一、人绒毛膜促性腺激素对小鼠睾丸、附睾表皮生长因子和睾酮的影响（论文文献综述）
杨喆[1]（2021）在《多聚嘧啶束结合蛋白1对小鼠血睾屏障完整性和支持细胞自噬的影响》文中提出目的:睾丸支持细胞（Sertoli cells,SCs）是构成生精小管管壁结构的重要组成之一,其参与形成的血睾屏障(Blood-testis barrier,BTB在维护生精细胞的生长、发育以及精子的形成中起着不可或缺的作用。多聚嘧啶束结合蛋白1（polypyrmidine tract-binding protein 1,PTBP1）是调节前体m RNA剪接和选择性剪接事件的关键蛋白,其不仅能促进精原细胞增殖,也能调控紧密连接（Tight junction,TJ）相关蛋白的表达。PTBP1还可以通过激活PI3K/Akt通路和抑制自噬来促进细胞生长,而PI3K/Akt通路和自噬活性均在支持细胞维持血睾屏障完整性中起重要作用。因此,我们在观察到睾丸支持细胞PTBP1的表达随着年龄增长显着降低的基础上,进一步探索PTBP1是否通过影响紧密连接相关蛋白分子表达和自噬来调控血睾屏障的完整性。方法:1.收集2月龄、6月龄和18月龄小鼠的左侧睾丸,经HE染色和透射电镜观察不同年龄段小鼠睾丸的组织光镜结构和超微结构特征变化;2.收集2月龄、6月龄和18月龄小鼠的右侧睾丸,经蛋白印迹（Western blot）、实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time q PCR）和免疫荧光染色检测PTBP1的表达变化;3.取2月龄、6月龄和18月龄小鼠的附睾尾部精子,通过透明质酸酶HYD活性检测和体外受精穿卵率检测精子活性;4.以胶原酶IV与胰酶联合消化的方法分离与培养小鼠原代SCs,经免疫组化和免疫荧光分别检测SCs特异性标志分子SOX-9和Wt-1来鉴定细胞纯度,并通过免疫荧光染色检测PTBP1在原代SCs中的表达;5.原代SCs分别转染重组慢病毒Lv-sh-EGFP和Lv-sh PTBP1-EGFP,三天后在荧光显微镜下观察EGFP的表达鉴定病毒转染率,并通过Western blot和Real-time q PCR法检测PTBP1、TJ相关蛋白（ZO-1、occludin和claudin-5）的表达;6.原代SCs传代至Trans-well板中,分别转染重组慢病毒Lv-sh-EGFP和Lv-sh PTBP1-EGFP,三天后通过跨上皮细胞电阻（Trans epithelium electrical resistant TEER）法检测BTB的通透性;7.原代SCs分别转染重组慢病毒Lv-sh-EGFP和Lv-sh PTBP1-EGFP,三天后通过Western blot检测PI3K/Akt/m TOR通路及自噬相关分子（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1和p62）表达变化;8.原代SCs分别转染重组慢病毒Lv-EGFP和Lv-PTBP1-EGFP,三天后在荧光显微镜下观察EGFP的表达鉴定病毒转染率,并通过Western blot和Real-time q PCR法检测PTBP1的表达。9.原代SCs分别转染重组慢病毒Lv-EGFP、Lv-PTBP1-EGFP以及PI3K通路抑制剂LY294002,三天后通过Western blot检测PI3K/Akt/m TOR通路及自噬相关分子（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1和p62）表达变化;Western blot和Real-time q PCR法检测TJ相关蛋白（ZO-1、occludin和claudin-5）的表达,TEER检测BTB的通透性。10.通过睾丸网微注射法,在6周小鼠睾丸后缘睾丸纵膈处分别注射慢病毒Lv-EGFP、Lv-sh PTBP1-EGFP和Lv-PTBP1-EGFP,并在第7天、14天、28天进行补充注射,四周后冰冻切片荧光显微镜观察感染结构;透射电镜观察睾丸组织SCs的TJ结构变化。结果:1.HE染色和透射电镜观察结果:2月龄与6月龄小鼠睾丸组织结构完整,生精细胞层次分明,精子HYD活性及体外受精率无明显差异;18月龄小鼠睾丸组织的生精上皮排列紊乱,层数进一步减少,多数精原细胞出现空泡样改变,部分管腔中可见大量脱落的生精细胞,SCs与相邻生精细胞之间连接松散,在透射电镜下发现SCs之间的TJ结构松散,连接缺失;2.Western blot、Real-time q PCR和免疫荧光检测PTBP1的结果:18月龄小鼠睾丸组织PTBP1阳性细胞数量减少、PTBP1在蛋白水平和m RNA水平表达显着降低。3.透明质酸酶HYD活性检测和体外受精穿卵率检测精子活性:18月龄小鼠的精子HYD阳性率和活性强度以及体外受精率明显下降。4.成功分离培养原代SCs,PTBP1在原代SCs中稳定表达。5.原代SCs分别成功转染重组慢病毒Lv-EGFP和Lv-sh PTBP1-EGFP;Lv-sh-PTBP1组的PTBP1在蛋白水平和m RNA水平表达显着降低,TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5在蛋白水平和m RNA水平表达均明显降低。6.TEER检测BTB的通透性结果:Lv-sh-PTBP1组细胞电阻降低,BTB的通透性增大。7.Western blot检测PI3K/Akt/m TOR通路及自噬相关分子表达结果:Lv-sh-PTBP1组p-PI3K、p-Akt、p-m TOR表达降低,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表达明显升高,p62表达降低。8.原代SCs分别成功转染重组慢病毒Lv-EGFP和Lv-PTBP1-EGFP;Lv-PTBP1组的PTBP1在蛋白水平和m RNA水平表达显着增高。9.原代SCs分别转染重组慢病毒Lv-EGFP、Lv-PTBP1-EGFP和PI3K通路抑制剂LY294002后:Lv-PTBP1组电阻增高,BTB的通透性降低,TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5在蛋白水平和m RNA水平表达均明显增高;LY294002组电阻降低,BTB的通透性增大,TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5在蛋白水平和m RNA水平表达均明显降低;Lv-PTBP1组p-PI3K、p-Akt、p-m TOR表达增高,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及Beclin1表达明显降低,p62表达升高;LY294002组p-PI3K、p-Akt、p-m TOR表达降低,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及Beclin1表达明显升高,p62表达降低。10.通过睾丸网微注射Lv-EGFP、Lv-sh PTBP1-EGFP和Lv-PTBP1-EGFP后结果:Lv-sh-PTBP1组的睾丸组织PTBP1在蛋白水平表达显着降低,TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5在蛋白水平表达均明显降低,TJ超微结构不完整;Lv-PTBP1组的睾丸组织PTBP1在蛋白水平表达显着增高,TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5在蛋白水平表达均明显升高,TJ超微结构紧密。结论:随着年龄增高,小鼠睾丸SCs内PTBP1的表达降低,PTBP1可能通过调节PI3K/Akt/m TOP通路影响TJ相关蛋白的表达,同时影响SCs的自噬,从而改变BTB的完整性,导致维护生精细胞正常发育的微环境发生变化。
覃道锐[2]（2020）在《HOXA4基因在尿道下裂尿包皮组织中的表达及意义研究及SIS材料覆盖尿道外层在尿道下裂比格犬动物模型上的应用》文中认为尿道下裂是小儿泌尿生殖系统常见的先天性畸形之一,发病率在1/300-1/125的出生男婴之间。我国近年尿道下裂发病率亦呈明显上升趋势。由于尿道下裂患者不能正排尿及射精,将严重影响患者的生活。目前认为尿道下裂与内分泌因素、环境因素、遗传因素等多种原因相关。但是,这些仅能解释约30%的尿道下裂。还有大部分尿道下裂不能解释。近年来,随着全基因组测序技术的发展及广泛应用。有更多可能与尿道下裂相关基因位点被筛选报道出来。有文章报道通过全基因组关联（GWAS）研究,发现HoxA4基因可能参与了尿道下裂疾病的发生发展过程。HoxA4基因是HOX基因家族成员,该基因定位于7号染色体上。编码一种DNA结合转录因子,参与调节基因表达及组织形态分化过程。但是GWAS相关研究的各种设计方法以及遗传统计学方法无法消除人群混杂、多重比较造成的假阳性。HOXA4基因是否真的参与了尿道下裂的发病过程需要进一步研究。目前外科手术是尿道下裂的唯一治疗方法。但尿道下裂修复手术中,容易出现各种并发症,其中尿道瘘是尿道下裂修复手术最常见对并发症。许多小儿泌尿外科医生为减少尿道下裂术后尿道瘘作出了不懈努力。常见的减少尿道下裂术后瘘的方法是手术中在新成形的尿道外层添加额外覆盖。常见的覆盖材料是患者手术区域临近的自体筋膜。但制备自体筋膜是一个耗时的过程,同时在多次手术等特殊情况下可能导致自体筋膜匮乏。小肠粘膜下层是一个在临床上有成熟使用经验的生物材料。它被广泛是应用在包括泌尿外科在内的多个专科的组织修复手术中。但该材料作为一种额外的覆盖材料使用在尿道下裂手术中的经验并不多。为了探究尿道下裂的发生过程以及临床治疗,我们进行了该研究。本研究分两部分,第一部分是关于尿道下裂发生原因的探讨;第二部分是SIS材料在减少尿道下裂常见并发症之一的尿道瘘上的应用。第一部分HoxA4基因在尿道下裂尿包皮组织中的表达及意义研究目的研究尿道下裂患儿包皮及及令苯二甲酸己酯诱导的小鼠尿道下裂模型小鼠阴茎中HoxA4基因及其蛋白的表达情况,初步研究HoxA4基因与尿道下裂发生的相关性。方法本研究分为两部分,其一是基础研究部分,其二是临床应用研究方面。在基础研究方面首先,选取正常包茎儿童的包皮与轻、中、重各型尿道下裂患儿的包皮做对照,分别用实时定量PCR方法及免疫组织化学方法测量HOXA4基因的mRNA及蛋白表达水平。其次,建立邻苯二甲酸酯（DEHP）诱导小鼠尿道下裂的动物模型。采用RT-PCR及免疫组织化学方法,进一步研究HOXA4基因在尿道下裂患病胎鼠及正常对照胎鼠阴茎组织中的mRNA及蛋白表达水平。结果DEHP诱导小鼠尿道下裂动物模型复制成功。HoxA4基因在包茎及包皮过长的患者标本中与尿道下裂包皮以及小鼠阴茎组织都有转录,及蛋白表达。与内参基因GAPDH相比,各组相对转录水平分别是:普通包皮组1.501±0.063、轻度尿道下裂1.101±0.147,中度尿道下裂1.099±0.140、重度尿道下裂0.539±0.056。普通包皮组HoxA4转录水平要高于尿道下裂组（p<0.001）。尿道下裂组内部比较轻、中度尿道下裂HoxA4基因转录水平要高于重度尿道下裂（p<0.001）。轻、中度尿道下裂间HoxA4基因mRNA转录水平差别无统计学意义（p=0.964）。结论 DEHP诱导小鼠构建胎鼠尿道下裂模型稳定有效,HoxA4基因表达可能参与了尿道下裂疾病的发生,是部分尿道下裂的原因。第二部分SIS材料覆盖尿道外层在尿道下裂比格犬动物模型上的应用目的:评价SIS组织尿道外层覆盖在修复犬尿道下裂模型中作用及观察SIS组织在犬尿道外层中降解过程。方法与材料:对22只健康雄性比格犬为试验对象。用随机数字表方法将犬随机分为试验组与对照组,每组11只犬。实验动物在戊巴比妥钠静脉全麻下通过手术切开尿道3-5cm建立尿道下裂模型。对照组常规手术修复尿道,试验组尿道外覆盖SIS组织材料,对照组尿道外不覆盖任何材料。将两组动物对尿道海绵体拨向两旁,使尿道与皮肤之间形成空腔,再缝合皮肤。术后注射头孢维星钠一次。于术后4W、12W采用逆行膀胱尿道造影检查重建尿道情况,记录尿道瘘及尿道狭窄发生情况。两组动物术后2w、4w、12w按计划麻醉处死后取材手术部位阴茎,材料组织保存于Bouin’s染色液中,包埋、切片,进行HE染色及Mallory染色,进行组织学观察。结果:对照组及试验组均顺利完成手术。早期均有手术部位红肿,未特殊处理,4周内恢复正常。两组各有1例动物手术后初期阴茎不能正常缩回皮套内。两组动物术后体重增长正常,组间无明显生物学差异。尿道造影未见明确尿道狭窄存在,术后4周试验组1/3,对照组3/3例动物手术部位存在漏尿现象;术后12周,试验组1/5例,对照组3/5例动物手术部位存在漏尿现象。合计试验组尿瘘发生率25%（2/8）,对照组尿瘘发生率75%（6/8）。组织学检查对照组早期术区可见明显急性炎症细胞浸润,随恢复时间延长,急性炎症转变为慢性炎症,且逐渐减轻。早期尿道固有层不连续、上皮增生,尿道海绵体血管窦和小梁消失,随恢复时间延长,尿道上皮与天然尿道上皮结构相似,但之谜纤维结缔组织与海绵体组织之间无明显边界。Mallory染色见胶原纤维在此处相互交错,杂乱无序。试验组早期只在手术缝线处见急性炎症细胞浸润,材料区未见明显炎症细胞浸润,后期术区及材料区均见慢性炎症细胞,SIS替代部位与天然尿道结构相似;mallory染色早期见胶原纤维随修复材料平行生长,后期材料消失,胶原纤维规则生长。结论:在本试验中,SIS材料对比格犬术后的正常生命活动无明显影响,可以降低动物模型尿道瘘发生率,可减少术区急性炎症反应,自身分解能引起慢性炎症细胞浸润,可引导胶原纤维附着于SIS材料成规则生长,术后12周已未见明确材料。SIS材料在比格犬体内有较好的生物相容性,具有减少比格犬尿道手术瘢痕的可能性。
管斯琪[3]（2020）在《补肾生精法治疗少弱精子症及其调控生精细胞增殖与凋亡的研究》文中认为目的人类生育力逐年降低已经成为影响发展的医学和社会学问题,男性因素导致的不孕不育占了 40%-50%,其中少弱精子症是男性不育症最常见的病因之一。对于特发性精液异常,西药治疗效果欠佳,手术治疗的应用范围存在一定局限性,而中医药具有较好的疗效。菟枸助育汤是在五子衍宗丸的基础上加减化裁而来,临床用于治疗少弱精子症逾20年,但目前尚无相关的研究。故本研究设计临床试验,观察评价菟枸助育汤对男性不育少弱精子症患者的临床疗效,并设计动物实验探究菟枸助育汤的核心药对“菟丝子-枸杞子”对生精功能障碍模型大鼠生精功能的影响,并对其具体的作用机制进行探讨。方法临床研究:收集男性不育少弱精子症76例,采用无病例对照研究的方法,观察菟枸助育汤对少精子症和弱精子症受试者精液质量（包括精液液化状态、精液量、精子活动率、精子浓度和总数等指标）和中医证候评分的干预作用。入组时,采集所有受试者的一般信息、病史、合并用药、体格检查等相关资料。研究第1天起每日给予入组的受试者菟枸助育汤中药免煎颗粒治疗,疗程共90天,分别于第0、30、60、90天各进行一次访视,记录受试者的精液常规结果和中医证候评分,同时进行安全性观察,记录各类不良事件,填写病例报告表,每次访视时严格进行脱落、剔除的评估,最后统计所有数据。实验研究:1.将78只SD大鼠随机分为空白对照组（NC组）、模型对照组（GTW组）、左卡尼汀组（GTW+LEV组）、菟丝子-枸杞子药对组（GTW+SCFL组）和药对+抑制剂组（LY+SCFL组）。2.除NC组以外,其余各组用雷公藤多苷（40mg/kg）灌胃4周,建立生精功能障碍模型。3.第5周起GTW+LEV组（予10ml/kg左卡尼汀灌胃）、GTW+SCFL组（予菟丝子-枸杞子中药液灌胃）和LY+SCFL组（予菟丝子-枸杞子中药液灌胃）每日分别予以相应药物干预,LY+SCFL组于第1周起每周1次尾静脉注射PI3K抑制剂。4.实验8周后测定各组大鼠精子质量、附睾/睾丸脏器系数,检测性激素、抑制素B、附睾肉毒碱的水平,光镜下和透射电镜下观察睾丸的组织病理形态和细胞的超微结构,用免疫组化法、western blot以及Real-Time PCR技术检测大鼠睾丸组织SCF、c-kit、PI3K、p-Akt、Bad、Bcl-2 和 Bax 蛋白及 mRNA 的表达。结果临床研究:本研究共完成临床病例76例,纳入研究的男性不育少精子症和弱精子症患者经过菟枸助育汤治疗后,总体的精液质量中液化状态、PR精子百分比、PR+NP精子百分比、精子浓度和精子总数等疗效性指标显着改善,具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;中医证候评分随着治疗进行有了明显的下降（P<0.05或P<0.01）;疗效判定为“痊愈”的11例,“显效”29例,“有效”32例,“无效”4例,总有效率为94.74%。整个观察期间脱落病例4例,无剔除病例,未见任何不良反应报告。实验研究:经菟丝子-枸杞子干预后的GTW+SCFL组与GTW组相比,大鼠的一般状态、附睾脏器系数、精子质量、卵泡生成素（FSH）、黄体生成素（LH）、泌乳素（PRL）和附睾肉毒碱均有显着的改善,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;睾丸组织病理形态及细胞的超微结构观察发现,GTW+SCFL组与GTW组比较,生精小管结构、排列较正常,生精细胞明显增多,形态改善,内含的线粒体等细胞器增多;免疫组化、western blot和Real-Time PCR结果显示,与GTW组比较,GTW+SCFL组大鼠睾丸SCF、c-kit、PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白含量升高,Bax、Bad蛋白表达下降（P<0.05或P<0.01）;LY+SCFL组与GTW+SCFL组相比,SCF、c-kit和PI3K的表达无明显差异,p-Akt和Bcl-2表达减少,Bad和Bax的蛋白表达增加（p<0.05或P<0.01）。结论1.菟枸助育汤在改善男性不育少弱精子症患者的精液参数和肾虚证候中医评分方面疗效显着,能提高患者的生精功能。2.菟枸助育汤中的核心药对“菟丝子-枸杞子”可以改善生精功能障碍模型大鼠一般状态、附睾脏器系数、精子质量、FSH、LH、PRL和附睾肉毒碱,并对雷公藤多苷致睾丸组织和生精细胞的形态结构和功能的损伤具有较好的修复作用。3.“菟丝子-枸杞子”药对可以有效调控模型大鼠睾丸组织SCF、c-kit、PI3K、p-Akt、BAD、Bcl-2、Bax 蛋白及其 mRNA 的表达,通过调控 SCF/c-kit-PI3K-Bcl-2 信号通路促进生精细胞增殖和抑制生精细胞凋亡的作用。综上,菟枸助育汤可有效提高男性不育少弱精子症患者的生精功能,临床疗效显着,其作用机制可能是通过SCF/c-kit--PI3K--Bcl-2通路调控生精细胞增殖和凋亡来实现的。
王琪[4]（2020）在《双峰驼精清诱导排卵分子调控机制的研究》文中研究表明双峰驼（Camelus Bactrianus）是生存于荒漠和半荒漠草原地带的古老物种,是我国重要的优势畜种资源,具有重要的经济和科研价值。由于双峰驼是严格的季节性发情动物,其生长速度慢、生殖周期长、繁殖性能低,而且双峰驼排卵机理尚不清楚,故而本研究以双峰驼为研究对象,展开蛋白质组及差异蛋白功能的研究。首先,我们选取繁殖季节和非繁殖季节双峰驼（公驼）血清,通过蛋白质组学（i TRAQ）筛选出与生殖相关的差异蛋白,利用生物信息学及分子生物学进一步筛选和鉴定与激素合成分泌相关的差异蛋白-视黄醇结合蛋白（Retinol-Binding Protein 4,RBP4）,并通过体外细胞模型验证RBP4蛋白的功能;其次,通过i TRAQ技术筛选肌肉注射精清（Seminal Plasm,SP）诱导排卵后的卵巢组织差异表达蛋白质;利用内分泌学、组织形态学、影像学及分子生物学进一步筛选出可能参与调控诱导排卵的靶蛋白-钙离子/钙调依赖性蛋白激酶II-γ（Calcium/calmodulin kinase II-γ,CAMK2G）;最后,通过体外卵巢颗粒细胞模型研究CAMK2G对雌激素受体（ER）的调控机制。本研究所取得的结果如下。1.通过i TRAQ方法,共筛选出359个公驼的血清蛋白,基于1.2和0.8的倍数变化临界值,且p<0.05,共筛选出32种差异蛋白（11种上调和21种下调）;筛选和鉴定了5个与生殖相关的差异蛋白（PCGF5、H1.2、ANTXR2、FOLR1和RBP4）。2.RBP4在性腺轴中均有不同程度的表达,但在睾丸组织中RBP4表达水平较高;双峰驼支持细胞中添加不同浓度的Vit A,可以影响IGFs、RBP4和AR的表达水平,且对RBP4（负相关）和AR（正相关）有剂量依赖性;过表达（敲低）RBP4对IGFs的表达有抑制（促进）作用,并且同时下调（上调）AR的表达水平;RBP4可通过类固醇合成通路调控雄激素受体AR的表达。3.通过i TRAQ共筛选出404个卵巢差异表达蛋白,260个上调蛋白（SP组）,144个下调蛋白,进一步筛选出5个可能参与诱导排卵的差异蛋白（CAMK2G、FST、NR5A1、PAK1和PRL）;通过RT-PCR、Western blot和组织免疫荧光等发现,排卵前后差异蛋白在性腺轴及生殖器官中表达水平不同,推测诱导排卵过程均有性腺轴的参与。4.调控CAMK2G的表达水平对各受体及相关蛋白有不同影响;过表达/敲低CAMK2G可以上调/下调ER的表达水平;CAMK2G的特异性抑制剂KN-93可下调ER的表达水平;CAMK2G可通过介导17βHSD和P450scc的表达来调节类雌激素受体（ER）的表达水平。本研究揭示:RBP4与公驼的繁殖相关,主要参与调节雄激素的合成,故而推测RBP4可作为一个调控因子调控激素的合成分泌;CAMK2G通过参与类固醇通路调控雌激素受体的表达,推测CAMK2G可能是双峰驼诱导排卵过程的一个调控分子。
黄华[5]（2020）在《CRISPR/dCas9介导人成纤维细胞转分化为Leydig样细胞的研究》文中研究指明睾丸间质细胞（Leydig细胞）是分布在睾丸曲精小管之间的一群细胞,能分泌睾酮等雄性激素。体内正常水平的雄激素对维持男性儿童的青春期发育及成年男性的身心健康均起着重要作用,由于体内90%以上的雄激素由Leydig细胞产生,因此任何引起Leydig细胞功能障碍的因素均可造成体内雄激素水平低下或缺乏,即性腺功能低下症（Hypogonadism）。在儿童时期,性器官先天性疾病,睾丸肿瘤及外伤等导致睾丸切除;而对于成年人,日益增加的各种压力,环境污染,以及年龄等因素;均可以造成Leydig细胞的功能障碍。目前,针对雄激素缺乏症的治疗,雄激素补充疗法仍然是临床上常规的治疗方案;然而,近来的大量研究表明,长期应用雄激素会导致中风、心脏病及诱发前列腺癌等风险,其应用受到一定限制。因此,寻找一种新的疗法显得颇为重要。鉴于Leydig细胞移植具有替代雄激素缺乏症传统疗法的潜力,本课题研究利用CRISPR/dCas9的转录激活作用,直接诱导人包皮成纤维细胞转分化为能够分泌睾酮的Leydig样细胞,从而为雄激素缺乏的治疗提供一个新的策略。在本课题的体外实验中,首先通过Hsd3b-promoter-GFP、dCas9-VP64和MS2-P65-HSF1慢病毒感染人原代包皮成纤维细胞（HFFs）,以构建稳定表达的Hsd3bdCas9-MPH-HFFs细胞系,然后使用靶向Nr5a、Gata4和Dmrt1启动子区的sgRNA慢病毒共同感染上述构建的细胞系。实验结果显示,sgRNA慢病毒感染后4天,细胞形态发生变化,且可以在培养液中检测到睾酮,更为重要的是,在人绒毛膜促性腺激素（h CG）刺激下,这些细胞产生睾酮激素明显增加;流式细胞仪分析细胞重编程效率约为7.57%;这些转分化的细胞表达睾酮合成过程的关键酶（3βHSD、CYP11A1、CYP17A1和St AR）;进一步的表观遗传学分析发现,靶基因启动子区局部组蛋白乙酰化水平（H3K27ac）和甲基化水平（H3K4me3）明显增高。为了进一步研究这些转分化的细胞在体内能否提高血清睾酮水平,细胞移植后的定植及存活情况,本研究用基质胶（Matrigel）包被这些转分化的细胞注射至去势大鼠的睾丸白膜腔内;研究发现移植后大鼠血清睾酮水平得到明显提升;在短时间内,能部分模拟Leydig细胞在下丘脑-垂体-性腺轴中的作用;且移植的细胞能够在基质胶中定植及存活至少6周。总而言之,本课题利用CRISPR/dCas9介导的转录激活作用,同时激活与Leydig细胞密切相关的3个转录因子基因,使人包皮成纤维细胞转分化为能够分泌睾酮激素的Leydig样细胞,这将为各种原因引起的男性雄激素缺乏症的治疗提供了一个崭新的治疗策略,促进了细胞治疗的发展。
杨凯[6]（2020）在《曾庆琪教授辨治男性不育症的学术思想及润精汤治疗少弱精子症的临床和实验研究》文中研究指明目的本文首先对曾庆琪教授治疗男性不育症的学术思想和临证经验进行分析总结;在前期理论的基础上采用单盲、随机、阳性对照药物的临床研究方法初步探讨润精汤对特发性少弱精子症患者的临床有效性和安全性;然后在运用奥硝唑诱导建立的少弱精子症SD雄性大鼠模型的基础上,通过观察润精汤对少弱精子症模型大鼠精液质量、性激素水平、大鼠睾丸组织病理形态变化、睾丸组织细胞凋亡、睾丸波形蛋白表达和ERK信号通路表达的变化,初步探讨润精汤治疗少弱精子症的作用靶点和作用机制,为润精汤治疗特发性少弱精子症的临床应用提供科学依据。方法1.经验总结:对曾庆琪教授治疗男性不育症的学术思想和临证经验进行分析总结,从病因病机、辨病论治、诊断治法、方药配伍、优生助孕和预防调护等方面进行了详细论述。2.临床研究:采用单盲、随机、阳性对照药物的临床研究方法,将符合诊断标准和纳入标准的72例特发性少弱精子症患者随机分为试验组（润精汤）和对照组（还少胶囊）,每组36例,分别治疗3个月,记录两组患者治疗前后的精液质量（精液量、精子浓度、精子总数、精子前向运动百分率、精子总活动力）、性激素水平、中医症状评分、安全性指标和不良反应情况,评价润精汤的临床有效性和安全性。3.实验研究:将32只SD雄性大鼠采用单纯随机抽样方法分成四组,每组8只,分别为空白组、模型组、低剂量组和高剂量组。空白组予以生理盐水灌胃;模型组予以奥硝唑ORN（400mg/kg·d）灌胃;低剂量组予以润精汤（14g/kg）+奥硝唑ORN（400mg/kg·d）灌胃;高剂量组予以润精汤（56g/kg）+奥硝唑ORN（400mg/kg·d）灌胃,疗程四周。实验结束后,检测大鼠血清性激素指标（FSH、LH和T）、大鼠精液质量（精子浓度、精子前向运动百分率、精子总活动力和精子畸形率）,采用Western Blot和免疫组织化学法测定大鼠睾丸波形蛋白表达和睾丸ERK信号通路表达,采用TUNEL法检测大鼠睾丸组织细胞凋亡情况。结果1.临床研究:①试验组（润精汤）和对照组（还少胶囊）均能提高精液质量（精液量、精子浓度、精子总数、精子前向运动百分率、精子总活动力）、调节性激素水平和改善中医临床症状,从而提高患者配偶妊娠率和临床有效率,且试验组（润精汤）改善更为明显。②润精汤未见明显毒副作用及不良反应。2.实验研究:①精液质量:模型组大鼠精子浓度、精子总活动力、精子前向运动百分率低于空白组（P<0.05）,精子畸形率高于空白组（P<0.05）;低剂量组、高剂量组的精子总活动力高于模型组（P<0.05）,精子畸形率低于模型组（P<0.05）;低剂量组的浓度和精子前向运动百分率轻度高于模型组（P>0.05）;高剂量组的浓度和精子前向运动百分率高于模型组（P<0.05）。②性激素:各组黄体生成素（LH）无明显变化（P>0.05）;模型组卵泡刺激素（FSH）高于空白组（P<0.05）,低剂量组和高剂量组低于模型组（P<0.05）;模型组睾酮（T）低于空白组（P<0.05）,低剂量组和高剂量组高于模型组（P<0.05）。③睾丸组织病理形态变化:空白组大鼠睾丸组织中各曲细精管生精上皮形态规则、排列整齐和结构完整,生精小管管腔内可见各级分裂活跃、形态规则、排列整齐和结构完整的生精细胞和大量形态正常且成熟的精子。模型组大鼠睾丸组织中各曲细精管生精上皮形态紊乱、排列不整齐和结构松散,生精小管管腔内各级生精细胞排列紊乱,且大量减少,甚至脱落,精子和生精细胞数量明显减少,且形态明显异常,生精上皮部分变性可见大量空泡。低剂量组大鼠睾丸组织中各曲细精管生精上皮形态的规则性、排列的整齐性和结构的完整性较模型组有所改善,生精小管管腔内正常生精细胞数和形态正常且成熟的精子数较模型组也有所增加,脱落生精细胞数量有所减少。高剂量组大鼠睾丸组织病理形态结构较低剂量组进一步有所改善,接近于空白组。④睾丸组织细胞凋亡的变化:模型组生精小管管腔内可见大量生殖细胞凋亡,大鼠睾丸组织凋亡阳性细胞率明显高于空白组（P<0.01）。低剂量组和高剂量组生精小管管腔内可少量生殖细胞凋亡,低剂量组大鼠睾丸组织凋亡阳性细胞率明显低于模型组（P<0.05）,高剂量组大鼠睾丸组织凋亡阳性细胞率明显低于模型组（P<0.01）。⑤睾丸组织波形蛋白表达的变化:空白组睾丸组织波形蛋白主要分布于睾丸支持细胞的核周围,并且从基底区域向近腔小室延伸。模型组睾丸组织波形蛋白信号和分布范围与空白组比较明显减弱,波形蛋白表达量明显降低（P<0.001）。低剂量组和高剂量组的睾丸组织波形蛋白的主要分布从睾丸支持细胞的核周围区域向内腔延伸,并且波形蛋白在两组间分布也趋于正常,波形蛋白表达量明显高于模型组（P<0.01）。⑥睾丸组织ERK信号通路的变化:模型组大鼠睾丸组织p-ERK蛋白表达量明显高于空白组（P<0.001）;低剂量组和高剂量组大鼠的睾丸组织p-ERK蛋白表达量明显低于模型组（P<0.001）。结论1.润精汤是曾庆琪教授基于“精室理论”,根据精室的功能特点,总结出“通补并用”为核心的治疗法则,创制而成的治疗少弱精子症的经验方,药物组成有菟丝子、黄精、山药、枸杞、仙灵脾、水蛭、刺五加、红景天、陈皮、川牛膝,诸药具有“肝脾肾三脏兼顾、气血阴阳平调、补而不腻、通而不损”的特点,全方以补肾健脾为主,兼有补血养肝、活血通络、行气利湿的作用,本方治法较单补肾填精法或补肾活血法更为全面,更加符合当今大多数男性不育症的临床实际情况,尤其是对江南地区的患者更为适宜。2.润精汤和还少胶囊均能提高精液质量（精液量、精子浓度、精子总数、精子前向运动百分率、精子总活动力）、调节性激素水平和改善中医临床症状,从而提高患者配偶妊娠率和临床有效率,且润精汤改善更为明显。所以说润精汤是安全和有效的,且未见明显不良反应,有一定的临床推广价值。3.润精汤可以改善奥硝唑诱导的少弱精子症大鼠的精液质量、血清性激素和睾丸组织病理形态学变化,初步猜测可能与润精汤调控下丘脑-垂体-睾丸性腺轴,调节生殖内分泌激素的水平,改善睾丸微循环和精子生成的局部微环境有关;此外润精汤可上调睾丸波形蛋白的表达和下降p-ERK的表达,提高生殖细胞结构的稳定性和抑制大鼠生殖细胞的凋亡,促进生殖细胞增殖等,其作用机理可能与抗氧化应激有关。
俄倩男[7]（2020）在《镍致大鼠Leydig细胞类固醇合成障碍中lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的构建及相关机制研究》文中认为目的:通过建立硫酸镍（NiSO4）体外处理的大鼠睾丸间质（Leydig）细胞类固醇合成障碍模型,筛选显着性差异表达的长链非编码RNAs（lncRNAs）、微小RNA（miRNAs）以及mRNAs并验证,构建竞争性内源性RNA（ceRNA）调控网络并检测PI3K/Akt信号通路相关基因和蛋白的表达,探讨其在镍致大鼠Leydig细胞类固醇合成障碍中的作用机制。方法:（1）摘取大鼠睾丸,采用0.25%IV型胶原酶消化、Percoll密度梯度（5%、30%、58%和70%）离心法和体外差速贴壁培养得到纯化的Leydig细胞。（2）使用不同浓度NiSO4（0、250、500和1000μmol/L）处理处于对数生长期的Leydig细胞24 h,于倒置相差显微镜下观察细胞形态的改变。（3）采用MTT法对Leydig细胞存活率进行测定。（4）酶联免疫吸附试验（ELISA）用于检测在1 IU/mL人绒毛膜促性腺激素（hCG）存在下不同浓度NiSO4（0、250、500和1000μmol/L）处理24 h的Leydig细胞培养液中睾酮含量。（5）蛋白免疫印迹法（Western Blot）用于检测细胞中类固醇合成快速调节蛋白（StAR）和细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）蛋白表达水平。（6）大鼠Leydig细胞经0和1000μmol/L NiSO4处理24 h后,采用高通量测序技术检测差异表达的lncRNAs、miRNAs以及mRNAs,并对显着性差异mRNAs进行聚类分析。（7）基于基因本体学（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库对差异表达mRNAs进行功能注释和通路分析。（8）筛选出与类固醇合成有关的mRNAs,使用miRanda和PITA数据库预测与mRNAs具有负靶关系的miRNAs,以及与miRNAs具有负靶关系的lncRNAs,构建ceRNA网络。（9）使用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证随机选择的18个差异RNAs的表达水平,以及ceRNA网络参与基因在不同浓度NiSO4（0、250、500和1000μmol/L）处理下的剂量依赖关系。（10）使用RT-qPCR法和Western Blot法分别检测各浓度NiSO4处理下大鼠Leydig细胞Pik3r1、Akt1 mRNA和PI3K/Akt相关蛋白的表达水平。结果:（1）Leydig细胞在含有不同浓度NiSO4的培养液中处理24 h后,倒置显微镜下可见,1000μmol/L NiSO4组细胞的胞浆中相比于对照组产生大量且明显的空泡。MTT结果显示:随着NiSO4浓度的增加,各处理组细胞存活率逐渐降低（P<0.05）。（2）ELISA检测结果表明:和对照组相比,各处理组Leydig细胞培养上清液里睾酮水平随NiSO4剂量的增加而减少（P<0.05）。Western Blot法检测发现:和对照组比较,随着NiSO4浓度的增加,各处理组类固醇生成酶StAR和CYP11A1的蛋白表达水平逐渐降低（P<0.05）。（3）测序结果显示:共有372个lncRNAs（FC>2,P<0.05）,27个miRNAs（FC>2,P<0.05）以及3666个mRNA（FC>2,P<0.01,FDR<0.01）的表达在NiSO4的影响下被显着改变。GO和KEGG富集分析结果显示:与类固醇相关的功能和信号通路被显着富集（如MAPKs、PI3K/Akt信号通路等）。靶基因预测结果显示:与类固醇有关的15个mRNAs由16个miRNAs负靶向调控,这些miRNAs与75个lncRNAs具有负靶向作用关系,可构建ceRNA网络。（4）RT-qPCR结果显示:在18个被检测的RNAs中,有15个RNAs的表达与测序结果相符。验证了4条ceRNA网络,即LOC102549726/miR-760-3p/Atf6、LOC102549726/miR-760-3p/Ets1、LOC102549726/miR-760-3p/Sik和AABR07037489.1/miR-708-5p/Mapk14。验证剂量依赖关系的RT-qPCR检测结果显示:除Mapk14外,4条ceRNA网络参与基因的表达水平均随NiSO4浓度的增加呈现剂量依赖趋势,且与测序和RT-qPCR验证的表达趋势一致。（5）RT-qPCR结果显示:与对照组比较,随着NiSO4浓度的增加,各处理组Pik3r1表达逐渐升高（P<0.05）,500和1000μmol/L NiSO4组中Akt1 mRNA表达逐渐降低（P<0.05）。通过Western Blot法检测发现:各处理组PI3K和Akt总蛋白表达量无显着性差异（P>0.05）;而随着NiSO4浓度的增加,250、500和1000μmol/L NiSO4组磷酸化蛋白p-PI3K p85表达水平有降低趋势,差异无统计学意义（P>0.05）;1000μmol/L NiSO4组p-Akt的表达显着降低（P<0.05）;随着NiSO4剂量的升高,各处理组中p-PI3K p85/PI3K p85以及高浓度组p-Akt/Akt蛋白比率均显着下降（P<0.05）。结论:（1）非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）能够通过ceRNA网络机制（LOC102549726/miR-760-3p/Atf6、LOC102549726/miR-760-3p/Ets1、LOC102549726/miR-760-3p/Sik1和AABR07037489.1/miR-708-5p/Mapk14）参与调控镍诱导的大鼠Leydig细胞类固醇生成障碍。（2）镍可抑制大鼠Leydig细胞PI3K/Akt信号通路的激活,可能因此影响睾酮生成。
季小阳[8]（2019）在《建立知识驱动的迁移学习方法比较多物种的精子功能生物学特性》文中指出随着社会经济的不断发展,动物繁殖在畜牧业和动物生产中变的越来越重要。提高动物繁殖率可以不断扩大良种覆盖率,提高动物生产效率以及增加经济效益。其中精子生物学特性研究是动物繁殖学的核心内容,与物种的延续和遗传进化紧密相关。随着高通量测序技术以及生物信息技术的发展,基于已发表的海量文献,我们已经获得了较为详细的精子生物学基因功能、基因表达以及突变检测位点等基因组数据信息。但这些基因功能和细胞生物学先验知识主要集中在人类或者一些模式动物中,在不同物种的知识分布上却不平衡。当我们将研究对象确定为某一种畜牧动物时,却发现并没有可靠和足够的数据信息支持该物种的生物学研究。本研究针对这一问题,基于已发表的精子生物学海量文献、比较基因组学数据、功能基因组学数据以及知识驱动的自动化文献挖掘方法,构建多个物种的精子生物学特性的知识图谱,实现物种间精子生物学特性的知识迁移。具体的研究内容与结果如下:（1）以“公共健康”关键词的文献摘要作为对照组,构建“精子”生物学特性知识图谱。基于知识驱动的自动化文献挖掘统计方法,获得精子生物学特性相关的特异性基因1195个,特异性实体2162个,以及1195个基因与2162个实体之间的关联矩阵,作为标准模型。同时基于标准化知识分类,获得89个精子生物学特性实体类别,以及与该实体类别最相关的文献摘要信息。（2）结合IPA、KEGG数据库的信号通路的通路特征（pathway signatures）数据信息,获得精子生物学特性实体类别显着相关的信号通路（即精子生物学特性类别信号通路）,以及该信号通路所富集的基因。进一步分析,我们获得每一个精子生物学特性类别中被显着激活和被显着抑制的信号通路。以及187个信号通路中每一个信号通路被显着激活和被显着抑制所对应的精子生物学特性类别。（3）基于物种基因组学数据和同源基因组数据信息,构建蒙古族五畜“山羊、绵羊、双峰驼、马、牛”的精子生物学特性知识图谱。结合人类精子生物学特性的标准知识数据库和信号通路功能数据库,进行物种间精子生物学特性的知识迁移。我们发现11个精子生物学特性类别信号通路在5个物种中是显着保守的（z-score>5）,以及获得不同物种中特异性保守的精子生物学特性类别信号通路（z-score>3）。同时,在相对保守的110个精子生物学特性类别信号通路所富集的基因网络中（z-score>3）,发现RAF1、和EGF基因是网络中的枢纽基因。（4）在“马和驴、山羊和绵羊”两对近缘物种之间进行精物生物学特性的可迁移性评估。分别获得每对近缘物种之间显着保守且可以互相进行迁移的精子生物学特性类别信号通路,以及单个物种显着特异性保守且不可迁移的精子生物学特性类别信号通路（Z-score>5）。（5）在“单峰驼、双峰驼、羊驼、野生双峰驼”4个骆驼科物种之间进行精子生物学特性的可迁移性评估。获得4个物种之间显着保守且可以迁移的13个精子生物学特性类别信号通路,以及单个物种特异性保守且不可迁移的精子生物学特性类别信号通路（Z-score>3）。同样,还获得只在某一物种的精子生物学特性类别中没有被显着激活的信号通路,如“Toll-like Receptor Signaling”信号通路在羊驼的精子细胞DNA和蛋白质结构相关的生物学特性中没有被显着激活,而在单峰驼、双峰驼和野生双峰驼中被显着激活。因此,我们以精子生物学文献摘要作为知识背景,构建知识驱动的自动化文献统计挖掘方法绘制了精子生物学标准知识图谱。同时,采用迁移学习方法构建多物种精子比较功能生物学组,进而实现物种间精子生物学特性的可迁移性评估,为深入了解不同物种的精子生物学特性提供了一定的数据和理论基础。
焦涛[9]（2019）在《高脂饮食诱导的脂肪组织白色化对小鼠生精微环境的影响及其调控机制研究》文中研究指明目的:研究高脂饮食诱导的肥胖对小鼠生精微环境的影响以及白色化脂肪组织与小鼠生精微环境的信息交流机制。方法:建立高脂肪饮食诱导的肥胖疾病小鼠模型,利用（hematoxylinand eosin,HE）染色方法检测饮食诱导的肥胖对小鼠睾丸形态的影响,利用（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测肥胖小鼠睾酮以及（anti-Mullerian hormone,AMH）、（glialcellline-derived neurotrophic factor,GDNF）、（Inhibin,INH）的分泌。利用mRNA测序寻找肥胖小鼠与对照小鼠脂肪组织的差异基因。利用定量PCR,ELISA和（immunohistochemistry,IHC）等方法确定差异表达基因为脂肪细胞因子。在细胞水平上,通过定量PCR,WB,ELISA的方法验证脂肪细胞因子clusterin和resistin对TM3和TM4细胞分泌功能的影响。利用免疫共沉淀和免疫荧光的方法确定clusterin和resistin的相互作用受体,并利用si-RNA和小分子抑制剂处理TM3和TM4细胞,证明clusterin和resistin通过其相应的受体发挥功能。在体内水平,通过睾丸曲细精管显微注射的方法将clusterin和resistin注射到小鼠睾丸内,检测其对小鼠睾丸间质和支持细胞功能的影响。结果:高脂饮食诱导12周后,与正常饮食的对照组相比,肥胖小鼠体重增加,胰岛素、血糖、血脂等生化指标升高,炎症因子水平增加。睾丸体积减小,精子数目降低。HE染色结果显示肥胖小鼠睾丸生精小管直径减小,生精上皮厚度变薄。ELISA结果显示肥胖小鼠血清（Gonadotropin-releasing hormone,GnRH）、（luteinizing hormone,LH）、睾酮以及AMH、GDNF、INH的含量降低,雌二醇水平升高。定量PCR和WB结果显示合成睾酮的关键基因和转录因子P450scc（cytochrome p450 cholesterol side chain lyase）、P450c17（cytochrome p450 17α-hydroxylase）、StAR（steroidogenic acute regulatory protein）和 Nur77 的表达水平降低,Amh、Gdnf、Inha基因的表达水平也降低。肥胖和正常对照小鼠脂肪组织mRNA测序结果显示在肥胖小鼠的附睾白色脂肪组织eWAT（epididymal white adipose tissue）和腹股沟白色脂肪组织 iWAT inguinal white adipose tissue（inguinal white adipose tissue）中 clusterin和resistin的表达水平显着降低。通过定量PCR,ELISA的方法检测结果可知clusterin和resistin是由脂肪组织分泌的脂因子。分别用两种脂因子处理TM3和TM4细胞,定量PCR和WB结果结果显示这两种脂因子都抑制了 TM3细胞合成睾酮的基因P450scc、P450c17、StAR和Nur77的表达和睾酮的分泌。同时,这两种因子还抑制了 TM4细胞Amh、Gdnf、Inha基因的表达以及蛋白的分泌。免疫共沉淀和免疫双荧光的结果显示 VLDLR（very low density lipoprotein receptor）和 TLR4（Toll-like receptor 4）分别是 clusterin 和 resistin 在 TM3、TM4 细胞中的受体。clusterin 和 resistin睾丸曲细精管显微注射结果显示,在体内条件下,clusterin和resistin的注射导致小鼠睾丸体积变小,HE结果显示睾丸曲细精管生精上皮细胞严重脱落。同时通过定量 PCR,WB 的结果显示睾丸中 P450scc、P450c17、StAR、Nur77 和 Amh、Gdnf、Inha 以及 Jam（junctional adhesion molecule）、Zo-1（Zonula occludens）、Cldn11和Ocln的表达降低,ELISA结果显示睾酮和AMH、GDNF、INH的分泌减少。结论:高脂饮食诱导的肥胖小鼠睾丸减小,精子数目降低。高脂诱导的白色化脂肪组织通过分泌的clusterin和resistin抑制小鼠睾丸间质细胞睾酮的分泌和支持细胞AMH、GDNF、INH的分泌,从而破坏小鼠睾丸的生精微环境,导致睾丸和精子数目减少。
罗娇[10]（2018）在《神经生长因子对快速老化小鼠迟发性性腺机能减退症的治疗作用及其机制研究》文中研究表明目的:（1）探索神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）通过下丘脑-垂体-睾丸（Hypothalamus-pituitary-testis,HPT）轴升高性激素的调控靶点及其作用机制。（2）研究NGF对快速老化小鼠（SAMP8）迟发性性腺机能减退症（Late-onset hypogonadism,LOH）的治疗作用,以及对非梗阻性无精症小鼠（Nonobstructive azoospermia,NOA）精子再生的促进作用,为NGF应用于低促性腺激素性性腺机能减退症和神经相关生殖缺陷提供理论依据。方法:（1）采用阳离子脂质体载药体系,通过单次鼻腔滴注给药NGF（25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg）,酶联免疫吸附实验（ELISA）和放射免疫分析（RIA）方法检测血清促黄体生成素（Luteinizing hormone,LH）和睾酮浓度变化。（2）通过对比脑室注射、静脉注射NGF对性激素调控作用的不同,推测NGF调控性激素的作用靶器官;采用ELISA和荧光标记蛋白的方法,检测鼻腔滴注NGF的入脑分布,以及根据NGF与促性腺激素释放激素（Gonadotropinreleasing hormone,Gn RH）拮抗剂的联用实验进一步明确NGF作用的靶器官;运用荧光定量PCR（RT-PCR）和ELISA法确定NGF对下丘脑Gn RH表达和分泌的调控作用;采用免疫荧光技术（IF）检测NGF受体Trk A和p75与Gn RH的共定位表达,NGF与Trk A抑制剂或Kisspeptin抑制剂联用实验确定NGF调控性激素的作用靶点。（3）采用Gn RH神经元体外模型GT1-7细胞,检测NGF（10 ng/m L、50 ng/m L、100 ng/m L）给药处理对Gn RH表达和分泌的作用;Western blots法检测PKC和MAPK信号通路蛋白的表达变化;ELISA法检测Trk A抑制剂、PKC抑制剂、MEK1/2抑制剂对NGF调控Gn RH分泌的影响;启动子荧光素酶报告系统检测NGF对Gnrh1启动子活性的调控作用。（4）以10月龄的SAMP8小鼠为LOH模型,检测鼻腔滴注脂质体NGF（12.5μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg,每周2次,连续12周）对小鼠血清性激素、性行为、致孕率、精子质量、睾丸病理形态学和精原细胞分化相关标记蛋白表达的作用,老龄化相关的空间探索能力、四肢抓力、运动平衡性、脂质代谢的改变,综合评价NGF对LOH模型小鼠的治疗药效。（5）利用白消安诱导的NOA模型小鼠,检测鼻腔滴注脂质体NGF（25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg,每周2次,连续6周）对血清性激素、精子质量和睾丸病理形态学的影响,验证NGF对NOA模型小鼠的治疗药效。结果:（1）阳离子脂质体载药体系显着提高鼻腔滴注NGF对性激素的升高作用。（2）NGF通过HPT轴调控血清性激素的作用靶器官是下丘脑;鼻腔滴注NGF可分布于小鼠的下丘脑;下丘脑Gn RH神经元胞体表达Trk A受体;NGF-Trk A通路直接调控Gn RH的表达和分泌;NGF对Kisspeptin的表达和分泌无显着影响。（3）NGF-Trk A通过上调GT1-7细胞PKCα、p-ERK1/2、p-CREB的表达,激活PKC和MAPK信号通路调控Gn RH的分泌,NGF通过促进CREB磷酸化提高Gnrh1启动子活性从而调控Gnrh1 m RNA的转录。（4）鼻腔滴注脂质体NGF显着上调LOH模型小鼠的血清性激素水平,增强性行为能力,提高致孕率和精子质量,促进睾丸萎缩的恢复和精原细胞的分化,明显改善小鼠老龄化相关的空间探索能力、四肢抓力、运动平衡性,使LOH小鼠的生殖功能和老龄化状态恢复至Gn RH给药组水平,与正常对照的SAMR1小鼠相当。（5）鼻腔滴注脂质体NGF显着提高NOA模型小鼠的血清性激素水平,促进损伤睾丸的恢复和精子的再生,提高精子质量。结论:（1）NGF-Trk A可通过直接调控下丘脑Gn RH神经元,通过PKC和MAPK信号通路调控Gn RH的分泌,进而调控HPT轴功能升高血清性激素水平。（2）NGF有效改善低促性腺激素性LOH小鼠的HPT轴的分泌功能和性行为能力,促进精原细胞发育,提高精子质量和生殖功能,改善老龄化相关运动能力,对LOH小鼠具有明显的治疗药效。（3）NGF有效促进非梗阻性无精症小鼠睾丸的部分恢复和精子的再生。
二、人绒毛膜促性腺激素对小鼠睾丸、附睾表皮生长因子和睾酮的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人绒毛膜促性腺激素对小鼠睾丸、附睾表皮生长因子和睾酮的影响（论文提纲范文）
（1）多聚嘧啶束结合蛋白1对小鼠血睾屏障完整性和支持细胞自噬的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 支持细胞在血睾屏障中的作用机制的发展研究 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（2）HOXA4基因在尿道下裂尿包皮组织中的表达及意义研究及SIS材料覆盖尿道外层在尿道下裂比格犬动物模型上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 HOXA4基因在尿道下裂尿包皮组织中的表达及意义研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 SIS材料覆盖尿道外层在尿道下裂比格犬模型上的应用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料及方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（3）补肾生精法治疗少弱精子症及其调控生精细胞增殖与凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药诊治男性不育少弱精子症的研究进展 |
| 1 少弱精子症诱因 |
| 2 中医病名 |
| 3 中医病因病机 |
| 4 中医药治疗 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 生精细胞增殖、凋亡相关蛋白及通路的研究进展 |
| 1 精子发生的三个阶段 |
| 2 生精细胞的增殖 |
| 3 生精细胞的凋亡 |
| 4 生精细胞增殖、凋亡相关蛋白 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究 菟枸助育汤治疗男性不育少弱精子症的临床研究 |
| 前言 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 菟丝子-枸杞子对生精功能障碍SD大鼠生精功能的影响 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于SCF/c-kit--PI3K--Bcl-2通路探讨菟丝子-枸杞子调控生精细胞增殖与凋亡的作用机制 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）双峰驼精清诱导排卵分子调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 英文缩略表 |
| 第一章 综述 |
| 1.骆驼的生殖生理 |
| 1.1 骆驼的分类及分布 |
| 1.2 骆驼的生殖特性 |
| 1.3 骆驼生殖生理 |
| 2 视黄醇及其代谢过程 |
| 2.1 视黄醇与动物生殖 |
| 2.2 视黄醇结合蛋白RBP的研究进展 |
| 2.3 视黄醇结合蛋白的作用机理 |
| 2.4 视黄醇结合蛋白在生殖疾病方面的研究 |
| 3 钙离子及其代谢过程研究进展 |
| 3.1 钙离子的功能 |
| 3.2 钙离子与生殖 |
| 3.3 钙离子与钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ |
| 3.4 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的生理功能 |
| 3.5 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ与生殖相关疾病的关系 |
| 4 本实验的研究目的意义及创新点 |
| 第二章 双峰驼血清差异蛋白的筛选与鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 血清蛋白的提取 |
| 1.3.2 过滤辅助样品制备(FASP)消解 |
| 1.3.3 iTRAQ标记和SCX分馏 |
| 1.3.4 LC-MS/MS分析 |
| 1.3.5 数据分析 |
| 1.3.6 血清RNA的提取及qPCR反应 |
| 1.3.7 总蛋白的提取及蛋白免疫印迹 |
| 1.3.8 统计与分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 双峰驼血清iTRAQ分析 |
| 2.2 鉴定差异表达蛋白 |
| 2.3 聚类分析和蛋白质间互作网络(PPI)分析 |
| 2.4 qPCR和 Western blot验证表达谱 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 维生素A结合蛋白(RBP4)对AR的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞原代培养 |
| 1.2.2 体外细胞处理和转染 |
| 1.2.3 实时荧光定量PCR |
| 1.2.4 免疫组织化学染色 |
| 1.2.5 免疫荧光染色 |
| 1.2.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RBP4 基因在双峰驼各组织的mRNA检测 |
| 2.2 RBP4在双峰驼性腺轴的检测 |
| 2.3 不同浓度VitA对其受体,结合蛋白(RBP4)及IGFs的影响 |
| 2.4 RBP4过表达载体的构建及其酶切鉴定 |
| 2.5 支持细胞转染过表达p-EGFP-RBP4 的效果检测 |
| 2.6 过表达RBP4对IGFs及类固醇激素合成的影响 |
| 2.7 siRNA-RBP4 的合成及沉默效率检测 |
| 2.8 沉默RBP4对IGFs及类固醇激素合成通路的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 双峰驼精清诱导排卵后卵巢差异蛋白质筛选 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物和处理条件 |
| 1.2.2 精液收集和精清制备 |
| 1.2.3 精清注射及血清样品收集 |
| 1.2.4 样品的采集 |
| 1.2.5 qRT-PCR和 RT-PCR |
| 1.2.6 蛋白质印迹 |
| 1.2.7 组织免疫荧光染色 |
| 1.2.8 数据分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 卵泡直径和血清激素水平 |
| 2.2 蛋白质分析 |
| 2.3 差异表达蛋白的鉴定 |
| 2.4 蛋白质-蛋白质互作网络(PPI)分析 |
| 2.5 表达谱验证 |
| 2.6 组织表达分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 CAMK2G通过类固醇通路调控ER的表达 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 不同浓度抑制剂处理细胞 |
| 1.2.2 细胞转染及其它方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CAMK2G的表达分析 |
| 2.2 过表达载体p-EGFP-CAMK2G酶切验证 |
| 2.3 双峰驼颗粒细胞转染过表达p-EGFP-CAMK2G的效果检测 |
| 2.4 过表达CAMK2G对各受体的影响 |
| 2.5 过表达CAMK2G对类固醇激素合成通路的影响 |
| 2.6 siRNA-CAMK2G沉默效率的检测 |
| 2.7 敲低CAMK2G对各受体及PPI各相关蛋白的影响 |
| 2.8 敲低CAMK2G对类固醇激素合成通路的影响 |
| 2.9 抑制剂KN-93对CAMK2G的影响 |
| 2.10 抑制剂KN-93对各受体及PPI各相关蛋白的影响 |
| 2.11 抑制剂KN-93对类固醇激素合成通路的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 附件 |
（5）CRISPR/dCas9介导人成纤维细胞转分化为Leydig样细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 Leydig细胞的发育过程 |
| 1.2 Leydig细胞功能 |
| 1.3 Leydig细胞及雄激素合成相关转录因子 |
| 1.4 雄激素缺乏症和Leydig细胞 |
| 1.5 Leydig样细胞来源的方式 |
| 1.6 CRISPR/dCas9 系统介导的细胞转分化 |
| 1.7 本研究的技术路线 |
| 第二章 CRISPR/dCas9 系统体外转分化人包皮成纤维细胞为Leydig样细胞的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 设备和仪器 |
| 2.1.2 细胞培养类试剂 |
| 2.1.3 质粒、菌株和细胞系 |
| 2.1.4 试剂与抗体 |
| 2.1.5 其它试剂 |
| 2.1.6 器械和耗材 |
| 2.1.7 相关引物 |
| 2.1.8 相关溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原代HFFs的分离和培养 |
| 2.2.2 感受态的制备 |
| 2.2.3 sgRNA质粒构建 |
| 2.2.3.1 载体信息 |
| 2.2.3.2 试剂 |
| 2.2.3.4 sgRNA靶位点的选择 |
| 2.2.3.5 sgRNA引物的设计 |
| 2.2.3.6 sgRNA重组质粒的构建 |
| 2.2.4 连接产物的转化 |
| 2.2.5 dCas9,SAM(MS2-P65-HSF1)和pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP质粒 |
| 2.2.6 无内毒素级质粒提取(大提) |
| 2.2.7 细胞复苏 |
| 2.2.8 细胞传代 |
| 2.2.9 细胞冻存 |
| 2.2.10 慢病毒包装与浓缩 |
| 2.2.11 构建稳定的Hsd3b-dCas9-MPH-HFFs细胞系 |
| 2.2.12 sgRNA病毒感染Hsd3b-dCas9-MPH-HFFs |
| 2.2.13 化学发光法检测睾酮浓度 |
| 2.2.14 流式细胞分选 |
| 2.2.15 RNA提取 |
| 2.2.16 cDNA合成 |
| 2.2.17 qRT-PCR |
| 2.2.18 细胞裂解及蛋白提取 |
| 2.2.19 Western blotting |
| 2.2.20 免疫荧光染色 |
| 2.2.21 组蛋白表观遗传学修饰(ChIP-qPCR) |
| 2.3 统计学方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 重组sgRNAs质粒构建及测序结果 |
| 2.4.2 慢病毒生成 |
| 2.4.3 Hsd3b-dCas9-MPH-HFFs细胞系构建 |
| 2.4.4 Hsd3b-dCas9-MPH-HFFs细胞转分化为Hsd3b:GFP~+细胞 |
| 2.4.5 Hsd3b:GFP~+细胞具备成熟Leydig细胞的一些特性 |
| 2.4.6 CRISPR/dCas9 系统促进靶基因启动子区组蛋白表观遗传重塑 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 Leydig样细胞移植对去势大鼠的治疗作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 设备与仪器 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 细胞培养相关试剂 |
| 3.1.4 试剂与抗体 |
| 3.1.5 器械和耗材 |
| 3.1.6 相关溶液配制 |
| 3.1.7 Leydig样细胞(iLCs)的分离纯化 |
| 3.1.8 睾丸去势模型的制作 |
| 3.1.9 细胞移植 |
| 3.1.10 睾酮激素检测 |
| 3.1.11 LH激素检测 |
| 3.1.12 HE切片制作及染色 |
| 3.1.13 组织免疫荧光染色 |
| 3.1.14 组织裂解及蛋白提取 |
| 3.1.15 Western blotting |
| 3.1.16 细胞免疫荧光染色 |
| 3.1.17 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 iLCs移植后雄激素缺乏症大鼠血清睾酮水平的检测 |
| 3.2.2 移植的iLCs在体内存活6 周以上 |
| 3.2.3 移植6 周后的iLCs体外培养的特点 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 (引物或序列) |
| 致谢 |
| 博士在读期间学术科研成果 |
（6）曾庆琪教授辨治男性不育症的学术思想及润精汤治疗少弱精子症的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 中医药治疗少弱精子症的研究进展 |
| 1 病因病机 |
| 2 辨证施治 |
| 2.1 名家经验 |
| 2.2 辨精论治 |
| 3 临床研究 |
| 3.1 专病专方 |
| 3.2 中成药 |
| 3.3 针灸及物理治疗 |
| 3.4 中西医结合治疗 |
| 3.5 综合治疗 |
| 4 实验研究 |
| 4.1 降低生殖细胞凋亡 |
| 4.2 改变Catsper通道 |
| 4.3 抗氧化应激损伤 |
| 4.4 调节生殖性腺轴,改善生殖内分泌功能 |
| 4.5 改善睾丸微循环 |
| 4.6 改善附属性腺的分泌功能 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 曾庆琪教授辨治男性不育症学术思想 |
| 1 病因病机 |
| 2 辨病论治 |
| 2.1 特发性不育症 |
| 2.2 精液不液化 |
| 2.3 感染性不育症 |
| 2.4 免疫性不育 |
| 2.5 精索静脉曲张性不育症 |
| 2.6 其他原因引起不育症 |
| 3 用药规律 |
| 3.1 用药特点 |
| 3.2 常用效验对药、角药 |
| 4 预防调护 |
| 4.1 三步四法、助孕有道 |
| 4.2 生活指导、综合治疗 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第三部分 润精汤治疗特发性少弱精子症的临床研究 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 临床来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 脱落标准 |
| 1.6 剔除标准 |
| 1.7 终止标准 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 试验方法 |
| 2.2 给药方案 |
| 2.3 治疗方法 |
| 2.4 注意事项 |
| 2.5 观察指标 |
| 2.6 疗效评价 |
| 2.7 统计学方法 |
| 2.8 设计路线图 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 一般资料分析 |
| 3.2 精液参数比较 |
| 3.3 血清性激素水平比较 |
| 3.4 中医症状评分比较 |
| 3.5 临床疗效比较 |
| 3.6 安全性观察 |
| 3.7 不良反应比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 润精汤组方思路 |
| 4.2 润精汤单味药的分析和现代药理研究 |
| 4.3 还少胶囊作为阳性对照药物的选择依据 |
| 4.4 润精汤对特发性少弱精子症的临床疗效探讨 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第四部分 润精汤对奥硝唑诱导的少弱精子症大鼠的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验药物 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 主要试剂的配制 |
| 2.5 实验仪器及耗材 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 分组与给药 |
| 3.2 实验取材 |
| 3.3 实验内容 |
| 3.4 统计方法 |
| 3.5 技术路线图 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 精液参数比较 |
| 4.2 血清性激素水平比较 |
| 4.3 睾丸组织病理形态比较 |
| 4.4 睾丸组织细胞凋亡比较 |
| 4.5 睾丸组织波形蛋白表达比较 |
| 4.6 睾丸组织ERK信号通路比较 |
| 5 讨论 |
| 5.1 奥硝唑诱导少弱精子症模型的建立 |
| 5.2 润精汤改善奥硝唑诱导的生精障碍型SD雄性大鼠生精功能的作用机制 |
| 6 结语 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 附录1 润精汤治疗特发性少弱精子症临床观察表 |
| 附录2 润精汤治疗特发性少弱精子症中医症状评分表 |
| 附录3 润精汤治疗特发性少弱精子症患者知情同意书 |
| 附录4 常用英文缩略表 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）镍致大鼠Leydig细胞类固醇合成障碍中lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的构建及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 镍的来源与暴露 |
| 1.2 镍的一般毒性及特殊毒性 |
| 1.3 镍的生殖毒性 |
| 1.4 镍对Leydig细胞类固醇生成的影响 |
| 1.5 非编码RNAs与镍的毒性 |
| 1.6 非编码RNAs对类固醇生成的影响 |
| 1.7 CeRNA机制 |
| 1.8 PI3K/Akt信号通路对类固醇生成的影响 |
| 1.9 研究目的及意义 |
| 1.10 技术路线图 |
| 第二章 镍致大鼠Leydig细胞类固醇合成障碍研究及相关ceRNA网络的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 PI3K/Akt信号通路在镍致大鼠Leydig细胞睾酮生成障碍中的作用研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在校期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）建立知识驱动的迁移学习方法比较多物种的精子功能生物学特性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 精子生物学特性概述 |
| 1.2.1 精子结构 |
| 1.2.2 精子发生 |
| 1.2.3 受精 |
| 1.3 知识驱动的自动化学习方法 |
| 1.3.1 信息检索 |
| 1.3.2 生物医学命名实体的识别 |
| 1.3.3 命名实体之间关系的抽取 |
| 1.3.4 文本标准化分类 |
| 1.3.5 信号通路的功能分析 |
| 1.4 工具与数据库介绍 |
| 1.5 研究内容 |
| 1.6 论文组织结构 |
| 2 搭建知识驱动的自动化学习方法 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 构建主题文献摘要数据库 |
| 2.3 主题文献摘要中特异性基因与实体的识别 |
| 2.3.1 特异性基因的识别 |
| 2.3.2 主题特异性实体的识别 |
| 2.3.3 主题实体的标准化分类 |
| 2.3.4 主题类别最显着相关的摘要集 |
| 2.3.5 基因与主题实体之间关系距离(relational distance,RD)的计算 |
| 2.3.6 “主题”实体类别与特异性基因的关系距离计算 |
| 2.3.7 “主题”实体类别的信号通路分析 |
| 3 构建“精子”生物学特性知识图谱 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 “精子”生物学特性的实体识别 |
| 3.2.1 构建“精子”生物学特性的特片性基因库 |
| 3.2.2 构建“精子”生物学特性的特异性实体库 |
| 3.3 “精子”生物学特性的特异性实体的标准化分类 |
| 3.4 “精子”生物学特性相关的文献摘要集 |
| 3.5 “精子”生物学特性实体与基因之间关系距离的计算 |
| 3.6 “精子”生物学特性类别与特异性基因关联 |
| 3.7 “精子”生物学特性实体类别的信号通路分析 |
| 4 蒙古族“五畜”的精子生物学特性研究及迁移性评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 迁移学习 |
| 4.1.2 直系同源基因 |
| 4.2 “五畜”精子生物学特性基因库的构建 |
| 4.3 5个物种精子生物学特性类别的信号通路构建方法 |
| 4.4 5个物种的精子生物学特性类别的信号通路分析 |
| 4.4.1 5个物种之间全局保守的信号通路分析 |
| 4.4.2 5个物种特异性高保守的信号通路分析 |
| 4.4.3 5个物种全局以及特异性保守信号通路的相关基因分析 |
| 4.5 讨论 |
| 5 近缘物种之间的精子生物学特性研究及迁移性评估 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 马和驴的精子生物学特性的可迁移性研究 |
| 5.3 山羊和绵羊的精子生物学特性的可迁移性研究 |
| 5.4 讨论 |
| 6 骆驼科物种精子生物学特性及迁移性评估 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 骆驼科物种的精子生物学特性基因库的构建 |
| 6.3 骆驼科物种的精子生物学特性类别信号通路的构建方法 |
| 6.4 骆驼科物种的精子生物学特性类别信号通路分析 |
| 6.4.1 4个物种之间全局保守的精子生物学特性类别信号通路 |
| 6.4.2 4个物种特异性高度保守且不可迁移的精子生物学特性类别信号通路 |
| 6.4.3 单个物种没有被显着激活的精子生物学特性类别信号通路 |
| 6.5 讨论 |
| 7 结论与创新性 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 本研究的创新性 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（9）高脂饮食诱导的脂肪组织白色化对小鼠生精微环境的影响及其调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌株和细胞系 |
| 1.3 质粒载体 |
| 1.4 工具酶及DNA marker |
| 1.5 试剂盒 |
| 1.6 抗体 |
| 1.7 主要仪器、设备和软件名称 |
| 1.8 耗材及主要化学试剂 |
| 1.9 引物的设计和合成 |
| 1.10 SiRNA的设计与合成 |
| 1.11 实验相关网战及软件 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 克隆载体的构建 |
| 2.2 细胞培养实验 |
| 2.3 细胞总RNA的提取和逆转录 |
| 2.4 Real-Time PCR实验 |
| 2.5 蛋白样品的制备及浓度测定 |
| 2.6 蛋白免疫印迹 |
| 2.7 免疫共沉淀(CO-IP) |
| 2.8 细胞免疫荧光实验 |
| 2.9 ELISA |
| 2.10 高脂饮食小鼠模型的建立 |
| 2.11 组织的取材、包埋、切片 |
| 2.12 小鼠睾丸曲细精管的显微注射 |
| 2.13 HE染色 |
| 2.14 免疫组化实验 |
| 2.15 组织免疫荧光实验 |
| 2.16 原代脂肪细胞的分离培养 |
| 2.17 小鼠睾丸血睾屏障的检测方法 |
| 2.18 实验数据处理 |
| 实验结果 |
| 1. 高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型的建立 |
| 1.1 高脂饮食诱导的肥胖小鼠的体重变化 |
| 1.2 高脂饮食诱导的肥胖小鼠的血清生化指标检测 |
| 1.3 高脂饮食诱导的肥胖小鼠炎症因子表达升高 |
| 2. 高脂饮食诱导的肥胖对小鼠睾丸的影响 |
| 2.1 高脂饮食诱导的肥胖小鼠的睾丸大小变化 |
| 2.2 高脂饮食肥胖小鼠的睾丸形态变化 |
| 3. 高脂饮食诱导的肥胖影响小鼠生殖激素的分泌 |
| 3.1 高脂饮食肥胖小鼠的生殖激素减少 |
| 3.2 高脂饮食诱导的肥胖小鼠辜酮合成的基因表达降低 |
| 3.3 高脂饮食诱导的肥胖小鼠睾丸支持细胞分泌因子的表达水平降低 |
| 4. 高脂饮食诱导的肥胖小鼠和对照小鼠脂肪组织基因表达的差异 |
| 4.1 高脂饮食肥胖小鼠和对照小鼠脂肪组织的基因表达差异分析 |
| 4.2 高脂饮食肥胖小鼠和对照小鼠脂肪组织的差异基因富集分析 |
| 4.3 高脂饮食肥胖小鼠和对照小鼠脂肪组织的差异基因蛋白互作网络分析 |
| 4.4 核心调节因子clusterin和resistin调控的生物学功能 |
| 5. CLUSTERIN和RESISTIN是由脂肪组织分泌的脂因子 |
| 6. CLUSTERIN在肥胖小鼠和对照小鼠中的表达情况 |
| 7. RESISTIN在肥胖和对照小鼠中的表达情况 |
| 8. CLUSTERIN对小鼠TM3和TM4细胞功能的影响 |
| 8.1 Clusterin影响TM3细胞睾酮的分泌以及合成睾酮相关基因的表达 |
| 8.2 Clusterin影响TM4细胞AMH、GDNF和INH的合成与分泌 |
| 8.3 Clusterin影响TM4细胞间连接相关蛋白的表达 |
| 9. CLUSTERIN影响TM3和TM4细胞功能的作用机制研究 |
| 9.1 Clusterin与VLDLR受体的相互作用 |
| 9.2 Clusterin通过VLDLR受体发挥功能 |
| 10. CLUSTERIN对C57小鼠睾丸间质和支持细胞的影响 |
| 11. RESISTIN对小鼠TM3和TM4细胞功能的影响 |
| 11.1 Resistin影响TM4细胞AMH、GDNF和INH的合成与分泌 |
| 11.2 Resistin影响TM4细胞紧密连接相关蛋白的表达 |
| 12. RESISTIN影响TM3和TM4细胞的作用机制研究 |
| 12.1 Resistin与VLDLR受体的相互作用 |
| 12.2 Resistin通过TLR4受体发挥功能 |
| 13. RESISTIN对C57小鼠睾丸间质和支持细胞的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士在读期间论文与会议摘要写作情况 |
| 致谢 |
（10）神经生长因子对快速老化小鼠迟发性性腺机能减退症的治疗作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 迟发性性腺机能减退症 |
| 1.1.1 LOH概述 |
| 1.1.2 LOH发病机制 |
| 1.1.3 LOH的临床治疗现状 |
| 1.2 非梗阻性无精症 |
| 1.2.1 无精症概述 |
| 1.2.2 NOA的发病机制 |
| 1.2.3 NOA的临床治疗现状 |
| 1.3 GnRH的分泌调节机制 |
| 1.4 神经生长因子 |
| 1.4.1 NGF研究历程 |
| 1.4.2 NGF的理化性质 |
| 1.4.3 NGF的作用机制 |
| 1.4.4 NGF的生物学功能 |
| 1.4.5 NGF的临床应用研究 |
| 1.4.6 NGF与生殖内分泌的联系 |
| 1.5 课题思路 |
| 1.6 研究内容 |
| 1.6.1 NGF促进血清性激素升高的机制研究 |
| 1.6.2 鼻腔滴注NGF治疗LOH的药效学评价 |
| 1.6.3 鼻腔滴注NGF治疗非梗阻性无精症的药效学验证 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 NGF促进小鼠血清性激素的升高及其机制研究 |
| 2.1 实验仪器设备与材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验细胞 |
| 2.1.4 主要实验抗体 |
| 2.1.5 PCR引物 |
| 2.1.6 其他实验试剂 |
| 2.1.7 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鼻腔滴注NGF给药体系的确定 |
| 2.2.1.1 实验动物饲养 |
| 2.2.1.2 脂质体NGF的配置 |
| 2.2.1.3 鼻腔滴注脂质体NGF和 NGF |
| 2.2.2 NGF调控下丘脑-垂体-睾丸轴性激素分泌的体内机制研究 |
| 2.2.2.1 实验动物饲养与收集血清 |
| 2.2.2.2 脑室注射 |
| 2.2.2.3 尾静脉注射 |
| 2.2.2.4 ELISA检测鼻腔滴注NGF的入脑分布 |
| 2.2.2.5 鼻腔滴注Alexa Fluor?647 标记NGF的入脑分布 |
| 2.2.2.6 ELISA检测血清LH |
| 2.2.2.7 血清睾酮的RIA检测 |
| 2.2.2.8 定量RT-PCR检测 |
| 2.2.2.9 下丘脑外植体培养 |
| 2.2.2.10 下丘脑双标免疫荧光检测 |
| 2.2.3 体外实验探讨NGF调控Gn RH分泌的机制 |
| 2.2.3.1 细胞培养 |
| 2.2.3.2 GT1-7细胞给药处理 |
| 2.2.3.3 ELISA检测培养基的Gn RH |
| 2.2.3.4 细胞免疫荧光 |
| 2.2.3.5 细胞的Western blotting检测 |
| 2.2.3.6 Gnrh1启动子荧光素酶报告系统 |
| 2.3 数据统计分析 |
| 2.4 实验结果及分析 |
| 2.4.1 鼻腔滴注脂质体NGF给药方式的优化 |
| 2.4.2 NGF调控下丘脑-垂体-睾丸轴性激素分泌的体内机制 |
| 2.4.2.1 脑室注射和静脉注射NGF对性激素的作用比较 |
| 2.4.2.2 鼻腔滴注NGF的入脑分布 |
| 2.4.2.3 NGF升高血清性激素水平的作用靶器官 |
| 2.4.2.4 NGF对 Kisspeptin表达和分泌的作用 |
| 2.4.2.5 NGF直接调控下丘脑的Gn RH神经元 |
| 2.4.3 NGF调控Gn RH表达和分泌的初步机制 |
| 2.4.3.1 GT1-7 细胞特异性表达Trk A受体 |
| 2.4.3.2 NGF促进GT1-7 细胞Gn RH的表达和分泌 |
| 2.4.3.3 NGF激活GT1-7 细胞MAPK/CREB信号通路 |
| 2.4.3.4 NGF通过激活MAPK和 PKC信号通路调控Gn RH的分泌 |
| 2.4.3.5 NGF调控Gn RH转录的作用机制 |
| 2.5 本章小结 |
| 2.6 本章讨论 |
| 第三章 NGF改善SAMP8 小鼠生殖功能低下的药效作用 |
| 3.1 实验仪器设备与材料 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 实验细胞 |
| 3.1.4 主要实验抗体 |
| 3.1.5 PCR引物 |
| 3.1.6 其他实验试剂 |
| 3.1.7 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 SAMP8 小鼠为LOH模型鉴定 |
| 3.2.1.1 实验动物饲养 |
| 3.2.1.2 SAMP8小鼠生殖功能鉴定 |
| 3.2.2 NGF治疗SAMP8 小鼠性腺机能减退症的药效学评价 |
| 3.2.2.1 实验动物分组及给药 |
| 3.2.2.2 脂质体NGF的配置 |
| 3.2.2.3 动物组织取材及样本处理 |
| 3.2.2.4 血清LH的 ELISA检测 |
| 3.2.2.5 血清FSH的 ELISA检测 |
| 3.2.2.6 睾酮的RIA检测 |
| 3.2.2.7 定量RT-PCR检测 |
| 3.2.2.8 性行为学检测 |
| 3.2.2.9 致孕率检测 |
| 3.2.2.10 精子活性检测 |
| 3.2.2.11 石蜡切片的HE染色 |
| 3.2.2.12 Western blotting检测 |
| 3.2.2.13 冰冻切片的免疫荧光检测 |
| 3.2.2.14 运动行为学检测 |
| 3.2.2.15 血液脂质代谢检测 |
| 3.3 数据统计分析 |
| 3.4 实验结果及分析 |
| 3.4.1 SAMP8 小鼠为低促性腺激素性LOH的模型评价 |
| 3.4.2 NGF治疗LOH模型小鼠的药效学评价 |
| 3.4.2.1 NGF给药对LOH模型小鼠体重的影响 |
| 3.4.2.2 NGF给药对LOH模型小鼠NGF受体表达的影响 |
| 3.4.2.3 NGF对 LOH模型小鼠性腺轴分泌功能的药效评价 |
| 3.4.2.4 NGF提高LOH模型小鼠生育能力的药效评价 |
| 3.4.2.5 NGF促进LOH模型小鼠精原细胞的分化 |
| 3.4.2.6 NGF改善LOH模型小鼠老龄化状态 |
| 3.5 本章小结 |
| 3.6 本章讨论 |
| 第四章 NGF治疗非梗阻性无精症的药效验证 |
| 4.1 实验仪器设备与材料 |
| 4.1.1 主要仪器设备 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要实验抗体 |
| 4.1.4 其他实验试剂 |
| 4.1.5 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 非梗阻性无精症模型的建立及组织处理 |
| 4.2.2 NGF促进非梗阻性无精症模型小鼠精子生成的药效学评价 |
| 4.3 数据统计分析 |
| 4.4 实验结果及分析 |
| 4.4.1 非梗阻性无精症模型的建立 |
| 4.4.2 NGF促进非梗阻性无精症模型小鼠精子生成的药效学评价 |
| 4.4.2.1 NGF对非梗阻性无精症小鼠血清性激素的作用 |
| 4.4.2.2 NGF对非梗阻性无精症小鼠睾丸组织的作用 |
| 4.4.2.3 NGF对非梗阻性无精症小鼠精子质量的作用 |
| 4.5 本章小结 |
| 4.6 本章讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 前景与展望 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表汇总 |
| 攻读博士学位期间的科研情况 |
| 课题资助及基金支持 |
| 致谢 |
四、人绒毛膜促性腺激素对小鼠睾丸、附睾表皮生长因子和睾酮的影响（论文参考文献）
- [1]多聚嘧啶束结合蛋白1对小鼠血睾屏障完整性和支持细胞自噬的影响[D]. 杨喆. 贵州医科大学, 2021(02)
- [2]HOXA4基因在尿道下裂尿包皮组织中的表达及意义研究及SIS材料覆盖尿道外层在尿道下裂比格犬动物模型上的应用[D]. 覃道锐. 南方医科大学, 2020(01)
- [3]补肾生精法治疗少弱精子症及其调控生精细胞增殖与凋亡的研究[D]. 管斯琪. 北京中医药大学, 2020(04)
- [4]双峰驼精清诱导排卵分子调控机制的研究[D]. 王琪. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [5]CRISPR/dCas9介导人成纤维细胞转分化为Leydig样细胞的研究[D]. 黄华. 上海交通大学, 2020(01)
- [6]曾庆琪教授辨治男性不育症的学术思想及润精汤治疗少弱精子症的临床和实验研究[D]. 杨凯. 南京中医药大学, 2020
- [7]镍致大鼠Leydig细胞类固醇合成障碍中lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的构建及相关机制研究[D]. 俄倩男. 兰州大学, 2020(01)
- [8]建立知识驱动的迁移学习方法比较多物种的精子功能生物学特性[D]. 季小阳. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [9]高脂饮食诱导的脂肪组织白色化对小鼠生精微环境的影响及其调控机制研究[D]. 焦涛. 北京协和医学院, 2019(02)
- [10]神经生长因子对快速老化小鼠迟发性性腺机能减退症的治疗作用及其机制研究[D]. 罗娇. 暨南大学, 2018