一、实验感染肝片吸虫的水牛体液免疫反应的研究（论文文献综述）
孙益春[1]（2021）在《基于GAPDH、Catl-1两种重组蛋白的绵羊肝片吸虫病间接ELISA和胶体金试纸条诊断方法的建立》文中指出
刘少雄[2]（2021）在《绵羊肝片吸虫感染间接ELISA及胶体金检测方法的建立及初步应用》文中研究说明肝片吸虫是一种重要的人畜共患寄生虫,对畜牧业,尤其是养羊业,会造成重大的经济损失。肝片吸虫感染人后可导致贫血和黄疸等症状,对人类的健康造成严重的威胁。肝片吸虫的检测是防治该病的前提和重点,目前用于检测肝片吸虫感染的方法主要有病原学检测方法、分子生物学检测方法和免疫学检测方法等。其中免疫学检测方法作为常用的方法之一,因其具有稳定性好、敏感性高和特异性强等优点而被广泛使用。其原理为抗原与抗体可发生特异性结合,故可用已知抗原（或抗体）检测未知抗体（或抗原）,以达到检测的目的。目前虽然已经有了用于检测肝片吸虫的特异性基因,如半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶L和谷胱甘肽S转移酶等,但相对来说用于检测的候选基因仍较少。本研究通过对肝片吸虫成虫c DNA表达文库的筛选,继续发掘新的肝片吸虫候选检测抗原基因,然后以该基因抗原建立间接ELISA和胶体金检测方法,对绵羊肝片吸虫感染的临床样品进行初步应用来评价所筛选抗原的检测实用价值,以期为检测肝片吸虫感染提供新的候选抗原和技术支撑。肝片吸虫候选检测抗原基因筛选及表达纯化利用绵羊肝片吸虫自然感染的阳性血清从肝片吸虫成虫c DNA表达文库筛选具有检测潜力的抗原基因。结果成功获取了肝片吸虫候选检测抗原基因12个,其中,2个为已报道的检测抗原基因,10个为新发现的可用于肝片吸虫感染检测研究的候选抗原基因。本研究选取新发现基因中的肝片吸虫变形虫样蛋白（Fasciola hepatica amoebapore-like protein,Gen Bank:AYA57790.1,以下简称FHA5蛋白）基因进行原核表达,并纯化获得重组肝片吸虫变形虫样蛋白。肝片吸虫感染间接ELISA检测方法的建立及初步应用以肝片吸虫FHA5蛋白为检测抗原,建立肝片吸虫感染间接ELISA检测方法。经条件优化,该方法抗原最佳包被量为0.187μg/孔;样品最佳稀释倍数为800倍;最佳封闭剂选择5%脱脂奶粉;HRP标记兔抗羊二抗最佳稀释浓度为1:5000;底物最佳反应时间为20 min。该方法敏感性可达到1:12800,经检测与绵羊双腔吸虫阳性血清无交叉反应,该方法表现出较高的特异性。分别用粪便检查法和本研究建立的ELISA方法对吉林省某地区的36例绵羊粪便和血清进行检测,结果发现粪便检查法检出的阳性样品为24份,阳性率为66.7%（24/36）;ELISA方法检出的阳性样品为26份,阳性率为72.2%（26/36）,两种检测方法的符合率为92%,间接ELISA方法的检出率更高,说明该方法具有更高的敏感性。随后应用该方法和商品化试剂盒分别检测黑龙江省某地区临床绵羊血清样品80份,结果发现这两种方法检出的阳性样品均为39份,阳性率均为48.7%（39/80）。本研究建立的间接ELISA方法和商品化试剂盒的检测结果一致,说明本方法所用的肝片吸虫FHA5蛋白具有成为检测抗原的潜力。肝片吸虫感染胶体金层析试纸条检测方法的建立及初步应用以肝片吸虫FHA5蛋白作为抗原,建立胶体金层析试纸条检测方法。经条件优化,最佳p H值为加入2μL 0.2 mol/L K2CO3时的p H值;SPA蛋白最佳标记量为6μg;检测线（T）最佳包被浓度为0.5 mg/m L;质控线（C）最佳包被浓度为0.25 mg/m L;该方法敏感性可达到1:160;经检测与绵羊双腔吸虫阳性血清无交叉反应,说明制备的胶体金试纸条具有较高的敏感性和特异性;经重复性试验和保存期试验发现,该试纸条在4℃、室温和37℃条件下的保存期分别为90、60和60天,表明该方法重复性和稳定性较好。应用建立的肝片吸虫感染胶体金层析试纸条检测方法对黑龙江省某地区80份临床绵羊血清样品进行检测,发现肝片吸虫感染阳性样品39份,感染阳性率为48.7%（39/80）。胶体金层析试纸条对80份临床样品的检测结果均与本研究建立的间接ELISA方法的结果相符,说明本研究建立的肝片吸虫感染胶体金层析试纸条同样具有较高的敏感性和稳定性,适用于现场使用。综上所述,本研究通过筛选肝片吸虫成虫c DNA表达文库,获得候选检测抗原基因变形虫样蛋白FHA5基因,以该抗原建立的用于检测绵羊肝片吸虫感染的间接ELISA检测方法和胶体金层析试纸条检测方法在初步检测临床样品时表现出较好的特异性和较高的敏感性,为我国肝片吸虫感染的检测和防控提供了一种新的候选检测抗原。
盛兆安[3]（2020）在《大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究》文中提出背景:片形吸虫病主要是由片形属的肝片吸虫和大片吸虫感染所致的人畜共患寄生虫病,对公共卫生安全造成严重威胁。片形吸虫在感染宿主的过程中会不断产生可溶性的分子及胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）调控宿主免疫微环境,在宿主体内建立持续感染。脊椎动物的胃肠道内共生微生物在维持免疫系统的发育和功能的同时,对宿主的营养和能量代谢平衡亦起着至关重要的作用。目前已经有大量的研究显示寄生虫与宿主肠道菌群具复杂的相互作用关系,本研究通过描绘大片形吸虫感染后对宿主肠道菌群与免疫相关分子相互关系,对宿主-寄生虫-肠道菌群的复杂关系深入探讨,为实验室研究转化临床应用奠定基础。方法:（1）通过大片吸虫囊蚴感染水牛、BALB/C小鼠,大片吸虫成虫ESP、15k EVs、100k EVs腹腔注射小鼠;（2）对涉及与寄生虫免疫相关的Th1型和Th2型免疫细胞因子、转录因子和Toll样受体,血清中特异性抗体等免疫学指标进行检测,初步推测大片吸虫感染所诱导的宿主免疫反应类型;（3）收集实验动物的肠道内容物,经Illumina Hi Seq测序平台进行16S r RNA测序分析,评价大片吸虫感染对肠道菌群构成和功能的影响;（4）使用差速离心的方法,对大片吸虫产生的两种不同形态的胞外囊泡15,000×g（15k EVs）和100,000×g（100k EVs）进行分离鉴定,使用shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行分析;（5）将免疫学指标与肠道菌群数据进行相关性分析,推断大片形吸虫感染与宿主肠道菌群的相互作用机制。结果:发现宿主对大片吸虫的易感性与Th2型免疫反应密切相关,大片吸虫感染早期诱导Th1/2混合型的免疫反应,慢性感染阶段则转为典型的Th2型免疫反应。血清中特异性的IgG和IgG1的抗体水平随感染进程呈上升趋势。表明大片吸虫感染所诱导的Th2型相关的细胞因子和IgG1可能是其在自然宿主水牛体内成功建立感染的关键。同时小鼠模型发现激活的ERK通路和抑制经典的TLRs-IKB-NF-κB（p65）通路,参与了大片吸虫诱导的Th2型免疫反应。依据不同离心力,成功分离鉴定了两种不同形态的胞外囊泡15k EVs和100k EVs,并经shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行鉴定,发现其中含有多种与免疫调控、诊断、疫苗候选分子相关的蛋白;体内实验发现ESP、15k EVs、100k EVs均可诱导小鼠Th2/Treg型免疫反应,并通过上调T细胞共抑制分子CLAT-4和PD-1,限制Th1型免疫的发展。水牛感染大片吸虫可显着降低水牛肠道菌群的α-多样性,肠道菌群的构成在不同胃肠道部位的结果差异较大。RDA/CCA分析在科水平上Peptostreptococcaceae和Family＿XIII与高水平的IgG1和IL4相关。F.gigantica感染显着减少水牛结肠中产短链脂肪酸（short-chain fatty acid,SCFAs）菌群Lachnospiraceae＿NK3A20＿group、Alistipes的丰度,降低结肠SCFAs浓度,大片吸虫感染小鼠同样观察到可减少结肠中产SCFAs的uncultured＿bacterium＿Lachnospiraceae丰度,提示Th2型免疫反应与下调菌群产生SCFAs相关。大片吸虫感染与成虫ESP、15k EVs、100k EVs注射均可降低小鼠结肠内容物菌群的α-多样性的,RDA/CCA分析Bacteroidetes和Proteobacteria与Th2和Treg型细胞因子具较强的相关性,而Bacteroidaceae和Cyanobacteria可能参与了大片吸虫感染引起的宿主纤维化的进程。结论:大片吸虫感染可通过调控宿主的肠道菌群的结构与菌群代谢产物影响宿主的免疫应答,促进其在宿主体内存活。对大片吸虫-宿主-肠道菌群作用关系的深入了解有助于我们更好的防控片形吸虫病提供参考。
吴丽佳[4]（2020）在《肝片形吸虫不同发育阶段虫体的蛋白质组学比较分析及胶体金试纸条研制》文中研究指明肝片形吸虫（Fasciola hepatica）主要寄生于牛、羊等反刍动物的肝脏和肝胆管内,引起的一种吸虫病称为肝片形吸虫病,肝片形吸虫病是一种人畜共患寄生虫病,该病在全球内广泛流行,每年因片形吸虫感染造成的经济损失超过30亿美元[1]。所以早期诊断变得尤为重要。本研究对肝片形吸虫囊蚴、童虫、幼虫和成虫四个主要发育阶段运用Label-free定量蛋白质组学进行分析,四个时期共鉴定到107501条肽段,2406个蛋白。采用Max Quant软件对蛋白质组学数据进行非标记定量计算,对定量结果进行显着性差异分析,发现囊蚴与其他三个时期虫体之间存在的差异蛋白数量显着低于其他三组之间存在的差异蛋白数,且童虫与成虫之间的差异蛋白数量最多。经过韦恩图、火山图和聚类分析图分析得到的结果与Label free算法的结果相符。对差异蛋白进行GO和KEGG分析,GO结果显示在生物学进程中参与蛋白质折叠过程的蛋白质最多;在细胞组分中,富集于细胞的蛋白质最多;在分子功能中,蛋白质主要参与蛋白结合功能。KEGG结果显示差异蛋白主要参与新陈代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、组织系统和其他这六个方面。经过对差异蛋白数据的筛选分析,将差异蛋白分为有明显趋势的50组,其中42、49、48、12、45、47组蛋白趋势较好,Profile42组主要为钙结合蛋白、硫氧还蛋白-谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、谷胱甘肽转移酶和甘油-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。Profile 49组主要为热休克蛋白90、热休克蛋白70、肌动蛋白。Profile 48组Ca2+不敏感的EF hand、醛脱氢酶家族蛋白。Profile 12组为Ras家族蛋白、钙调素样蛋白1、肌动蛋白、钙调素样蛋白3。Profile 45为分泌组织蛋白酶L1、脂肪酸结合蛋白III、蛋白质二硫化物异构酶、钙网蛋白家族蛋白、肌球蛋白尾。Profile 47组为肌球蛋白、原肌球调节蛋白、肌球蛋白调节轻链。我选取了Profile 42组的谷胱甘肽转移酶和Profile 45组的脂肪酸结合蛋白III,作为早期诊断抗原,其中谷胱甘肽转移酶为本实验室研制并保存。脂肪酸结合蛋白III经Uni Prot查询基因序列,成功构建原核表达载体PET-30a-FhFABⅢ,片段大小399bp,蛋白大小为16k Da,经Western bloting检测,肝片形吸虫抗体能够特异性识别重组表达蛋白,用重组Fh GST和FhFABⅢ蛋白纯化后作为诊断抗原,建立间接ELISA方法并优化其条件,检测结果显示FhFABⅢ重组抗原包被浓度每孔为9.275ng;血清稀释度为1:12800;FhFABⅢ重组抗原最佳孵育时间为4℃包被过夜;最佳封闭液选5%脱脂乳;最佳二抗孵育时间为60min;最佳底物作用时间为15 min。Fh GST重组抗原包被浓度为每孔为37.5ng;血清稀释度为1:12800;Fh GST重组抗原最佳孵育时间为37℃2h包被;最佳封闭液选10%脱脂乳,最佳二抗孵育时间为30min,最佳底物作用时间为15 min。在敏感性试验中,FhFABⅢ和Fh GST最早检出肝片形吸虫感染天数均为21d;在特异性实验中,肝片形吸虫FhFABⅢ和Fh GST重组抗原与华枝睾吸虫、日本血吸虫和捻转血矛线虫均无交叉反应;对不同生产批号的酶标板进行板间和板内的重复性实验,两种重复性实验结果显示变异系数均小于10%。临床检测样本95份,结果显示FhFABⅢ的阳性检出率为16.84%（16/95）,Fh GST的阳性检出率为12.63%（12/95）。用纯化好的FhFABⅢ和Fh GST重组蛋白免疫新西兰大白兔（1mg/kg）,每间隔两周免疫一次,当抗体效价达到105以上,便可心脏采血,采用Protrin A亲和层析法纯化多抗。采用柠檬酸三钠还原法制备了20nm大小的胶体金颗粒用来标记纯化后的兔多抗。FhFABⅢ最佳多抗标记量为5.07μg/m L,最适p H值为7.5;Fh GST最佳多抗标记量为10.15μg/m L,最适p H值为8.0。差速低温纯化金标抗体,FhFABⅢ多抗标记纯化后的胶体金颗粒作1:1稀释,Fh GST兔多抗标记纯化后的胶体金颗粒作1:4稀释,分别浸泡玻璃纤维。用FhFABⅢ和Fh GST抗原在硝酸纤维素膜上划检测线（T线）,最适划线浓度均为0.8mg/m L。对两种试纸条分别进行了敏感性、重复性、特异性实验。结果显示:两种胶体金试纸条检出最早感染肝片形吸虫的时间均为21d;FhFABⅢ检测最低稀释倍数为1:60,Fh GST检测最低稀释倍数为1:80;不同批次试纸条重复检测,结果无明显差异;两种试纸条均不与华枝睾吸虫、捻转血矛线虫和日本血吸虫发生反应,表明两种试纸条的敏感性、重复性和特异性良好。两种试纸条检测临床样本95份,Fh GST试纸条检测出11份阳性血清,阳性率为11.58%（11/95）,与ELISA方法的符合率为91.67%,FhFABⅢ试纸条检测出14份阳性血清,阳性率为14.71%（14/95）,与ELISA方法的符合率为87.5%。该结果表明,制备的基于FhFABⅢ和Fh GST蛋白多克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条能够初步检测临床样本,可用于肝片形吸虫的诊断。
贾骁晔[5]（2020）在《肝片吸虫病诊断候选抗原的筛选和制备》文中认为肝片吸虫病是由肝片吸虫（Fascioloa hepatica,F.hepatica）寄生于人和家畜肝脏、胆管,引起肝炎、胆管炎以及全身性营养障碍的一种新兴人畜共患寄生虫病。该病严重影响了全球畜牧业的发展,也造成了极其严重的公共卫生问题,吸引了全世界的广泛关注。为了丰富和拓展肝片吸虫病的诊断靶点,突破肝片吸虫病原学诊断方法的局限性,研究更加经济、快速、特异、敏感的肝片吸虫感染病的诊断方法,本研究通过肝片吸虫噬菌体展示cDNA文库的筛选、肝片吸虫特异性抗原分子的生物信息学分析、相应抗原基因的克隆、重组质粒的构建以及重组蛋白的诱导表达与Western Blot鉴定分析等研究方法和技术对肝片吸虫病的诊断候选抗原进行了筛选和制备。结果如下:（1）通过对肝片吸虫噬菌体展示cDNA文库的筛选和分析,成功获得了38条肝片吸虫基因,包括24条为已明确的肝片吸虫蛋白基因,14条为肝片吸虫假定蛋白基因。并从中筛选了5个肝片吸虫特异性抗原基因作为肝片吸虫病诊断候选抗原用于后续探索研究:组织蛋白酶L（Cathepsin L,Cat）、假定蛋白D915000758、假定蛋白D915001617、假定蛋白D915005900以及假定蛋白D915010969。（2）对5个候选抗原分子进行了基本的生物信息学分析,并成功预测了这些抗原分子的蛋白质空间结构。组织蛋白酶L具有完整的开放阅读框,编码区序列长981 bp,编码326个氨基酸;该蛋白为稳定的亲水性蛋白,其多肽链和主链骨架盘绕折叠形成了包含103个的α-螺旋、65个延伸链、22个β-转角和136个无规则卷曲的构象。假定蛋白D915000758开放阅读框完整,编码区序列长345bp,编码114个氨基酸;是一种稳定的亲水性蛋白,其空间构象包含58个的α-螺旋、7个延伸链、7个β-转角和42个无规则卷曲。假定蛋白D915001617开放阅读框完整,编码区序列长798 bp,编码265个氨基酸;为不稳定的疏水性蛋白,其空间构象包含159个的α-螺旋、40个延伸链、14个β-转角和52个无规则卷曲。假定蛋白D915005900开放阅读框完整,编码区序列长345 bp,编码114个氨基酸;为不稳定的亲水性蛋白,其空间构象包含11个的α-螺旋、27个延伸链、4个β-转角和72个无规则卷曲。假定蛋白D915010969开放阅读框完整,编码区序列长147 bp,编码48个氨基酸;该蛋白为稳定的亲水性蛋白,其空间构象包含17个的α-螺旋、9个延伸链、6个β-转角和16个无规则卷曲。（3）通过PCR克隆了诊断候选抗原基因片段,并成功连接表达载体pET-32a,转化至BL21（DE3）感受态细胞。（4）通过IPTG成功诱导重组蛋白进行原核表达。SDS-PAGE表明重组蛋白pET-Cat L、pET-000758、pET-001617、pET-005900和pET-010969在37℃被诱导6 h后,均以包涵体形式进行表达,蛋白分子量大小分别为:55 kDa、32 kDa、50 kDa、32 kDa和25 kDa。Western-Blot证明这5种重组蛋白都可以被肝片吸虫阳性血清特异性识别,具有良好的免疫反应性。综上所述,得出以下结论:肝片吸虫组织蛋白酶L、假定蛋白D915000758、假定蛋白D915001617、假定蛋白D915005900以及假定蛋白D915010969具有良好的免疫反应性,可成为潜在的肝片吸虫病诊断候选抗原靶点,应用于肝吸虫病的诊断研究中。
侯林静[6]（2019）在《大片形吸虫诊断抗原的制备及诊断方法的建立与优化》文中认为本研究目的是从大片形吸虫分泌排泄产物（Fasciola gigantila Excretory-Secretory Products,FgESP）凝胶过滤层析组分及其鉴定蛋白成分中筛选出大片形吸虫病早期诊断抗原并建立诊断方法,为大片形吸虫病的诊治及开发早期诊断试剂盒奠定基础。本研究通过制备成虫FgESP,进行凝胶过滤层析,从中收集第一个波峰及其附近层析组分,依次命名为F1、F2、F3、……Fn等。以不同层析组分作为抗原,筛选出检测效果较优层析组分。同时将效果较好层析组分进行质谱分析,选取有潜在诊断价值的3个候选抗原进行原核表达。以较优层析组分作为诊断抗原与标准阳性和标准阴性水牛血清反应,建立并优化间接ELISA方法;分别将3个重组蛋白及其混合蛋白作为诊断抗原与标准阳性和标准阴性水牛血清及感染大片形吸虫4周小鼠血清反应,进行间接ELISA方法优化。应用优化好的ELISA方法检测0～14周水牛血清以及广西部分地区700份奶牛血清Ig G抗体水平,比较Fg ESP与较优层析组分作为诊断抗原的结果。本研究筛选检测效果较好层析组分为F21、F22与F23。将效果较好的层析组分进行质谱分析,结果含有硫氧还蛋白过氧化物酶1（Thioredoxin Peroxidase-1,TPx-1）、组织蛋白酶 B3（Cathepsin B3,Cat B3）和组织蛋白酶L1（Cathepsin L1,Cat L1）、热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）和微管蛋白（Tubulin proteins）等潜在诊断价值的候选抗原。筛选出TPx-1、Cat B3和Cat L1作为诊断候选抗原,进行原核表达。FgTPx-1表达形式为可溶性蛋白和包涵体两种,FgCat B3和FgCat IL1表达形式均为包涵体。FgTPx-1、FgCat B3和FgCat L1重组蛋白分子量分别为46 kDa、40 kDa和39 kDa。效果较优的层析组分F22作诊断抗原的最优条件是包被浓度为0.157 μg/mL,水牛血清稀释倍数为1:400,二抗稀释倍数为1:40000,阴阳临界值为0.391。F22层析组分最优浓度为常用FgESP抗原用量（2.5 μg/mL）的1/16。通过间接ELISA优化结果显示FgTPx-1和FgCat B3单个蛋白对水牛阴阳性血清反应P/N值较小。FgTPx-1和FgCat B3浓度为1.25 μg/mL,小鼠血清稀释倍数为1:100时P/N值较大。FgCat L1用水牛血清和小鼠血清优化时,均在抗原浓度为0.157 μg/mL,血清比例为1:100时P/N值较大。混合蛋白浓度为0.313μg/mL,水牛血清比例为1:100时P/N值较大,混合蛋白浓度为1.25 μg/mL,小鼠血清比例为1:100时P/N值较大。混合蛋白与FgCat L1在0～14周实验感染水牛血清检测时,实验组OD450nm值整体呈上升趋势,混合蛋白阴阳性差值在1～8周检测时略低于FgCat L1。将FgESP、F22、FgCat IL1与混合蛋白进行间接ELISA诊断比较,用实验感染水牛第4周血清优化,F22层析组分在血清稀释比为1:400,P/N值最大,其次为FgESP。用水牛标准血清优化,4个诊断抗原P/N值均较大。用实验感染小鼠4周血清优化,F22层析组分在血清稀释比为1:400时,P/N值最大,4个诊断抗原阴阳性差异均较大。FgESP与小鼠血清灵敏性略低于其他蛋白,其中FgCat L1与混合蛋白作为诊断抗原时,阴阳性差异大,但两者P/N值较接近。F22检测水牛0～14周血清抗体水平结果为从第2周抗体水平明显开始升高,快速升至4周后呈平缓上升趋势,FgESP检测结果为从第2周抗体水平明显升高,抗体水平呈平缓上升趋势。抗F22-IgG水平均明显高于抗FgESP-IgG水平。FgESP和F22层析组分检测0～14周水牛血清的准确率为100%。普查广西部分地区700份奶牛血清,F22的阳性检出率为50.43%,FgESP的阳性检出率为45.29%。F22建立的间接ELISA方法效果较好。本研究发现有效层析组分主要集中于第一个峰、获得检测效果较优层析组分F22并建立了以层析组分F22为诊断抗原的间接ELISA方法。本研究原核表达的FgTPx-]、FgCat L1和FgCat B3三种重组蛋白,可为进行进一步功能研究奠定基础。FgESP、F22和FgCat L1与混合蛋白对大片形吸虫病的诊断结果表明,F22、FgCat L1诊断效果较好,混合蛋白无明显优势,其中F22可进行水牛大片形吸虫病较早期诊断,为开发大片形吸虫病早期诊断试剂盒奠定基础。
陆珂静[7]（2018）在《大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体表达影响的研究》文中进行了进一步梳理Toll样受体（TLRs）参与病原相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）,是固有免疫防御机制的第一道防线。寄生虫通过影响TLRs的表达和功能实现对宿主免疫应答的逃避或调控,研究大片形吸虫（Fasciolagigantica）及其分泌排泄产物（FgESP）对宿主或宿主免疫细胞TLR信号通路的作用,有助于揭示大片形吸虫早期感染固有免疫机制。本试验用大片形吸虫囊蚴人工感染BALB/c和C57BL/6两个品系实验小鼠不同天数后,ELISA检测小鼠血清抗体水平的动态变化,RT-qPCR检测肝组织TLR1～9和炎症因子的转录水平变化。结果表明大片形吸虫感染两种品系小鼠能引起不同类型的肝脏局部免疫应答,BALB/c以Th1/Th2混合应答为主,C57BL/6以Th1免疫应答为主。大片形吸虫感染两种品系小鼠后均能引起肝脏TLR1～9转录水平的动态变化,TLR1、TLR6、TLR7、TLR8均显着上调表达（P<0.05）,其中TLR6最早发生上调,可能与脂肽类分子的特异性识别相关。两种小鼠处于Th1/Th2混合免疫应答时TLR1均显着上调,表明其可能起重要作用。用自然活性的FgESP（nFgESP）腹腔注射BALB/c和C57BL/6小鼠不同天数后,RT-qPCR检测小鼠肝脏TLR1～9和炎症因子的转录水平变化。结果表明nFgESP腹腔注射两种品系小鼠所致肝脏局部免疫类型倾向存在差异（BALB/c小鼠倾向于Th2,C57BL/6小鼠倾向于Th1型）;FgESP能诱导TLR1、TLR2、TLR8的上调表达。用自然活性FgESP和热灭活的FgESP（hiFgESP）体外刺激小鼠RAW264.7传代巨噬细胞,RT-qPCR测定细胞TLR1～9和炎症因子的转录水平变化。结果表明nFgESP和hiFgESP刺激RAW264.7细胞均能引起 TLR1、TLR7、TLR8 的显着上调（P<0.05）和 TLR2、TLR3、TLR9的显着下调（P<0.05）,可能与FgESP中非活性酶类物质相关;TLR4、TLR6在FgESP热灭活后无明显变化,可能与FgESP中活性酶类物质相关。综合比较FgESP体内、外刺激和大片形吸虫囊蚴人工感染小鼠后TLR1～9转录水平的变化,发现TLR1、TLR8基因水平均显着上调,推测TLR1、TLR8在大片形吸虫可能通过分泌FgESP调控宿主免疫应答的过程中可能发挥重要作用。本研究结果及讨论基于TLRs和细胞因子转录水平的变化,还需从蛋白水平进一步验证。对推测可能存在重要作用的TLR及其特异性蠕虫来源的配体进行筛查,深入研究宿主抗片形吸虫固有免疫机制,将为探索疫苗候选物和药物靶点提供理论依据,有助于更好的预防和控制片形吸虫病。
李雪[8]（2018）在《大片吸虫两种CD59样蛋白的生物信息分析及体外重组表达》文中提出片形吸虫体被的表面富含糖蛋白。这些体被的蛋白与宿主组织和体液直接接触,是寄生虫与宿主发生生化反应,身体的免疫反应和生理反应的位置,对片形吸虫的宿主免疫机制与免疫逃避等有重要作用。研究片形吸虫的体被蛋白对片形吸虫的免疫预防、治疗以及疫苗的研究有着重要的作用。本实验通过PCR扩增与序列测序获得了大片吸虫CD59-1与CD59-2蛋白基因序列。FgCD59-1蛋白大小为122个氨基酸残基,FgCD59-2蛋白大小为127氨基酸残基。两个蛋白皆N端有一个信号肽片段,C端有一个GPI锚定片段,序列内皆有一个LY6/CD59的保守结构域“CCXXXXCN”。通过序列相似性比对分析发现,大片吸虫的FgCD59-1、FgCD59-2蛋白序列与肝片吸虫的FhCD59-1、FhCD59-2蛋白序列的相似性非常高。对大片吸虫CD59-1蛋白6个克隆测序分析和大片吸虫CD59-2蛋白3个克隆测序分析证实了 FgCD59-1和FgCD59-2蛋白多态性不高。将大片吸虫FgCD59-1、FgCD59-2蛋白序列与肝片吸虫的FhCD59-1、FhCD59-2蛋白,以及其他43种蛋白构建系统进化树,发现FgCD59-1与肝片吸虫 CD59 样蛋白 FhCD59-1、FhCD59-4、FhCD59-5、FhCD59-6、FhCD59-7、FhCD59-8属于同一个分群。而FgCD59-2与FhCD59-2属于同一个分群。通过应用SWISS-MODEL、modeller等一系列的生物信息学软件,对FgCD59-1和FgCD59-2蛋白的一级结构、二级结构和三级结构、跨膜区域、亚细胞定位进行了预测和分析,并预测构建了较为准确的FgCD59-1和FgCD59-2蛋白的同源模型。根据FgCD59-1和FgCD59-2基因的序列设计出两对带有酶切位点的特异性引物,从大片吸虫虫体提取大片吸虫的RNA,并通过RT-PCR扩增出目的片段。克隆测序验证后,克隆载体进行重组克隆。鉴定序列正确后双酶切出粘性未端,并将其连接到表达载体pET-32a中,成功构建出带有Trx标签与 6His 标签的表达质粒 pET-32a-FgCD59-1 和 pET-32a-FgCD59-2。将鉴定正确的重组质粒转化到表达细菌BL21中,通过IPTG诱导蛋白表达,优化表达菌、表达温度、诱导表达IPTG浓度等表达条件,之后大量获得融合蛋白包涵体。将包涵体变性复性之后,获得蛋白序列不变的可溶性蛋白,并使用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物。结果证明确实得到了FgCD59-1融合蛋白和FgCD59-2融合蛋白。本研究获得并分析了FgCD59-1、FgCD59-2两个蛋白基因,预测分析了蛋白结构并构建了两个同源模型。成功构建了 2个蛋白基因的表达载体,并获得2个目的融合蛋白。为进一步研究两种蛋白的结构性质,以及其在大片吸虫免疫过程中的作用奠定了基础。
施维[9]（2018）在《片形吸虫及其分泌排泄产物对巨噬细胞极化和宿主细胞免疫应答作用的研究》文中研究说明片形吸虫的两个致病种大片形吸虫和肝片形吸虫均能感染人和哺乳动物引起片形吸虫病,不同宿主的易感性不同,这与片形吸虫对宿主免疫应答的调控或逃避有关。肝片形吸虫及其ESP已被证实能诱导小鼠和牛巨噬细胞的M2型极化,而大片形吸虫在宿主中能否引起相似的免疫反应尚无明确的结论。本研究旨在通过体内外试验探讨大片形吸虫及其ESP在不同宿主引起的巨噬细胞极化和固有免疫反应的差异及其免疫机制,并将淋巴插管模型应用于片形吸虫ESP对宿主免疫细胞的作用研究,以探明片形吸虫及其ESP对宿主免疫应答的调控机制,为理解大片形吸虫与宿主免疫系统的相互作用提供可靠的理论基础。本研究取得以下成果:1.用大片形吸虫囊蚴感染水牛、昆明小鼠（KM）和C57BL/6Nju小鼠（B6）,分别于水牛感染后4周、10周、14周和小鼠感染后3周、4周、7或8周处死。通过肝组织切片观察到水牛和小鼠肝脏均能从炎症浸润向结缔组织增生转归,水牛感染14周可见肝内肉芽组织和成虫形成。实时荧光定量PCR检测肝脏枯否细胞（巨噬细胞）分子标志和细胞因子mRNA表达量,并用ELISA检测血清IFN-γ和IL-4,结果显示:随着感染病程的加剧水牛枯否细胞表型从M2型极化向M1、M2型共上调的趋势转变,KM小鼠枯否细胞表型则由前期的M1+M2混合型向M0型转归,而B6小鼠则表现为更明显的M2型极化。结果表明:大片形吸虫感染水牛和小鼠可诱导肝脏KC表型和细胞因子的表达变化存在较大宿主差异,这些变化的宿主差异是与不同宿主肝脏的载虫能力、损伤修复能力、病变程度以及虫体在宿主体内移行、发育密切相关的。2.用大片形吸虫分泌排泄产物200μg FgESP腹腔注射KM小鼠和B6小鼠,4天、7天隔日注射作为短期试验组,14周每周注射作为长期试验组,注射PBS为对照。通过肝组织切片观察到FgESP腹腔短期注射不会引起小鼠肝脏明显的组织学变化,而长期注射会导致细胞膜通透性增加、结缔组织增生和纤维化趋势。实时荧光定量PCR检测肝脏枯否细胞（巨噬细胞）分子标志和细胞因子mRNA表达量,结果显示:KM小鼠短期注射FgESP会引起肝组织iNOSmRNA表达下调,但B6小鼠CD206、Arg-2、YM-1的表达上调,两种小鼠枯否细胞均表现出M2型极化优势;两种小鼠长期注射FgESP则引起完全不同的KCs表型趋势,其中KM小鼠表现为M1和M2型同时上调的混合型,B6则表现为M1和M2均没变化的M0型。3.用200 gg/mL大片形吸虫分泌排泄产物FgESP体外刺激水牛原代BLMΦ和B6小鼠来源的传代iPMΦ（野生型）两类MΦ48小时。实时荧光定量PCR测定两类巨噬细胞表面分子标志和细胞因子mRNA表达量,化学法测定细胞Arg-1,Griess法测定细胞上清NO浓度,ELISA测定上清IFN-γ、IL-4浓度,结果显示:水牛BLMΦCD68基因表达下调、Arg-2基因表达上调,Arg-1、NO的合成增加,上清中的IFN-γ浓度下降、IL-4没有明显变化,提示可能存在M2型极化和细胞激活的抑制或凋亡的发生;小鼠野生型iPMΦArg-1合成增加,上清中的IL-4浓度显着升高,而IFN-γ、NO浓度没有变化,也提示M2型极化。结果表明:FgESP体外刺激不同宿主MΦ均能诱导M2型极化。4.用2000μg/mL FgESP分别体外刺激B6小鼠来源的基因敲除iPMΦ（MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-、TLR-2/4-/-）,测定上清NO、IFN-γ、IL-4浓度和细胞裂解物的Arg-1含量,并与野生型iPMΦ进行比较,结果显示:MyD88的缺失导致IL-4的分泌与对照组无差异,而MyD88、TRIF同时缺失导致IL-4的分泌减少,两者均低于野生型iPMΦ;无论是MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-还是TLR-2/4-/-iPMΦ,FgESP体外刺激诱导的Arg-1产量均与对照组无差异。结果表明:FgESP体外刺激小鼠传代巨噬细胞能诱导依赖于MyD88及其相关通路的M2型激活,促进Th2型细胞因子分泌,促进Arg-1合成和NO分泌抑制,而TRIF和TLR2、TLR4也有可能以某种方式发挥作用。5.通过外科手术成功构建绵羊的股骨前伪输入淋巴插管、肝脏输入淋,巴插管,成功率分别为约70%和33%左右。6.将200μg荧光标记的肝片形吸虫分泌排泄产物FhESP于绵羊股骨前区域多点皮下注射（OVA设为对照抗原）,并通过股骨前伪输入淋巴插管收集0～7天不同时间点的淋巴液并分离免疫细胞,流式细胞术分析免疫细胞种类和抗原吞噬细胞的比例,荧光实时定量PCR测定巨噬细胞表面分子标志mRNA表达量,ELISA测定淋巴液的IFN-γ和IL-4,结果显示:FhESP注射刺激能使股骨前输入淋巴中的中性粒细胞、单核细胞的比例分别在注射后4～8小时和8～12小时特异性升高,淋巴细胞的比例在注射后4～8小时特异性降低,DCs的比例在注射后4～8小时升高但与OVA对照抗原相比缺乏统计学差异,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞样细胞的比例在各时间点无明显改变;抗原吞噬细胞的数量在注射后4～12h的短暂提高,其中,嗜酸性粒细胞、单核细胞和树突状细胞对FhESP的早期吞噬具有特异性,但DCs的两个亚群的比例变化不具抗原特异性;FhESP刺激能导致淋巴液分离到的细胞M2型分子标志CD206、Arg-2和YM-1的表达均在刺激后24小时内特异性上调,淋巴液IL-4在0～8h特异性升高,IFN-γ、IL-10、IL-12的含量没有特异性变化。结果表明:绵羊股骨前伪输入淋巴插管操作简单,成功率高,适用于免疫反应动力学试验,通过该模型我们发现FhESP能在绵羊体内促进单核细胞和中性粒细胞的快速招募,提高吞噬细胞抗原吞噬能力,特异性诱导巨噬细胞M2型极化和Th2细胞因子分泌。综上所述,本文认为大片形吸虫感染导致肝脏枯否细胞表型极化趋势和细胞免疫应答趋势存在较大的宿主差异,主要取决于宿主肝脏的载虫能力、损伤修复能力和病变进程。大片形吸虫分泌排泄产物FgESP则能在体、内外诱导动物宿主巨噬细胞依赖于MyD88信号通路的M2型极化,并刺激分泌Th2型细胞因子,通过上调Arg-1抑制NO分泌降低巨噬细胞清除病原的能力,可能是大片形吸虫逃避巨噬细胞免疫杀伤的策略。此外,在绵羊身上成功构建并应用伪输入淋巴插管模型研究肝片形吸虫分泌排泄产物FhESP对宿主免疫细胞的作用,发现FhESP具有早期招募中性粒细胞和单核细胞、提高吞噬细胞早期抗原吞噬、诱导M2型巨噬细胞和Th2型细胞免疫的能力。
岳东梅[10]（2017）在《大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析》文中提出片形吸虫不仅感染牛羊等反刍动物,而且也可感染人体,严重威胁着人和动物的健康。因此,建立高效准确的诊断方法是防控该病的研究重点。片形吸虫包括肝片形吸虫、大片形吸虫及其中间型,目前对于大片形吸虫及其中间型的相关研究相对较少。因此,本研究选择大片形吸虫为研究对象,通过对大片形吸虫排泄分泌（ES）抗原与宿主的互作,旨在筛选、鉴定及分析出具有诊断潜力的蛋白,为建立大片形吸虫的诊断方法奠定基础。本研究分为三部分。第一部分,对大片形吸虫的鉴定。首先,将采自广西南宁的144条片形吸虫虫体进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。形态学鉴定这144条虫体均为片形吸虫。对这144条虫体的核糖体第二内转录间隔区（ITS-2）序列进行了扩增、测序,结果表明144个PCR样品的测序结果区别于肝片形吸虫及中间型,而均与大片形吸虫ITS-2序列（GenBank accession AJ557569）匹配率达99.7%,从而判定分离得到的144条片形吸虫均为大片形吸虫,不含中间型。第二部分,大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选。首先,利用体外培养方法收集大片形吸虫虫卵,对虫卵进行体外培养孵出毛蚴感染淡水螺,使其在淡水螺体内生长发育,直至尾蚴逸出螺体脱尾形成囊蚴,收集形成的囊蚴（感染虫卵后35 d）,并进一步用囊蚴经口感染水牛（约500个囊蚴/头）,在水牛感染后的14 d、42 d、70 d、98 d,分别采血制备血清。其次,利用体外培养方法分别收集大片形吸虫ES抗原,将收集的ES抗原免疫家兔制备阳性血清,用间接ELISA方法检测其抗体效价,结果表明ES抗原制备的阳性血清效价可达到1:1 000,说明大片形吸虫ES抗原的免疫原性较好,可用于后续的试验。然后,将大片形吸虫ES抗原分别与水牛各时间段的血清互作,通过免疫共沉淀和LC-MS/MS（质谱）试验,共获得了465个非冗余蛋白。进一步用BlastP同源性比对、UniProt鉴定,找到57个已知蛋白,分别在42 d、70 d和98 d的蛋白有13（22.8%）个、5（8.8%）个和7（12.3%）个,同时存在于42 d和70 d、70 d和98 d、42 d和98 d的可被鉴定的蛋白分别有8（14%）个、5（8.8%）、1（1.8%）个,同时存在于42 d、70 d和98 d可被鉴定的蛋白有18（31.6%）个。进一步用生物信息学分析,预测α-微管蛋白和亮氨酸氨肽酶等蛋白具有诊断价值。第三部分,对筛选出的具有代表性的α-微管蛋白和亮氨酸氨肽酶进行克隆、原核表达,并探索其作为片形吸虫病诊断抗原的可行性。结果表明,成功克隆了片段长为1 356 bp、能编码452个氨基酸、理论分子量为48.99 kDa的α-微管蛋白基因和片段长为1 572 bp、能编码523个氨基酸、理论分子量为56.38 kDa的亮氨酸氨肽酶基因。这两个蛋白的二级结构预测都以无规卷曲为主,抗原表位在整个序列均有分布。三级结构的主要功能区域都在N端。将α-微管蛋白基因插入载体pGEX-6P-1（+）,亮氨酸氨肽酶基因插入载体pET-30a分别进行原核表达。发现经IPTG诱导表达的重组蛋白pGEX-6P-1（+）-FgAT分子量约为76 kDa（含载体携带的26 kDa的GST标签）,且以融合蛋白形式表达,经Glutathione-Sepharose beads纯化后,获得了较高纯度的重组蛋白pGEX-6P-1（+）-FgAT;经IPTG诱导表达的重组蛋白pET-30a-FgLAP分子量约为56 kDa,以包涵体形式表达,经Ni-NTA His bind Resin纯化后获得较高纯度的重组蛋白pET-30a-FgLAP。这两个重组蛋白分别与大片吸虫ES抗原免疫家兔后制备的阳性血清、水牛感染大片吸虫不同期的阳性血清反应,经Western Blot分析证实均具有免疫反应性。本研究通过以上三个部分的试验,成功鉴定出大片形吸虫ES抗原中与宿主互作的蛋白,包括465个非冗余蛋白。利用生物信息学分析,筛选出57个已知蛋白,并进一步鉴定出具有代表性的α-微管蛋白基因和亮氨酸氨肽酶基因。通过对这两个基因的克隆、表达及免疫反应性分析,推断出它们在大片形吸虫病诊断中具有很大的潜力。
二、实验感染肝片吸虫的水牛体液免疫反应的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、实验感染肝片吸虫的水牛体液免疫反应的研究（论文提纲范文）
（2）绵羊肝片吸虫感染间接ELISA及胶体金检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 肝片吸虫感染检测方法的研究进展 |
| 1 临床症状和病原学检测 |
| 2 分子生物学检测方法 |
| 3 免疫学检测方法 |
| 4 放射学检测方法 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 绵羊肝片吸虫感染候选检测抗原基因筛选及表达纯化 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 绵羊肝片吸虫感染间接ELISA检测方法的建立与初步应用 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 绵羊肝片吸虫感染胶体金层析试纸条检测方法的建立与初步应用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（3）大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病的研究概述 |
| 1.1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行现状 |
| 1.1.3 片形吸虫病的防控现况 |
| 1.2 片形吸虫与宿主的相互作用机制 |
| 1.2.1 片形吸虫的生活史 |
| 1.2.2 片形吸虫宿主适应性 |
| 1.2.3 宿主抗片形吸虫感染的机制 |
| 1.2.4 宿主的免疫应答与片形吸虫感染的互作关系 |
| 1.2.5 片形吸虫的免疫逃避策略 |
| 1.3 蠕虫感染与肠道菌群之间相互作用研究进展 |
| 1.3.1 蠕虫感染对微生物丰富度和多样性的影响 |
| 1.3.2 蠕虫感染对宿主代谢的影响 |
| 1.3.3 蠕虫与肠道菌群相互作用关系的假设 |
| 1.3.4 蠕虫-微生物相互作用关系的应用 |
| 1.3.5 片形吸虫与肠道菌群的可能机制 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 大片吸虫感染对水牛宿主免疫微环境的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂、耗材 |
| 2.2.3 主要设备、仪器 |
| 2.2.4 试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验动物感染及取材 |
| 2.3.2 RNA的分离及反转录 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR检测(RT-q PCR) |
| 2.3.4 血清抗体检测 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 水牛感染大片吸虫肝门淋巴结免疫学指标变化 |
| 2.4.2 水牛感染大片吸虫脾脏免疫学指标变化 |
| 2.4.3 水牛感染大片吸虫血清中抗大片吸虫ESP特异性抗体检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 大片吸虫胞外囊泡的分离鉴定与蛋白质组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 3.2.3 主要的仪器设备 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.3 .实验方法 |
| 3.3.1 大片吸虫ESP和 EVs的收集 |
| 3.3.2 蛋白浓度定量分析 |
| 3.3.3 电镜观察 |
| 3.3.4 粒径检测 |
| 3.3.5 Western blot鉴定胞外囊泡所含蛋白质 |
| 3.3.6 Shotgun鉴定100k胞外囊泡中蛋白 |
| 3.3.7 小鼠免疫与感染 |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 大片吸虫成虫ESP、EVs的分泌特征 |
| 3.4.2 大片吸虫成虫15k EVs、100k EVs鉴定 |
| 3.4.3 虫体回收 |
| 3.4.4 肝脏病理损伤评分 |
| 3.4.5 血清中ALT、AST的变化 |
| 3.4.6 血清中特异性抗体的变化 |
| 3.4.7 大片吸虫成虫100k EVS的蛋白组整体分析 |
| 3.4.8 大片吸虫成虫100k EVS鉴定的蛋白分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠T细胞分化相关TLR-ERK通路的初探 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物及材料 |
| 4.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 4.2.3 主要的实验仪器、设备 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠囊蚴感染分组 |
| 4.3.2 小鼠腹腔注射分组 |
| 4.3.3 样品收集 |
| 4.3.4 RT-q PCR检测 |
| 4.3.5 抗体ELISA检测 |
| 4.3.6 动物病理组织切片的制备 |
| 4.3.7 组织匀浆的制备 |
| 4.3.8 细胞因子ELISA检测 |
| 4.3.9 Western blot检测 |
| 4.3.10 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 小鼠感染大片吸虫囊蚴结果 |
| 4.4.2 大片吸虫 成虫 ESP、15k EVs和100k EVs腹腔注射小鼠模型 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 大片吸虫感染对水牛胃肠道菌群的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要试剂/耗材 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 测序数据的分析 |
| 5.5 结果 |
| 5.5.1 肠系膜淋巴结、肝门淋巴结、脾脏和肝脏TLRs在感染组和对照组的表达情况 |
| 5.5.2 α-多样性分析 |
| 5.5.3 主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCo A) |
| 5.5.4 水牛感染大片吸虫对胃肠道菌群各分类水平组成 |
| 5.5.5 LEf Se(Line Discriminant Analysis(LDA)Effect Size,LEf Se)分析 |
| 5.5.6 CCA/RDA分析 |
| 5.5.7 结肠中SCFAs水平检测 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 小结 |
| 第六章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠菌群的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料 |
| 6.2.1 实验动物及材料 |
| 6.2.2 主要试剂、耗材 |
| 6.2.3 实验设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 小鼠囊蚴感染对结肠内容肠道菌群构成的影响 |
| 6.4.2 腹腔注射小鼠模型结肠内容物菌群分析结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 水牛RT-qPCR使用引物 |
| 附表2 小鼠RT-qPCR使用引物 |
| 附表3 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况及参加科研项目 |
（4）肝片形吸虫不同发育阶段虫体的蛋白质组学比较分析及胶体金试纸条研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 肝片形吸虫概述 |
| 1.2 蛋白质组学研究进展 |
| 1.2.1 蛋白质组学的概念 |
| 1.2.2 蛋白质组学技术的发展 |
| 1.2.3 蛋白质组学在寄生虫研究中的应用 |
| 1.3 胶体金试纸条研究进展 |
| 1.3.1 免疫胶体金技术原理 |
| 1.3.2 免疫胶体金技术在寄生虫病诊断的应用 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 实验动物和血清 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要试剂的配置 |
| 2.1.6 主要应用软件和数据分析 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品制备 |
| 2.2.2 SDS-PAGE |
| 2.2.3 蛋白质消化 |
| 2.2.4 LC-MS/MS分析 |
| 2.2.5 蛋白质鉴定与定量分析 |
| 2.2.6 生物信息学和多元性分析 |
| 2.2.7 引物的设计与合成 |
| 2.2.8 肝片形吸虫总RNA的提取 |
| 2.2.9 目的基因反转录 |
| 2.2.10 目的基因克隆 |
| 2.2.11 FhFABⅢ克隆载体的构建 |
| 2.2.12 FhFABⅢ基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.13 重组蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.2.14 重组蛋白的Western blotting分析 |
| 2.2.15 兔抗FhFABⅢ和 FhGST蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.2.16 亲和层析法纯化多抗 |
| 2.2.17 间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.18 重组FhGST和 FhFABⅢ蛋白间接ELISA条件的优化 |
| 2.2.19 间接ELISA临界值的确定 |
| 2.2.20 重复性实验 |
| 2.2.21 敏感性实验 |
| 2.2.22 特异性实验 |
| 2.2.23 临床样本检测 |
| 2.2.24 免疫胶体金颗粒的制备与纯化 |
| 2.2.25 金标抗体的制备及鉴定 |
| 2.2.26 胶体金免疫层析试纸条的制备 |
| 2.2.27 试纸条质量的评估 |
| 3 结果 |
| 3.1 蛋白质组学结果 |
| 3.1.1 蛋白质鉴定结果统计分析 |
| 3.1.2 蛋白质聚类分析 |
| 3.1.3 蛋白主要成分分析 |
| 3.1.4 蛋白质相互作用分析 |
| 3.1.5 生物信息学结果 |
| 3.2 重组蛋白FhFABⅢ构建结果 |
| 3.2.1 肝片形吸虫FhFABⅢ基因的扩增 |
| 3.2.2 重组克隆载体的双酶切鉴定 |
| 3.2.3 重组克隆载体的序列测序结果 |
| 3.2.4 重组表达载体的双酶切鉴定 |
| 3.2.5 重组蛋白表达诱导时间的优化 |
| 3.2.6 重组蛋白表达IPTG诱导浓度优化 |
| 3.2.7 重组蛋白诱导温度的优化 |
| 3.2.8 重组蛋白的纯化结果 |
| 3.2.9 重组蛋白的Western blotting分析 |
| 3.2.10 肝片形吸虫FhGST和 FhFABⅢ多克隆抗体纯化 |
| 3.3 间接ELISE结果 |
| 3.3.1 抗原浓度和血清稀释度优化 |
| 3.3.2 抗原最佳孵育时间的优化 |
| 3.3.3 最佳封闭液的优化 |
| 3.3.4 二抗孵育时间的优化 |
| 3.3.5 显色时间的优化 |
| 3.3.6 临界值确定 |
| 3.3.7 敏感性实验 |
| 3.3.8 特异性实验 |
| 3.3.9 重复性实验 |
| 3.3.10 样本检测 |
| 3.4 试纸条制备结果 |
| 3.4.1 胶体金溶液的制备 |
| 3.4.2 胶体金稳定性 |
| 3.4.3 胶体金标记抗体的制备 |
| 3.4.4 胶体金诊断试纸条优化 |
| 3.4.5 敏感性检测 |
| 3.4.6 试纸条特异性检测 |
| 3.4.7 试纸条重复性检测 |
| 3.4.8 临床样本检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 蛋白质组学数据分析 |
| 4.2 间接ELISA方法检测效果的评估 |
| 4.3 胶体金试纸条检测效果的影响因素分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）肝片吸虫病诊断候选抗原的筛选和制备（论文提纲范文）
| 项目资助基金 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 肝片吸虫及肝片吸虫病概述 |
| 1.1.1 肝片吸虫 |
| 1.1.2 肝片吸虫病的流行性 |
| 1.1.3 肝片吸虫病临床症状体征 |
| 1.1.4 肝片吸虫病的防治 |
| 1.2 肝片吸虫检测方法 |
| 1.2.1 病原学检测 |
| 1.2.2 分子生物学检测 |
| 1.2.3 免疫学检测 |
| 1.2.4 其它检查方法 |
| 1.3 肝片吸虫病诊断抗原研究进展 |
| 1.3.1 组织蛋白酶家族(CAT) |
| 1.3.2 天冬氨酰内肽酶(LEG) |
| 1.3.3 谷胱甘肽S-转移酶(GST) |
| 1.3.4 脂肪酸结合蛋白(FABP) |
| 1.3.5 鞘脂激活蛋白样蛋白家族(SAP) |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第2章 肝片吸虫诊断候选抗原的筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 肝片吸虫噬菌体cDNA展示文库和阳性血清 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 噬菌体展示及免疫筛选用相关试剂的配制 |
| 2.1.5 阳性噬菌体初筛 |
| 2.1.6 阳性噬菌体的复筛 |
| 2.1.7 诊断候选抗原的筛选 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 阳性噬菌体初筛 |
| 2.2.2 阳性噬菌体复筛 |
| 2.2.3 阳性克隆的鉴定与分析 |
| 2.2.4 候选抗原的筛选 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 候选抗原蛋白分子的生物信息学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 生物信息学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 肝片吸虫组织蛋白酶L |
| 3.2.2 假定蛋白D915_000758 |
| 3.2.3 假定蛋白D915_001617 |
| 3.2.4 假定蛋白D915_005900 |
| 3.2.5 假定蛋白D915_010969 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 候选抗原基因的克隆以及重组质粒的构建 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 主要试剂及耗材 |
| 4.1.2 相关培养基和试剂的配制 |
| 4.1.3 肝片吸虫抗原基因特异性引物的设计与合成 |
| 4.1.4 特异性抗原基因的克隆 |
| 4.1.5 重组克隆质粒的构建 |
| 4.1.6 重组表达质粒的构建 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 肝片吸虫组织蛋白酶L |
| 4.2.2 假定蛋白D915_000758 |
| 4.2.3 假定蛋白D915_001617 |
| 4.2.4 假定蛋白D915_005900 |
| 4.2.5 假定蛋白D915_010969 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 候选抗原的诱导表达及鉴定 |
| 5.1 材料及方法 |
| 5.1.1 仪器与试剂材料 |
| 5.1.2 相关试剂的配制 |
| 5.1.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 5.1.4 SDS-PAGE检测重组蛋白表达 |
| 5.1.5 包涵体蛋白的纯化 |
| 5.1.6 Western-Blot分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 融合蛋白pET-Cat L的表达与鉴定 |
| 5.2.2 融合蛋白pET-000758 的表达与鉴定 |
| 5.2.3 融合蛋白pET-001617 的表达与鉴定 |
| 5.2.4 融合蛋白pET-005900 的表达与鉴定 |
| 5.2.5 融合蛋白pET-010969 的表达与鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 :中英文缩略词对照表 |
| 附录二 :作者简介 |
| 致谢 |
（6）大片形吸虫诊断抗原的制备及诊断方法的建立与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.1 片形吸虫概述 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行情况 |
| 1.1.3 片形吸虫病防控 |
| 1.2 片形吸虫病诊断研究 |
| 1.2.1 用于检测抗体的诊断抗原 |
| 1.2.1.1 应用ESP及其纯化产物作诊断抗原的研究 |
| 1.2.1.2 应用重组蛋白作诊断抗原的研究 |
| 1.2.1.3 应用其它物质作诊断抗原的研究 |
| 1.2.2 用于检测抗原的诊断抗体 |
| 1.3 片形吸虫试剂盒的研究 |
| 1.4 课题研究目的与意义 |
| 第二章 大片形吸虫分泌排泄产物凝胶过滤层析组分和重组蛋白FgTPx-1、FgCatB3与FgCat L1的制备及质谱分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂、耗材 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大片形吸虫分泌排泄产物制备 |
| 2.2.2 大片形吸虫层析组分制备及筛选 |
| 2.2.2.1 FgESP凝胶过滤层析 |
| 2.2.2.2 层析组分收集 |
| 2.2.2.3 间接ELISA筛选较优层析组分 |
| 2.2.3 大片形吸虫分泌排泄产物及层析组分质谱 |
| 2.2.3.1 蛋白提取和浓度测定 |
| 2.2.3.2 蛋白酶解 |
| 2.2.3.3 肽段脱盐 |
| 2.2.3.4 肽段质谱鉴定 |
| 2.2.3.5 质谱数据搜库 |
| 2.2.4 重组蛋白制备 |
| 2.2.4.1 设计引物 |
| 2.2.4.2 FgTPx-1目的基因PCR扩增 |
| 2.2.4.3 pMD18-FgTPx-1克隆质粒构建 |
| 2.2.4.4 pET32α-FgTPx-1、pET28α-FgCat B3及pET28α-FgCat L1表达质粒的构建 |
| 2.2.4.5 阳性克隆小量表达与鉴定 |
| 2.2.4.6 蛋白大量表达及破菌检测 |
| 2.2.4.7 可溶性蛋白纯化 |
| 2.2.4.8 包涵体蛋白纯化 |
| 2.2.5 重组蛋白质谱鉴定 |
| 2.2.6 数据统计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 大片形吸虫分泌排泄产物浓度测定 |
| 2.3.2 层析组分收集和浓度测定 |
| 2.3.3 层析组分的筛选 |
| 2.3.4 大片形吸虫分泌排泄产物及部分层析组分质谱结果 |
| 2.3.5 目的基因扩增结果 |
| 2.3.6 克隆载体、表达载体构建结果 |
| 2.3.7 蛋白诱导表达检测 |
| 2.3.8 纯化蛋白检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 大片形吸虫分泌排泄产物及层析组分质谱结果分析 |
| 2.4.2 蛋白表达结果分析 |
| 第三章 大片形吸虫分泌排泄产物凝胶过滤层析组分和重组蛋白FgTPx-1、FgCatB3及FgCat L1作诊断抗原建立及优化间接ELISA方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂、耗材 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 F22层析组分作诊断抗原建立及优化间接ELISA方法 |
| 3.2.2 重组蛋白作诊断抗原优化间接ELISA方法 |
| 3.2.3 应用间接ELISA方法检测实验感染水牛和广西部分地区自然感染奶牛血清抗体水平 |
| 3.2.4 数据统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 F22层析组分作诊断抗原间接ELISA方法优化结果 |
| 3.3.2 重组蛋白作诊断抗原间接ELISA方法优化结果 |
| 3.3.3 间接ELISA应用结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 F22层析组分优化分析 |
| 3.4.2 重组蛋白优化分析 |
| 3.4.3 各个抗原诊断效果分析 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 项目资助 |
（7）大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体表达影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.1 片形吸虫概述 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行 |
| 1.1.3 片形吸虫病防治 |
| 1.2 片形吸虫与宿主的免疫反应 |
| 1.2.1 片形吸虫感染与宿主免疫 |
| 1.2.2 片形吸虫的分泌排泄产物与宿主免疫 |
| 1.3 Toll样受体及其信号通路 |
| 1.3.1 TLR分子 |
| 1.3.2 TLR配体识别模式 |
| 1.3.3 TLR信号通路 |
| 1.3.4 TLR的功能及研究应用 |
| 1.4 TLR与宿主抗蠕虫感染及其分泌排泄产物免疫应答 |
| 1.4.1 TLR与抗蠕虫感染免疫应答 |
| 1.4.2 TLR与蠕虫分泌排泄产物的互作关系 |
| 1.5 课题的目的与意义 |
| 第二章 大片形吸虫感染对小鼠肝脏TLRs及炎症因子转录水平的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验试剂、耗材 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.0 大片形吸虫囊蚴培养 |
| 2.2.1 动物分组与感染 |
| 2.2.2 样品采集及保存 |
| 2.2.3 间接ELISA检测小鼠感染大片形吸虫抗体水平 |
| 2.2.4 Real-time qPCR测定TLRs和炎症因子mRNA相对表达量的变化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 小鼠感染大片形吸虫后血清抗体变化 |
| 2.3.2 小鼠感染大片形吸虫肝脏TLR1～9 mRNA相对表达量的变化 |
| 2.3.3 小鼠肝脏炎症因子mRNA相对表达量的变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 大片形吸虫分泌排泄产物体内外刺激对小鼠来源TLRs及炎症因子转录水平的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 实验试剂、耗材 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 FgESP的制备与分析 |
| 3.2.2 nFgESP刺激小鼠体内实验 |
| 3.2.3 FgESP刺激小鼠巨噬细胞体外实验 |
| 3.2.4 Real-time qPCR测定TLRs和炎症因子mRNA相对表达量的变化 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 nFgESP和hiFgESP的蛋白及蛋白酶活性的分析 |
| 3.3.2 nFgESP刺激小鼠肝脏TLRs和炎症因子mRNA相对表达量的变化 |
| 3.3.3 nFgESP和hiFgESP刺激小鼠巨噬细胞TLRs和炎症因子mRNA相对表达量的变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 nFgESP对小鼠肝脏TLRs转录水平的影响 |
| 3.4.2 nFgESP和hiFgESP对小鼠巨噬细胞TLRs转录水平的影响 |
| 3.4.3 nFgESP诱导小鼠来源TLRs转录水平变化的体内外差异 |
| 3.5 本章小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文情况 |
| 项目资助 |
（8）大片吸虫两种CD59样蛋白的生物信息分析及体外重组表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫病的概述 |
| 1.2 片形吸虫病的诊断研究 |
| 1.2.1 血清学检测 |
| 1.2.2 粪抗原检测 |
| 1.2.3 牛奶抗原/抗体检测 |
| 1.3 片形吸虫的疫苗研究 |
| 1.4 片形吸虫体被蛋白的研究 |
| 1.5 CD59样蛋白的研究 |
| 1.6 生物信息学研究 |
| 1.7 本课题的目的和意义 |
| 第二章 大片吸虫两种CD59样蛋白编码区扩增、测序和分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫种及菌种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂的配制 |
| 2.1.5 FgCD59样蛋白质编码区扩增引物和M13引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 大片吸虫成虫总RNA的提取 |
| 2.2.2 FgCD59样蛋白序列反转录扩增和PCR扩增 |
| 2.2.3 序列测序 |
| 2.2.4 FgCD59样蛋白质编码区序列的克隆 |
| 2.2.5 阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.6 蛋白序列的测序分析与对比分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 克隆测序结果 |
| 2.3.2 FgCD59-1与FgCD59-2的碱基序列分析 |
| 2.3.3 FgCD59-1与FgCD59-2的蛋白序列分析 |
| 2.3.4 FgCD59-1、FgCD59-2与FhCD59-1、FhCD59-2序列比对 |
| 2.3.5 序列系统进化树的构建和分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 大片吸虫CD59-1, CD59-2的蛋白质结构预测和分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 FgCD59样蛋白初级结构性质预测 |
| 3.2.2 FgCD59样蛋白跨膜结构预测 |
| 3.2.3 FgCD59样蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.4 FgCD59样蛋白二级结构分析 |
| 3.2.5 FgCD59样蛋白三级结构预测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 FgCD59样蛋白初级结构分析 |
| 3.3.2 FgCD59样蛋白跨膜区域预测 |
| 3.3.3 FgCD59样蛋白二级结构预测 |
| 3.3.4 FgCD59样蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3.5 FgCD59样蛋白三级结构预测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 大片吸虫两种CD59样蛋白的体外重组表达 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 试剂的配制 |
| 4.1.4 FgCD59样蛋白质编码区扩增引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 大片吸虫成虫总RNA的提取 |
| 4.2.2 目的蛋白序列反转录扩增和PCR扩增 |
| 4.2.3 PCR产物纯化和测序 |
| 4.2.4 FgCD59样蛋白质编码区序列的克隆 |
| 4.2.5 阳性克隆的鉴定 |
| 4.2.6 表达载体的构建及鉴定 |
| 4.2.7 重组蛋白的表达与诱导表达条件的检测和优化 |
| 4.2.8 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.9 Western blot检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 目的序列的扩增 |
| 4.3.2 构建载体鉴定 |
| 4.3.3 表达载体的构建及鉴定 |
| 4.3.4 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（9）片形吸虫及其分泌排泄产物对巨噬细胞极化和宿主细胞免疫应答作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 引言 |
| 第一章 蠕虫感染与宿主免疫应答 |
| 1.1 抗蠕虫感染固有免疫应答概述 |
| 1.2 抗蠕虫感染的固有免疫细胞 |
| 1.3 抗蠕虫感染的病原识别受体(PRRs) |
| 1.4 抗蠕虫感染的辅助性T细胞(Th)免疫 |
| 第二章 巨噬细胞的激活和调控与蠕虫感染 |
| 2.1 巨噬细胞的不同亚型 |
| 2.2 巨噬细胞信号通路与免疫学功能实现 |
| 2.3 巨噬细胞在蠕虫感染中的作用 |
| 第三章 片形吸虫与片形吸虫病免疫学的研究进展 |
| 3.1 片形吸虫与片形吸虫病的研究概况 |
| 3.2 片形吸虫与宿主免疫应答 |
| 3.3 片形吸虫分泌排泄产物与宿主免疫 |
| 3.4 巨噬细胞与抗片形吸虫免疫 |
| 第四章 淋巴插管模型在免疫学研究中的应用 |
| 4.1 大动物淋巴插管模型的研究进展 |
| 4.2 大动物输入淋巴插管及其应用研究 |
| 第五章 本课题的目的和意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 大片形吸虫感染对宿主肝脏枯否细胞极化及细胞免疫应答的作用 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二章 大片形吸虫分泌排泄产物对宿主巨噬细胞极化的作用及相关关键信号通路的初探 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 输入淋巴人造插管模型在片形吸虫细胞免疫研究的应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.1.3 流行情况 |
| 1.1.4 防控 |
| 1.2 大片形吸虫病诊断的研究进展 |
| 1.2.1 经典方法 |
| 1.2.2 免疫诊断方法 |
| 1.2.3 吸虫抗原的检测 |
| 1.2.4 分子生物学方法 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 大片吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 3.1.1 大片形吸虫形态学鉴定结果 |
| 3.1.2 大片形吸虫ITS |
| 3.1.3 大片形吸虫ITS |
| 3.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 3.2.1 大片形吸虫ES抗原免疫家兔后制备多抗的间接ELISA结果 |
| 3.2.2 免疫共沉淀SDS |
| 3.2.3 质谱数据分析 |
| 3.3 大片形吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 |
| 3.3.1 大片形吸虫FgAT和FgLAP基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.2 FgAT和FgLAP的理化特性、结构功能域和三级结构预测 |
| 3.3.3 重组质粒pGEX-6P-1(+)-FgAT和pET-30a-FgLAP的双酶切结果 |
| 3.3.4 重组蛋白的诱导表达结果 |
| 3.3.5 重组蛋白pGEX-6P-1(+)-FgAT和pET-30a-FgLAP的纯化结果 |
| 3.3.6 目的蛋白的Western Blot分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 4.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 4.3 大片形吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、实验感染肝片吸虫的水牛体液免疫反应的研究（论文参考文献）
- [1]基于GAPDH、Catl-1两种重组蛋白的绵羊肝片吸虫病间接ELISA和胶体金试纸条诊断方法的建立[D]. 孙益春. 东北农业大学, 2021
- [2]绵羊肝片吸虫感染间接ELISA及胶体金检测方法的建立及初步应用[D]. 刘少雄. 吉林大学, 2021
- [3]大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究[D]. 盛兆安. 广西大学, 2020
- [4]肝片形吸虫不同发育阶段虫体的蛋白质组学比较分析及胶体金试纸条研制[D]. 吴丽佳. 东北农业大学, 2020(04)
- [5]肝片吸虫病诊断候选抗原的筛选和制备[D]. 贾骁晔. 西北民族大学, 2020(08)
- [6]大片形吸虫诊断抗原的制备及诊断方法的建立与优化[D]. 侯林静. 广西大学, 2019(01)
- [7]大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体表达影响的研究[D]. 陆珂静. 广西大学, 2018(12)
- [8]大片吸虫两种CD59样蛋白的生物信息分析及体外重组表达[D]. 李雪. 广西大学, 2018(12)
- [9]片形吸虫及其分泌排泄产物对巨噬细胞极化和宿主细胞免疫应答作用的研究[D]. 施维. 广西大学, 2018(05)
- [10]大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析[D]. 岳东梅. 黑龙江八一农垦大学, 2017(08)