶和细胞转录因子对MHV-68裂解性复制的调控作用,提供了大量分子水平和细胞水平的研究靶点。这些调控因子可能作用于病毒裂解复制的不同阶段,如裂解基因表达、病毒DNA复制、病毒组装和释放等。我们进一步研究了其中一个调控因子PTK7,发现PTK7促进宿主细胞释放MHV-68,且这种作用可能适用于所有疱疹病毒。本研究为病毒裂解性复制的调控机制提供了新的成果和认知,有利于γ疱疹病毒致瘤机理的研究、抗病毒药物的研发和PTLD等相关肿瘤治疗策略的制定。背景:γ疱疹病毒在宿主内的感染、复制和繁殖有赖于多种宿主蛋白的参与。大量的研究发现,宿主细胞蛋白既直接结合（物理性相互作用）KSHV、EBV或MHV-68的病毒蛋白来显着影响病毒的裂解性复制,也可以通过功能性相互作用进行调控。但大多数研究主要局限于对病毒裂解性复制起始或早期阶段的研究,在细胞蛋白影响裂解性复制其他阶段如病毒DNA复制、晚期基因表达,病毒组装和病毒释放等方面的研究极其有限。本研究希望能系统性筛选出影响病毒裂解性复制各个阶段的相关宿主蛋白。方法:我们构建了包含近350种细胞激酶和700种细胞转录因子c DNA文库。HEK293T细胞转染表达质粒后感染携带有荧光素酶表达元件的重组型MHV-68报告病毒,检测荧光素酶活性（代表感染性病毒产量）。利用STRING数据库构建宿主蛋白-蛋白相互作用网络,利用Metascape数据库对这些调控性蛋白进行细胞信号通路和生物学过程富集分析。我们还选取了23种调控疱疹病毒感染的细胞蛋白,检测两两共表达下病毒裂解性复制的变化。结果:本研究共筛选出105个MHV-68裂解性复制的促进因子（54个细胞激酶,51个细胞转录因子）和164个限制因子（66个细胞激酶,98个细胞转录因子）。细胞通路富集分析发现在促进因子组,MAPK信号通路、Erb B信号通路、Fox O信号通路以及Gn RH信号通路等显着富集。在限制因子组,Fox O信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和Ras信号通路为主要富集通路。通过构建蛋白-蛋白相互作用网络,发现167个调控因子之间存在417对相互作用关系,并筛选出8个紧密联系的蛋白群组,与基因转录和蛋白运输、定位、活性调控等密切相关。宿主蛋白两两配对共表达发现MAP3K5+Fos、MAP2K3+Fos、MAX+Fos等共表达组合在调控病毒裂解性复制中表现出协同效应,显着增强裂解性复制,而过表达CREB1和Myc则拮抗大多数促进因子对病毒裂解性复制的增强作用。结论:病毒在感染宿主过程中,受到宿主细胞内多种因子和信号通路的影响。本研究通过系统性筛选出269个参与调控MHV-68裂解性复制的细胞激酶和细胞转录因子,并初步探索了宿主蛋白间的相互作用和宿主信号通路在病毒裂解性复制中的作用,为进一步研究宿主-病毒相互作用提供了方向。背景基于第一部分的高通量筛选结果,我们发现PTK7促进MHV-68裂解性复制。PTK7是受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases,RTKs）家族成员,参与多项细胞信号转导通路,影响细胞的生长、分化、增殖、运动、凋亡,在脊椎动物的胚胎发育和肿瘤的发生发展中发挥重要作用。本部分研究探究PTK7如何调控MHV-68病毒的裂解性复制。方法:HEK293T细胞转染不同剂量的PTK7表达质粒后感染携带有荧光素酶表达元件的重组型MHV-68报告病毒,收集上清检测荧光素酶活性。野生型（wild type,WT）MHV-68病毒感染表达PTK7的细胞后,在不同时间点检测病毒裂解基因的转录水平、DNA拷贝数以及裂解性蛋白表达量。低感染复数（multiplicity of infection,MOI）下感染细胞,多个时间点收集上清检测荧光素酶活性,构建病毒在过表达PTK7、阳性对照Tpl2和空白对照空载体的三种细胞中的多步生长曲线。并根据多步生长曲线,在病毒感染48小时时,我们分别检测上清中、细胞中、上清加细胞中的病毒的滴度。我们还构建了短发夹RNA（short hairpin RNA,sh RNA）慢病毒载体干扰PTK7的表达,检测胞内活病毒量的变化。此外,我们检测了过表达PTK7后HSV-1在胞内、胞外的病毒量和总病毒量。结果:PTK7对MHV-68裂解性复制的促进作用呈剂量依赖性。PTK7的过表达不影响病毒裂解相关立即早期、早期、晚期基因的转录和表达,不影响病毒基因组的复制,但可促使细胞向胞外释放病毒。抑制PTK7的表达可明显减弱病毒释放。PTK7这种促病毒释放作用同样可见于α疱疹病毒HSV-1。结论:PTK7的研究结果揭示了其对疱疹病毒裂解性复制终末阶段病毒的释放的调控作用。这既佐证了第一部分的高通量筛选的有效性和意义,即其可一次性筛选出相当数量的作用于病毒裂解复制的不同阶段的宿主蛋白,也为疱疹病毒及相关肿瘤的治疗提供了新的靶点。
张岩[7]（2019）在《EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究》文中认为EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属γ疱疹病毒亚科,全球成人的感染率高达90%以上,能够在宿主细胞内长期潜伏,与多种人类肿瘤的发生有关,是公认的DNA肿瘤病毒。EBV相关肿瘤中几乎所有的肿瘤细胞均可检测到EBV基因组的存在,EBV在宿主细胞中建立的潜伏感染是其重要的致癌基础,EBV通过其潜伏期基因产物影响受感染细胞的基因表达及生物学行为参与相关肿瘤的发生发展。EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）是胃癌的一种独特亚型,是发病人数最高的EBV相关肿瘤,与EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC）相比具有独特的临床病理特征,但其发病机制尚未完全明了。EBV编码的潜伏基因产物可参与多种细胞信号通路的传导,如NF-κB、JNK、STAT3和PI3K/AKT等,通过一系列级联反应参与宿主细胞基因和病毒基因的表达调控,诱导细胞转化、促进细胞增殖、抑制细胞的分化和凋亡,从而导致EBV相关肿瘤的发生。转录因子NF-κB是与细胞增殖、免疫反应、炎症反应和肿瘤密切相关的重要的调节因子,持续激活的NF-κB信号通路能够通过上调其下游分子的表达来诱导细胞增殖,抑制肿瘤细胞的凋亡。NF-κB信号通路在肿瘤发生发展中的重要作用在多种EBV相关肿瘤中已被阐述,但其在EBVaGC中的具体作用机制还不明确。目的:1通过检测胃癌细胞系及胃癌组织中NF-κB经典信号通路相关分子的表达及亚细胞定位,明确EBVaGC和EBVnGC中NF-κB经典信号通路的激活情况。2探讨EBV通过潜伏感染激活NF-κB经典信号通路的具体机制。3检测分析NF-κB信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖和凋亡等细胞生物学行为,以及EBV潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A表达的影响。方法:1提取EBV阴性胃癌细胞系（SGC7901,BGC823,HGC27）、EBV阳性胃癌细胞系（GT38,GT39,SNU719）总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）对NF-κB信号通路相关分子（NFKBIA、TRAF1/2/3/6）的转录表达进行检测;Western blot检测并分析其蛋白表达水平;免疫荧光技术检测胃癌细胞系中p65蛋白的亚细胞定位;ELISA技术检测细胞系中NF-κB转录因子与DNA结合能力,综合判断NF-κB信号通路在胃癌细胞系中的激活情况。2免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC肿瘤组织中IκBα及p65蛋白表达及亚细胞定位。3采用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系SNU719及EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,24h后CCK-8检测细胞存活情况。4采用流式细胞技术及Annexin-FITC试剂盒分别检测浓度为2.5μM、5μM和10μM的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用12h后对EBV阳性胃癌细胞系GT38凋亡的影响。Western blot检测BAY11-7082、MG-132不同浓度及不同处理时间IκBα和磷酸化IκBα以及凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3）的表达。5采用2.5μM,5μM,10μM浓度的BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系GT38,12h后收集细胞提取总蛋白,Western blot检测转录因子ZEB1蛋白的表达变化情况。6采用BGS特异性引物对NFKBIA基因启动子区进行扩增,该区域含有83个CpG位点,随机选取扩增条带进行TA克隆,每个样本挑选6个克隆,根据所测6个TA克隆总CpG位点中发生甲基化的比例计算甲基化率。7 PCR结合DNA测序技术检测胃癌细胞系IκBα基因突变情况。8 miRBase和rna22网站预测EBV编码的miR-BART16含有IκBα3’UTR结合位点,将IκBα3’UTR靶定序列或其突变序列分别克隆至双荧光素酶报告基因质粒,连同相应的模拟物共转染HEK293T细胞检测其荧光素酶的表达。9构建分别携带EBV潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A编码基因的重组表达质粒,分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照。收集转染2h、6h、24h、48h、72h的实验组细胞,并提取各组细胞总蛋白,Western blot检测相关蛋白表达的变化。设计并合成靶向LMP1编码基因的siRNA及对照序列（NC）,转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,作用48h收集细胞,提取细胞总蛋白和总RNA,Western blot和qRT-PCR检测IκBα的表达变化。10分别转染LMP1和LMP2A重组质粒至EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照质粒,G418筛选实验及流式细胞仪分选后建立稳定表达LMP1和LMP2A的SGC7901细胞克隆以及载体对照细胞系,Western blot检测稳定表达外源性LMP1和LMP2A的细胞克隆NF-κB信号通路相关基因的表达。11设计并合成靶向TRAF1编码基因的siRNA转染EBV阳性胃癌细胞系GT39,检测下调TRAF1表达对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。12采用qRT-PCR和免疫组织化学技术检测EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39及EBVaGC组织中miR-BART16与LMP1的相对表达水平。13在GT38和GT39细胞系中分别转染miR-BART16的模拟物、抑制物及对照序列,浓度分别为10nM,30nM和50nM,作用48 h收集细胞,提取各组细胞总RNA和总蛋白检测LMP1的表达。选取50nM浓度miR-BART16模拟物、抑制物及对照序列,分别转染GT38和GT39细胞,采用CCK-8检测转染24h,48h,72h的细胞增殖情况。14 miR-BART16模拟物与抑制物作用GT38、GT39细胞48 h,采用流式细胞技术检测对细胞凋亡的影响,同时采用PI及BrdU染色分析miR-BART16模拟物与抑制物作用后对细胞周期的影响。结果:1 EBV阳性胃癌细胞系NF-κB信号通路抑制因子NFKBIA的转录表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系（P<0.005）,EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1、TRAF3、TRAF6转录水平均高于EBV阴性胃癌细胞系,TRAF2转录水平明显低于阴性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中IκBα蛋白表达均较EBV阴性胃癌细胞系明显降低;而两种细胞系中磷酸化IκBα蛋白的表达则无明显差异;p65及p-p65蛋白表达亦无明显差异。EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1蛋白表达明显高于EBV阴性胃癌细胞,而EBV阳性胃癌细胞系TRAF2、TRAF3和TRAF6蛋白的表达均低于EBV阴性胃癌细胞系。2 EBV阳性胃癌细胞系中p65蛋白的核内转位约占50%,而EBV阴性胃癌细胞系则较少检测到核内转位。EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719的p65-DNA结合能力均高于EBV阴性胃癌细胞系。3 EBVaGC组织中IκBαmRNA的转录表达水平明显低于EBVnGC组织及癌旁组织,EBVaGC组织中IκBα蛋白表达较EBVnGC组织弱,而发生p65核转位的肿瘤细胞多于EBVnGC组织。4 EBV阳性胃癌细胞系SNU719对NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用的敏感性明显强于EBV阴性胃癌细胞系SGC7901。5与DMSO对照组比较,2.5μM BAY11-7082处理组SNU719细胞凋亡率无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM处理组的细胞凋亡率明显升高,最高达51.5%,差异有显着性（P<0.001）。MG-132及BAY11-7082信号通路抑制剂作用后均能对凋亡相关蛋白的表达产生不同程度的影响。6 2.5μM浓度BAY11-7082作用细胞后ZEB1蛋白表达无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM浓度作用后,ZEB1蛋白表达明显下调（P<0.01）。7 EBV阳性胃癌细胞系中NFKBIA基因启动子区甲基化率:GT38为0.80%,GT39为0.80%,SNU719为0.4%,均呈低甲基化状态。8 EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719 NFKBIA基因第一外显子区均存在12bp的片段缺失（+615+626delCGCCCCCAGGAG）,造成4个氨基酸的丢失,而在EBV阴性胃癌细胞系未检测到该片段的缺失.9 EBV-miR-BART16不能直接影响带有h-NFKBIA-3’UTR的荧光素酶的表达,IκBα的表达不受miR-BART16的直接调控。10与载体对照组比较,转染LMP1重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,72h表达量是对照组的40%,磷酸化p-IκBα表达上调,在7h表达水平最高（2.15倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而磷酸化p-p65表达随作用时间上调。TRAF1表达上调,72h可达2.01倍,而TRAF2/3/6表达下调。干扰LMP1,其mRNA表达是对照组的26%,而IκBα的mRNA转录表达未见明显改变（P>0.05）,LMP1蛋白水平表达下调,IκBα蛋白表达水平则出现上调现象。11与空白对照比较,转染LMP2A重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,48h下调最明显,表达量仅是对照组的29%,p-IκBα的表达上调,在72h达到最高（3.32倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而p-p65表达随作用时间而上调。TRAF1表达上调,72h可达2.51倍,而TRAF2/3表达下调,TRAF6略有下调。12与空白对照比较,稳定转染LMP1/2A均能下调IκBα表达,表达量仅是对照组的67%和61%,p-IκBα的表达上调,为对照组的1.35倍和1.47倍,p65总蛋白和磷酸化蛋白的表达无明显差异,TRAF1分别上调2.15倍和1.46倍,而TRAF2/6表达下调,TRAF3表达无明显变化。13靶向TRAF1的siRNA作用EBV阳性胃癌细胞系GT39 48h和72h后,p65和IκBα总蛋白及磷酸化蛋白表达均未发生明显变化。14与GT38和GT39细胞系比较,EBVaGC组织中miRNA-BART16表达量明显高于2种EBV阳性胃癌细胞系,约为14-165倍。qRT-PCR及免疫组化技术在10例EBVaGC组织中均未检测到LMP1的表达。15与阴性对照组比较,GT38和GT39细胞系转染miR-BART16模拟物后,LMP1mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而降低;而转染miRNA-BART16抑制物以后,LMP1 mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而增加,呈明显的量效关系。16 miR-BART16转染GT38和GT39细胞48 h和72 h后,CCK-8检测显示其模拟物能够明显抑制细胞增殖（P<0.05）,而转染miR-BART16抑制物后,细胞增殖明显增强（P<0.05）。17在GT38和GT39细胞中转染miR-BART16模拟物及抑制物,细胞凋亡没有发生明显变化（P>0.05）;转染miR-BART16抑制物48h后,细胞周期阻滞在G2/M期,而转染模拟物后没有明显的变化。结论:1 EBV阳性胃癌的细胞系和EBVaGC组织均存在NF-κB经典信号通路的持续激活,LMP1和LMP2A的表达是该信号通路激活的重要原因。2 NF-κB信号通路的激活可促进上皮细胞间质转化相关分子及潜伏膜蛋白的表达,从而导致EBV阳性肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡。3κBα基因第一外显子在EBV阳性胃癌细胞系存在一段12bp的缺失,造成4个氨基酸的丢失。4 EBVaGC中IκBα基因的低表达不受启动子区甲基化和miR-BART16的调控。5 miR-BART16能够在mRNA及蛋白水平下调LMP1的表达,抑制miR-BART16表达能够促进细胞增殖,诱导细胞G2/M期阻滞。
刘娟娟[8]（2020）在《EBV相关胃癌中GCNT3生物学作用及调控机制的研究》文中指出背景:爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus,EBV）是一种普遍存在的γ疱疹病毒,是最常见的人类疱疹病毒之一,可感染世界90%以上的成年人,并在原发感染后建立终身潜伏感染。EBV是传染性单核细胞增多症的病原体,也是最早确认的与人类肿瘤密切相关的病毒。研究表明,EBV与多种人类恶性肿瘤密切相关,如霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌、结外NK/T细胞淋巴瘤以及免疫功能低下患者的淋巴增生性疾病。在感染细胞中,EBV多以称为附加体的质粒形式存在于宿主细胞内,不与宿主细胞基因组整合。肿瘤细胞通常表现出细胞糖基化的变化,这是常见的肿瘤标志物。O-聚糖合酶葡糖胺基（N-乙酰基）转移酶3（Glucosaminyl（N-Acetyl）Transferase 3,GCNT3）是一种粘蛋白型转移酶,负责催化核心2和核心4 O-聚糖,并促进O-联糖基化蛋白质生物合成。目前尚未见有关EBV感染与GCNT3蛋白表达关系的研究报道。目的:探讨GCNT3在EBV相关胃癌（EBV-associated gastric cancer,EBVaGC）发生发展的具体作用,明确EBVaGC发生发展中EBV对GCNT3表达的影响以及可能的作用机制,为EBVa GC病因学研究提供实验基础和新的思路。材料和方法:（1）Western blot检测EBV阳性胃癌细胞系（GT38,GT39,SNU719）和EBV阴性胃癌细胞系（BGC823,HGC27,SGC7901,AGS）中GCNT3蛋白和mTOR通路相关分子的表达,以及采用不同试剂处理后相关蛋白分子的表达;免疫组化检测胃癌组织中GCNT3蛋白表达。（2）CCK8、Transwell和流式细胞分析检测TGF-β1、mTOR通路、GCNT3和miR-BART1-5p对细胞表型的影响。（3）双荧光素酶实验检测miR-BART1-5p是否靶向GCNT3编码基因。（4）采用免疫荧光技术检测GCNT3蛋白的亚细胞定位。（5）实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR,qRT-PCR）检测EBV阳性胃癌细胞系miR-BART1-5p、LMP2A及GCNT3的转录表达。（6）采用TGF-β1、mTOR通路激活剂和抑制剂以及靶向GCNT3编码基因的siGCNT3处理胃癌细胞,检测GCNT3蛋白及EMT相关蛋白表达的变化。（7）采用LMP2A重组质粒转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,筛选稳定表达LMP2A的细胞克隆SGC7901-LMP2A;并采用靶向LMP2A编码基因的si LMP2A转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,检测外源性LMP2A表达和LMP2A沉默对GCNT3蛋白及mTOR通路相关蛋白表达的影响。结果:（1）EBV阳性胃癌细胞系中GCNT3蛋白的表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系（P<0.05）;EBV阳性胃癌细胞系中mTOR通路呈抑制状态;EBV阴性胃癌组织中GCNT3表达水平较高,其高表达与淋巴结转移呈正相关。（2）mTORC1-GCNT3激活可促进细胞增殖和迁移,并抑制G0/G1细胞周期停滞,但对细胞凋亡没有显着影响。（3）miR-BART1-5p可直接靶向GCNT3编码基因,通过下调GCNT3蛋白表达抑制细胞增殖与迁移。（4）NF-κB信号可激活miR-BART1-5p转录表达,进而抑制GCNT3蛋白表达。（5）免疫荧光结果显示EBV阳性胃癌细胞系中GCNT3蛋白的表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系,阳性信号主要定位于细胞核。（6）EBV潜伏膜蛋白LMP2A可抑制GCNT3蛋白及mTOR通路相关蛋白分子的表达,LMP2A可通过mTORC1信号通路下调GCNT3蛋白的表达。（7）TGF-β1可激活mTORC1-GCNT3通路,进而促进EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系的细胞迁移;而TGF-β1可促进EBV阴性胃癌细胞的凋亡和G0/G1细胞停滞,LMP2A可抑制TGF-β1对EBV阳性胃癌细胞凋亡的调控。结论:（1）EBV在阳性胃癌细胞系和EBVa GC组织中均下调GCNT3的表达,EBV编码的mi R-BART1-5p通过靶向GCNT3抑制细胞增殖和迁移。（2）NF-κB信号通路的激活可促进EBV阳性胃癌细胞miR-BART1-5p的转录表达,进而下调GCNT3蛋白的表达;E-cadherin,N-cadherin,波形蛋白和p-ERK可能是miR-BART1-5p/GCNT3途径的下游分子。（3）LMP2A可抑制mTORC1通路的激活,并可通过下调TGF-β1-mTORC1信号传导的作用抑制GCNT3蛋白表达。（4）激活mTORC1-GCNT3途径可促进细胞增殖和迁移并抑制G0/G1期细胞停滞。激活TGF-β1-mTORC1-GCNT3途径可通过调控下游EMT途径中相关基因的表达促进细胞迁移。
赵梦鹤[9]（2019）在《EB病毒相关胃癌中EB病毒对AXL基因表达的影响及调控机制研究》文中研究指明背景和目的:EB病毒（EBV）是疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员之一,在人群中广泛感染,与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来EB病毒相关胃癌作为一种独特的分子亚型疾病逐渐被人们所知。全球的胃癌患者之中平均有10%为EB病毒相关胃癌（EBV-associated gastric cancer,EBVa GC）,但目前对其发病机制的研究尚不明确。AXL基因编码的蛋白是受体酪氨酸激酶亚家族中的一员。AXL基因作为原癌基因,可激活众多通路,其中AXL激活PI3K/AKT途径是其信号转导过程中的重要通路之一,该通路的激活在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。本研究旨在探讨EBVa GC中EBV对AXL基因表达的影响及调控AXL基因表达的相关机制,为进一步阐明EBVa GC的发病机制提供实验依据。方法:（1）利用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）检测EBV阳性胃癌细胞系（GT38、GT39、SNU719）和EBV阴性胃癌细胞系（AGS、BGC823、SGC7901、HGC27）中AXL基因的转录表达情况。（2）Western-Blotting检测EBV阳性胃癌细胞系（GT38、GT39、SNU719）和EBV阴性胃癌细胞系（AGS、BGC823、SGC7901、HGC27）中AXL蛋白的表达情况。（3）免疫组化技术检测EBV阳性胃癌组织和EBV阴性胃癌组织中AXL蛋白的表达。（4）利用亚硫酸氢盐-基因组测序法（Bisulfite genomic sequencing,BGS）检测EBV阳性胃癌细胞系（GT39、SNU719）和EBV阴性胃癌细胞系（BGC823、SGC7901、HGC27）中AXL基因启动子区域甲基化的状态。（5）采用质粒转染方法建立潜伏膜蛋白2A（LMP2A）过表达EBV阴性胃癌细胞系SGC7901细胞模型,检测LMP2A过表达对AXL基因表达的影响。（6）利用生物信息学方法筛选出可能靶向AXL基因的EBV编码micro RNA（mi RNA）。采用q RT-PCR技术检测EBV阳性胃癌细胞系（GT39、GT38、SNU719）和EBV阴性胃癌细胞系（BGC823、SGC7901、HGC27）中三种EBV编码mi R的表达水平。分别将人工合成的mi R-BART4-3p模拟物和mi R-BART4-3p抑制物及相应的阴性对照瞬时转染至EBV阴性胃癌细胞系SGC7901和EBV阳性胃癌细胞系GT38中,利用q RT-PCR检测mi R-BART4-3p的表达水平,后利用Western-Blotting检测AXL基因的表达水平。同时利用CCK8细胞增殖与毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）、细胞划痕及流式细胞术检测上述转染细胞及相应的对照组细胞的增殖、迁移和凋亡情况。结果:（1）qRT-PCR结果显示EBV阳性胃癌细胞系中AXL基因转录表达的水平均明显低于EBV阴性胃癌细胞系（P<0.05）。（2）Western-Blotting结果显示,AXL蛋白在EBV阳性胃癌细胞系中表达较EBV阴性胃癌细胞系低（P<0.05）。（3）免疫组化结果显示,EBVa GC和EBVn GC组织中AXL蛋白表达无明显差异（P>0.05）。（4）BGS结果显示阳性胃癌细胞系与EBV阴性胃癌细胞系中AXL基因启动子区域甲基化水平无明显差异（P>0.05）。（5）EBV阴性胃癌细胞系SGC7901过表达LMP2A后,AXL基因的转录及翻译水平均下降（P<0.05,P<0.05）。（6）利用生物信息学方法选出mi R-BART4-3p、mi R-BART19-5p、mi R-BART21-3p可能为靶向AXL基因的EBV编码mi RNA。q RT-PCR结果显示mi R-BART4-3p在三种EBV阳性胃癌细胞系中均高表达。EBV阳性胃癌细胞系GT38转染mi R-BART4-3p抑制物后mi R-BART4-3p的表达水平与其相应的阴性对照组相比无明显差异（P>0.05）,EBV阴性胃癌细胞系SGC7901转染mi R-BART4-3p模拟物后mi R-BART4-3p的表达水平与其相应的阴性对照组相比明显增高（P<0.05）。EBV阳性胃癌细胞系GT38转染mi R-BART4-3p抑制物后,AXL蛋白的表达水平与其相应的阴性对照组相比明显增高（P<0.05）,EBV阴性胃癌细胞系SGC7901转染mi R-BART4-3p模拟物后,AXL蛋白的表达水平与其相应的阴性对照组相比明显降低（P<0.05）。与其相应的阴性对照组相比,EBV阳性胃癌细胞系GT38转染mi R-BART4-3p抑制物后的细胞存活能力和迁移能力均明显增加（P<0.05,P<0.05）,细胞凋亡比例明显降低（P<0.05）;与其相应的阴性对照组相比,EBV阴性胃癌细胞系SGC7901转染mi R-BART4-3p模拟物后的细胞存活能力和迁移能力均明显降低（P<0.05,P<0.05）,细胞凋亡比例明显增加（P<0.05）。结论:（1）与EBV阴性胃癌细胞系相比,EBV阳性胃癌细胞系中AXL基因的转录水平及翻译水平均较低,提示EBV可抑制AXL基因的表达。（2）EBV阳性胃癌组织中AXL蛋白的表达与EBV阴性胃癌组织相比没有明显的差异,提示AXL基因在EBV相关胃癌中的表达可能存在更复杂的调控机制。（3）EBV不诱发AXL基因启动子区域的甲基化状态发生改变,提示AXL基因的表达在EBV阳性胃癌细胞系中受抑制可能不是由启动子甲基化状态的改变所致。（4）LMP2A可抑制AXL基因的表达,提示LMP2A可能参与AXL基因表达的调控。（5）mi R-BART4-3p可抑制AXL基因的表达,且EBV阳性胃癌细胞系GT38中mi R-BART4-3p表达下调可促进细胞的增殖和迁移,抑制细胞的凋亡;而EBV阴性胃癌细胞系SCG7901中mi R-BART4-3p表达上调可抑制细胞的增殖和迁移,促进细胞的凋亡。提示mi R-BART4-3p可能参与AXL基因表达的调控,并且EBV编码mi R-BART4-3p作为抑癌因子在EBVa GC的发生发展中可能发挥一定的作用。
刘璐瑶,孙金峤,王晓川[10]（2017）在《EB病毒感染的免疫机制研究进展》文中进行了进一步梳理1 EB病毒（EBV）的生物学特点EBV,又称人类疱疹病毒4型,类似于其他疱疹病毒,EBV基因组为双链线性DNA分子,是第一个被发现与人类肿瘤有关的DNA病毒。EBV在全球范围内感染率>90%。EBV基因组具有高度的变异性,不同的变异体的致病力和分布不同。根据EBV核抗原（EBNA）,主要是EBNA2和EBNA3A、-B、-C基因序列的不同,将EBV分为1型和2型[1]。在西方和东南亚等国家EBV 1型多见,在非洲EBV两型均多见[2]。
二、Epstein-Barr病毒在人上皮细胞中的增殖和表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Epstein-Barr病毒在人上皮细胞中的增殖和表达（论文提纲范文）
（1）LMP1在鼻咽癌的增殖、转移及放疗敏感性中的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 鼻咽癌的研究进展 |
| 1.1.1 前言 |
| 1.1.2 鼻咽癌的病理 |
| 1.1.3 鼻咽癌的危险因素及病因 |
| 1.1.4 症状和诊断 |
| 1.1.5 治疗 |
| 1.1.6 总结及展望 |
| 1.2 EB病毒LMP1 在肿瘤研究中的进展 |
| 1.2.1 前言 |
| 1.2.2 EB病毒LMP1 简介 |
| 1.2.3 LMP1 的结构特点 |
| 1.2.4 LMP1 在上皮细胞中的作用 |
| 1.2.5 LMP1 在相关肿瘤中的研究进展情况 |
| 1.2.6 针均LMP1 的潜在治疗策略 |
| 1.2.7 结论 |
| 第2章 实验研究:LMP1 对鼻咽癌增殖、转移及放疗敏感性的机制研究 |
| 2.1 LMP1 诱导MIR-155 在鼻咽癌中的机制研究 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 EBV感染上调高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达促进人鼻咽癌细胞增殖 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 血浆人类疱疹病毒第四型LMP1和EBER1 与循环肿瘤细胞及鼻咽癌转移的关系 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 材料和方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 总结 |
| 第3章 结论 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 胃癌流行病学 |
| 1.2 胃癌治疗现状 |
| 1.3 LncRNA的分类与功能 |
| 1.4 LncRNA在胃癌发病中的作用 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 生物信息学鉴定CASC19与胃癌进展和预后相关 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据的来源与获取 |
| 2.1.2 差异lncRNA筛选过程 |
| 2.1.3 加权基因共表达网络构建过程 |
| 2.1.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.1.5 核心lncRNA与 GC临床性状之间的联系 |
| 2.1.6 核心lncRNA的预后分析 |
| 2.1.7 核心lncRNA的 GSEA分析 |
| 2.1.8 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者的基线资料 |
| 2.2.2 差异lncRNA筛选结果 |
| 2.2.3 加权基因共表达网络构建结果 |
| 2.2.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.2.5 CASC19与GC临床性状之间的联系 |
| 2.2.6 CASC19 过表达GC患者预后差 |
| 2.2.7 CASC19相关的信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 CASC19在人胃癌组织中的表达及临床意义 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 临床样本收集 |
| 3.1.2 纳入与排除标准 |
| 3.1.2.1 纳入标准 |
| 3.1.2.2 排除标准 |
| 3.1.3 临床病理参数 |
| 3.1.4 组织总RNA提取及质检 |
| 3.1.4.1 组织总RNA提取 |
| 3.1.4.2 组织总RNA质检 |
| 3.1.5 qRT-PCR实验 |
| 3.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 3.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 3.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 3.1.6 HE染色 |
| 3.1.6.1 石蜡包埋 |
| 3.1.6.2 切片 |
| 3.1.6.3 HE染色步骤 |
| 3.1.7 IHC实验 |
| 3.1.7.1 石蜡包埋 |
| 3.1.7.2 切片 |
| 3.1.7.3 IHC步骤 |
| 3.1.8 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 患者临床病理资料 |
| 3.2.2 CASC19在GC组织和癌旁组织中的表达 |
| 3.2.3 CASC19 表达与GC患者临床病理参数之间的关系 |
| 3.2.4 CASC19 表达与NPM1 表达之间的关系 |
| 3.2.5 CASC19在GC诊断中的意义 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 CASC19对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞培养 |
| 4.1.1.1 细胞复苏 |
| 4.1.1.2 细胞传代 |
| 4.1.1.3 细胞冻存 |
| 4.1.2 慢病毒制备 |
| 4.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 4.1.2.2 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 4.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 4.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 4.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 4.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 4.1.5 qRT-PCR实验 |
| 4.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 4.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 4.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 4.1.6 cDNA末端快速扩增实验 |
| 4.1.6.1 CASC19 PCR扩增及回收 |
| 4.1.6.2 3 ’RACE获取CASC19的3’全长 |
| 4.1.6.3 5 ’RACE获取CASC19的5’全长 |
| 4.1.7 CCK-8细胞增殖实验 |
| 4.1.8 细胞克隆形成实验 |
| 4.1.9 EdU细胞增殖实验 |
| 4.1.10 细胞划痕实验 |
| 4.1.11 Transwell迁移实验 |
| 4.1.12 Transwell侵袭实验 |
| 4.1.13 流式凋亡实验 |
| 4.1.14 蛋白质免疫印迹实验 |
| 4.1.14.1 细胞总蛋白提取 |
| 4.1.14.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 4.1.14.3 电泳 |
| 4.1.14.4 电转 |
| 4.1.14.5 显色 |
| 4.1.15 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 CASC19在GC细胞系中的表达水平 |
| 4.2.2 RACE获得CASC19在GC细胞中的全长 |
| 4.2.3 CASC19的非编码分析 |
| 4.2.4 CASC19慢病毒敲减和过表达效率检测 |
| 4.2.5 CCK-8 实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.6 克隆形成实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.7 EdU实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.8 划痕实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.9 Transwell迁移实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.10 Transwell侵袭实验检测CASC19对GC细胞侵袭的影响 |
| 4.2.11 流式细胞实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.12 WB实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.13 WB实验检测CASC19对GC细胞EMT的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 CASC19表达对胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞培养 |
| 5.1.2 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 5.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.1.5 实验分组 |
| 5.1.6 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 5.1.7 裸鼠活体成像实验 |
| 5.1.8 组织总RNA提取及质检 |
| 5.1.8.1 组织总RNA提取 |
| 5.1.8.2 组织总RNA质检 |
| 5.1.9 qRT-PCR实验 |
| 5.1.9.1 反转录合成cDNA |
| 5.1.9.2 qRT-PCR检测 |
| 5.1.9.3 qRT-PCR引物 |
| 5.1.10 移植瘤HE染色 |
| 5.1.11 移植瘤IHC实验 |
| 5.1.12 移植瘤WB实验 |
| 5.1.12.1 组织总蛋白提取 |
| 5.1.12.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 5.1.12.3 电泳 |
| 5.1.12.4 电转 |
| 5.1.12.5 显色 |
| 5.1.13 统计学方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 CASC19 在稳转MKN-45 细胞株中的表达水平 |
| 5.2.2 CASC19下调可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长 |
| 5.2.3 CASC19 下调对移植瘤HE染色的镜下改变 |
| 5.2.4 CASC19 下调对移植瘤中Ki-67 蛋白表达的影响 |
| 5.2.5 CASC19 下调对移植瘤中PCNA蛋白表达的影响 |
| 5.2.6 CASC19 下调对移植瘤中HDAC1 表达的影响 |
| 5.2.7 CASC19 下调对移植瘤中NPM1 表达的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 基于芯片技术鉴定CASC19调控的下游靶基因及信号通路 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验设计及样本的制备 |
| 6.1.1.1 细胞培养与感染 |
| 6.1.1.2 细胞总RNA提取 |
| 6.1.1.3 细胞总RNA质检 |
| 6.1.2 芯片的制备 |
| 6.1.3 芯片实验 |
| 6.1.3.1 反转录合成cDNA |
| 6.1.3.2 体外转录合成标记cRNA |
| 6.1.4 芯片的杂交 |
| 6.1.5 芯片的洗染和扫描 |
| 6.1.6 差异分析 |
| 6.1.7 IPA分析 |
| 6.1.8 qRT-PCR验证芯片结果 |
| 6.1.9 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 芯片数据的质量评估 |
| 6.2.2 差异分析结果 |
| 6.2.3 IPA分析结果 |
| 6.2.3.1 IPA的经典通路分析结果 |
| 6.2.3.2 IPA的上游调控分析结果 |
| 6.2.3.3 IPA的疾病和功能分析结果 |
| 6.2.3.4 IPA的调控效应分析结果 |
| 6.2.3.5 IPA的相互作用网络分析结果 |
| 6.2.4 qRT-PCR验证结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 CASC19 通过募集HDAC1 来抑制NPM1 表达的机制研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞培养 |
| 7.1.1.1 细胞复苏 |
| 7.1.1.2 细胞传代 |
| 7.1.1.3 细胞冻存 |
| 7.1.2 慢病毒制备 |
| 7.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.2 HDAC1 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.3 MYC shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.4 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.5 HDAC1过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.6 MYC过表达慢病毒制备 |
| 7.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 7.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 7.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 7.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 7.1.5 qRT-PCR 实验 |
| 7.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 7.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 7.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 7.1.6 核质分离实验 |
| 7.1.6.1 分离细胞核和细胞质 |
| 7.1.6.2 RNA抽提及反转录 |
| 7.1.6.3 qRT-PCR检测 |
| 7.1.7 WB 实验 |
| 7.1.7.1 细胞总蛋白提取 |
| 7.1.7.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 7.1.7.3 电泳 |
| 7.1.7.4 电转 |
| 7.1.7.5 显色 |
| 7.1.8 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.8.2 制备生物素标记的RNA |
| 7.1.8.3 标记RNA探针 |
| 7.1.8.4 进行 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.5 蛋白质谱鉴定 |
| 7.1.9 RNA 纯化染色质分离实验 |
| 7.1.9.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.9.2 超声处理 |
| 7.1.9.3 进行 Ch IRP 实验 |
| 7.1.9.4 DNA分离鉴定 |
| 7.1.9.5 蛋白质分离鉴定 |
| 7.1.10 RNA 结合蛋白免疫沉淀实验 |
| 7.1.10.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.10.2 准备磁珠 |
| 7.1.10.3 RNA结合蛋白免疫沉淀 |
| 7.1.10.4 RNA纯化 |
| 7.1.10.5 qRT-PCR检测 |
| 7.1.11 染色质免疫共沉淀实验 |
| 7.1.11.1 细胞交联 |
| 7.1.11.2 染色质片段化 |
| 7.1.11.3 DNA纯化 |
| 7.1.11.4 免疫沉淀 |
| 7.1.11.5 解交联 |
| 7.1.11.6 qPCR或者测序 |
| 7.1.12 双荧光素酶报告基因实验 |
| 7.1.13 统计学分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 CASC19的亚细胞定位 |
| 7.2.2 RNA pull-down实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质 |
| 7.2.3 ChIRP实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质和基因 |
| 7.2.4 CatRAPID验证CASC19与HDAC1 蛋白相互作用 |
| 7.2.5 WB检测RNA pull-down富集蛋白中HDAC1 的表达 |
| 7.2.6 RIP实验证明CASC19 可以结合HDAC1 蛋白 |
| 7.2.7 HDAC1 的表达不受CASC19 的调控 |
| 7.2.8 ChIP-seq实验检测与HDAC1 相互作用的基因 |
| 7.2.9 CASC19 下调抑制HDAC1与NPM1 启动子的结合 |
| 7.2.10 NPM1 的表达受HDAC1 的调控 |
| 7.2.11 CASC19 通过募集HDAC1 抑制NPM1 的表达 |
| 7.2.12 CASC19上游的调控转录因子预测 |
| 7.2.13 CASC19 的表达受MYC的调控 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 全文结论 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 综述 染色体8q24.21 区域的lncRNA在癌症中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）CXCR4在EBV相关胃癌中的表达和调控作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 常用试剂配制 |
| 1.2 细胞系及胃癌组织标本的选择 |
| 1.2.1 细胞系的选择 |
| 1.2.2 胃癌组织标本的选择 |
| 1.3 细胞处理 |
| 1.3.1 实验前准备 |
| 1.3.2 细胞复苏 |
| 1.3.3 培养液的更换 |
| 1.3.4 细胞传代 |
| 1.4 CXCR4 及相关基因m RNA检测 |
| 1.4.1 细胞系RNA提取 |
| 1.4.2 cDNA合成 |
| 1.4.3 实时荧光定量PCR(Real-time qPCR) |
| 1.4.4 microRNA逆转录 |
| 1.4.5 microRNA表达水平检测 |
| 1.4.6 Real-time qPCR结果数据分析 |
| 1.5 CXCR4及相关蛋白检测 |
| 1.5.1 细胞系总蛋白的提取 |
| 1.5.2 蛋白浓度的测量 |
| 1.5.3 Western blott 检测细胞系中蛋白的表达 |
| 1.5.4 PI3K通路抑制剂LY294002作用后检测蛋白表达变化 |
| 1.5.5 免疫组织化学染色(SP法)检测胃癌组织中CXCR4 蛋白的表达 |
| 1.5.6 免疫荧光检测胃癌细胞中蛋白亚定位 |
| 1.6 CXCR4甲基化状态检测 |
| 1.6.1 细胞系DNA提取 |
| 1.6.2 DNA样本的焦亚硫酸盐修饰 |
| 1.6.3 亚硫酸盐基因组测序 |
| 1.7 细胞转染 |
| 1.7.1 LMP1 和 LMP2A 过表达细胞模型的建立 |
| 1.7.2 siRNA转染 |
| 1.8 细胞生物学表型实验的检测 |
| 1.8.1 细胞凋亡实验 |
| 1.8.2 细胞周期实验检测 |
| 1.9 细胞自噬的检测 |
| 1.9.1 透射电镜检测自噬体的形成 |
| 1.9.2 共聚焦显微镜检测自噬体的形成 |
| 1.10 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 2.1 GSE51575 数据集中CXCR4 的转录表达 |
| 2.2 胃癌细胞系中CXCR4及相关基因的转录表达 |
| 2.3 胃癌细胞系及组织中 CXCR4 蛋白表达 |
| 2.4 CXCR4 启动子和第 1 外显子甲基化状态检测结果 |
| 2.5 LMP1对CXCR4 表达的调控作用 |
| 2.6 EBV相关胃癌细胞中microRNA-146a的转录表达 |
| 2.7 microRNA-146a潜在靶基因的预测 |
| 2.8 microRNA-146a对 CXCR4 表达的调控作用 |
| 2.9 AGS 和 AGS-EBV 细胞系中 PI3K/AKT 表达 |
| 2.10 LY294002 通路抑制剂作用后CXCR4 蛋白表达变化 |
| 2.11 LMP2A对 CXCR4 表达的调控作用 |
| 2.12 CXCR4蛋白对细胞自噬的调控作用 |
| 2.13 CXCR4对细胞凋亡和周期的影响 |
| 2.14 CXCR4 和自噬在EBV潜伏期的作用 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录或缩略词表 |
| 致谢 |
（4）EB病毒对MUS81基因表达调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 常用液体的配制 |
| 1.2 细胞培养 |
| 1.2.1 实验前准备 |
| 1.2.2 细胞复苏 |
| 1.2.3 培养液更换 |
| 1.2.4 细胞传代 |
| 1.2.5 去甲基化药物处理细胞 |
| 1.3 基因甲基化状态检测 |
| 1.3.1 NA的提取 |
| 1.3.2 NA样本的重亚硫酸盐处理 |
| 1.3.3 甲基化特异性PCR(BGS) |
| 1.4 MUS81 及相关基因mRNA检测 |
| 1.4.1 RNA的提取 |
| 1.4.2 去g NA处理 |
| 1.4.3 逆转录合成c NA |
| 1.4.4 实时荧光定量PCR |
| 1.5 MUS81 及相关基因蛋白检测 |
| 1.5.1 蛋白质的提取 |
| 1.5.2 蛋白质浓度的测定 |
| 1.5.3 Western blot检测目的基因的表达 |
| 1.5.4 免疫组化实验检测MUS81 蛋白表达 |
| 1.6 细胞学实验 |
| 1.6.1 siRNA靶向沉默 |
| 1.6.2 细胞凋亡实验 |
| 1.6.3 细胞周期实验 |
| 结果 |
| 2.1 实时荧光定量PCR检测MUS81 及其相关基因的转录表达 |
| 2.2 Western blot检测MUS81和EME2 蛋白表达 |
| 2.3 外源性LMP1、LMP2A和 EBER对 MUS81 表达的影响 |
| 2.4 MUS81启动子区甲基化状态检测结果 |
| 2.5 去甲基化药物处理对 MUS81 基因转录的影响 |
| 2.6 去甲基化药物处理对 MUS81 蛋白表达的变化 |
| 2.7 LMP1 对 MUS81 转录表达的影响 |
| 2.8 MUS81和EME2 基因对细胞周期和细胞凋亡的影响 |
| 2.8.1 检测siMUS81和siEME2 的沉默效率 |
| 2.8.2 MUS81和EME2 表达沉默对SGC7901 细胞系细胞周期和凋亡的影响 |
| 2.9 胃癌组织中MUS81 蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（5）EBV相关胃癌中Smad2功能及调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 常用试剂配制 |
| 1.2 细胞系及胃癌组织标本的选择 |
| 1.3 细胞处理 |
| 1.3.1 实验前准备 |
| 1.3.2 细胞复苏 |
| 1.3.3 培养液的更换 |
| 1.3.4 细胞传代 |
| 1.4 Smad2及miR-155-5p mRNA检测 |
| 1.4.1 细胞系RNA提取 |
| 1.4.2 cDNA合成 |
| 1.4.3 实时荧光定量PCR(Real-time qPCR) |
| 1.4.4 micro RNA逆转录 |
| 1.4.5 miRNAs表达水平检测 |
| 1.4.6 Real-time qPCR结果数据分析 |
| 1.5 Smad2及相关蛋白检测 |
| 1.5.1 细胞系总蛋白的提取及浓度测量 |
| 1.5.2 Western blotting检测相关蛋白的表达 |
| 1.5.3 通路抑制剂作用后检测蛋白表达变化 |
| 1.6 免疫荧光检测胃癌细胞中蛋白亚定位 |
| 1.7 细胞生物学表型实验的检测 |
| 1.7.1 细胞增殖实验(CCK-8) |
| 1.7.2 细胞凋亡实验 |
| 1.7.3 细胞周期实验检测 |
| 1.8 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 2.1 EBV阳性胃癌细胞系中miR-155 的表达 |
| 2.2 EBV阳性胃癌细胞系中miR-155-5p的生物信息学分析以及细胞学功能 |
| 2.3 EBV阳性胃癌细胞系中miR-155-5p对 Smad2 的表达情况的调控 |
| 2.4 外源性LMP2A表达对miR-155-5p和 Smad2 表达的影响 |
| 2.5 抑制NF-κB通路对miR-155-5p和 Smad2 表达的影响 |
| 2.6 PI3K/AKT,mTOR通路以及泛素化对Smad2 相关蛋白表达的影响 |
| 2.7 Smad2对肿瘤细胞生物学行为的作用 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录或缩略词表 |
| 致谢 |
（6）致瘤性γ疱疹病毒裂解复制相关宿主蛋白的筛选：PTK7促进病毒释放（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 移植后淋巴增殖性疾病 |
| 1.2 致瘤性γ疱疹病毒 |
| 1.3 鼠γ疱疹病毒68 |
| 1.4 本课题研究方向和主要内容 |
| 2 第一部分 高通量筛选调控鼠疱疹病毒68裂解性复制的宿主蛋白 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞和病毒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要器材 |
| 2.2.4 主要溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 病毒滴度测定 |
| 2.3.3 病毒扩增 |
| 2.3.4 病毒浓缩(超速离心法) |
| 2.3.5 质粒转染 |
| 2.3.6 细胞激酶和细胞转录因子的cDNA文库高通量筛选 |
| 2.3.7 GO(Gene Ontology)功能和KEGG通路富集分析 |
| 2.3.8 蛋白质相互作用网络构建 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 调控MHV-68裂解性复制的细胞激酶和细胞转录因子的筛选 |
| 2.4.2 调控因子的PPI网络构建和分析 |
| 2.4.3 细胞内调控因子两两共表达对MHV-68裂解性复制的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 3 第二部分 细胞激酶PTK7的调控机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞、病毒和细菌 |
| 3.2.2 质粒 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要溶液配制 |
| 3.2.5 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞RNA提取纯化 |
| 3.3.2 逆转录定量PCR |
| 3.3.3 细胞DNA提取纯化 |
| 3.3.4 qPCR检测病毒基因组DNA拷贝数 |
| 3.3.5 免疫印迹试验(Western Blot) |
| 3.3.6 shRNA慢病毒载体构建 |
| 3.3.7 统计学方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 PTK7对MHV-68裂解性复制的促进作用呈剂量依赖性 |
| 3.4.2 PTK7不影响MHV-68裂解性基因转录和表达,也不影响DNA复制 |
| 3.4.3 PTK7促进MHV-68病毒释放至胞外 |
| 3.4.4 PTK7促进HSV-1病毒释放至胞外 |
| 3.5 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Epstein-Barr病毒感染相关实体器官移植后淋巴增殖性疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（7）EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 NF-κB经典信号通路在EBV相关胃癌中持续激活的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 胃癌细胞系及组织标本的选择 |
| 2.1 细胞系选择 |
| 2.2 胃癌组织标本选择 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 实验前准备 |
| 3.2 细胞复苏 |
| 3.3 培养液的更换 |
| 3.4 细胞传代 |
| 4 NFKBIA基因启动子区甲基化状态检测 |
| 4.1 细胞系DNA的提取 |
| 4.2 DNA样本焦亚硫酸盐修饰 |
| 4.3 亚硫酸盐基因组测序 |
| 5 NFKBIA及相关基因mRNA检测 |
| 5.1 细胞系RNA提取 |
| 5.2 新鲜组织标本RNA的提取 |
| 5.3 cDNA的合成 |
| 5.4 实时荧光定量PCR |
| 5.5 qRT-PCR结果数据分析 |
| 6 IκBα及相关蛋白检测 |
| 6.1 细胞系总蛋白的提取及浓度测量 |
| 6.2 Western blot检测细胞系蛋白表达情况 |
| 6.3 免疫荧光技术检测胃癌细胞系中蛋白亚定位 |
| 6.4 石蜡切片免疫组织化学染色(SP法)检测胃癌组织中蛋白的表达 |
| 6.5 免疫组织化学染色结果分析 |
| 6.6 通路抑制剂作用后检测蛋白表达及核定位变化 |
| 7 细胞增殖能力检测(CCK8 试剂盒) |
| 8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 9 LMP1和LMP2A过表达细胞系的建立 |
| 9.1 载体构建 |
| 9.2 菌液培养 |
| 9.3 质粒提取 |
| 9.4 重组质粒pcDNA3.1-LMP1和pcDNA3.1-LMP2A 转染胃癌细胞系SGC7901细胞 |
| 10 siRNA及 miRNA转染 |
| 11 双荧光素酶报告基因检测 |
| 11.1 h-NFKBIA载体构建 |
| 11.2 细胞转染操作步骤 |
| 11.3 检测实验操作步骤 |
| 12 细胞核蛋白与浆蛋白提取 |
| 13 NF-κB p65 转录因子试剂盒p65-DNA结合能力检测 |
| 14 EBV-DNA拷贝数相对及绝对定量 |
| 14.1 EBV DNA相对拷贝数检测 |
| 14.2 EBV DNA绝对拷贝数检测 |
| 15 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 1 qRT-PCR检测胃癌细胞系中NF-κB经典信号通路相关基因的转录表达 |
| 2 胃癌细胞系中NFKBIA(IκBα)及相关基因的蛋白表达 |
| 3 胃癌细胞系TRAF1/2/3/6 蛋白表达 |
| 4 NFKBIA甲基化状态检测结果 |
| 5 p65 蛋白在胃癌细胞系中的亚定位 |
| 6 ELISA检测胃癌细胞系NF-κB转录因子活性 |
| 7 IκBα及相关基因在胃癌组织中的表达 |
| 8 NF-κB经典信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖、凋亡的影响 |
| 8.1 抑制NF-κB信号通路对胃癌细胞增殖的影响 |
| 8.2 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC凋亡的影响 |
| 9 抑制NF-κB信号通路对ZEB1 表达的影响 |
| 9.1 EBV阳性和阴性胃癌细胞系细胞系ZEB1的表达 |
| 9.2 BAY11-7082对ZEB1 表达的影响 |
| 10 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A的影响 |
| 11 胃癌细胞系NFKBIA基因变异检测 |
| 12 EBV编码的miRNA-BART16对IκBα表达的影响 |
| 13 LMP1对NF-κB信号通路的调控作用 |
| 14 LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 15 稳定转染LMP1及LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 16 干扰TRAF1对NF-κB信号通路的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EBV编码miR-BART16 通过靶定LMP1调节肿瘤细胞增殖 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 细胞培养 |
| 3 RNA的提取 |
| 4 miRNA的实时荧光定量检测 |
| 5 细胞增殖能力检测 |
| 6 细胞周期检测 |
| 6.1 碘化丙啶染色分析 |
| 6.2 溴脱氧尿苷(BrdU)细胞周期检测 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 EBVaGC细胞系及胃癌组织中miRNA-BART16与LMP1 的相对表达量 |
| 2 miRNA-BART16 能够调控LMP1 的表达 |
| 3 miR-BART16 对细胞增殖的影响 |
| 4 miRNA-BART16 对细胞凋亡的影响 |
| 5 miR-BART16 对细胞周期的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（8）EBV相关胃癌中GCNT3生物学作用及调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 MiR-BART1-5p 通过靶向 GCNT3 在 EBV 相关胃癌发生发展中的作用 |
| 材料与方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 常用试剂配制 |
| 1.2 胃癌细胞系及组织标本的选择 |
| 1.2.1 细胞系的选择 |
| 1.2.2 胃癌组织标本的选择 |
| 1.3 细胞处理 |
| 1.3.1 实验前准备 |
| 1.3.2 细胞复苏 |
| 1.3.3 培养液的更换 |
| 1.3.4 细胞传代 |
| 1.4 萤光素酶报告基因检测 |
| 1.4.1 细胞铺板 |
| 1.4.2 mi R-BART1-5P 与 GCNT3 质粒转染 |
| 1.4.3 双荧光素酶报告基因检测 |
| 1.5 GCNT3 及相关基因m RNA检测 |
| 1.5.1 细胞系RNA提取 |
| 1.5.2 cDNA合成 |
| 1.5.3 实时荧光定量 PCR(q RT-PCR) |
| 1.5.4 micro RNA逆转录 |
| 1.5.5 mi RNAs 表达水平的检测 |
| 1.5.6 qRT-PCR 结果分析 |
| 1.6 EBV 阳性和 EBV 阴性胃癌细胞中蛋白表达的检测 |
| 1.6.1 总蛋白的提取及浓度测定 |
| 1.6.2 细胞系中蛋白表达的检测 |
| 1.7 免疫组织化学染色(SP法)检测胃癌组织中GCNT3 蛋白的表达 |
| 1.7.1 免疫组化实验步骤 |
| 1.7.2 免疫组织化学染色结果分析 |
| 1.8 细胞生物学表型的检测 |
| 1.8.1 细胞增殖检测 |
| 1.8.2 细胞迁移检测 |
| 1.8.3 细胞凋亡检测 |
| 1.9 mi R-BART1-5p 的表达和转染及小干扰 RNA 转染 |
| 1.9.1 EBV 阳性胃癌细胞系中 mi R-BART1-5p 转录水平的检测 |
| 1.9.2 mi R-BART1-5p 转染及 si RNA 转染 |
| 1.9.3 转染效果的检测 |
| 1.10 核蛋白的提取和NF-κBp65转录活性的检测 |
| 1.11 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 2.1 胃癌细胞系中 GCNT3 蛋白的表达 |
| 2.2 胃癌组织中 GCNT3 蛋白表达 |
| 2.3 GCNT3对肿瘤细胞生物学行为的影响 |
| 2.4 Mi R-BART1-5p 通过直接靶向 GCNT3 参与 EBVa GC 进程 |
| 2.5 mi R-BART1-5p 可抑制 GCNT3 的表达、细胞增殖和迁移 |
| 2.5.1 mi R-BART1-5p 对 GCNT3 表达的调控 |
| 2.5.2 Mi R-BART1-5p对细胞生物学表型的影响 |
| 2.6 mi R-BART1-5p 抑制剂促进 GCNT3 表达、细胞增殖和迁移 |
| 2.6.1 抑制 mi R-BART1-5p 对 GCNT3 表达的影响 |
| 2.6.2 抑制 mi R-BART1-5p 转录对细胞生物学表型的影响 |
| 2.7 NF-κB信号激活mi R-BART1-5p表达 |
| 2.8 NF-κB 信号抑制 GCNT3 的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 EBV 潜伏膜蛋白 LMP2A 下调 GCNT3 蛋白表达机制的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 细胞系的选择 |
| 1.3 细胞处理 |
| 1.4 免疫荧光检测 GCNT3 蛋白亚定位 |
| 1.5 LMP2A及相关基因m RNA检测 |
| 1.5.1 细胞系RNA提取 |
| 1.5.2 cDNA合成 |
| 1.5.3 实时荧光定量 PCR(q RT-PCR) |
| 1.5.4 Real-time q PCR结果数据分析 |
| 1.6 GCNT3及相关蛋白检测 |
| 1.7 建立 LMP2A 过表达细胞模型 |
| 1.8 细胞生物学表型的检测 |
| 1.8.1 细胞增殖实验(CCK-8) |
| 1.8.2 细胞凋亡检测 |
| 1.8.3 细胞迁移检测 |
| 1.8.4 细胞周期检测 |
| 1.9 小干扰RNA转染 |
| 1.10 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 2.1 胃癌细胞系中 GCNT3 蛋白定位 |
| 2.2 LMP2A对 GCNT3 蛋白表达的影响 |
| 2.3 LMP2A对m TORC1 信号通路的影响 |
| 2.4 LMP2A 通过 m TORC1 信号通路下调 GCNT3 的表达 |
| 2.5 GCNT3 对肿瘤细胞表型的影响及 mTORC1 途径的增强作用 |
| 2.6 mTORC1途径对肿瘤细胞生物学行为的影响 |
| 2.7 TGF-β1对m TORC1-GCNT3 通路的作用及对细胞迁移的影响 |
| 2.8 TGF-β1对胃癌细胞凋亡和细胞周期的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录或缩略词表 |
| 致谢 |
（9）EB病毒相关胃癌中EB病毒对AXL基因表达的影响及调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 2 细胞系及胃癌组织标本的选择 |
| 2.1 细胞系的选择 |
| 2.2 胃癌组织标本的选择 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 实验前准备 |
| 3.2 细胞复苏 |
| 3.3 细胞传代 |
| 4 AXL基因mRNA检测 |
| 4.1 EBV 阴性和阳性胃癌细胞系 RNA 的提取 |
| 4.2 cDNA合成 |
| 4.3 实时荧光定量PCR |
| 4.4 qRT-PCR结果数据分析 |
| 5 EBV阴性和阳性胃癌细胞系中AXL蛋白的表达 |
| 5.1 EBV阴性和阳性胃癌细胞系总蛋白的提取及浓度测量 |
| 5.2 EBV阴性和阳性胃癌细胞系AXL蛋白水平的检测 |
| 6 EBV阴性和阳性胃癌组织中AXL蛋白的表达 |
| 6.1 EBV阴性和阳性胃癌组织中AXL蛋白的表达 |
| 6.2 免疫组织化学染色结果分析 |
| 7 AXL甲基化状态检测 |
| 7.1 EBV阴性和阳性细胞系DNA的提取 |
| 7.2 DNA样本焦亚硫酸盐修饰 |
| 7.3 亚硫酸氢盐基因组测序 |
| 8 LMP2A过表达细胞模型建立 |
| 9 miR-BART4-3p转染及表型检测 |
| 9.1 EBV阳性胃癌细胞系中三种EBV编码miR表达量的检测 |
| 9.2 miR-BART4-3p转染 |
| 9.3 miR-BART4-3p转染效果的检测 |
| 9.4 细胞增殖检测 |
| 9.5 细胞凋亡检测 |
| 9.6 细胞迁移检测 |
| 10 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 1 EBV阴性和EBV阳性胃癌细胞系AXL基因的转录表达 |
| 2 EBV阴性和EBV阳性胃癌细胞系中AXL基因的翻译表达 |
| 3 EBV阴性和EBV阳性胃癌组织中AXL蛋白的表达情况 |
| 4 AXL基因启动子区域甲基化状态 |
| 5 EBV潜伏期基因LMP2A对 AXL的影响 |
| 5.1 EBV潜伏期基因LMP2A过表达SGC7901 细胞模型的建立 |
| 5.2 外源性LMP2A过表达对AXL的影响 |
| 6 miR-BART4-3p对 AXL及胃癌细胞系的影响 |
| 6.1 EBV阳性胃癌细胞系中三种EBV编码miR的表达情况 |
| 6.2 转染效果检测 |
| 6.3 miR-BART4-3p对细胞活性的影响 |
| 6.4 miR-BART4-3p对细胞凋亡的影响 |
| 6.5 miR-BART4-3p对细胞迁移的影响 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（10）EB病毒感染的免疫机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 EB病毒 (EBV) 的生物学特点 |
| 1.1 初始感染阶段 |
| 1.2 潜伏感染阶段 |
| 1.3 再活化阶段 |
| 2 EBV感染的临床类型 |
| 2.1 无症状EBV感染 |
| 2.2 传染性单核细胞增多症 (IM) |
| 2.3 CAEBV |
| 2.3.1 CAEBV的发生机制 |
| 2.3.2 CAEBV诊断标准的进展 |
| 2.3.3 CAEBV的治疗 |
| 2.4 重症致死性EBV感染 |
| 2.4.1 HLH |
| 2.4.2 肝功能衰竭 |
| 3 机体抵御EBV感染的免疫反应 |
| 3.1 T细胞 |
| 3.1.1 CD8+T细胞 |
| 3.1.2 CD4+T细胞 |
| 3.2 B细胞 |
| 3.2.1 抗体的产生 |
| 3.2.2 B细胞的转化 |
| 3.3 树突状细胞 (DCs) |
| 3.5 固有免疫 |
| 4 EBV逃逸机体免疫防御的机制 |
| 4.1 抑制固有免疫应答 |
| 4.1.1 抑制TLR信号通路 |
| 4.1.2 抑制NF-κB信号通路 |
| 4.2 干扰细胞免疫应答 |
| 4.2.1 BGLF5的干扰 |
| 4.2.2 BNLF2a抑制抗原肽的转运 |
| 4.2.3 BILF1影响MHC-Ⅰ的表达 |
| 4.3 干扰细胞因子的作用 |
| 4.4 EBERs |
| 4.5 micro RNA |
| 4.5.1 miRNAs的产生 |
| 4.5.2 miRNAs维持EBV的潜伏感染 |
| 4.5.3 miRNAs抑制凋亡 |
| 5 EBV感染相关免疫缺陷病 |
| 5.1 仅易感EBV的免疫缺陷 |
| 5.1.1 SH2D1A缺陷 |
| 5.1.2 XLAP缺陷 |
| 5.1.3 ITK缺陷 |
| 5.1.4 CD27缺陷 |
| 5.1.5 MAGT1缺陷 |
| 5.1.6 LRBA缺陷 |
| 5.2 除易感EB病毒外, 还易感其他病原的免疫缺陷 |
| 5.2.1 PI3K信号通路缺陷 |
| 5.2.1.1 PIK3CD缺陷 |
| 5.2.1.2 PIK3R1缺陷 |
| 5.2.2 CTPS1缺陷 |
| 5.2.3 STK4缺陷 |
| 5.2.4 GATA2缺陷 |
| 5.2.5 MCM4缺陷 |
| 5.2.6 FCγR3A缺陷 |
| 5.2.7 CARD11缺陷 |
| 5.2.8 CORO1A缺陷 |
| 5.3 与EB病毒感染后发生HLH相关的免疫缺陷 |
| 5.3.1 PRF1缺陷 |
| 5.3.2 UNC13D缺陷 |
| 5.3.3 STX11缺陷 |
| 5.3.4 STXBP缺陷 |
四、Epstein-Barr病毒在人上皮细胞中的增殖和表达（论文参考文献）
- [1]LMP1在鼻咽癌的增殖、转移及放疗敏感性中的机制研究[D]. 孙乐. 吉林大学, 2020(08)
- [2]长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究[D]. 汪文杰. 兰州大学, 2020(01)
- [3]CXCR4在EBV相关胃癌中的表达和调控作用研究[D]. 王维文. 青岛大学, 2020(01)
- [4]EB病毒对MUS81基因表达调控机制的研究[D]. 吴硕. 青岛大学, 2019(03)
- [5]EBV相关胃癌中Smad2功能及调控机制的研究[D]. 石茜竹. 青岛大学, 2020(01)
- [6]致瘤性γ疱疹病毒裂解复制相关宿主蛋白的筛选：PTK7促进病毒释放[D]. 马玺. 浙江大学, 2020(01)
- [7]EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究[D]. 张岩. 青岛大学, 2019(07)
- [8]EBV相关胃癌中GCNT3生物学作用及调控机制的研究[D]. 刘娟娟. 青岛大学, 2020(01)
- [9]EB病毒相关胃癌中EB病毒对AXL基因表达的影响及调控机制研究[D]. 赵梦鹤. 青岛大学, 2019(03)
- [10]EB病毒感染的免疫机制研究进展[J]. 刘璐瑶,孙金峤,王晓川. 中国循证儿科杂志, 2017(03)