一、中国人丙型肝炎病毒膜蛋白和非结构区1(E1,E2/NS1)的基因克隆和序列分析（论文文献综述）
夏静[1]（2019）在《丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究》文中进行了进一步梳理丙型肝炎（HCV）感染是一个全球性健康问题,全球范围共有7100万人感染了HCV。80%的患者急性感染后转化为潜伏感染,随着时间的推移,逐渐转变为肝硬化和肝癌。目前,HCV是唯一一种疫苗尚未商业化的肝炎病毒,尽管目前高效的直接抗病毒在HCV治疗方面取得了重要的进展,小分子药疗法会因出现耐药株（RAV）而治疗失败,并且直接抗病毒药物因其昂贵的售价,使得发展中国家的病人对其望而却步。更重要的是,尽管治愈,再次感染依旧会发生。世界卫生组织（WHO）计划在2030年内将HCV新感染患者人数降低90%,所以,一个有效的预防性疫苗对于对抗全球HCV流行至关重要。诱导出能与病毒包膜糖蛋白结合的广谱中和抗体是HCV疫苗研究的主要目标。因此,对于自然感染患者中的广谱中和抗体研究是必不可少的。我们从一个慢性丙肝感染患者体内分离出一株能与HCV包膜糖蛋白E2结合的人源抗体,命名为8D6。这株抗体展示出广谱中和抗体活性,即能中和细胞培养产生的所有亚型的HCV病毒颗粒（HCVcc）。通过功能和表位分析,我们发现8D6可以通过靶向E2保守区域进而阻断E2和受体CD81的结合。更重要的是,8D6对直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral reagents,DAA）耐药毒株也显示出了广谱中和活性。随后,我们对抗体序列进行分析时发现,8D6 CDRH3区域上存在一个二硫键桥基序（C-C）,并且在二硫键桥中恒定存在4个氨基酸（CX4C）,进一步研究发现,该二硫键桥一旦发生突变,抗体的广谱中和活性会大大降低,甚至丧失。并且这一基序在一类抗体之中都是保守的,说明抗体广谱中和活性的获得与二硫键桥息息相关。最后,我们重建了8D6推测的胚系（iGL）抗体基因并测试其与HCVcc的结合能力和中和活性,并从中找到了一个1b亚型的毒株PR79L9,8D6胚系抗体可以对PR79L9毒株产生很强的中和效果。这暗示了PR79L9毒株的E2序列可以作为疫苗抗原设计来诱导产生类似8D6的广谱中和抗体（bNAbs）。总之,我们发现了一个新的结合E2保守区的广谱中和抗体8D6,并且其胚系抗体可以作为一种潜在HCV疫苗株的探针。
武炜[2]（2019）在《Caspase依赖的DDX21切割调控抗病毒先天性免疫机制研究》文中进行了进一步梳理DEAD/H-box家族RNA解旋酶是一类重要的解旋酶,DDX21是DEAD box家族的一员,在正常细胞中主要位于细胞核的核仁中,对细胞RNA加工过程具有重要的作用。此外,DDX21被证实可能调控宿主细胞先天性免疫。在来源于骨髓的树突状细胞（myeloid dendritic cells,mDCs）细胞中,DDX21通过作用于DDX1-DDX21-DHX36-TRIF通路来调控天然免疫。登革热病毒感染后DDX21能够从细胞核迁移进入细胞质进而调控机体的免疫应答。然而,对于DDX21具体如何调控抗病毒天然免疫机制尚不可知。为了探究DDX21调控抗病毒天然免疫的新机制,我们展开以下研究:一、DDX21调控病毒刺激所诱导干扰素的产生。为了观察DDX21在抗病毒免疫应答的功能,沉默DDX21基因后感染病毒,以Western blot、TCID50、ELISA和RT-PCR方法鉴定DDX21基因的缺失对病毒复制和干扰素产生的影响,结果表明:DDX21的沉默能够促进干扰素的产生并且抑制病毒的复制。但是DDX21的过表达对干扰素的产生和病毒复制没有显着影响。二、DDX21在病毒的作用下能够发生切割。为了研究DDX21在病毒感染后蛋白表达的变化,用不同的细胞感染不同的病毒或使用核酸模拟物刺激细胞,以Western blot方法检测,结果表明:内源性和外源性的DDX21在病毒感染和核酸模拟物刺激后均能够发生切割。三、病毒感染通过Caspase-3/6途径切割DDX21。为了探究DDX21的切割机制,首先利用抑制剂处理病毒感染的细胞。结果显示:Caspase抑制剂z-VAD-FMK能够显着抑制DDX21的切割,通过构建一系列DDX21的缺失和突变真核表达质粒,证实DDX21 126位天冬氨酸为其切割位点。通过对其切割位点序列的分析及基因敲除实验验证,证实Caspase-3/6参与了病毒感染诱导的切割DDX21切割。四、DDX21切割后能够从细胞核迁移至细胞质中。为了观察DDX21在发生切割后是否影响其定位发生变化,以激光共聚焦的方法检测病毒感染后DDX21的定位,证实DDX21在病毒感染后从细胞核迁移到细胞质中,进一步结果证实DDX21的转位依赖于切割。五、DDX21切割抑制抗病毒先天性免疫通路。为了探究DDX21切割对先天性免疫通路的影响,通过比较DDX21切割与不切割对干扰素产生的影响,结果表明:DDX21切割抑制病毒感染和poly（I:C）诱导的干扰素的产生及下游干扰素刺激基因的表达。六、DDX21 C端结构域结合双链RNA。为了进一步地探究DDX21的切割如何调控干扰素的产生,利用CO-IP和RNA pull down方法检测DDX21与其自身和RNA的互作,结果显示DDX21能够通过其C端结构域与自身和双链RNA互作。本论文证明DDX21在抗病毒天然免疫中发挥重要的调控作用,更重要的是首次发现DDX21在病毒的作用下发生切割且能够发生迁移,通过与RNA结合调控抗病毒天然免疫。这为进一步的研究DDX21调控抗病毒天然免疫提供理论依据。
寇春[3]（2016）在《新疆准噶尔盆地周边地区蜱与鼠类携带虫媒病毒的调查研究》文中研究表明新疆维吾尔自治区位于我国西北边陲,亚欧大陆腹地,与俄罗斯、蒙古、巴基斯坦等8家接壤,陆上对外口岸较多,与周边国家经济交往频繁。新疆地理生态环境多样,物种分布广与内地有着明显的不同,适合蜱的生长繁殖,其分布广泛,种类较多,可传播多种虫媒病毒。新疆地区时有人、畜不明原因发热和脑炎散发或流行,疑似虫媒病毒引起,但是由于种种原因,目前还没有进行过系统而深入的调查,急需加强研究。我国已知流行的4种虫媒病毒病中新疆出血热和蜱传脑炎在新疆都有发现,在新疆既往进行的虫媒病毒调查中,已经从新疆地区的全沟硬蜱、森林革蜱、亚洲璃眼蜱、边缘革蜱和草原革蜱中分别分离到蜱传脑炎病毒,东方马脑炎病毒,新疆出血热病毒、新环状病毒。从按蚊、库蚊、伊蚊中分别分离到辛德毕斯病毒,西方马脑炎病毒,辽宁病毒,Tahyna病毒等。但尚缺乏对新疆准噶尔盆地周边地区虫媒病毒的深入调查研究。为了解新疆准噶尔盆地周边地区蜱及啮齿动物（鼠）携带虫媒病毒情况,应用RT-PCR、细胞培养及生物信息学等方法对该地区蜱及啮齿动物（鼠）感染虫媒病毒情况进行了调查研究。本项研究结果对丰富新疆乃至国内虫媒病毒资源和进行新疆地区虫媒病毒病预防控制具有重要意义。主要内容包括以下方面:1.新疆啮齿动物（鼠）样本采集及携带虫媒病毒的初步检测2014-2015年在新疆准噶尔盆地周边地区乌苏、阜康、奇台、吉木萨尔和石河子149团等地区采集了1054只啮齿动物,其中2014年,2015年分别为684只和370只,主要种类有长尾黄鼠（Spermophilus undulatus）、子午沙鼠（Meriones meridianus Pallas）、大沙鼠（Rhombomys opimus）和三趾跳鼠（Dipus sagitta）。2014年鼠样本根据采集地、属种与脏器的不同分成193组。通过RT-PCR的方法对鼠中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）、新疆出血热病毒（XHFV）、荆门病毒（JMTV）以及古尔图病毒（Guertu virus）的感染情况进行了检测。结果发现总样本中Guertu virus的S片段阳性率为9.3%,SFTSV的S片段阳性率为6.2%。Guertu virus与SFTSV主要集中在乌苏地区,主要宿主为长尾黄鼠。提示长尾黄鼠为Guertu virus与SFTSV新的宿主。2015年样本同样方法分组成136组,除检测以上4种病毒外还检测了汉坦病毒（HTV）,蜱传脑炎病毒（TBEV）与黄病毒属病毒（Flavivirus）。结果显示总样本中XHFV的阳性率为11%,SFTSV阳性率为7.4%,Guertu virus阳性率为21.3%。阳性样本主要集中在乌苏地区。根据2014-2015年对准噶尔盆地周边地区鼠样本的检测结果,提示新疆乌苏地区可能存在XHFV、SFTSV与Guertu virus的自然疫源地。2.新疆蜱中新病毒的发现、分离及在蜱中分子流行病学调查2014年在新疆乌苏地区共采集了13662只草原革蜱（Dermacentor nuttalli）。根据采集地与蜱种类不同按每组约200只左右分成68组,选取8组有代表样性的样本,经武汉中科院病毒研究所的454高通量测序,有7组样本中存在黄病毒科病毒的重叠群（Contig）。对获得的Contig利用NCBI中的BLISA工具搜索,发现所有Contig都与荆门蜱病毒（Jingmen tick virus,JMTV）的核酸序列相似性最高,在65%-84%之间。暂将该新病毒命名为新疆蜱病毒（Xinjiang tick virus,XJTV）。选取454高通量测序的3组阳性样本,利用Vero细胞对XJTV进行病毒培养和分离,细胞传至第7代后,仅在第一代培养细胞的上清中检测到有XJTV的核酸片段,同时对第一代细胞的上清及细胞制备切片进行电镜观察,发现在细胞与上清中存在90nm左右的病毒粒子。通过RT-PCR对XJTV在乌苏地区蜱中的流行情况进行检测。结果表明,2014年乌苏地区的68组草原革蜱中,检测到XJTV阳性组数54组,其阳性率达79.4%。说明草原革蜱为XJTV的媒介之一,该病毒可能在乌苏地区的蜱中广泛分布。3.新疆蜱携带XJTV基因组序列信息分析与克隆454高通量测序的Contig与JMTV基因序列比对后发现只有部分S1与S3的信息,利用获得的基因序列设计引物进行RT-PCR得到了该病毒的S1与S3全序列信息。对采自新疆羊沟地区的一份阳性样本经RNA-Seq技术（上海伯豪公司）分析获得了S2与S4的部分序列信息,通过设计特异性引物用RT-PCR的方法获得了该病毒的S2与S4全序列信息。利用RT-PCR和重叠RT-PCR的方法分别将结构蛋白S1,S2,S3与S4全基因序列克隆到p GEM-Teasy载体中,这为更好地保存病毒的基因组信息,以及对该病毒分子特性和相关基因功能等性质的研究提供了基础。4.XJTV非结构蛋白和结构蛋白的生物信息学分析利用相关生物学软件Signa IP 4.1、TMHMM、Net NGlyc1.0 Serve、Phrye、MEGA5与DNAStar等对XJTV编码的非结构蛋白（NSP1与NSP2）和结构蛋白（VP1、VP2和VP3）进行了分析。在二级结构中XJTV与黄病毒科的代表株在非结构蛋白的功能区域的motif保守性较高。利用已经解析蛋白晶体结构的登革热病毒（DENV-4）和日本脑炎病毒（JEV）作为模板模拟出XJTV的S1与S3编码蛋白的三维结构。结果发现XJTV基于二级结构保守的motif在空间位置上也与模板蛋白的motif一一对应,提示这些保守结构在病毒的生命周期中可能行使着相同的生物学功能。对结构蛋白VP1、VP2与VP3的跨膜区域、信号肽与糖基化位点进行分析预测,结果表明结构蛋白VP1、VP2与VP3分别具有病毒的包膜蛋白、衣壳蛋白和膜蛋白的功能。基于XJTV的S1与S3编码的非结构蛋白构建的系统发育进化树分析结果显示,与选择的黄病毒科的部分代表毒株相比,XJTV不属于黄病毒科已有的三个属,而与JMTV和MGTV位于进化树单独的分支中。提示XJTV可能是黄病毒科一个新的属中的毒株。5.XJTV衣壳蛋白重组表达质粒的构建及其兔多克隆抗体的制备将XJTV与JMTV编码结构蛋白的基因序列进行比较后,选取相对保守的衣壳蛋白（Capsid protein）ORF片段序列,将其构建到原核表达载体p ET28a与p ET32a中,同时构建至真核表达载体pc DNA3.1中,通过序列测定,结果表明成功获得了三种表达质粒p ET28a-CP,p ET32a-CP和pc DNA3.1-CP。将p ET28a-CP质粒转染大肠杆菌中表达纯化获得重组蛋白,用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备抗体,经检测所获得的抗体效价达1:100000以上,通过western blot检测证实了该抗体与抗原有很好的结合亲和性。构建的原核表达质粒及制备的抗体可为后续开展病毒血清学检测及XJTV的免疫学特性研究工作提供了条件。将构建的真核表达载体p CDNA3.1-CP转染入293T细胞,经IFA检测,表明VP2基因编码的衣壳蛋白在该细胞中成功表达,这为后续病毒的包装以及对哺乳动物的侵染机制研究提供了基础。
殷安国[4]（2014）在《HCV对幼龄树鼩感染实验研究》文中认为丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）是一种在世界范围内引起慢性肝炎的病毒。HCV属于黄病毒科肝炎病毒属。它是长约9.6kb的单股正链RNA病毒,直径40-50nm,主要在肝细胞内复制。人类是HCV的天然宿主,黑猩猩是HCV的敏感动物。可以引起慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化甚至肝癌。树鼩（Tupaiabelangeri）,是一种只生活在亚洲东南地区的非灵长类哺乳动物。它可以感染许多人源性的病毒,例如乙型肝炎病毒HBV,对HCV也表现出易感性。有文献指出,接种HCV的树鼩虽然不像人和黑猩猩那样具有持续高滴度的病毒血症,但大约1/3的树鼩出现了一过性感染,除了用树鼩作为病毒的体内感染动物模型的尝试,还有以树鼩肝细胞为基础的体外感染模型研究。这些证据强烈的说明树鼩具有成为HCV感染动物模型。而采用小树鼩作为HCV感染动物模型还未有人尝试。本文章旨在研究小树鼩感染HCV时动物的部分感染特性。本论文采用5周龄大小的幼龄树鼩,采用肝门静脉注射的方法,向肝脏注射1mL载量为1.3×107copies/mL的J6/JFH-1型HCV病毒上清液,在攻毒后第三天开始抽血,每次抽0.6mL的非抗凝血及50μ1的抗凝血,连续3个月,50μ1的抗凝血用于血常规检测,对实验树鼩的血清提取RNA后运用巢式PCR技术可检测到阳性条带,对阳性条带进行胶回收测序,在NCBI上BLAST比对后与HCVJ6/JFH1-QC69（NS4A）（KF693783.1）相似度99%,所得到的阳性条带的确为HCV病毒片段,第三天阳性率为70.0%,第五周为100%,第六周为88.9%,运用Taqman探针实时荧光定量PCR法对RNA定量发现攻毒后第三天和第五周病毒载量最高,分别为6.07×103copies/mL,2.04×103copies/mL。病理组织检查发现树鼩肝脏汇管区出现可见灶状淋巴细胞浸润,免疫组化染色显示有HCV抗原表达。表明幼龄树鼩具有较高的HCV阳性感染率,部分幼龄树鼩感染HCV后可形成慢性HCV感染。
庞义全[5]（2014）在《丙型肝炎病毒对树鼩感染性及其变异特性研究》文中研究说明丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒引起的非甲、非乙型肝炎,是引起肝癌与肝硬化的主要原因之一。据世卫组织不完全统计,全球大约有1.7-2亿人感染丙肝病毒,我国属于丙肝高感染区,大约有4300万人感染了丙肝病毒。一直以来,缺乏合适的丙肝病毒感染模型严重影响着治疗药物及疫苗的研发进程。现今主要的治疗方式为干扰素与利巴韦林联合用药,但治疗效果由于基因型的不同而存在部分差异。近年来,虽然建立了HCV感染的细胞培养模型,但也仅局限于部分基因型。随着huh7.5.1细胞-病毒培养模型的建立,使得感染型小动物模型的建立尤为紧迫。目前除人和黑猩猩可以自然感染丙肝病毒外,并未发现新的可自然感染的小动物。小鼠是与人类亲缘关系差距较大的动物,病毒感染后的病理变化机制也存在较大差异,很难用于丙肝动物模型研究。树鼩由于其生长繁殖快、价格低、易于饲养及新陈代谢等生理学特点与人类似,以被广泛的应用于人类相关疾病的研究。很多研究已发现,树鼩可以被丙肝病毒感染,具有发展为理想动物模型的潜力。但由于树鼩来源及种系差别大、遗传不稳定等宿主因素,致使树鼩对HCV感染具有不确定性,且不同研究发现的感染与致病现象也不尽相同。丙肝病毒是一种RNA病毒,由于缺乏RNA聚合酶的矫正功能及存在机体的免疫选择压力,在病毒感染过程中,病毒基因组会随之发生突变。在HCV基因组中,E2/NS1区中的27个氨基酸变异最明显,因而此区被称为高变区1（hypervariableregion1, HVR1）。此高变区含有抗原表位,与体液免疫及细胞免疫有重要联系。对于高变区序列的研究有利于我们了解病毒与宿主的关系,在后续的治疗药物效果评价及免疫预防等方面具有重要的意义。本研究以驯化的树鼩为研究对象,采用已优化好的分离及培养条件得到生长状态良好的树鼩原代肝细胞。在分离培养细胞的同时,利用本实验室病毒培养方法在huh7.5.1细胞培养出病毒载量为108copies/mL的病毒。将病毒与原代肝细胞共培养,定期收取培养上清及细胞。通过逆转录-巢式PCR检测,上清中有病毒RNA的存在。荧光定量PCR检测发现,PTH上清中病毒载量最高达到6×104copies/mL。利用Western blot检测PTH细胞中HCV NS3蛋白的表达情况,在感染前九天并未发现HCV NS3蛋白的表达,感染后11天和13天可检测到蛋白表达。从分子及蛋白水平证实HCV可以感染树鼩肝细胞并在其中复制及装配,但由于宿主个体及病毒批次的不同致使感染很不稳定。其次,将树鼩采取单笼单养模式进行树鼩驯化饲养,待树鼩适应环境后,进行树鼩病毒的感染性实验。通过尾静脉注射和肝脏多点注射等方式进行病毒接种,在一星期之后,对树鼩进步加强感染。定期进行抽血,每次抽血约800μL,将获得血清分装。一部分血清用于生化指标（ALT, AST）检测,一部分血清用于RNA的提取并进行定性及定量检测,来确定是否有病毒RNA的存在。ALT及AST整体处于20～50的正常范围,通过逆转录-巢式PCR检测发现,实验组B2、B5、B6、B9及H8树鼩感染时间出现间歇性感染现象,十六周之后全为阴性,H2与H5两只能在第一周和第二周检测HCVRNA阳性,之后转为阴性,但在感染16周后所有感染组并未检测到病毒的存在,检测阳性的病毒载量最高仅达到4×103copies/mL,病毒载量较低。结果初步证实,树鼩可以被HCV感染,由于个体遗传及免疫差异致使感染效率不一样。最后,选取体内及体外检测阳性的实验组,提取总RNA,然后通过巢式PCR扩增出含有HVR1区的目的片段,通过胶回收纯化目的片段,送与公司测序。发现,高变区1中1490、1511、1530、1532、1554位核苷酸有突变现象产生,27个氨基酸中384、391、392、397、398、405位氨基酸也出现对应的突变。结果显示,不同实验组的HVR1区存在不同程度的变异,这可能是由于在机体的免疫选择压力而产生的突变。综上,我们通过实验研究发现树鼩个体和树鼩肝细胞均可被HCV感染,在高变区1有突变现象产生。尽管总体感染率较低,但结果显示树鼩可作为潜在的HCV感染动物模型,用于后续研究。
尹珊[6]（2013）在《猪瘟病毒Erns、NS4A、NS4B、NS5A蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备》文中认为猪瘟分布于是世界各地,在国内广泛流行,给养猪业造成严重的经济损失。长期的疫苗使用,造成病毒发生变异,呈现多种病型的发生。猪瘟病毒建立了一种逃避宿主先天性免疫系统识别的策略,免疫系统不能识别非自我元件而导致免疫耐受,造成猪的持续性感染。猪瘟病毒E吣蛋白能诱导产生中和抗体,在病毒的持续性感染和抗病毒应答过程中发挥重要功能作用,NS4A、NS4B、NS5A参与病毒RNA的复制过程,四种蛋白Erns、NS4A、NS4B和NS5A在对宿主的致病过程中扮演着重要角色,研制猪瘟病毒各种蛋白的抗体有助于对病毒蛋白的结构与功能的深入探讨,因此本研究通过制备结构蛋白Erns和非结构蛋白NS4A、NS4B和NS5A的多克隆抗体,进一步探索感染细胞中猪瘟病毒Erns、NS4A、NS4B、NS5A蛋白与宿主的相互作用关系。本文克隆了Erns、NS4A、NS4B△205-347、NS5A基因,将这些基因插入原核表达载体PET-32a（+）克隆位点,成功构建了PET-Erns、PET-NS4A. PET-NS4B△205-347、PET-NS5A重组原核表达质粒。将重组质粒转化BL-21或BL一21衍生菌并进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot分析显示Erns、NS4A、NS4B△205-347和NS5A基因得到了有效表达,Erns、NS4A、NS5A重组蛋白主要以包涵体的形式表达,而NS4B△205-347重组蛋白能以包涵体和可溶性蛋白两种形式进行表达。Erns、NS4A、NS5A包涵体在变性条件下,通过Ni2+的亲和层析法纯化蛋白,纯化的蛋白经逐步透析法进行复性重折叠,获得有活性的免疫原。NS4B△205-347可溶性蛋白不需经变性就可经Ni2+的亲和层析纯化获得有活性的蛋白。以制备的Erns、NS4A、NS4BA205-347、NS5B重组活性蛋白作为抗原按免疫程序免疫四周龄小鼠,获取抗这四种蛋白的多克隆抗体。Western Blot分析显示：抗Erns、NS4A、NS4BΔ205-347和NS5A重组蛋白的多克隆抗体能分别与相应的重组蛋白发生良好反应；PK-15细胞中真核表达融合GFP蛋白的NS4B蛋白,抗NS4BΔ205-347的多克隆抗体能特异地识别NS4B-GFP融合蛋白；抗NS5A蛋白的多克隆抗体能与PK-15细胞真核表达的NS5A-GFP融合蛋白特异性结合；NS4A、NS5A多抗能分别特异性地检测到CSFV感染PK-15细胞中的NS4A、NS5A蛋白。对感染CSFV的PK-15细胞的间接免疫荧光抗体试验显示：抗Erns、NS4A、NS4B Δ205-347、NS5A重组蛋白的抗体能分别与CSFV的Erns、NS4A、NS4B、 NS5A蛋白发生反应,具备良好的敏感性与特异性,同时也表明这些抗体能检测到CSFV的Erns、NS4A、NS4B、NS5A亚细胞定位于PK-15细胞胞质中。
余琴琴[7]（2013）在《靶向HCV包膜蛋白的信标适体应用于病毒检测的研究》文中进行了进一步梳理丙型肝炎病毒（HCV）感染了全球大约3%（约1.7亿）的人口，是肝脏疾病的主要病原体之一，可导致急性或慢性感染，慢性丙型肝炎可发展成肝硬化或肝癌，丙型肝炎每年新发病例约3.5万例。HCV以血液传播为主，发病隐匿，且症状不典型，患者容易因未能及时诊断而错过治疗的最佳时机。目前尚未开发出有效的HCV疫苗，现有的HCV临床检测存在窗口期较长，容易出现漏诊或假阳性检测结果，难以满足大通量检测和血液快速筛查的要求。因此，改善和发展HCV早期检测的新方法迫在眉睫。HCV包膜蛋白E1、E2是HCV病毒颗粒的结构蛋白，它们以非共价键形成异二聚体E1E2，主要参与细胞受体相互作用，诱导机体产生中和抗体，在病毒的感染和病毒颗粒的形成过程起关键作用，对HCV包膜蛋白的研究是热点之一。本论文成功扩增出HCV E1E2，并将目的基因插入到pET28b载体中，进行诱导表达和纯化，得到大量E1E2蛋白。本论文首次以HCV包膜蛋白E1E2为靶分子，经指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选出特异性结合的核酸适体—Aptamer。进一步进行体外原核表达HCV E1、HCV E2蛋白，运用ELONA法（酶联寡核苷酸检测法）对筛选出来的Aptamer的特异性从反面进行了鉴定，结果发现筛选出的Aptamer能特异性地识别E1E2蛋白和E2蛋白，而不识别E1蛋白。将筛选得到的Aptamer修饰成分子信标核酸适体（molecular beacon aptamer，MBA），简称信标适体。Aptamer实现了“信号探针”的转化，并运用MBA实现了重组E1E2蛋白、E2蛋白nM级的检测以及被病毒感染的细胞上清中包膜蛋白的检测。信标适体（MBA）有望成为HCV包膜蛋白在病毒生活周期机制研究的新的重要手段和桥梁，为HCV的早期检测提供一种新思路新方法，MBA有望成为一种新型的HCV早期检测试剂，发展成为HCV早期诊断的新方法。
袁治国[8]（2012）在《丙型肝炎病毒6型和2型分子遗传学研究》文中进行了进一步梳理HCV感染是一个世界性的健康问题，其发病率逐年增高，且致病性强，易转为慢性，导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，并可发展为肝硬化和肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）。HCC是严重影响人类健康的恶性肿瘤之一，居人类常见的恶性肿瘤第5位，其恶性程度高，5年存活率小于3%。目前HCC的发病率还在持续升高，据统计分析发现，2005年HCC的发病人数是1975年的3倍，从1.6/十万上升至4.9/十万。全世界每年大约有50万人死于HCC。HCV主要由血液系统传播，据估计全球的HCV感染率约为3.0%，即大约有1.7亿人被感染，每年新发病例约3.5万例。在美国，HCV感染是最常见的慢性血液系统传播性疾病，每年大约有1万人直接死于此感染，而且死亡人数在未来20年还将大幅增加。在我国，HCV的感染率约在2.5%～4.9%之间，有超过5000万人感染HCV。HCV感染者初期大多数无明显症状，大约有70%～80%的HCV急性感染会转为慢性感染，其中约有10%～20%的慢性感染者会转变成肝硬化，最终约有5%的慢性感染者进展为HCC。目前有关HCV具体的致病机制和病理发生过程的研究还十分有限，同时也缺乏针对HCV的保护性疫苗和有效的治疗方案。当前临床上常规用于治疗HCV的措施是联合使用聚乙二醇α干扰素（Pegylated α Interferon，Peg‐αINF）和利巴韦林（Ribavirin，RBV），但是患者持续病毒应答率（Sustained Virological Response，SVR）也只有约50%～70%，而且此联合疗法副作用很大，费用昂贵，耗时也比较长。由于缺乏高效、稳定的HCV体外细胞培养体系和合适的小动物模型，致使研制HCV特异性药物的和开发针对性保护疫苗的工作进展缓慢。1991年国际病毒分类委员会（Interna‐tionalcommitteeon taxonomy of viruses，lCTV）将HCV归类于黄病毒科（Flaviviridae），肝炎病毒属（Hepacivirus）。HCV为有包膜的单股正链RNA病毒，其基因组全长约为9.6kb，包含一个大的开放阅读框（Opening Reading Framework，ORF），及其两侧的5’端和3’端非编码区（Non‐Translated Region，UTR）。目前HCV基因型命名主要采用Simmonds系统的标准。Simmonds系统是2005年建立的针对HCV全基因组以及部分区段核苷酸序列进行分析，并结合系统进化树分析将HCV分为6个主要的基因型，每个基因型又可以分为若干亚型。HCV6型是HCV所有基因型中亚型最多、最复杂，遗传学上多样性最为突出的一个基因型。HCV6型现有6a～6w共23个亚型，主要在东南亚及其周边地区呈地方流行。Simmonds标准要求至少测定一条HCV全基因组序列，进行核苷酸相似性分析和系统进化分析后，确定不属于已知的任一亚型，即可确定为一个新的亚型。但是有一些特殊的变异株，它们之间的核苷酸差异率以及遗传距离并不在典型的亚型间或者亚型内的范围内，而是大于同一亚型内之间的距离，而小于不同亚型之间的距离。这些变异株的存在，使得HCV的分类和命名愈加复杂。在全基因组水平研究和分析这些变异株，将为完善HCV分类命名规则，修订新分离命名体系提供重要依据。虽然HCV2型的复杂性相比较6型来说比较小，但是有其独特的地域分布和遗传变异，而且2型还有许多亚型没有正式的分类和命名。通过结合HCV数据库，研究HCV2型的地域分布方式和遗传多样性的特点，为制定预防策略、发展有效的治疗措施和研发针对性的疫苗提供一些有益的帮助。目的1.在全基因组水平上分析HCV6型变异株DH027、TV533、L349和QC271，确定其可能的亚型归属，分析、讨论这些变异株在HCV基因分型系统中的重要意义，为将来修订、完善HCV分型标准提供重要依据。2.依据HCV2型11分离株的基因序列，结合数据库中的2型的序列、来源信息，探讨2型的地域分布方式，遗传变异特点。方法1.采用DNA walking on bridges and islands的策略，扩增、测定HCV6型变异株DH027、TV533、L349和QC271的全基因组序列。然后采用DNAStar、BioEdit、MEGA、SimPlot等生物信息学软件，进行核苷酸相似性比较分析和系统进化分析，以最大似然法构建进化树，确定这几株病毒序列的亚型归属，探讨它们在HCV基因分型中的意义。2.测定11株HCV2型分离株的全基因组序列，采用DNAStar、BioEdit、MEGA等生物信息学软件，参考Genebank中2型序列，综合进行系统进化分析，确定归属。结合HCV数据库中的已知2型信息，探讨2型的地域分布方式，遗传变异特点。结果1. DH027、TV533、L349和QC271全基因组大小分别为9460nt、9446nt、9454nt和9553nt。本研究所扩增4条HCV变异株的序列与其它63条6型参考序列比较时，DH027与6m的全基因组差异率为18.7%～19%，与6n之间的差异率为15%～16.1%；TV533与6k的全基因组差异率为19.5%，与6l之间的差异率为16.9%～17.3%；L349与6k的全基因组差异率为19%，与6l之间的差异率为13.8%～14.5%；QC271与6i的全基因组差异率为16.2%～17%，与6j之间的差异率为14.5%～14.8%。2. HCV2型11个分离株的全基因组序列长度介于9508nt～9825nt之间。通过测定HCV的全基因组序列证实2d、2e、2j、2m和2r亚型命名。另外6个分离株QC114、QC182、QC289、QC297、QC302和QC331则代表了6个新的谱系。QC297、QC331、QC182和QC64在E2、P7和NS5A区域有一些特殊的遗传变异。结论1.根据核苷酸相似性分析和系统进化分析DH027、TV533、L349和QC271可暂时划分为HCV6n、6l和6j亚型，但是这几株病毒序列也与6m、6k和6i亚型也比较接近。将本研究中的4变异株与参考株序列放在一起比较，6m、6n；6k、6l；6j、6l之间的界限变得模糊。这些变异株的发现，使得HCV的亚型分类变得更加复杂，为今后修订、完善HCV分类命名规则提供重要依据。2.在11个型分离株中，明确了5个HCV2型分类、命名，发现了6个新的2亚型候选株。分析了2型的全球地域分布。确认了某些独特的氨基酸序列变异，显示出某些2型的遗传特殊性。
贾战生,马力,韦三华,姚志强[9]（2011）在《丙型肝炎疫苗研究的新理念、挑战与策略》文中研究说明丙型肝炎病毒（HCV）感染是引起慢性肝病的主要原因之一,严重危害人类健康,目前抗病毒治疗的标准方案为聚乙二醇干扰素α（PEG-IFN-α）联合利巴韦林,其有效率仅为50%70%,且疫苗研究进展缓慢,已成为严峻的公共卫生问题。近10多年来,对HCV感染发病机制、保护性免疫应答和病毒持续感染机制的认识取得了很大进展,中和抗体以及CD4+和CD8+T细胞在内的强烈的T细胞免疫应答已被证明与HCV的清除相关,这将是研制丙型肝炎疫苗的希望所在。当前HCV疫苗的研究主要集中在多肽疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗、重组多表位疫苗、以抗原递呈细胞为载体的树突状细胞（DC）疫苗等,已有多种疫苗正在研制并进行进入临床试验前的测试。我们结合多年来对HCV的研究基础,通过与国内外同行交流,提出变"单纯预防"为"防治结合,以诱导持续免疫应答和维持病毒抑制状态为基本目标"的HCV疫苗研究新理念,发展以诱导细胞免疫为主的预防和治疗性疫苗,尤其是既能在体内有效激发HCV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应,又能维持CD4+记忆T细胞功能的治疗性细胞疫苗。本文综述关于HCV保护性免疫应答及持续感染的机制,HCV疫苗研究新理念,目前面临的挑战以及研究策略。
朱研[10]（2010）在《基于HCV 6Kb扩增子的动态准种优势株的确定及包膜2基因正选择位点分析》文中进行了进一步梳理背景和目的:丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染已成为全球性公共卫生问题,据估计全球约有2.1亿HCV感染者,其中85%发展成为慢性丙型肝炎。现有的抗HCV治疗方案十分有限且迄今尚无有效的疫苗问世。HCV有效的免疫逃逸策略是HCV持续感染及疫苗研究困难的关键问题,但免疫逃逸的机制尚不清楚。研究表明,病毒适应环境的高度可变性的发生机制而非宿主免疫防御功能的缺陷或损伤,可能在病毒免疫逃逸中起更重要的作用。HCV具有明显的异质性,以一群不同但密切相关的变异株即准种（quasispecies, QS）存在于感染者体内。研究表明准种具有两个显着特性,其一是准种群体内变异株的分布是不均匀的,总以一种变异株为优势株即主要变异株（dominant variants）;其二是是准种的优势变异株处于动态变化中,研究显示同一个体在不同的时间点准种的主要变异株是不同的,主要变异株的迁移可能反映了宿主的免疫压力及病毒的强大适应性。由此可见,动态变化的HCV准种优势株蕴藏着病毒免疫逃逸的相关信息。对动态变化的HCV准种优势株长片段序列分析,以获得序列的变异特征及进化规律,是探索HCV免疫逃逸分子基础的新途径,而建立基于HCV长序列的、准确的、动态变化的准种优势株的鉴定方法是准种优势株相关研究的重要前提。HCV包膜2基因在HCV基因组中变异程度最高,是公认的受到宿主免疫压力即正选择压力（positve selection pressure）作用最强的区域。位于宿主强烈免疫压力作用下的位点发生变异,可能引起其蛋白功能发生相应的变化,有利于新的变异株发生免疫逃逸,躲避宿主的免疫清除。如果一个氨基酸位点非同义核苷酸替代速率（dN）显着地超过其同义核苷酸替代速率（dS）,那么我们称这个位点为正选择位点。目前,E2基因正选择位点的相关研究报道有限。本研究从中国人HCV感染患者系列标本库（CQueen cohort）中筛选出未抗病毒治疗的1b型HCV慢性感染者的系列血清样本,进行了6Kb的长链RT-PCR扩增及克隆,建立了基于6Kb长序列的动态变化的准种优势株的鉴定方法。同时,用固定效应似然法（fixed effects likeli- hood method, FEL）对基于6Kb长片段的E2基因的正选择位点进行了分析,初步探讨了E2基因的正选择位点分布及其与已知功能区之间的关系。材料和方法:1. HCV 5′端6Kb长链RT-PCR扩增及高效克隆:从中国人HCV感染患者系列标本库（CQueen cohort）中筛选出3例未经IFN抗病毒治疗的1b型HCV慢性感染者及其3个不同时间点共9份血清样本作为研究对象,各样本两两间隔时间为半年以上,HCV RNA≥6log10 copies/ml。根据GenBank中所有已知的HCV 1b型全基因组序列,选择相对保守、GC含量适当的区域,设计RT引物及巢式PCR扩增引物,其中正向引物与本研究小组已建立的5.2Kb扩增方法所用的正向引物相同,扩增产物长度为6, 030 bp。采用SuperScriptTMⅢRNase H–逆转录酶和Platinum高保真DNA聚合酶、优化RT及PCR条件,以期获得清晰、无杂带的6Kb的目的条带。采用高效的长片段TOPO? XL PCR克隆试剂盒进行克隆。2. HCV 6Kb扩增子动态变化的准种优势株的确定:从患者1的3份系列血清样本中各随机挑选33个阳性克隆（共99个克隆）,对E2区5’端396 bp片段直接测序,采用CLUSTALX、BioEdit、MEGA软件序列比对后构建系统进化树,确定各时间点的准种主要变异株及主要变异株发生更替的时间间隔;从33个阳性克隆中（准种复杂程度较高的时间点）随机挑选10,15,20,25,30个克隆,各重复100次,组成5组,用χ2检验确定能准确检出准种优势株所需的最少克隆数;用第2、3例患者对上述结果进行验证。3.基于HCV 6Kb长序列的E2基因正选择位点分析及其功能意义:用HyPhy软件包（http:// www.hyphy.org/）内嵌的固定效应似然法（fixed effects likelihood method, FEL）检测各患者基于6Kb长序列的E2基因的正选择位点,将所检测到的位点与E2基因已知功能区进行比对,分析各位点的功能意义。主要结果:1.建立了HCV 5′端6Kb长链RT-PCR扩增及高效克隆的方法:通常HCV RNA定量≥6 log10 copies/ml的血清标本扩增均可获得阳性条带,目的条带亮度高,特异性好。将PCR回收产物连接于pCR?-XL-TOPO? T载体,每个LB平板上可获得200～800个转化克隆,用EcoRⅠ内切酶酶切鉴定,阳性克隆比例大于95%。2.建立了6Kb扩增子动态变化的准种优势株的鉴定方法:系谱分析显示每个患者3个时间点的准种主要变异株分别位于3个不同的进化枝;25及30个克隆的主要变异株与总体33个克隆的主要变异株的检出完全一致。3. 3例1b型HCV慢性感染者系列血清样本基于6Kb长序列的E2基因分析,共检测到5个正选择位点:通过对每例HCV慢性感染者6Kb长序列的E2基因动态变化的准种变异株的适应性进化分析,发现慢性HCV感染者体内的E2区准种复杂程度并非随着感染时间的延长而进行性增高,在某个时间点上准种变异株的序列可能会趋于一致。在患者1、3共检测到5个位点:aa 384、aa 399、aa 410、aa 475和aa 522,分布于HCV E2基因HVR1区、HVR2区及HCV E2-CD81分子结合区。主要结论:1.建立的HCV 5′端6Kb长链RT-PCR扩增及高效克隆方法,为HCV免疫逃逸的分子基础研究奠定了基础。2.每份血清样本随机挑取25个阳性克隆足以准确确定HCV慢性感染者体内的动态准种优势株。HCV感染患者体内的病毒准种优势变异株的进化速度较快,半年时间即可发生更替。3.慢性HCV感染过程中,E2基因位于重要功能区的aa位点受到了宿主强烈的免疫压力,aa 384、aa 399及aa 410位点的变异可能导致HCV发生体液免疫逃逸;而aa 475和aa 522位点的变异则可能通过影响HVR2区的功能,或改变HCV E2-CD81分子的亲和力,或改变CD81分子的结构而导致HCV发生固有免疫逃逸。该研究为分析HCV C-NS4A基因片段的正选择位点奠定了良好的基础。
二、中国人丙型肝炎病毒膜蛋白和非结构区1(E1,E2/NS1)的基因克隆和序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中国人丙型肝炎病毒膜蛋白和非结构区1(E1,E2/NS1)的基因克隆和序列分析（论文提纲范文）
（1）丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 HCV流行病学 |
| 1.2 HCV基因组分子生物学特征 |
| 1.3 HCV研究模型 |
| 1.3.1 细胞培养模型 |
| 1.3.2 动物模型 |
| 1.4 HCV生命周期 |
| 1.5 HCV预防和治疗手段 |
| 1.5.1 HCV的 DAA治疗 |
| 1.5.2 HCV的抗体治疗和预防 |
| 1.6 HCV广谱中和抗体诱导对疫苗设计的启示 |
| 1.6.1 E1/E2 包膜糖蛋白诱导产生广谱中和抗体 |
| 1.6.2 HCV胚系抗体对疫苗设计的启示 |
| 1.7 8D6 筛选过程及表位分析、功能鉴定 |
| 1.8 课题设计思路 |
| 1.9 总结与展望 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 HCVcc病毒 |
| 2.1.3 抗体及蛋白 |
| 2.1.4 病人血清样本 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HCVpp中和实验 |
| 2.2.2 HCV E2 分选探针制备 |
| 2.2.3 抗体表达 |
| 2.2.4 Protein-G亲和层析纯化抗体 |
| 2.2.5 胚系抗体设计及改造 |
| 2.2.6 OCTET RED96 仪器检测抗原抗体亲和力 |
| 2.2.7 8D6 Fab制备 |
| 2.2.8 小角度X射线散射(SAXS) |
| 2.2.9 Docking |
| 2.2.10 HCVcc制备 |
| 2.2.11 HCV RNA电转 |
| 2.2.12 HCV耐药株构建 |
| 2.2.13 微中和实验 |
| 2.2.14 免疫荧光 |
| 2.2.15 HCV E2 截短突变体及丙氨酸扫描突变体构建 |
| 2.2.16 Lipo3000 脂质体DNA转染 |
| 2.2.17 酶联免疫吸附实验 |
| 2.2.18 8D6 表位保守性序列分析 |
| 2.2.19 数据分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 HCV广谱中和抗体8D6 的分离和初步评价 |
| 3.2 8D6 与纯化的重组Con1(1b亚型)E2 蛋白具有高亲和力 |
| 3.3 8D6 对不同基因型HCV病毒E2 蛋白具有广谱结合活性 |
| 3.4 8D6 对不同基因型HCVcc病毒具有广谱结合活性 |
| 3.5 8D6 对不同基因型HCV病毒E2 蛋白具有广谱中和活性 |
| 3.6 8D6 可以中和DAA药物耐药毒株 |
| 3.7 8D6 通过阻断E2与CD81 的结合来阻断病毒入侵 |
| 3.8 8D6 是构象表位抗体并且识别保守的E2 表位 |
| 3.9 8D6 识别E2 的具体表位探究 |
| 3.10 E2 N448 去糖基化对8D6 识别的影响 |
| 3.11 8D6 Fab-E2 小角散射(SAXS)模型 |
| 3.12 重组E2(1b/Con1)与8D6 Fab复合物模型 |
| 3.13 8D6 通过体细胞超频突变获得广谱中和活性 |
| 3.14 8D6在CDRH3 上存在一个对抗体广谱活性获得重要的CX_4C基序 |
| 3.15 通过8D6 胚系抗体筛选疫苗合适的HCV免疫原 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词表(中英文对照) |
| 附录二 抗体序列 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（2）Caspase依赖的DDX21切割调控抗病毒先天性免疫机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 DEXD/H-box家族的研究进展 |
| 1.1.1 DEXD/H-box家族概述 |
| 1.1.2 DEXD/H-box家族的生物学功能 |
| 1.1.3 DExD/Hbox对天然免疫和病毒复制的影响 |
| 1.2 DDX21的研究进展 |
| 1.2.1 DDX21概述 |
| 1.2.2 DDX21的生物学功能 |
| 1.2.3 DDX21对机体的抗病毒天然免疫和病毒复制的影响 |
| 1.2.4 DDX21研究展望 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 DDX21对调控病毒复制和Ⅰ型干扰素的产生 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 抗体和试剂 |
| 2.1.3 siRNA和质粒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 2.1.6 HeLa细胞的干扰 |
| 2.1.7 构建DDX21稳转细胞系 |
| 2.1.8 病毒感染细胞 |
| 2.1.9 Western blot检测 |
| 2.1.10 细胞上清中病毒的TCID_(50)的测定 |
| 2.1.11 细胞上清中病毒的IFN-β的测定 |
| 2.1.12 RNA的提取 |
| 2.1.13 荧光定量PCR |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 DDX21的沉默对VSV病毒病毒复制和干扰素水平的影响 |
| 2.2.2 外源性DDX21稳定表达对VSV病毒复制和干扰素水平的影响 |
| 2.2.3 DDX21的沉默或稳定表达对HSV-1病毒对病毒复制和干扰素产生的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 病毒感染诱导DDX21发生切割 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒和细胞 |
| 3.1.2 抗体和试剂 |
| 3.1.3 Flag-DDX21重组质粒的构建 |
| 3.1.4 病毒感染细胞 |
| 3.1.5 核苷酸模拟物转染细胞 |
| 3.1.6 HeLa细胞的过表达 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Flag-DDX21-1和Flag-DDX21-2重组质粒构建 |
| 3.2.2 病毒感染HeLa细胞检测内源性的DDX21 |
| 3.2.3 病毒感染不同的细胞检测内源性的DDX21 |
| 3.2.4 核酸模拟物刺激细胞检测内源性的DDX21 |
| 3.2.5 病毒感染过表达的细胞检测外源性的DDX21 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 病毒感染通过Caspase-3/6途径切割DDX21 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 抗体及试剂 |
| 4.1.3 DDX21缺失质粒和突变质粒的构建 |
| 4.1.4 药物处理实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 药物处理对DDX21切割的影响 |
| 4.2.2 1-216位氨基酸缺失阻断DDX21切割 |
| 4.2.3 126位氨基酸突变阻断DDX21切割 |
| 4.2.4 Flag-DDX211-125和127-784重组质粒构建及其表达 |
| 4.2.5 Caspase-3和-6切割DDX21 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 DDX21切割后从细胞核迁移至细胞质 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 抗体及试剂 |
| 5.1.2 主要试剂配制 |
| 5.1.3 免疫荧光 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 内源性DDX21的定位 |
| 5.2.2 外源性DDX21及其切割片段的定位 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 DDX21切割对干扰素的调控及其机制 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 抗体及试剂 |
| 6.1.2 HA-DDX21重组质粒的构建 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 主要试剂配制 |
| 6.1.5 DDX21敲除细胞系的构建 |
| 6.1.6 单克隆细胞系genotyping PCR测序鉴定 |
| 6.1.7 Western blot鉴定DDX21敲除 |
| 6.1.8 DDX21敲除细胞稳定表达细胞系的构建 |
| 6.1.9 Dual-Luciferase实验 |
| 6.1.10 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP） |
| 6.1.11 RNA Pull down |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 用于DDX21基因敲除打靶载体的构建 |
| 6.2.2 DDX21基因敲除细胞株的鉴定 |
| 6.2.3 DDX21基因敲除细胞对病毒复制的影响 |
| 6.2.4 构建稳定表达Flag-DDX21和Flag-DDX21 D126A细胞系 |
| 6.2.5 DDX21的切割对干扰素产生的影响 |
| 6.2.6 DDX21能够发生自身互作 |
| 6.2.7 DDX21结合RNA |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）新疆准噶尔盆地周边地区蜱与鼠类携带虫媒病毒的调查研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 新疆地区虫媒病毒调查研究状况 |
| 1.1 新疆主要虫媒病毒 |
| 1.2 新疆虫媒病毒研究的发展与展望 |
| 2 黄病毒研究进展 |
| 2.1 基因组及复制周期 |
| 2.2 黄病毒的检测方法 |
| 2.3 黄病毒属主要诊断抗原的研究进展 |
| 2.4 黄病毒的流行情况 |
| 3 研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 新疆地区啮齿动物（鼠）携带虫媒病毒的分子生物学初步检测及分离 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 采集时间与采集地点 |
| 1.2.2 采集方法 |
| 1.2.3 样品研磨 |
| 1.2.4 RNA的提取 |
| 1.2.5 cDNA的制备 |
| 1.2.6 引物设计与合成 |
| 1.2.7 PCR |
| 1.2.8 病毒的分离与检测 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 新疆蜱中新病毒的发现、分离及蜱中分子流行病学调查 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 采集时间与采集地点 |
| 1.2.3 样本研磨 |
| 1.2.4 RNA的提取 |
| 1.2.5 cDNA的合成 |
| 1.2.6 454高通量测序检测样本的准备 |
| 1.2.7 PCR检测 |
| 1.2.8 组织细胞培养法分离病毒 |
| 1.2.9 电镜观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 捕蜱数量及种类 |
| 2.2 454高通测序结果 |
| 2.3 蜱样本分毒结果 |
| 2.4 电镜观察实验 |
| 2.5 蜱样本中XJTV的流行病学调查 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 新疆蜱携带XJTV基因组序列信息分析与克隆 |
| 前言 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 454高通量测序序列分析与拼接 |
| 1.2.2 RNA-seq高通测序序列分析与拼接 |
| 1.2.3 XJTV序列的 5'与 3'两端序列信息的获取 |
| 1.2.4 XJTV每节段中的片段克隆到pGEM-Teasy |
| 1.2.5 XJTV每节段全长克隆至pGEM-Teasy载体中 |
| 1.2.6 序列的拼接及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 454高通量测序结果分析 |
| 2.2 RNA-seq高通量测序结果分析 |
| 2.3 XJTV全序列信息的克隆 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 XJTV序列的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 1 方法 |
| 1.1 基因序列选取 |
| 1.2 二级结构预测 |
| 1.3 三级结构预测 |
| 1.4 系统发育进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 XJTV二级结构分析结果 |
| 2.1.1 糖基化位点分析 |
| 2.1.2 信号肽分析 |
| 2.1.3 跨膜区域 |
| 2.1.4 黄病毒科保守的模体分析 |
| 2.2 非结构蛋白三级结构预测 |
| 2.3 NS3与NS5的进化分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 XJTV的CP蛋白基因原核与真核载体构建及抗体制备 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 CP蛋白基因引物的设计、合成与PCR反应 |
| 1.2.2 重组表达载体的构建 |
| 1.2.3 CP蛋白的原核表达 |
| 1.2.4 真核质粒转染实验 |
| 1.2.5 重组CP蛋白的大量诱导及纯化 |
| 1.2.6 重组CP蛋白兔多克隆抗体的制备 |
| 1.2.7 Western Blotting分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CP蛋白基因原核与真核质粒构建结果 |
| 2.2 重组CP蛋白基因原核表达结果 |
| 2.3 重组CP基因在真核细胞中表达结果 |
| 2.4 Western Blotting检测抗重组CP蛋白的兔多克隆抗体 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）HCV对幼龄树鼩感染实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 插图和附表清单 |
| 英文缩写表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丙型肝炎与丙型肝炎病毒 |
| 1.1.1 丙型肝炎 |
| 1.1.2 丙型肝炎病毒 |
| 1.2 丙型肝炎病毒基因组序列变异 |
| 1.2.1 HCV基因组变异的高度异质性 |
| 1.2.2 HCV基因组变异的非均一性 |
| 1.3 丙型肝炎病毒的感染与复制机制 |
| 1.3.1 CD81受体 |
| 1.3.2 SR-BⅠ受体 |
| 1.3.3 Claudin-1受体 |
| 1.3.4 Occludin受体 |
| 1.3.5 LDLR受体 |
| 1.4 丙型肝炎发病机制及免疫应答 |
| 1.4.1 丙型肝炎病毒的直接致病作用 |
| 1.4.2 丙型肝炎病毒的免疫损伤机制 |
| 1.4.3 丙型肝炎病毒感染慢性化机制 |
| 1.5 慢性丙型肝炎的抗病毒治疗 |
| 1.5.1 干扰素(IFN) |
| 1.5.2 利巴韦林(Ribavirin) |
| 1.5.3 聚乙二醇化干扰素(PEG-IFN) |
| 1.6 丙型肝炎病毒细胞模型 |
| 1.6.1 原代细胞系 |
| 1.6.2 非原代细胞系 |
| 1.6.3 转染细胞系 |
| 1.7 丙型肝炎动物模型 |
| 1.7.1 黑猩猩(Chimpanzee) |
| 1.7.2 猴(Monkey) |
| 1.7.3 小鼠(Rat) |
| 1.7.4 树鼩(Tree shrew,Tupaia belangeri) |
| 1.8 树鼩模型在人类病毒性疾病研究中的应用 |
| 1.8.1 肝炎病毒 |
| 1.8.2 肠道病毒EV71(Human enterovirus 71,EV71) |
| 1.8.3 单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV) |
| 1.8.4 流感病毒(Influenza virus) |
| 1.8.5 轮状病毒(Rotavirus) |
| 1.8.6 基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV) |
| 1.8.7 腺病毒(Adenovirus,ADV) |
| 1.9 本研究的意义 |
| 第二章 H C V对幼龄树鼩的感染研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验药品与试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1. 攻毒 |
| 2.3.2 血液及样本采集 |
| 2.3.3. 血常规的检测 |
| 2.3.4 ALT的检测 |
| 2.3.5 HCV的定性 |
| 2.3.7 病理切片检查 |
| 2.3.8 免疫组化检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 血常规检查结果 |
| 2.4.2 ALT检测结果 |
| 2.4.3 HCV定性结果 |
| 2.4.4 HCV定量结果 |
| 2.4.5 病理切片的检查 |
| 2.4.6 免疫组化检测结果 |
| 第三章 讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
| 附录B 其他要说明的内容 |
| 附件 |
（5）丙型肝炎病毒对树鼩感染性及其变异特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 插图与附表清单 |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丙型肝炎与丙型肝炎病毒 |
| 1.2 丙肝病毒生物特性 |
| 1.3 丙型肝炎的检测、治疗及预防 |
| 1.3.1 丙型肝炎的检测 |
| 1.3.2 丙型肝炎的治疗 |
| 1.3.3 丙型肝炎的预防 |
| 1.4 丙肝病毒细胞模型研究 |
| 1.4.1 HCV感染肝细胞模型 |
| 1.4.2 HCV感染非肝细胞模型 |
| 1.4.3 HCV转基因类细胞模型 |
| 1.5 丙肝病毒动物模型研究 |
| 1.5.1 黑猩猩动物模型 |
| 1.5.2 猴动物模型 |
| 1.5.3 小鼠动物模型 |
| 1.5.4 树鼩动物模型 |
| 1.6 原代细胞的分离与培养 |
| 1.6.1 原代细胞的分离 |
| 1.6.2 原代细胞的培养 |
| 1.7 基因序列的多变性 |
| 1.7.1 HVR1区 |
| 1.7.2 HVR1区与机体免疫的关系 |
| 1.8 本研究的意义 |
| 1.9 实验技术路线 |
| 第二章 HCV感染树鼩原代肝细胞初步研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂及主要设备 |
| 2.2.3 树鼩原代肝细胞的分离培养 |
| 2.2.4 Huh7.5.1细胞及病毒的培养 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR检测病毒载量 |
| 2.2.6 不同感染复数对树鼩原代肝细胞生长的影响 |
| 2.2.7 HCV感染树鼩原代肝细胞及检测 |
| 2.2.8 感染后细胞跟踪检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 树鼩原代肝细胞的培养 |
| 2.3.2 树鼩原代肝细胞增殖情况 |
| 2.3.3 huh7.5.1细胞培养上清病毒载量检测 |
| 2.3.4 不同感染复数对PTH细胞生长的影响 |
| 2.3.5 病毒对肝细胞的感染性检测 |
| 2.3.6 感染后细胞检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 HCV感染树鼩模型的初步研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂及主要设备 |
| 3.2.3 树鼩的感染与样本采集 |
| 3.2.4 树鼩体内接种HCV后生化指标检测 |
| 3.2.5 注射HCV后树鼩血清中病毒检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 接种HCV后树鼩血清中生化指标检测结果 |
| 3.3.2 接种HCV后树鼩血清中病毒定性检测结果 |
| 3.3.3 接种HCV后树鼩血清中病毒载量检测结果 |
| 3.3.4 病毒载量与生化指标关系 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 感染PTH及树鼩后HCV HVR区突变分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂及主要设备 |
| 4.2.3 HVR1区基因的扩增 |
| 4.2.4 目的片段的富集与纯化 |
| 4.2.5 目的片段的测序 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 目的片段的扩增结果 |
| 4.3.2 HVR1区核酸序列分析 |
| 4.3.3 HVR1区氨基酸序列变化分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士期间发表论文目录附录 |
| 附录B 其他需要说明的内容 |
（6）猪瘟病毒Erns、NS4A、NS4B、NS5A蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪瘟病毒的分类及其结构特性 |
| 1.2 猪瘟病毒的致病机理研究 |
| 1.2.1 免疫抑制 |
| 1.2.2 免疫逃避 |
| 1.2.3 出血机制 |
| 1.3 猪瘟病毒基因组结构及其功能蛋白的特性 |
| 1.3.1 CSFV的非编码区 |
| 1.3.2 CSFV的非结构蛋白 |
| 1.3.3 CSFV的结构蛋白 |
| 1.4 非结构蛋白NS4A、NS4B和NS5A及结构蛋白E~(rns)的研究进展 |
| 1.4.1 NS4A蛋白 |
| 1.4.2 NS4B蛋白 |
| 1.4.3 NS5A蛋白 |
| 1.4.5 E~(rns)蛋白 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞、质粒与菌株 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 引物及载体构建策略 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 试剂配制 |
| 2.1.7 感受态细胞的制备 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 基因的克隆 |
| 2.3.2 构建原核表达载体 |
| 2.3.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.4 纯化重组蛋白 |
| 2.3.5 免疫小白鼠制备多抗血清 |
| 2.3.6 多克隆抗体的特异性 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 总体实验设计及所用引物 |
| 3.2 猪瘟病毒E~(rns)蛋白的原核表达及多抗的制备 |
| 3.2.1 E~(rns)表达区域的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列 |
| 3.2.2 猪瘟病毒E~(rns)基因的克隆 |
| 3.2.3 构建E~(rns)基因的原核表达载体 |
| 3.2.4 E~(rns)重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.5 E~(rns)重组蛋白表达形式的鉴定与纯化 |
| 3.2.6 Western Blot鉴定E~(rns)重组蛋白 |
| 3.2.7 抗E~(rns)多克隆抗体与纯化的重组蛋白的反应性 |
| 3.2.8 抗E~(rns)多克隆抗体与CSFV感染PK-15细胞中E~(rns)蛋白的反应性 |
| 3.3 猪瘟病毒NS4A蛋白的原核表达及多抗的制备 |
| 3.3.1 NS4A表达区域的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列 |
| 3.3.2 猪瘟病毒NS4A基因的克隆 |
| 3.3.3 构建NS4A基因的原核表达载体 |
| 3.3.4 原核表达载体PET-NS4A的诱导表达 |
| 3.3.5 NS4A重组蛋白表达形式的鉴定与纯化 |
| 3.3.6 Western Blot鉴定NS4A重组蛋白 |
| 3.3.7 抗NS4A多克隆抗体与NS4A重组蛋白的反应性 |
| 3.3.8 抗NS4A多克隆抗体与CSFV感染的PK-15细胞中NS4A蛋白的反应性 |
| 3.4 猪瘟病毒NS4B蛋白的原核表达及多抗的制备 |
| 3.4.1 NS4B表达区域的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分析 |
| 3.4.2 猪瘟病毒NS4B基因的克隆 |
| 3.4.3 构建NS4B基因的原核表达载体 |
| 3.4.4 诱导NS4B基因原核表达载体表达蛋白 |
| 3.4.5 NS4BΔ205-347重组蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.4.6 Western Blot鉴定NS4BΔ205-347重组蛋白 |
| 3.4.7 抗NS4BΔ205-347多克隆抗体与重组蛋白的反应性 |
| 3.4.8 抗NS4BΔ205-347多克隆抗体与真核表达NS4B蛋白的反应性 |
| 3.4.9 抗NS4BzΔ205-347多克隆抗体与CSFV感染PK-15细胞中NS4B蛋白的反应性 |
| 3.5 猪瘟病毒NS5A蛋白的原核表达及多抗的制备 |
| 3.5.1 NS5A表达区域的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列 |
| 3.5.2 猪瘟病毒NS5A基因的克隆 |
| 3.5.3 构建NS5A基因的原核表达载体 |
| 3.5.4 原核表达载体PET-NS5A的诱导表达 |
| 3.5.5 NS5A蛋白表达形式的鉴定及纯化 |
| 3.5.6 NS5A重组蛋白的Western Blot分析 |
| 3.5.7 抗NS5A多克隆抗体与重组蛋白的反应性 |
| 3.5.8 抗NS5A多克隆抗体与PK-15细胞中真核表达的NS5A蛋白的反应性 |
| 3.5.9 抗NS5A多克隆抗体与CSFV感染PK-15细胞中NS5A蛋白的反应性 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 免疫原的选择 |
| 4.2 猪瘟病毒E~(rns)、NS4A、NS4B、NS5A的原核表达策略 |
| 4.3 可溶性抗原的制备 |
| 4.4 多克隆抗体的反应性和特异性 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）靶向HCV包膜蛋白的信标适体应用于病毒检测的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 丙型肝炎病毒研究概况 |
| 1.1.1 丙型肝炎病毒基因组 |
| 1.1.2 丙型肝炎病毒粒子结构 |
| 1.1.3 丙型肝炎病毒生活周期 |
| 1.1.4 丙型肝炎病毒蛋白的结构和功能 |
| 1.1.5 HCV 包膜蛋白 E1、E2 的功能介绍 |
| 1.1.6 丙型肝炎的传播途径 |
| 1.1.7 丙型肝炎的流行病学 |
| 1.2 丙型肝炎的诊断与治疗 |
| 1.2.1 丙型肝炎的临床诊断和实验室诊断方法 |
| 1.2.2 丙型肝炎的临床治疗 |
| 1.3 核酸适体及其应用 |
| 1.3.1 核酸适体 |
| 1.3.2 核酸适体探针的筛选—SELEX 技术 |
| 1.3.3 核酸适体在生物医学中的应用 |
| 1.3.4 分子信标核酸适体—核酸适体技术与分子信标原理的结合 |
| 1.4 本课题的研究方案及目的 |
| 第2章 丙型肝炎包膜蛋白 E1E2、E1、E2 的原核表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.2.1 质粒及菌种 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 重组质粒 pET28b- E1E2、pET32a-E1、pET32a-E2 的构建 |
| 2.3.2 E1E2、E1、E2 蛋白的小量诱导表达与鉴定 |
| 2.3.3 HCV E1E2、HCV E1、HCV E2 蛋白的大量表达和纯化 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.4.2 蛋白的表达及鉴定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 特异性识别 HCV 包膜蛋白 E1E2 的核酸适体的筛选与鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料及仪器设备 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 HCV E1E2 蛋白核酸适体的筛选 |
| 3.3.2 特异性识别 HCV 包膜蛋白的核酸适体特异性鉴定 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基于信标适体对 HCV 包膜蛋白的特异性识别研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 MBAs 对重组 HCV 包膜蛋白检测的可行性分析 |
| 4.3.2 MBA3 特异性识别原核表达的 HCV 包膜蛋白 |
| 4.3.3 MBA3 检测被 HCVcc 感染的 Huh7.5 cells 上清的检测 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 MBAs 检测重组 HCV 包膜蛋白的可行性分析结果 |
| 4.4.2 实验条件优化结果 |
| 4.4.3 MBA3 检测原核表达的重组包膜蛋白 |
| 4.4.4 MBA3 检测包膜蛋白 E2 的检出限以及标准曲线的绘制 |
| 4.4.5 MBA3 检测被 HCVcc 感染的细胞上清中包膜蛋白 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读学位期间参与项目与发表论文 |
| 附录 B 常用自配试剂的配制方法 |
| 附录 C 非变性法纯化蛋白所用试剂 |
| 致谢 |
（8）丙型肝炎病毒6型和2型分子遗传学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 前言 |
| HCV的分子生物学特性 |
| HCV功能性蛋白 |
| HCV的生命周期 |
| HCV命名和基因分型 |
| HCV命名 |
| HCV分型方法 |
| HCV分型的意义 |
| HCV的全球流行情况 |
| 本研究的主要内容 |
| 参考文献 |
| 第一章 HCV 6 型变异株全基因组分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 HCV 2 型分离株遗传多样性研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）丙型肝炎疫苗研究的新理念、挑战与策略（论文提纲范文）
| 1 HCV感染后的保护性免疫应答及持续感染的机制 |
| 1.1 HCV感染后的保护性免疫应答尽管宿主免 |
| 1.2 HCV持续感染的机理尽管对HCV感染后机 |
| 2 HCV疫苗面临的挑战和新理念 |
| 3 当前HCV疫苗研究的现状 |
| 3.2 DNA疫苗自上世纪90年代, DNA免疫的研究 |
| 3.3 病毒载体疫苗复制缺陷性腺病毒载体和痘 |
| 3.4 DC为载体的细胞疫苗用带有抗原基因的载 |
| 3.5 重组多表位疫苗重组多表位疫苗因其可以 |
| 4 展望 |
（10）基于HCV 6Kb扩增子的动态准种优势株的确定及包膜2基因正选择位点分析（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 基于HCV 6Kb扩增子的动态准种优势株的确定及包膜2基因正选择位点分析 |
| 前言 |
| 第一部分 基于HCV 6Kb 扩增子的动态准种优势株鉴定方法的建立 |
| 前言 |
| 试剂与材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 基于HCV 6Kb 长序列的E2 基因正选择位点分析及功能意义 |
| 前言 |
| 试剂与材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结与研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一丙型肝炎病毒免疫逃逸的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间主要工作成绩 |
四、中国人丙型肝炎病毒膜蛋白和非结构区1(E1,E2/NS1)的基因克隆和序列分析（论文参考文献）
- [1]丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究[D]. 夏静. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [2]Caspase依赖的DDX21切割调控抗病毒先天性免疫机制研究[D]. 武炜. 中国农业科学院, 2019(08)
- [3]新疆准噶尔盆地周边地区蜱与鼠类携带虫媒病毒的调查研究[D]. 寇春. 新疆大学, 2016(06)
- [4]HCV对幼龄树鼩感染实验研究[D]. 殷安国. 昆明理工大学, 2014(01)
- [5]丙型肝炎病毒对树鼩感染性及其变异特性研究[D]. 庞义全. 昆明理工大学, 2014(01)
- [6]猪瘟病毒Erns、NS4A、NS4B、NS5A蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备[D]. 尹珊. 广西大学, 2013(03)
- [7]靶向HCV包膜蛋白的信标适体应用于病毒检测的研究[D]. 余琴琴. 湖南大学, 2013(04)
- [8]丙型肝炎病毒6型和2型分子遗传学研究[D]. 袁治国. 中山大学, 2012(09)
- [9]丙型肝炎疫苗研究的新理念、挑战与策略[J]. 贾战生,马力,韦三华,姚志强. 临床肝胆病杂志, 2011(01)
- [10]基于HCV 6Kb扩增子的动态准种优势株的确定及包膜2基因正选择位点分析[D]. 朱研. 第三军医大学, 2010(04)