一、中国株家蚕浓核症病毒的发育（论文文献综述）
高亦涵[1]（2021）在《家蚕对BmBDV-Z抗病基因功能研究及其在育种中的应用》文中研究说明
郭莹[2]（2020）在《罗氏沼虾两种病毒、两种细菌及虾肝肠胞虫检测与鉴定方法的建立》文中研究说明本研究针对罗氏沼虾常见病原白斑综合征（WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）和虾肝肠胞虫（EHP）建立了单一PCR病原检测技术和多重PCR病原检测技术,同时对罗氏沼虾致病性气单胞菌维氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌进行分离鉴定以及致病性和耐药性进行探究,主要研究结果如下:1. 罗氏沼虾WSSV、IHHNV和EHP单一PCR检测技术的建立本研究通过设计虾肝肠胞虫（EHP）和白斑综合征（WSSV）特异性引物以及OIE推荐检测传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）所用引物序列,建立EHP、WSSV和IHHNV单一PCR检测方法,并对引物退火温度、预变性条件、变性条件和循环数进行优化,探究最佳单一PCR反应条件,并检测单一PCR反应的灵敏度。结果显示:WSSV单一PCR反应的的最优程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度是59.8℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸50s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,WSSV单一PCR检测灵敏度为200 fg包含5.41x104个拷贝;IHHNV单一PCR反应的的最优程序为:95℃预变性5min;95℃变性45s,退火温度是57℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸30s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,IHHNV单一PCR的检测灵敏度是200 fg包含5.99x104个拷贝;EHP单一PCR反应的的最优程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度是58℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸20s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,EHP单一PCR检测灵敏度是2 pg,包含6.36x105个拷贝。2. EHP和IHHNV、EHP和WSSV及IHHNV和WSSV多重PCR检测技术的建立本实验对EHP和IHHNV、EHP和WSSV以及IHHNV和WSSV分别建立多重PCR检测方法,对其引物的退火温度、预变性条件、变性条件和循环数进行优化,探究最佳多重PCR反应条件,并检测其特异性和反应灵敏度,结果表明:在EHP和IHHNV多重PCR反应中,其最优反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性45s,退火温度是57℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸30s,共36个循环,最后72℃条件下延伸8min,EHP的检测灵敏度是200 pg包含6.36x107个拷贝,IHHNV的检测灵敏度是20 pg包含5.99x106个拷贝;在EHP和WSSV多重PCR反应中,其最优反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度为58℃,反应时间为30s,72℃延伸50s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,EHP的检测灵敏度是200pg包含6.36x107个拷贝,WSSV的检测灵敏度是2 pg包含5.41x105个拷贝;在IHHNV和WSSV多重PCR反应中,其最反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度为58.9℃,反应时间为30s,72℃延伸50 s,共38个循环,最后72℃条件下延伸8min,IHHNV的检测灵敏度是20 pg包含5.99x106个拷贝,WSSV的检测灵敏度是2 pg包含5.41x105个拷贝。分别对三种多重PCR反应的特异性进行检测,结果表明,三种多重PCR反应的阴性对照豚鼠气单胞菌DNA和SPF罗氏沼虾DNA均无条带扩出,该结果表明本研究建立的三种多重PCR技术具有较强的特异性。3. 罗氏沼虾维氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌的分离鉴定本实验从濒死罗氏沼虾幼虾和成虾肝胰腺中分别分离出两株致病菌,对其溶血性、革兰氏染色、形态学、生理生化进行鉴定,并结合16Sr RNA基因测序以及系统进化树分析,判断两株分离菌株分别为维氏气单胞菌（登录号MN733186）和豚鼠气单胞菌（登录号MN736843）,并利用分离菌株分别进行人工感染实验,结果发现,被感染的罗氏沼虾出现与自然水域患病虾相似的症状,且在较短时间内发病死亡,说明这两株分离菌株对罗氏沼虾均具有较强的致病性,对分离菌株的药物敏感性进行检测,结果显示维氏气单胞菌对头孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、多西环素和利福平5种药物高度敏感,对新生霉素和复方新诺明2种药物中度敏感,对环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、阿奇霉素、链霉素、卡那霉素、四环素7种药物耐药;豚鼠气单胞菌对头孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、四环素、多西环素5种药物高度敏感,对卡那霉素1种药物中度敏感,对环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、阿奇霉素、新生霉素、链霉素、复方新诺明和利福平8种药物耐药。本研究实验结果为罗氏沼虾气单胞菌的病原鉴定及药物诊治提供一定的参考和理论基础。
常珈菘[3]（2020）在《家蚕全基因组编辑细胞库的构建及其应用》文中进行了进一步梳理家蚕（Bombyx mori）是昆虫纲鳞翅目昆虫,有超过5000年的人工驯养的历史,自古以来就是中国重要的经济动物,也是中国传统文化的重要载体,同时,家蚕还是重要的鳞翅目模式生物,具有重要的研究价值。家蚕是较早完成全基因组测序的生物,而且家蚕已经建立了转基因技术、RNA干扰技术、基因组编辑技术等一系列遗传操作技术。经过几十年的研究,研究人员已经揭示了一系列家蚕基本遗传学问题,例如:性别决定、人工驯化等。但是,绝大多数的家蚕基因功能还未知。面对海量家蚕的功能基因和迫切的产业需求,我们急需一种全新的研究方法来加速家蚕功能基因组研究,加快家蚕功能基因组注释。在人类基因组计划（Human Genome Project,HGP）完成之后,注释基因组就成为了生物学的中心任务之一。近年来,高通量功能缺失筛选技术已被成功应用于基础生物学研究过程中新基因的功能注释。常用的高通量基因功能缺失筛选平台是基于RNA干扰（RNA interference,RNAi）或者规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）系统来建立的。与CRISPR系统相比,RNA干涉系统存在一些固有缺陷,限制了其应用,例如:脱靶效应、基因功能不完全缺失等。因此,全基因组的CRISPR系统是目前最有效的基因功能缺失筛选工具,已被用来识别必需基因、耐药基因和宿主-病原互作基因等。在本文中,我们利用piggyBac转座子将sgRNA文库稳定整合在家蚕胚胎细胞系（Bombyx mori embryonic cell line,BmE）的基因组上,建立了CRISPR全基因组编辑的筛选平台（BmE genome-scale CRISPR/Cas9 knockout library,BmEGCKLib）,这是首次在家蚕中构建高通量基因功能筛选平台。我们利用这个平台鉴定了家蚕胚胎细胞系BmE的必需基因和生长抑制基因,以及BmE细胞系响应生物胁迫（家蚕核型多角体病毒,Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV）或者非生物胁迫（高温或低温）的基因。此外,在本研究中,我们应用piggyBac转座子系统替代普遍应用的慢病毒系统来递送CRISPR文库到目标细胞基因组上,为更多生物构建CRISPR全基因组编辑系统提供了新的递送工具。本研究的主要结果和结论如下:1.家蚕细胞转基因敲除系统的构建将CRISPR文库整合到宿主细胞基因组上是构建全基因组CRISPR筛选平台的关键步骤。在人或者小鼠的细胞中,CRISPR文库主要是应用慢病毒系统整合到基因组上。但是,慢病毒载体在昆虫细胞中转基因效率极低,不能满足构建文库的需求。在本文中,我们选择piggyBac转座子系统将CRISPR文库整合到家蚕细胞的基因组上。为了高效地将CRISPR文库整合到家蚕细胞基因组上,我们构建了一个一元载体系统,命名为:pB-CRISPR,该载体包括三个表达框,分别是由Hsp70启动子驱动的Cas9表达框、由U6启动子驱动的sgRNA表达框和由IE2启动子驱动的Zeocin抗性基因表达框。为了验证pB-CRISPR载体在家蚕胚胎细胞系BmE中的基因编辑效率,我们首先以BmE细胞为基础构建了一个稳定表达绿色荧光蛋白（enhance green fluorescence protein,EGFP）的细胞系BmE-Mi-EGFP。我们设计并构建了三个打靶绿色荧光蛋白编码基因EGFP的家蚕细胞转基因敲除载体pB-CRISPR-EGFP-1、pB-CRISPR-EGFP-2、pB-CRISPR-EGFP-3;两个不打靶EGFP的转基因敲除载体pB-CRISPR-NS-1和pB-CRISPR-NS-2作为对照。将这5个转基因敲除载体分别与piggyBac转座酶（piggyBac transposase）表达载体A3-Helper共转染至家蚕BmE-Mi-EGFP细胞系,转染后用含有Zeocin的完全培养基连续培养两个月。荧光显微镜观察显示:三种转染靶向EGFP的sgRNAs的载体（pB-CRISPR-EGFP-1、pB-CRISPR-EGFP-2、pB-CRISPR-EGFP-3）的实验组中几乎所有细胞的绿色荧光都消失了,而两组转染对照载体（pB-CRISPR-NS-1和pB-CRISPR-NS-2）的细胞中绿色荧光几乎保持不变,流式细胞仪分析显示同样的结果。最后,我们通过PCR扩增EGFP基因,并进行T-A克隆,应用Sanger测序法对突变模式进行了检测分析。我们挑选了44个单克隆进行Sanger序列,结果显示:几乎所有的EGFP基因都发生了突变,突变类型以小片段缺失为主。此外,超过70%的突变体发生了移码突变。这些结果表明,pB-CRISPR转基因敲除载体系统可以在BmE细胞中高效地实现基因编辑。2.家蚕BmE细胞全基因组编辑文库的构建为了在BmE细胞中建立全基因组CRISPR筛选文库,我们首先针对家蚕全部蛋白编码基因设计了1,534,227个sgRNAs,然后从中筛选了94,000个sgRNAs在94K基因芯片上合成寡核苷酸文库,筛选标准如下:为了提高移码突变效率,我们尽量选择靶向前三个外显子内并且打靶效率高而脱靶效率低的sgRNAs;最终,每个基因筛选出约6个sgRNAs。随后,从94K芯片中纯化出sgRNAs寡核苷酸文库,将其重组到家蚕细胞转基因敲除骨架载体pB-CRISPR上,构建家蚕全基因组编辑质粒文库,命名为:pB-CRISPR-lib。为了保证pB-CRISPR-lib具有较高的覆盖度和多样性,我们总共构建了大约1×108个克隆。最终,每个sgRNA覆盖了大约1000个克隆。之后,通过PCR扩增质粒文库pB-CRISPR-lib的sgRNA区域,并进行深度测序,分析质粒库的覆盖率、准确性和多样性。我们检测到51,431个sgRNAs,覆盖家蚕16198个基因,约占家蚕全部基因总数的97.7%。其中,约72%的sgRNAs的reads数在11–200之间。以上结果表明,我们构建的家蚕全基因组编辑质粒文库具有较高的覆盖度和较好的均匀度。在完成质粒文库的构建后,我们将pB-CRISPR-lib和A3-Helper共转染到家蚕胚胎细胞系（BmE）中,一共转染了150个T-25细胞培养瓶（25 cm2 flask）,每个sgRNA平均转染了大约2,000个细胞。经2个月的Zeocin筛选后,几乎所有细胞都整合了pB-CRISPR-lib系统,构建完成的家蚕全基因组编辑细胞文库,命名为BmEGCKlib（BmE genome-scale CRISPR/Cas9 knockout library）。随后,我们收集了4×107个BmEGCKlib文库的细胞,抽提基因组后测序分析sgRNA丰度。结果显示:BmEGCKlib细胞文库总计包含48,982个sgRNAs,约占pB-CRISPR-lib质粒文库中sgRNA数量的95.2%,相关性分析显示,BmEGCKlib细胞文库与pB-CRISPR-lib质粒文库高度相关,相关性系数为0.99。以上结果表明,我们构建的家蚕全基因组编辑细胞文库可以用于家蚕功能基因筛选。3.运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因为了对家蚕的基本功能基因进行注释,我们首先应用家蚕全基因组编辑细胞文库BmEGCKLib鉴定了家蚕胚胎细胞系BmE的必需基因和生长抑制基因。我们将构建好的细胞文库BmEGCKLib在27℃的条件下培养,每隔一个月收集一次细胞,每次收集4×107个BmEGCKLib文库的细胞,总共收集三次,分别命名为BmE-Lib 1、BmE-Lib 2和BmE-Lib 3。分别抽提三组细胞的基因组DNA,然后通过PCR扩增三组细胞的sgRNA片段进行深度测序。根据测序结果,我们计算了每个时间点的sgRNAs数量和sgRNAs丰度。结果表明,随着时间的推移,BmEGCKlib细胞文库中sgRNA的数量逐渐减少。虽然sgRNAs的总体丰度呈逐渐减少的趋势,但部分sgRNAs明显富集,表明随着培养时间的延长,BmEGCKlib细胞文库受到了筛选。我们利用MAGeCK软件分析家蚕胚胎细胞系BmE的必需基因和生长抑制基因。生物学重复实验显示,在基因水平（r=0.76）和sgRNA（r=0.87）水平具有高度可重复性,说明我们的筛选实验数据可信度很高。之后,我们计算了正筛选基因（sgRNA富集）得分和负筛选基因（sgRNA消耗）得分,然后以p-value≤0.05为阈值,总共筛选到1,006个必需基因和838个生长抑制基因。我们还发现,家蚕BmE细胞的必需基因和其他真核生物的必需基因高度重叠,但是和原核生物的必需基因重叠较少。家蚕BmE细胞的必需基因和生长抑制基因几乎都均匀地分布在28对染色体上。结合BmE细胞转录组数据,我们发现,与家蚕所有基因的平均表达水平相比,家蚕BmE细胞必需基因的平均表达水平更高,而BmE细胞生长抑制基因的平均表达水平比家蚕所有基因的平均表达水平低。同时我们对家蚕丝腺细胞的基因表达水平进行了同样的调查,也呈现出相同的规律。家蚕BmE细胞必需基因的基因本体论（Gene Ontology,GO）功能富集分析显示,BmE细胞的必需基因主要与核心细胞成分相关。为了确定家蚕BmE细胞必需基因的生物学功能,我们对家蚕BmE细胞的必需基因进行了KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析。结果显示,富集程度最高的通路大多与DNA代谢、RNA代谢或者蛋白质代谢相关,如:核糖体、RNA转运、mRNA、剪接体、核糖体生物发生、嘧啶代谢等。此外,我们还对BmE细胞的必需基因和生长抑制基因进行了亚细胞定位分析。结果显示,家蚕BmE细胞的必需基因主要定位于细胞核（38.2%）和细胞质（34.4%）。我们还发现,定位于细胞核和线粒体的基因中,必需基因的比例比生长抑制基因要高。4.运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因自然环境对生物是至关重要的,环境变化往往会给生物体带来巨大的挑战。为了应对极端环境带来的生存挑战,生物进化出了很多的重要抵抗机制。本部分我们应用家蚕全基因组编辑细胞库筛选了家蚕响应高温或低温胁迫的基因,为研究生物体在高温或低温胁迫下的生理生化反应提供参考。我们将BmEGCKLib细胞文库平均分成三组,每组含有4×107个BmEGCKLib文库细胞。其中两组作为实验组,分别在4℃或者30℃培养,另一组作为对照组,在BmE细胞的正常培养温度（27℃）培养。培养20天后,分别收集三个组所有存活的细胞,提取三组细胞的基因组DNA,然后PCR扩增sgRNAs区域,进行深度测序分析,鉴定家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因。之后,我们对筛选到的家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因做了KEGG通路富集,分析这些基因可能的生物学功能。KEGG富集分析显示,4℃存活的细胞正筛选得到的基因（sgRNA富集）主要富集在必需基因的通路,这些通路主要包括RNA相关通路和蛋白质相关通路。此外,负筛选基因在甾体生物合成途径、脂肪酸生物合成通路和脂肪酸代谢通路富集,暗示维持细胞膜的流动性是细胞应对高温或低温胁迫的关键。然后,我们对筛选到的家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因做了亚细胞定位分析。我们发现,在4℃组和30℃组中,细胞膜上的负筛选基因均多于正筛选基因。然而,在4℃和30℃两组细胞中,线粒体上的正筛选基因均多于负筛选基因。这表明生物膜系统更有可能被高温或低温摧毁,降低能量代谢水平可能有助于细胞在极端环境下存活。5.运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染基因家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrodrovirus,BmNPV）是对蚕业生产危害最大的病原微生物。在本部分,我们将运用家蚕全基因组编辑细胞库（BmEGCKlib）筛选家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因。我们将家蚕全基因组编辑细胞库（BmEGCKlib）均匀的分成两份,每份包含4×107个BmEGCKlib文库细胞。其中一份感染BmNPV（每隔一天感染一次,总共感染4次）,然后用流式细胞仪分选出绿色荧光蛋白阴性的少数细胞作为实验组,另一份不感染BmNPV作为对照组。分别收集实验组和对照组的所有存活细胞,提取两组细胞的基因组DNA,然后PCR扩增sgRNAs区域,进行深度测序分析,鉴定家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因。我们总共鉴定到811个正筛选基因和809个负筛选基因。之后,我们对筛选到的基因进行了KEGG通路富集分析,显着富集的通路是:吞噬体、Notch信号通路、Wnt信号通路等。最后,我们选择了三个家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的正筛选基因,构建了三个单基因敲除细胞系来验证我们的筛选结果。与对照相比,三个单基因敲除的细胞系均表现出一定的BmNPV抗性。总结:在本文中,我们首次构建了家蚕全基因组编辑细胞库,然后我们应用家蚕全基因组编辑细胞库筛选鉴定了家蚕BmE细胞的必需基因和生长抑制基因,以及家蚕BmE细胞响应生物胁迫（BmNPV侵染）或者非生物胁迫（高温或低温）的基因。我们的研究结果为家蚕基因组的功能注释提供了一个全新的高通量平台。此外,本研究还为非模式生物全基因组CRISPR筛选提供了可供借鉴的研究策略。
詹明月[4]（2019）在《家蚕C型凝集素S3相关免疫功能研究》文中研究指明C型凝集素（C-type lectin,CTL）广泛存在于动植物中,它们具有保守的糖识别域（Carbohydrate-recognition domain,CRD）,能够在钙离子存在的条件下特异的识别单糖或多糖。昆虫的C型凝集素广泛参与介导免疫反应及发育过程,尤其是分泌型的CTL通常作为模式识别受体（Pattern-recognition receptor）参与介导体液免疫反应和细胞免疫反应。过去的研究多集中于C型凝集素介导的体液免疫,对于其如何介导细胞免疫的研究较少。有鉴于此,本文针对家蚕C型凝集素S3（CTL-S3）介导细胞免疫反应的相关功能展开了研究。首先,对CTL-S3进行了基因克隆、序列分析、系统进化分析;然后分析了该基因在家蚕中的组织分布和诱导表达;研究了重组蛋白对细菌的结合和生长抑制作用,以及对细菌清除的促进作用。在此基础上通过构建CTL-S3的缺失突变体,分析了它们与细菌、病原分子以及血细胞的结合;最后分析了重组蛋白与家蚕整合素（Integrin）β5亚基的互作。相关研究结果为深入研究CTL-S3介导细胞免疫反应的机理奠定了基础,可以为蚕病防治以及其它害虫的生物防控提供思路。主要研究结果如下:1、序列分析:家蚕CTL-S3开放阅读框672 bp,编码223aa,有一个19 aa的信号肽以及一个172aa的CRD,属于典型的S型凝集素（即只含有一个CRD的Simple型）。MEGA6.0构建同源进化树,发现CTL-S3的同源蛋白主要存在于飞蛾、蝴蝶、蚂蚁、甲壳虫、苍蝇、蚊、蜜蜂、黄蜂、白蚁、蚜虫和甲虫中,而与斑马鱼和对虾的同源序列相似性较低。2、重组蛋白与细菌、细胞壁组分以及血细胞的结合:通过Western blot和ELISA实验,发现CTL-S3重组蛋白能与革兰氏阳性菌及阴性菌结合;能与血细胞结合;也能与多种细菌细胞壁组分结合。3、组织分布和诱导表达:通过qPCR实验,发现在注射大肠杆菌和金黄葡萄球菌后,CTL-S3基因在马氏管中的表达水平均显着下调;而在注射金黄葡萄球菌后,CTL-S3在中肠中的表达水平显着下调。在喂食大肠杆菌和枯草芽孢杆菌6 h后,CTL-S3基因在全虫中的表达水平均明显上调。在正常组织中,CTL-S3基因在马氏管中表达量最高,在血细胞中的表达量最低。4、C型凝集素对细菌的作用:通过抑菌和凝集实验发现,CTL-S3重组蛋白能选择性地抑制枯草芽孢杆菌的生长,并引起金黄葡萄球菌的凝集。通过抗体封闭和细菌清除实验,发现CTL-S3重组蛋白能促进家蚕体内细菌的清除。5、C型凝集素与整合素的互作:通过Far-Western蛋白印迹,发现Flag-S3融合蛋白与整合素β5亚基存在互作关系。
李静[5]（2019）在《一株新的蚊浓核病毒AalDV-7的分离、鉴定和病原学分析》文中研究表明研究背景:蚊虫传播的病毒性疾病（Mosquito-borne viral diseases,MBVDs）对全球公共卫生构成了严重威胁,严重危害人类生命健康,影响社会的稳定。蚊虫防制仍然是综合蚊虫管理（Integrate mosquito management,IMM）计划中的核心干预策略,以减少MBVDs的传播。传统的化学农药是目前使用最频繁和最广泛的控制蚊虫的方法,然而,化学农药对生态系统造成了严重的负面影响,蚊虫也出现了杀虫剂抗性（Insecticide resistance,IR）问题,这使得开发新的蚊虫防制方法至关重要。而生物杀虫剂的研究与应用将为蚊虫的防制提供新的策略。生物防制主要应用蚊虫真菌,细菌、病毒等病原体、天敌等来达到防治效果,对非靶标生物和有益生物无毒害,不危害生态系统,蚊虫对其不易产生抗性。蚊浓核病毒（Mosquitodensovirus,MDVs）属于蚊虫特异性病毒,特异性感染蚊类,可以在自然界中垂直传播和水平传播。高滴度病毒可以直接杀伤蚊类,低滴度可以影响蚊类寿命、产卵量、孵化率等,从而降低媒介种群数量。目前多种MDVs的全基因组己经成功构建为感染性克隆质粒载体,便于进行基因改造使其成为很好的基因转移载体和基因表达载体。因此,对MDVs进行分离和鉴定,分析MDVs的分子生物学和病原性特点,将为发展MDVs为生物杀虫剂和基因表达载体提供理论基础,为发展生物杀虫剂提供更多可替代的选择。目的:对野外白纹伊蚊（Aedes albopictuds）成蚊中分离出的一株蚊浓核病毒（Aedes albopictus densovirus-7,AalDV-7）进行鉴定,对其全基因组、转录本、蛋白进行分析,实验室初步测试该病毒对白纹伊蚊、埃及伊蚊（Aedesaegypti）和致倦库蚊（Culexququefasciatus）的幼虫的病原性,为发展MDVs为生物杀虫剂和基因表达载体提供理论基础。方法:通过超速密度梯度离心的方法,从广东省广州市野外采集的白纹伊蚊体内成功分离一株蚊浓核病毒,并将其命名为白纹伊蚊浓核病毒-7（AalDV-7）。我们通过克隆、测序分析了AalDV-7的基因组特征,并对三个开放阅读框（ORF）的转录和翻译进行了分析。利用重组载体和野生病毒共转染细胞获得重组病毒感染幼虫后观察重组病毒在蚊幼虫体内的入侵部位和扩散。将登革热和寨卡病毒的主要媒介白纹伊蚊、埃及伊蚊和西尼罗病毒（West Nile virus,WNV）媒介致倦库蚊的幼虫暴露于 1.00×10s、1.00×109、1.00×l010、1.00×1011geq/ml剂量梯度的病毒液中感染24 h后,每24 h记录幼虫的生存情况,以分析AalDV-7的病原性。另外,评估了 1.00×108geq/ml病毒浓度下,AalDV-7在宿主体内的感染率和病毒相对滴度,以探究其对蚊虫防制的潜力。结果:经过克隆和测序,AaIDV-7的完整序列己提交GeneBank（GeneBank:MK182384）。AalDV-7的基因组完整基因组长4,048 nt,含三个重叠的ORFs。SDS-PAGE证明其可编码NS 1蛋白、VP蛋白。经RACE实验,VP的转录起始位点（Transcription initiation site,TIS）位于ATG上游 158 nt或 1 nt,NS1/NS2基因的TIS位于ATG上游6 nt而NS1和NS2基因共享一个TIS位点。NS与VP基因享有一个共同的转录终止位点（Transcription termination sites,TTS）,位于VP基因翻译终止位点后60 nt。系统进化树分析表明,AalDV-7与MDVs聚类,其中大多数是从成蚊中分离出来的。AalDV-7感染伊蚊的初始部位主要为肛门乳头,第二常见部位是毛细胞基部,其次是肛门乳头基础部。感染致倦库蚊的初始部位仅出现在肛门乳头。重组病毒可分布于幼虫全身,包括前肠,中肠,后肠,肌肉组织等。AalDV-7对三种蚊虫的致病性差异显着,当白纹伊蚊的幼虫暴露于1.00×Il010geq/ml的病毒液24h后,死亡率大于50%,LD50为109.48 geq/ml。暴露于1011ugeq/ml的病毒液24h后,死亡率为82%,LT50为7.72d。与埃及伊蚊和致倦库蚊相比,具有最低的半数致死浓度（Median lethal dose,LD50）和较短的半数致死时间（Median lethal time,LT50）。亚致死效应分析还表明,AalDV-7感染可降低化蛹率和羽化率。三种蚊虫1-2龄幼虫均表现出100%的感染率,在致倦库蚊的1-2龄幼虫中观察到最高的相对滴度。结论:AalDV-7对三种蚊虫的致病性差异显着。AalDV-7对白纹伊蚊致病性强,有望作为生物杀虫剂应用于蚊媒防制。另外,AalDV-7感染致倦库蚊后,有很高的感染率和病毒滴度,但对其致死性很弱,这使得AalDV-7有望成为致倦库蚊体内的基因表达载体,用于基因功能的研究。总之,对MDVs进行分离和鉴定,分析MDVs的分子生物学和病原学特征,丰富了蚊虫病原体病毒的资源,将为生物杀虫剂的发展提供更多的选择。
孔鸣[6]（2018）在《家蚕免疫信号通路对BmNPV和BmBDV两种病毒感染的应答》文中研究表明家蚕（Bombyx mori）作为一种重要的经济昆虫,同时也是优良的模式生物,为遗传学、病理学等的研究提供了良好模型。而家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV）所引发的病毒感染严重威胁着蚕业的生产,约占总蚕病所引起的损失的60%以上,迄今为止对该蚕病还滞留在预防阶段。本课题组通过对344种家蚕品系进行抗BmNPV筛选得到了一种高抗品系NB,其后经与感病品系306杂交和回交,构建了与306为近等基因系的抗病品系华八BC8,从DNA、RNA和蛋白质水平上已经开展了一系列对抗性基因的筛选工作,但尚未获得具显着抗性功能的基因。此外,家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus,BmBDV）作为二分DNA病毒科内的唯一病毒种,已被确定为二分浓核病毒属的代表种,极具典型性。本研究采用BmNPV病毒感染家蚕后,通过荧光定量PCR的方法检测感、抗品系中免疫信号通路元件的转录水平,分析其在感、抗品系间表达模式的差异,从而筛选出免疫信号通路中发挥抗性功能的通路元件,希望阐明抗性品系家蚕对于BmNPV感染的抗性机制;同时探究另一DNA病毒BmBDV感染家蚕后,是否具相似规律。在对筛选得到的可能具抗BmNPV功能的通路元件在不同品系家蚕中的序列进行分析后,继续在细胞水平上对该基因的抗BmNPV功能进行鉴定与评估。主要取得的研究结果如下:1.BmNPV感染家蚕后,通过荧光定量PCR共对12个Toll信号通路相关信号因子、6个Imd信号通路相关信号元件以及7个Jak-STAT信号通路中的信号因子进行了检测,分析发现BmNPV感染能激活家蚕Toll通路与Jak-STAT通路免疫反应,其中发现细胞因子信号转导抑制因子2基因BmSocs 2在抗性品系家蚕NB与华八BC8中的表达量显着高于感性品系306。2.当BmBDV侵染家蚕时,通过与上述类似的方法对12个Toll信号通路相关信号因子、6个Imd信号通路相关信号元件以及7个Jak-STAT信号通路中的信号因子进行检测后,发现了一些相似规律,BmBDV感染也能引发家蚕Toll通路与Jak-STAT通路免疫反应的激活,BmSocs 2在抗性品系家蚕华八BC7中的表达量较高。推测BmSocs 2基因在家蚕抗病毒感染过程中发挥了重要作用。3.分别从BmNPV感性品系家蚕306、BmNPV抗性品系家蚕NB与华八BC8中克隆得到了家蚕BmSocs 2基因,为探究造成表达量差异的原因是否由于其在不同品系家蚕中基因序列的不同,结果发现在三种家蚕品系中BmSocs 2基因序列一致。其后再与已公布的大造家蚕品系中的BmSocs 2基因进行比对,发现有8个碱基序列发生了突变,但它们的氨基酸序列完全一致。经生物信息学分析后,发现BmSocs 2蛋白具主要负责信号转导的SH2功能结构域以及连接特异底物结合结构域与通用蛋白质的SOCS box,并存在多个潜在的磷酸化位点,表明BmSocs 2基因较为保守并在Jak-STAT信号通路中发挥着重要的信号转导作用。4.构建含BmSocs 2目的基因的重组真核表达质粒转染家蚕卵巢细胞BmN,通过体外过表达实验对其是否具抗BmNPV的功能进行研究,结果显示在细胞水平上家蚕BmSocs 2基因确实在抗BmNPV侵染的过程中发挥了重要作用。
董非凡[7]（2018）在《基因编辑BmNPV iap2和orf59的家蚕抗性素材创制》文中研究指明家蚕作为具有重要经济价值的鳞翅目昆虫,每年受蚕病危害十分严重,严重制约了我国蚕丝产业的可持续发展。其中家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）所造成的家蚕血液型脓病是最常见的且危害最大的蚕病之一。由于传统抗性育种的周期过长,加之抗性多与经济性状成负相关,因此,迫切需要通过分子育种来提高家蚕的抗病性。本研究首先在细胞水平敲除BmNPV凋亡抑制因子iap2和增殖复制相关基因orf59,检测其对BmNPV增殖复制的影响;其次通过转基因技术构建了共同敲除BmNPV iap2和orf59基因的转基因家蚕,对构建的转基因家蚕的基因编辑效率和脱靶效率进行了系统的检测;进而检测了转基因家蚕对BmNPV的抗性效果,以及对BmNPV的DNA复制和基因转录影响,并鉴定转基因家蚕对个体生长发育和经济性状的影响;最后通过转录组数据初步分析转基因家蚕品系调控细胞凋亡,进而抑制BmNPV增殖复制的作用机制。论文取得的主要结果如下:1.BmNPV iap2和orf59对BmNPV增殖的影响利用CRISPR/Cas9系统构建了单独敲除BmNPV iap2和orf59的表达载体。相对定量检测病毒不同时期基因的转录水平变化,发现敲除BmNPV iap2和orf59,病毒基因的表达量在48h都有了明显的下调。进一步同时敲除BmNPV iap2和orf59,荧光定量分析显示病毒基因转录水平进一步下调,同时对敲除BmNPV iap2之后对宿主凋亡相关基因进行检测,发现caspase家族基因BmICE的表达量有明显上调,而Bcl-2家族基因BmBuffy的表达与对照相比没有明显变化。以上结果表明,可以通过敲除BmNPV抗凋亡基因iap2和复制相关基因orf59引起家蚕细胞凋亡通路变化,从而抑制BmNPV增殖复制,应用于家蚕抗病育种研究。2.基因编辑BmNPV iap2和orf59的抗性素材创制为了进一步分析应用抗凋亡作用提高家蚕抗病毒作用的效率,本研究成功的构建了转基因注射载体piggyBac[U6-sgIAP2-U6-sgORF59-3×P3 DsRed afm],通过显微注射技术获得表达sgIAP2&sgORF59的转基因家蚕,与表达Cas9蛋白的转基因家蚕杂交之后获得获得双阳性品系Cas9（+）/sgIAP2&sgORF59（+）和对照品系Cas9（+）/sgIAP2&sgORF59（-）、Cas9（-）/sgIAP2&sgORF59（+）和Cas9（-）/sgIAP2&sg ORF59（-）。通过T7E1酶切和T克隆测序检测发现双阳性品系在添食BmNPV 12h起就能够有效的编辑靶位点,48h编辑效率达到100%,并持续到120h。靶基因的编辑频率进行统计结果表明,从添食病毒12h开始出现比例较小的大片段缺失,仅有19.4%,到120h大片段缺失的比例达到62.5%。对2个靶位点预测的6个脱靶率最高的脱靶位点经T克隆测序分析未检测到脱靶现象。以上研究表明我们获得了能够特异性的编辑BmNPV基因组的转基因基因编辑家蚕。3.转基因家蚕的抗性鉴定和主要经济性状分析通过对双阳性品系和对照品系在4龄起蚕添食不同剂量的BmNPV,鉴定这两个家蚕品系对BmNPV的抗性水平。结果显示,Cas9（+）/sgIAP2&sgORF59(+在添食不同剂量的ODV之后相比于Cas9（-）/sgIAP2&sgORF59（-）的发病时间均推迟12天,且最终的死亡率均高于Cas9（-）/sgIAP2&sgORF59（-）。SPSS软件进一步分析Cas9（+）/sgIAP2&sgORF59（+）家蚕的LD50为2.25×106多角体/头,相比对照品系Cas9（-）/sgIAP2&sgORF59（-）的LD50为2.46×104多角体/头,其抗性提高了近100倍。通过荧光定量PCR检测病毒DNA的拷贝数,结果显示转基因家蚕在4龄起的添毒实验中,病毒DNA的拷贝数从72h起明显低于Cas9（-）/sgIAP2&sgORF59（-）,在5龄起添食BmNPV后,从96h开始双阳性品系的DNA拷贝数受到了明显的抑制。qRT-PCR检测结果显示双阳性品系的病毒基因ie-1、gp64、vp39、poly在4龄起蚕添食BmNPV后的转录水平从48h起显着低于对照品系,5龄起蚕添食病毒后病毒基因的转录水平则从96h起开始明显低于对照品系。为了分析转基因品系个体发育和经济性状是否受到了影响,本研究对获得的4种杂交品系的幼虫体重和全茧量、茧层量和茧层率进行称重统计分析,结果显示均没有明显变化。以上结果表明,本实验所构建的转基因家蚕不仅可以提高对BmNPV的抗性,而且对其经济性状没有影响。4.转基因家蚕的抗性差异基因分析为了探究转基因家蚕凋亡调控的抗性机制,本研究对Cas9（+）/sgIAP2&sgORF59（+）和Cas9（-）/sgIAP2&sgORF59（-）品系添食BmNPV 48h后的样品进行了转录组分析。首先本研究对提取的样品进行病毒基因复制水平检测,结果显示,在添食BmNPV 48h后,Cas9（+）/sgIAP2&sgORF59（+）品系的vp39表达量显着低于Cas9（-）/sgIAP2&sgORF59（-）品系。转录组分析结果显示,共筛选到709个差异基因,其中上调基因有194个,下调基因有515个。对差异基因进行eggNOG聚类分析,结果显示,差异基因主要集中在能量转运、核糖体翻译、翻译与修饰这三类功能中。通过KEGG通路聚类分析差异基因,结果显示差异基因主要集中在氧化磷酸化通路,共有41个差异基因,且全部为下调表达基因。从这41个差异基因中筛选出12个差异较大的基因进行荧光定量检测,结果表明其在感染BmNPV 48h后转基因家蚕的转录水平的确低于Cas9（-）/sgIAP2&sgORF59（-）,且在细胞水平的检测结果与转录组数据一致。为了鉴定敲除BmNPV iap2基因之后对家蚕细胞凋亡的影响,本研究检测了凋亡相关基因Bmiap2、BmICE、BmBuffy的转录水平变化,结果发现Bmiap2的表达下调,BmICE的转录水平有明显上调,而BmBuffy表达没有明显变化。说明在敲除BmNPV iap2和orf59之后,主要引起宿主能量水平和凋亡相关通路的变化。
徐五[8]（2016）在《家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究》文中研究表明家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus,Bm BDV）是继Bm NPV（家蚕核型多角体病毒,Bombyx mori nuclear polyhydrosis virus）,Bm CPV（家蚕质型多角体病毒,Bombyx mori cypovirus）之后又一种感染家蚕的特异性病毒。它是一种慢性病毒,感病家蚕7到12天死亡,其病症与浓核病毒感染相似。该病毒最初被命名为家蚕浓核病毒Ⅱ型,鉴于该病毒特异的基因组结构以及基因组中编码DNA聚合酶基因,2012年,国际病毒分类委员会新设立二分DNA病毒科,家蚕二分浓核病毒是该病毒科中的唯一代表种。Bm BDV基因组可以表达多个非结构蛋白,其中NS1蛋白由Bm BDV VD1基因组中ORF2阅读框编码,其长度为951nts（核苷酸,nucleotides）,含有316个氨基酸理论序列,分子量为36 k Da,等电点为8.7。前期研究结果表明:NS1是一种多功能蛋白,不仅具有ATPase与解旋酶活性,而且还能结合特定核酸序列,且磷酸化修饰能调控NS1蛋白的生物活性。在本研究中,将NS1蛋白与GST标签融合构建原核表达载体,通过改变诱导表达条件和优化翻译起始区密码子,在大肠杆菌大量表达可溶性NS1蛋白,进而研究纯化的NS1蛋白对家蚕细胞和家蚕个体的毒性作用。另外,用pull-down实验对NS1蛋白与DNA聚合酶及家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142之间的相互作用进行分析。研究结果表明:在不同温度的诱导条件下,20℃诱导,可溶性的NS1蛋白表达量最高;而在ns1翻译起始区（translational initiation region,TIR）引入4个同义突变,未见显着提高其原核表达量;纯化的NS1蛋白添加到Bm N细胞培养基中,能明显抑制细胞增长,Bm N细胞形态发生改变;NS1蛋白注射到家蚕血液中,会加速家蚕死亡。本研究为解析NS1蛋白的分子机制具有一定作用。具体研究内容如下:（1）NS1原核表达载体构建,通过一系列PCR、酶切与酶连,构建了NS1蛋白与GST标签融合的原核表达质粒p GEX-5X-3-ns1 wt。其次,为了提高NS1蛋白在大肠杆菌表达量,在ns1基因的翻译起始区TIR区中引入4个翻译频率较高的同义突变,构建了GST标签融合的重组质粒p GEX-5X-3-ns1 M。另外,构建了NS1蛋白与His标签融合的重组质粒p ET30a-ns1 C。（2）2种重组质粒在大肠杆菌BL21中的表达,用4种不同温度（16℃、20℃、28℃、37℃）诱导重组质粒表达,在20℃时,p GEX-5X-3-ns1 wt可溶性NS1蛋白表达产量最高;在20℃和37℃两种温度诱导条件下,比较野生型重组质粒p GEX-5X-3-ns1 wt和TIR的突变型重组质粒p GEX-5X-3-ns1 M表达NS1蛋白,结果显示NS1翻译起始区的密码子同义突变并不能明显提高目的蛋白的表达量与可溶性。此外,对20℃诱导表达的目的蛋白进行纯化,经质谱分析表达产物是融合蛋白NS1。（3）NS1蛋白的毒性研究,在Bm N细胞培养基中添加了不同浓度的NS1蛋白,观察NS1蛋白对家蚕培养细胞的作用。另外,用纯化NS1蛋白溶液给家蚕幼虫添食或皮下注射;观察NS1蛋白对家蚕个体的影响。结果表明:NS1蛋白能抑制Bm N细胞的正常生长与增殖。添食NS1蛋白对家蚕没有毒性,而皮下注射NS1蛋白会致家蚕死亡;（4）NS1的互作蛋白研究,前研究结果报道:NS1蛋白能与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142和病毒VD1-ORF4编码的DNA聚合酶结合。为深入研究NS1蛋白与这两种蛋白哪个区域结合,本论文通过体外pull-down实验,将NS1蛋白与Bm-SP142蛋白、VD1-ORF4截短的3个原核表达产物互作分别进行了分析,结果都呈阴性,表明NS1蛋白与这些蛋白的相互作用较弱,或许它们结合还需要其它蛋白的介入等其它因素。
孙振丽[9]（2016）在《病毒感染和高温处理对家蚕肠道菌群结构的影响》文中研究指明家蚕是鳞翅目昆虫的模式种,家蚕基因组全序列完成后,有关家蚕功能基因组学、发育与变态、性别决定、丝蛋白的高效合成、天然免疫等机制研究取得巨大进展,但有关家蚕肠道菌群结构的研究相对较少。动物肠道中栖居着大量的微生物,肠道微生物在对食物的消化和营养的吸收过程中起非常重要的作用。早期研究者通过传统的纯培养的方法对家蚕肠道微生物做了初步的研究;随着对分子生物学技术的进步,有学者利用细菌16S rRNA基因的通用引物,采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）的方法对家蚕肠道菌群做进一步研究。由于自然界绝大多数菌难以人工培养,DGGE法也存在缺陷,不能全面深入地检测出家蚕肠道微生物。近年来,高通量测序技术已成为研究肠道微生物种群的关键技术,因此本研究利用高通量测序技术调查家蚕肠道细菌的多样性及丰度,希望为更全面地理解肠道微生物与家蚕间的相互关系提供新的数据。家蚕肠道菌群结构受性别、发育、饲料及环境等多种因素的影响,肠道微生物的失衡,往往导致肠道细菌性疾病的发生,同时诱导家蚕产生免疫响应,并引起免疫通路相关基因及抗菌肽基因的表达发生相应的改变,反过来又影响肠道菌群的结构和组成。为了探讨家蚕肠道微生物菌群对病毒感染、高温处理的响应规律,解析肠道微生物与病毒感染、家蚕免疫通路基因表达间的互作,分析家蚕进化过程中肠道微生物的变化,本研究分别调查了家蚕质型多角体病毒（BmCPV）、家蚕浓核病毒（BmBDV）感染以及高温刺激对五龄家蚕肠道细菌种群的变化,分析了家蚕肠道细菌之间的互作,初步研究了家蚕肠道菌群变化与病毒感染、高温刺激、家蚕基因表达之间的相互关系,并研究了家蚕与野桑蚕肠道细菌种群的差异。相关研究结果为全面理解家蚕肠道微生物提供了新的数据。1.BmCPV感染对家蚕肠道菌群的影响为了调查正常家蚕肠道菌群的结构组成及感染BmCPV后的变化,按感染病毒后正常饲养24h,72h和144h三个时间点收集五龄家蚕肠道内容物,根据16S rRNA基因的焦磷酸测序数据分析各感染时期的肠道细菌的组成和丰度。结果显示,在正常雌性和雄性家蚕肠道中分别发现147和135个细菌属,在感染BmCPV雌性和雄性家蚕肠道中分别发现113和103个细菌属。总体来讲,感染BmCPV以后,家蚕肠道细菌多样性明显降低,但是属于革兰氏阳性菌的肠球菌属（enterococcus）和葡萄球菌属（staphylococcus）的丰度增加,推测感染bmcpv后的这种细菌属丰度的变化与家蚕的免疫系统反应有关。优势菌属的丰度相关性分析结果显示,肠球菌属的丰度与其它的优势菌属成负相关。2.bmbdv感染对家蚕肠道菌群的影响为了探讨bmbdv感染对家蚕肠道菌群的影响及可能的作用机制,五龄起蚕人工感染bmbdv后,按感染病毒后正常饲养48h,96h,144h三个时间点收集感染家蚕及正常家蚕的中肠内容物及中肠,利用16srrna基因的illuminamiseqsequencing数据对肠道菌群进行分析。结果显示,bmbdv感染家蚕肠道中菌群结构与对照家蚕差异较大,菌群多样性在感染后正常饲养48h、96h变化不大,而144h明显低于正常家蚕。感染bmbdv后,肠球菌属比例逐渐增加,分类不明菌属incertaesedis的比例在感染后96h时达到最高,乳球菌属（lactococcus）的比例减少。主成分分析结果显示,肠球菌丰度与大部分优势细菌呈负相关,其中anderseniella、incertaesedis、反硝化细菌（simplicispira）及肠球菌属丰度增加很可能与感染bmbdv有关。荧光定量分析结果显示,bmbdv感染后期,免疫系统toll、imd和jak/stat通路相关基因表达量升高,同时诱导中肠抗菌肽（攻击素attacins,防御素defensin,天蚕素cecropins）的表达,感染后144h时肠道中的肠球菌属丰度增加与家蚕spatzle（bmspz）、肽聚糖识别蛋白（bmpgrp-le和bmpgrp-lb）基因表达量成正比,推测bmbdv感染导致肠球菌丰度增加,进而激活toll及imd通路。3.短暂高温处理对家蚕肠道菌群的影响有关高温对家蚕肠道微生物种群、基因表达的影响研究较少。本研究利用16srrna基因的高通量测序技术研究了短暂高温处理（37?c,8h）后正常饲养48、96、144h的家蚕肠道细菌种群结构,同时用qpcr检测了家蚕免疫信号通路重要基因表达水平。结果显示,高温处理的家蚕肠道细菌多样性增加,肠球菌属、泛菌属（pantoea）、incertaesedis、escherichia-shigella、anderseniella和不动杆菌属（acinetobacter）的丰度变化幅度较大,表明它们对高温处理较敏感。pca分析显示,肠球菌属与葡萄球菌属的丰度与其它优势菌成负相关。物种-宿主基因表达矩阵分析结果显示,在健康家蚕样品中bmspz表达水平与肠球菌属和葡萄球菌属的丰度成负相关,与其它优势菌成正相关（除贪食菌属（variovorax）外）),dicer-2基因（Bmdrc-2）的表达水平与肠球菌属和葡萄球菌属丰度成正相关;在高温处理的家蚕样品中,贪食菌属的丰度与Bmspz表达水平成正相关,肠球菌属、Escherichia-Shigella、IncertaeSedis、Anderseniella、不动杆菌属的丰度与Bmspz表达水平成负相关,与Bmdrc-2、BmPGRP-LE、BmPGRP-LB成正相关。这些结果为理解高温-家蚕肠道细菌-家蚕基因表达间的关系提供了新的线索。4.野蚕肠道菌群结构野桑蚕（Bombyx mandarina Leech）是家蚕的祖先,为了分析家蚕驯化对肠道微生物种群的影响,本研究对野桑蚕/家蚕五龄后期肠道细菌进行了16S rRNA基因的高通量测序,结果显示,野桑蚕中肠球菌属的丰度（69.73%）明显高于家蚕（48.99%）,罕见菌属（Advenella）在野蚕肠道细菌的比例为11.54%,而在家蚕中没有检测到;乳球菌属（Lactococcus）,芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）在正常家蚕肠道细菌的占比分别为17.73%、5.02%和1.61%,而野桑蚕中的比例明显低于家蚕,分别为0.15%、0.54%和0.45%。表明肠道细菌的结构家蚕与野桑蚕间存在明显差异,人工驯化也可影响肠道细菌的种群,而肠道细菌的这些差异也许与野蚕对环境的适应性、摄食性优于家蚕有关。
张晓龙[10]（2016）在《家蚕二分浓核病毒感染的家蚕连续病理变化研究》文中指出家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus,BmBDV）是二分DNA病毒科（Bidnaviridae）,二分浓核病毒属（Bidensovirus）的代表种,也是目前发现的唯一一株动物二分体病毒。该病毒为单链线性的DNA病毒,基因组含有两个节段VD1（6.5 kb）和VD2（6.0 kb）。其病毒粒子呈二十面体对称结构,无囊膜包被,直径约为20-24 nm。BmBDV是导致家蚕罹患浓核病的一种病原体,对家蚕具有致死性,给蚕业造成了一定的损失。该病毒具有高度的宿主和组织特异性,仅感染家蚕幼虫的中肠上皮细胞,致使其细胞核异常膨大。感病的家蚕表现出典型的浓核病病症,如运动迟缓、厌食、生长延缓、下痢等。尽管BmBDV引发的病理变化在此之前已有很多相关报道,但这些研究都是分散的,不完整的,甚至有些描述是模糊的、不准确的,家蚕连续的病理变化还未被系统的分析。本文主要运用生物统计学,组织病理切片和实时荧光定量PCR等技术,从个体,组织及分子三个水平对BmBDV引起的家蚕的连续病理变化进行了详细的研究。在个体水平上,BmBDV的感染会导致家蚕生长延缓,龄期延长,发育不良,最终因生长发育停滞而死亡,BmBDV对家蚕的半数致死时间约21天。被病毒感染的幼虫排泄出串珠状蚕沙,其后部中肠变黄变薄。不同发育阶段的家蚕幼虫对BmBDV的敏感性并没有差异。4龄初被病毒感染的幼虫,从感染后第三天（3 dpi）,生长开始落后于健康幼虫,10 dpi后,家蚕的生长停滞。5龄幼虫被病毒感染后仍能吐丝结茧,但是茧重约减少了4.9%,蛹的重量降低了17.9%,蛹的存活率也降低了5%。进一步研究表明BmBDV不能垂直传播给后代。在组织水平上,从2 dpi有少数柱状上皮细胞核开始膨大,蜕皮后第1天（5dpi）,核膨大的细胞消失,到8 dpi几乎所有的柱状上皮细胞核膨大。从4 dpi,肠腔中能看到退化脱落的细胞核。随着被感染的柱状细胞不断的脱落,到10 dpi几乎看不到柱状细胞,这时杯状细胞核开始膨大,在第13 dpi时杯状细胞的病变最为严重,此时杯泡消失,整个细胞被膨大的核占据。说明在感染晚期,杯状细胞也会被感染。病理切片的免疫组化分析进一步表明,中肠上皮细胞核膨大是由BmBDV的繁殖引起的。在分子水平上,病毒从被摄入到子代病毒被释放的整个感染周期大约是60h。病毒基因的表达分析显示,病毒基因从2 dpi开始大量表达,7-9 dpi表达量最高,随后显着降低。到13 dpi后基因表达有所回升,说明感染晚期病毒在杯状细胞中繁殖。BmBDV引起的家蚕的病变在分子水平,组织水平和个体水平间表现出了密切的联系。病毒在中肠细胞内的繁殖,导致了中肠组织的病变,从而影响了其对营养物质的消化吸收功能,致使家蚕营养不良,生长延缓,直至家蚕生长停滞,从而逐渐死亡。BmBDV基因在第2 dpi大量转录,此时中肠柱状细胞核开始膨大,致使从第3 dpi开始家蚕的生长减缓。个体的蜕皮过程,使得中肠细胞更替,核膨大细胞消失,也影响了病毒基因的转录。在第10 dpi,病变柱状细胞完全脱落,病毒没有了繁殖的宿主细胞从而转录降到极低水平,个体生长也在此时停滞,并伴随有大量的串珠状蚕沙的产生。后期病毒基因转录的短暂回升是感染了杯状细胞的结果,导致了杯状细胞的核膨大。这充分说明,分子病变是组织病变和个体病变的根源所在,分子水平上的病理变化也要早于组织和分子的病变。同时我们还建立了一种BmBDV的快速分子诊断体系。以蚕沙为材料的病原检测,免去了普通分子诊断提取RNA或DNA的繁琐过程,实现了对BmBDV感染的快速、简便、准确的诊断。我们的研究完整地阐述了BmBDV引起的家蚕病理现象,为生产实践中对BmBDV的诊断和防治提供了理论依据和技术支持。同时为后续对该病毒侵染机制以及以及病毒和宿主的相互作用的研究打下了基础。
二、中国株家蚕浓核症病毒的发育（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中国株家蚕浓核症病毒的发育（论文提纲范文）
（2）罗氏沼虾两种病毒、两种细菌及虾肝肠胞虫检测与鉴定方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 罗氏沼虾发展现状 |
| 2 传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) |
| 2.1 IHHNV基因结构与分类 |
| 2.2 IHHNV宿主范围 |
| 2.3 IHHNV病理症状 |
| 2.4 IHHNV的传播途径 |
| 2.5 IHHNV检测技术 |
| 3 白斑综合征病毒(WSSV) |
| 3.1 白斑综合征病毒形态结构 |
| 3.2 白斑综合征病毒命名 |
| 3.3 白斑综合征病毒基因组 |
| 3.4 白斑综合征病毒的病理症状 |
| 3.5 白斑综合征易感宿主和传播途径 |
| 3.6 白斑综合征检测技术 |
| 4 虾肝肠胞虫 |
| 4.1 虾肝肠胞虫的易感宿主和传播途径 |
| 4.2 虾肝肠胞虫致病性 |
| 4.3 虾肝肠胞虫患病症状及病理变化 |
| 4.4 虾肝肠胞虫检测方法 |
| 4.5 虾肝肠胞虫防控措施 |
| 5 细菌常规鉴定法 |
| 5.1 气单胞菌 |
| 5.2 气单胞菌致病性 |
| 5.3 细菌鉴定方法 |
| 6 研究内容及目的意义 |
| 第二章 罗氏沼虾IHHNV、EHP和 WSSV病原检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验毒株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 DNA提取 |
| 2.3 PCR反应体系 |
| 2.4 PCR条件优化 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 灵敏度检测 |
| 2.7 临床检验试验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 退火温度优化结果 |
| 3.2 预变性条件优化结果 |
| 3.3 变性条件优化 |
| 3.4 循环数优化 |
| 3.5 WSSV、IHHNV和 EHP的 PCR程序优化结果 |
| 3.6 灵敏度检测 |
| 3.7 临床检测试验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 罗氏沼虾IHHNV、EHP和 WSSV多重PCR病原检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DNA提取 |
| 2.2 多重PCR反应体系 |
| 2.3 多重PCR反应条件优化 |
| 2.4 多重PCR特异性 |
| 2.5 多重PCR反应敏感性 |
| 3 结果 |
| 3.1 多重PCR退火温度优化 |
| 3.2 多重PCR预变性条件优化 |
| 3.3 多重PCR变性条件优化 |
| 3.4 多重PCR循环次数优化 |
| 3.5 多重PCR程序优化结果 |
| 3.6 多重PCR的特异性扩增结果 |
| 3.7 多重PCR灵敏度检测 |
| 4 讨论 |
| 第四章 罗氏沼虾两种细菌性病原的检测与鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要实验材料及仪器设备 |
| 1.2 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细菌分离培养 |
| 2.2 细菌形态观察 |
| 2.3 细菌生理生化特性鉴定 |
| 2.4 药敏实验 |
| 2.5 分子生物学鉴定 |
| 2.6 人工感染实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 病原菌形态特征 |
| 3.2 生理生化特性 |
| 3.3 药敏试验 |
| 3.4 细菌16SrRNA分子鉴定 |
| 3.5 人工感染 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）家蚕全基因组编辑细胞库的构建及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 家蚕功能基因组研究 |
| 1.2.1 家蚕研究历史 |
| 1.2.2 家蚕功能基因组研究进展 |
| 1.3 全基因组编辑技术的发展 |
| 1.3.1 基因组编辑技术的发展 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9 全基因组编辑技术 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9 全基因组编辑技术的应用 |
| 1.4 家蚕功能基因组研究的发展方向 |
| 1.4.1 应用定位克隆技术解析家蚕功能基因 |
| 1.4.2 参照近缘物种功能基因解析家蚕功能基因 |
| 1.4.3 应用全基因组编辑技术筛选家蚕功能基因 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的和意义 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.4 技术路线 |
| 第三章 家蚕细胞转基因敲除系统的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂及配置方法 |
| 3.1.3 主要实验方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 家蚕细胞转基因敲除骨架载体p B-CRISPR的构建 |
| 3.2.2 家蚕绿色荧光蛋白表达细胞系BmE-Mi-EGFP的构建 |
| 3.2.3 家蚕细胞转基因敲除载体p B-CRISPR的编辑效率的检测 |
| 3.3 总结与展望 |
| 第四章 家蚕BmE细胞全基因组编辑文库的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要试剂及配置方法 |
| 4.1.3 主要试验方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 家蚕全基因组sgRNA的设计 |
| 4.2.2 家蚕全基因组编辑质粒库的构建 |
| 4.2.3 家蚕全基因组编辑细胞库的构建 |
| 4.3 总结与展望 |
| 第五章 运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要试剂及配置方法 |
| 5.1.3 主要试验方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因的筛选 |
| 5.2.2 家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因的染色体定位 |
| 5.2.3 家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因的表达水平分析 |
| 5.2.4 家蚕BmE细胞必需基因和其他生物必需基因的比较 |
| 5.2.5 家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因的KEGG富集分析 |
| 5.2.6 家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因的亚细胞定位 |
| 5.3 总结与展望 |
| 第六章 运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞响应高温或者低温胁迫的基因 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 主要试剂及配置方法 |
| 6.1.3 主要试验方法 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因的筛选 |
| 6.2.2 家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因的KEGG富集分析 |
| 6.2.3 家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因的亚细胞定位分析 |
| 6.2.4 家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因的表达水平分析 |
| 6.3 总结与展望 |
| 第七章 运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 主要试剂及配置方法 |
| 7.1.3 主要试验方法 |
| 7.2 结果与讨论 |
| 7.2.1 家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因的筛选 |
| 7.2.2 家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因的验证 |
| 7.3 总结与展望 |
| 第八章 综合与结论 |
| 1 建立家蚕细胞转基因敲除系统。 |
| 2 建立家蚕全基因组编辑细胞库 |
| 3 筛选家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因 |
| 4 筛选家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因 |
| 5 筛选家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因 |
| 论文创新点 |
| 附件 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表文章 |
| 参研课题 |
| 会议报告 |
| 致谢 |
（4）家蚕C型凝集素S3相关免疫功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 家蚕 |
| 1.2 昆虫天然免疫的研究进展 |
| 1.2.1 昆虫天然免疫 |
| 1.2.2 细胞免疫 |
| 1.2.3 体液免疫 |
| 1.3 C型凝集素的研究进展 |
| 1.3.1 C型凝集素的结构域 |
| 1.3.2 C型凝集素介导的免疫反应研究进展 |
| 1.4 整合素的研究进展 |
| 1.4.1 整合素的简介 |
| 1.4.2 整合素的种类 |
| 1.4.3 整合素的结构 |
| 1.4.4 整合素在昆虫中的功能研究 |
| 2 引言 |
| 2.1 研究目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验虫体、菌株及质粒 |
| 3.1.2 试验仪器及试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 家蚕CTL-S3基因的克隆及蛋白诱导表达 |
| 3.2.2 家蚕CTL-S3重组蛋白对细菌的作用 |
| 3.2.3 家蚕CTL-S3缺失突变体的构建 |
| 3.2.4 家蚕CTL-S3缺失突变体蛋白相关免疫功能的研究 |
| 3.2.5 BmIntegrinβ亚基及其缺失突变体的cNDA克隆 |
| 3.2.6 家蚕Integrinβ亚基及其缺失突变体的蛋白诱导表达 |
| 3.2.7 家蚕Integrinβ亚基的生物信息学分析 |
| 3.2.8 家蚕Integrinβ亚基的功能研究 |
| 3.2.9 BmIntegrinβ5在家蚕血细胞中的表达 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 家蚕CTL-S3基因的克隆及蛋白诱导表达 |
| 4.1.1 家蚕CTL-S3基因的克隆 |
| 4.1.2 CLT-S3重组蛋白的表达及纯化 |
| 4.2 家蚕CTL-S3重组蛋白对细菌的作用 |
| 4.2.1 组织表达和喂食实验 |
| 4.2.2 活性抑菌实验 |
| 4.2.3 CTL-S3与细菌和细胞壁的结合 |
| 4.2.4 凝集实验 |
| 4.2.5 抗体封闭和细菌清除实验 |
| 4.3 家蚕CTL-S3缺失突变体的构建 |
| 4.3.1 家蚕CTL-S3缺失突变体cDNA的克隆 |
| 4.3.2 家蚕CTL-S3缺失突变体重组蛋白的诱导表达 |
| 4.4 家蚕CTL-S3缺失突变体蛋白相关免疫功能的研究 |
| 4.4.1 CTL-S3缺失突变体蛋白和细菌及家蚕血细胞的结合 |
| 4.5 家蚕Integrinβ亚基及其缺失突变体的cDNA克隆 |
| 4.6 家蚕Integrinβ亚基及其缺失突变体的蛋白诱导表达 |
| 4.7 家蚕IIntegrinβ亚基的功能研究 |
| 4.7.1 β5及其突变体与细菌、微生物组分的结合 |
| 4.8 家蚕Integrinβ5在血细胞中的表达 |
| 4.9 Flag-S3与Integrinβ5的相互作用 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（5）一株新的蚊浓核病毒AalDV-7的分离、鉴定和病原学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 蚊浓核病毒AalDV-7的分子生物学分析 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 蚊浓核病毒AalDV-7的病原学分析 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（6）家蚕免疫信号通路对BmNPV和BmBDV两种病毒感染的应答（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 序论 |
| 1.1 昆虫的病毒免疫研究 |
| 1.1.1 黑化作用和包裹作用 |
| 1.1.2 细胞凋亡 |
| 1.1.3 免疫信号转导 |
| 1.1.4 抗菌肽 |
| 1.1.5 其他免疫方式 |
| 1.2 家蚕核型多角体病毒BmNPV概况 |
| 1.2.1 BmNPV简介 |
| 1.2.2 抗BmNPV家蚕品种的发现和鉴定 |
| 1.3 家蚕二分浓核病毒BmBDV概况 |
| 1.3.1 BmBDV简介 |
| 1.3.2 家蚕对BmBDV的敏感性 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 研究主要内容与技术路线 |
| 1.5.1 主要研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 家蚕核型多角体病毒感染家蚕时对感、抗品系间差异表达的免疫信号通路元件的筛选 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 家蚕品种、桑叶及病毒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验设备 |
| 2.1.4 相关试剂配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 家蚕的饲养、病毒接种及中肠组织的提取 |
| 2.2.2 总RNA提取和cDNA合成 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 荧光定量PCR |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 家蚕感染BmNPV后Toll信号通路相关元件的表达模式 |
| 2.3.2 家蚕感染BmNPV后Jak-STAT信号通路相关元件的表达模式 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 家蚕二分浓核病毒感染家蚕时对感、抗品系间差异表达的免疫信号通路元件的筛选 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.1 家蚕品种、桑叶及病毒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 主要实验设备 |
| 3.1.4 相关试剂配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 家蚕的饲养、病毒接种及中肠组织的提取 |
| 3.2.2 总RNA提取和cDNA合成 |
| 3.2.3 引物设计 |
| 3.2.4 荧光定量PCR |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 家蚕感染BmBDV后Toll信号通路相关元件的表达模式 |
| 3.3.2 家蚕感染BmBDV后Jak-STAT信号通路相关元件的表达模式 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 家蚕细胞因子信号转导抑制因子2基因BmSocs2的克隆及生物信息学分析 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要实验设备 |
| 4.1.4 常用试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 BmSocs2基因的引物设计与克隆 |
| 4.2.2 PCR产物的回收与连接 |
| 4.2.3 转化 |
| 4.2.4 阳性克隆的挑选和验证 |
| 4.2.5 阳性克隆菌的质粒抽提与鉴定 |
| 4.2.6 软件及分析方法 |
| 4.2.7 序列的获取 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 家蚕BmSocs2基因全长克隆与鉴定 |
| 4.3.2 家蚕BmSocs2基因信号肽的预测 |
| 4.3.3 家蚕BmSocs2蛋白氨基酸序列特征分析及疏水性分析 |
| 4.3.4 家蚕BmSocs2蛋白磷酸化位点预测 |
| 4.3.5 家蚕BmSocs2蛋白亚细胞定位预测 |
| 4.3.6 家蚕BmSocs2与其他物种同源性分析及进化树的构建 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 家蚕BmSocs2基因的真核表达及抗BmNPV功能的鉴定 |
| 5.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.1 主要实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验设备 |
| 5.1.4 常用试剂配方 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 构建瞬时表达BmSocs2基因的真核表达质粒 |
| 5.2.2 重组BmNPV病毒滴度的测定 |
| 5.2.3 BmN细胞的培养与转染 |
| 5.2.4 重组BmNPV病毒感染BmN细胞 |
| 5.2.5 引物设计 |
| 5.2.6 荧光定量PCR分析BmSocs2过表达对病毒DNA复制的影响 |
| 5.2.7 荧光定量PCR分析BmSocs2过表达对病毒基因转录的影响 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 BmSocs2基因真核表达载体鉴定 |
| 5.3.2 目的基因BmSocs2在BmN细胞中过表达鉴定 |
| 5.3.3 BacmidDNA标准曲线的制作 |
| 5.3.4 BmSocs2基因抗BmNPV作用的评估 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 主要工作总结 |
| 6.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间发表论文 |
| 参与科研项目 |
（7）基因编辑BmNPV iap2和orf59的家蚕抗性素材创制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 杆状病毒特征 |
| 1.1.2 杆状病毒基因功能研究 |
| 1.1.3 杆状病毒与宿主相互作用 |
| 1.2 家蚕抗性育种 |
| 1.2.1 家蚕抗性育种策略 |
| 1.2.2 传统育种 |
| 1.2.3 分子育种 |
| 1.3 CRISPR/Cas9技术进展 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9研究进展 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9在病毒研究中的应用 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9在抗BmNPV研究中的应用 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景及目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.2.1 BmNPViap2和orf59对BmNPV增殖的影响 |
| 2.2.2 转基因编辑BmNPViap2和orf59的抗性素材创制 |
| 2.2.3 转基因素材的抗性检测及经济性状检测 |
| 2.2.4 转基因家蚕的抗性差异基因分析 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 BmNPViap2和orf59对BmNPV增殖的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 试验方法和步骤 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 载体构建 |
| 3.2.2 BmNPViap2和orf59敲除后对BmNPV增殖复制的影响 |
| 3.2.3 BmNPViap2和orf59共同敲除后对BmNPV增殖复制的影响 |
| 3.2.4 BmNPViap2敲除后对凋亡相关基因的影响 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 基因编辑BmNPViap2和orf59的抗性素材创制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.1.3 试验方法和步骤 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 基因编辑BmNPViap2和orf59的转基因家蚕的构建 |
| 4.2.2 基因编辑BmNPViap2和orf59的双阳性转基因家蚕的构建和鉴定 |
| 4.2.3 转基因家蚕添食BmNPV后的编辑效率检测 |
| 4.2.4 转基因家蚕脱靶效率检测 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 转基因素材的抗性检测及经济性状分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器和试剂 |
| 5.1.3 实验方法和步骤 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 转基因家蚕食下感染BmNPV后存活率分析 |
| 5.2.2 转基因家蚕感染BmNPV的半致死剂量分析 |
| 5.2.3 转基因家蚕感染BmNPV后复制增殖差异分析 |
| 5.2.4 转基因家蚕感染BmNPV后基因转录水平分析 |
| 5.2.5 转基因家蚕主要经济性状检测 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 转基因家蚕的抗性差异基因分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要仪器和试剂 |
| 6.1.3 试验方法与步骤 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 转录组样品的制备与分析 |
| 6.2.2 转录组数据质量评估与可靠性分析 |
| 6.2.3 BmNPV感染引起转基因家蚕的差异基因分析 |
| 6.2.4 氧化磷酸化差异基因分析 |
| 6.2.5 转基因家蚕凋亡相关基因分析 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 第七章 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参与课题 |
| 致谢 |
（8）家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 细小病毒科浓核病毒的研究进展 |
| 1.2 家蚕二分浓核病毒的研究 |
| 1.2.1 家蚕二分浓核病毒概述 |
| 1.2.2 家蚕二分浓核病毒的分子生物学研究 |
| 1.2.3 病毒复制与拯救的研究 |
| 1.2.4 家蚕对家蚕二分浓核病毒抗性的研究 |
| 1.3 细小病毒与家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的研究 |
| 1.3.1 细小病毒NS1蛋白功能的研究 |
| 1.3.2 BmBDV NS1蛋白的相关研究 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 1.5 研究内容及技术路线 |
| 1.5.1 主要研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 BmBDV ns1基因的克隆与原核表达载体构建 |
| 2.1 材料试剂 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 配制试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 ns1片段的PCR |
| 2.2.3 将ns1片段与pMD-18T载体连接 |
| 2.2.4 转化以及验证 |
| 2.2.5 目的条带ns1与表达质粒的连接 |
| 2.2.6 再次转化和验证 |
| 2.2.7 重组质粒转化E.coli BL21菌 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 获得ns1序列 |
| 2.3.2 三种片段分别与表达载体连接的验证 |
| 2.3.3 重组质粒转化E.coli BL21菌 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 BmBDV NS1蛋白的表达及纯化 |
| 3.1 材料试剂 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 配制试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 寻找最佳诱导表达温度 |
| 3.2.2 翻译起始区（TIR）内同义突变对表达的影响 |
| 3.2.3 蛋白的纯化 |
| 3.2.4 NS1蛋白的质谱分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 最佳诱导表达温度 |
| 3.3.2 翻译起始区（TIR）内同义突变对表达的影响 |
| 3.3.3 BmBDV NS1蛋白的纯化 |
| 3.3.4 NS1蛋白的质谱分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 BmBDV NS1蛋白生物毒理性分析 |
| 4.1 材料试剂 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 配制试剂 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 NS1蛋白对BmN细胞的毒性 |
| 4.2.2 NS1蛋白在家蚕水平的毒性 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 NS1蛋白对BmN细胞的毒性 |
| 4.3.2 NS1蛋白对家蚕的毒性 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 BmBDVNS1蛋白与Bm-SP142及BmBDV DNA聚合酶的体外互作分析 |
| 5.1 材料试剂 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 配制试剂 |
| 5.1.4 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 带His标签的BmBDV NS1蛋白的表达 |
| 5.2.2 NS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142的pull-down assay |
| 5.2.3 NS1蛋白与VD1-ORF41093bp蛋白片段的pull-down assay |
| 5.2.4 NS1蛋白与VD1-ORF4616bpA蛋白片段的pull-down assay |
| 5.2.5 NS1蛋白与VD1-ORF4616bpB蛋白片段的pull-down assay |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 pET30a-ns1C/BL21菌的诱导表达 |
| 5.3.2 NS1蛋白与家蚕丝氨酸蛋白酶Bm-SP142的体外互作 |
| 5.3.3 NS1蛋白与VD1-ORF41093bp蛋白片段的体外互作 |
| 5.3.4 NS1蛋白与VD1-ORF4616bpA蛋白片段的体外互作 |
| 5.3.5 NS1蛋白与VD1-ORF4616bpB蛋白片段的体外互作 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 主要工作总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表论文及参与课题 |
| 致谢 |
（9）病毒感染和高温处理对家蚕肠道菌群结构的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.肠道微生物的研究历程 |
| 2.肠道微生物的研究方法 |
| 3.昆虫肠道微生物 |
| 4.家蚕肠道微生物 |
| 4.1 结构与组成 |
| 4.2 品种的影响 |
| 4.3 性别及发育时期的影响 |
| 4.4 饲料的影响 |
| 4.5 环境的影响 |
| 4.6 肠道微生物与病毒、免疫、疾病的发生 |
| 4.7 微生态制剂的应用 |
| 5.家蚕肠道微生物研究存在的问题及发展方向 |
| 参考文献 |
| 第二章 研究目的与研究内容 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究内容 |
| 2.1 Bm CPV感染对家蚕肠道菌群的影响 |
| 2.2 Bm BDV感染对家蚕肠道菌群的影响 |
| 2.3 高温处理对家蚕肠道菌群的影响 |
| 2.4 家蚕与野蚕肠道菌群结构的差异 |
| 3 技术路线 |
| 第三章 Bm CPV感染对家蚕肠道菌群的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 肠道内容物的收集 |
| 1.2 DNA抽提，扩增，纯化及测序 |
| 1.3 测序序列分析 |
| 1.4 样品之间的相关性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 焦磷酸测序数据的分析 |
| 2.2 健康家蚕肠道菌群结构 |
| 2.3 健康家蚕在生长发育过程中肠道菌群结构的变化 |
| 2.4 健康雌蚕和雄蚕肠道菌群的差异 |
| 2.5 感染Bm CPV后家蚕肠道菌群的变化 |
| 2.6 健康家蚕和感染Bm CPV家蚕肠道菌群结构的相似性分析 |
| 2.7 优势菌属进化分析 |
| 2.8 优势菌属之间相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 Bm BDV感染对家蚕肠道菌群的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料和主要试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Illumina miseq sequencing数据分析 |
| 2.2 不同发育阶段家蚕肠道细菌种群的结构分析 |
| 2.3 感染Bm BDV家蚕肠道菌群结构的变化 |
| 2.4 健康家蚕及感染Bm BDV家蚕肠道优势菌群进化分析 |
| 2.5 家蚕肠道细菌的互作 |
| 2.6 免疫信号通路关键基因、抗菌肽基因的表达与肠道微生物种群的关系 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 短时间高温处理后对家蚕肠道菌群的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料和主要试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 健康家蚕肠道菌群结构 |
| 2.2 短时间高温处理对家蚕肠道菌群结构的影响 |
| 2.3 健康家蚕和高温处理的家蚕肠道菌群结构的相似性分析 |
| 2.4 短暂高温处理家蚕后肠道菌群进化分析 |
| 2.5 家蚕肠道细菌的互作 |
| 2.6 家蚕免疫通路、Hippo通路、抗菌肽基因的表达与肠道细菌种群的关系 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 家蚕与野桑蚕肠道菌群结构差异分析 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 家蚕肠道菌群结构 |
| 2.2 野桑蚕肠道菌群结构及与家蚕的区别 |
| 2.3 野桑蚕肠道细菌的聚类分析及与家蚕的比较 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 总讨论 |
| 1 不同季节饲养家蚕肠道细菌的结构存在差异 |
| 2 不同因素对家蚕肠道细菌的影响存在差异 |
| 3 肠道细菌之间互作与肠道基因表达关系 |
| 结论 |
| 1 已取得的成果 |
| 2 有待进行的研究 |
| 附录一 论文中荧光定量数据 |
| 附录二 原始数据登录号 |
| 附录三 缩略词 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）家蚕二分浓核病毒感染的家蚕连续病理变化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 家蚕二分浓核病毒（BmBDV）研究简史 |
| 1.2 家蚕及家蚕病毒病 |
| 1.2.1 家蚕 |
| 1.2.2 家蚕病毒病 |
| 1.3 家蚕二分浓核病毒 |
| 1.3.1 家蚕对家蚕二分浓核病毒的敏感性 |
| 1.3.2 家蚕二分浓核病毒导致的家蚕病理变化 |
| 1.3.3 家蚕二分浓核病毒基因组结构简介 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 1.5 研究内容和技术路线 |
| 1.5.1 主要研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 BmBDV感染对家蚕生长发育的影响 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 病毒与家蚕 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 溶液的配制 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 BmBDV粗提液的制备 |
| 2.2.2 BmBDV粗提液的PCR鉴定 |
| 2.2.3 BmBDV感染家蚕实验 |
| 2.2.4 五龄家蚕的感染与饲养 |
| 2.2.5 蛹重和蛹死亡率统计 |
| 2.2.6 子代卵及蚁蚕总DNA的提取 |
| 2.3 结果和分析 |
| 2.3.1 BmBDV粗提液PCR检测 |
| 2.3.2 不同发育阶段的幼虫对BmBDV的敏感性 |
| 2.3.3 BmBDV对家蚕生长发育的影响 |
| 2.3.4 BmBDV感染家蚕的典型病理症状 |
| 2.3.5 BmBDV感染对家蚕吐丝量和蛹发育的影响 |
| 2.3.6 BmBDV感染对家蚕子代的影响 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 BmBDV感染的家蚕中肠组织连续病理变化研究 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 BmBDV感染组织的取材与固定 |
| 3.2.2 中肠组织的包埋与病理切片 |
| 3.2.3 HE染色 |
| 3.2.4 组织病变观察 |
| 3.2.5 免疫酶组织化学 |
| 3.3 实验结果及分析 |
| 3.3.1 组织连续病理变化 |
| 3.3.2 病变细胞的脱落 |
| 3.3.3 免疫组织化学 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 BmBDV的感染周期及其基因的转录时相研究 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂的配制 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 BmBDV荧光定量引物的设计与合成 |
| 4.2.2 实时荧光定量PCR标准品质粒的构建 |
| 4.2.3 标准品质粒拷贝数的计算 |
| 4.2.4 qPCR反应条件的优化及标准曲线的建立 |
| 4.2.5 蚕沙中病毒量的测定 |
| 4.2.6 组织的取材与保存 |
| 4.2.7 中肠总RNA的提取及cDNA第一链的合成 |
| 4.2.8 RT-PCR和RT-qPCR反应 |
| 4.3 实验结果及分析 |
| 4.3.1 标准品质粒的鉴定结果 |
| 4.3.2 BmBDV荧光定量标准曲线 |
| 4.3.3 BmBDV的感染周期研究 |
| 4.3.4 中肠总RNA的电泳鉴定结果 |
| 4.3.5 BmBDV感染四龄家蚕后的转录时相 |
| 4.3.6 BmBDV感染五龄家蚕后的转录时相 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要工作总结 |
| 5.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间研究成果 |
| 参加课题 |
四、中国株家蚕浓核症病毒的发育（论文参考文献）
- [1]家蚕对BmBDV-Z抗病基因功能研究及其在育种中的应用[D]. 高亦涵. 江苏科技大学, 2021
- [2]罗氏沼虾两种病毒、两种细菌及虾肝肠胞虫检测与鉴定方法的建立[D]. 郭莹. 华中农业大学, 2020(02)
- [3]家蚕全基因组编辑细胞库的构建及其应用[D]. 常珈菘. 西南大学, 2020(12)
- [4]家蚕C型凝集素S3相关免疫功能研究[D]. 詹明月. 安徽农业大学, 2019(05)
- [5]一株新的蚊浓核病毒AalDV-7的分离、鉴定和病原学分析[D]. 李静. 南方医科大学, 2019(09)
- [6]家蚕免疫信号通路对BmNPV和BmBDV两种病毒感染的应答[D]. 孔鸣. 江苏大学, 2018(02)
- [7]基因编辑BmNPV iap2和orf59的家蚕抗性素材创制[D]. 董非凡. 西南大学, 2018(01)
- [8]家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及细胞毒性研究[D]. 徐五. 江苏大学, 2016(01)
- [9]病毒感染和高温处理对家蚕肠道菌群结构的影响[D]. 孙振丽. 苏州大学, 2016(01)
- [10]家蚕二分浓核病毒感染的家蚕连续病理变化研究[D]. 张晓龙. 江苏大学, 2016(09)