一、动脉粥样硬化的扫描电镜研究进展（论文文献综述）
张润军[1]（2019）在《pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究》文中指出研究背景:心血管疾病（CVD）是全世界发病率和死亡率的主要原因。据估计,心血管病每年可导致1790万人死亡,约占全球死亡总数的31%。研究表明,血管炎症与多种心血管疾病的发病机制密切相关,如动脉粥样硬化、心肌梗死、再狭窄、颅内动脉瘤和主动脉瘤、卒中和外周动脉疾病。通过调节参与炎症反应的不同分子和细胞过程,已经有大量的治疗方法被研究用来预防和治疗心血管病。尽管在临床前研究方面取得了重大成果,但大多数已检测的抗炎药物的理想疗效尚未在临床实践中得到充分证明。在很大程度上,这可能与治疗分子递送到血管炎症部位的效率低下有关,这是由于它们的非特异性分布和从循环中被快速消除造成的。即使是炎症血管内局部吸收的药物,由于扩散不受控制,滞留时间也很短。近年来,基于纳米粒的靶向治疗被认为是一种很有前景的策略,可以特异性地递送不同的治疗和成像药物,用于检测或治疗血管炎症。尤其广泛的纳米粒已被设计作为靶向载体治疗动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭、缺血再灌注损伤、严重的肢体缺血、再狭窄、腹主动脉瘤和缺血性卒中。在这些例子当中,聚合脂质纳米粒、脂质体、重组高密度脂蛋白、来源于细胞的囊泡、无机纳米粒和金属纳米粒以及混合纳米粒被用于递送治疗药物,从小分子药物、多肽/蛋白质到核酸,治疗与血管炎症相关的心血管疾病。除了通过受损的内皮细胞层或EPR效应被动靶向到血管病变部位,纳米粒还可通过调节它们的物理性质（如几何结构和顺应性）,分子基团的修饰或特殊细胞膜的功能化,使血管靶向效率得到进一步提高。另一方面,可以根据血管炎症部位异常变化的生物化学信号,设计合成纳米粒的组成成份,有针对性地释放药物载荷。然而,这些血管靶向纳米治疗的转化仍然具有很大的挑战性。虽然直接调控抗原特异性亲和力可以增强纳米粒在血管的聚集,但仅用分子基团修饰后,纳米粒的靶向效率仍然非常有限。对于以细胞膜为基础的仿生策略衍生的纳米药物治疗,其相对复杂的配方流程和不明确的成分可能会妨碍其后续的大规模生产和临床研究。此外,需要进一步改进对感兴趣的血管病变部位的不可控的释放。越来越多的证据表明,双重或多重刺激响应性纳米粒能够在其作用的部位更精准地控制负载药物的释放,大大提高了药物的递送效率。在这方面,对多种生物化学信号或生物化学/物理信号敏感的纳米粒已被广泛用于肿瘤、糖尿病、炎症等多种疾病的靶向治疗。然而,基于这些响应性纳米粒治疗的临床转化并不简单,在很大程度上主要是由于更复杂的药物研发,尤其是在可重复性和质量控制方面。此外,针对目前大多数靶向血管的响应性纳米载体,体内安全性是另外一个重要的问题,尤其对于慢性疾病的治疗,因为大多数静脉注射纳米粒被单核吞噬细胞系统清除并聚集于肝脏和脾脏等器官。因此,亟待开发能够响应与血管炎症相关的生物化学信号,具有理想的靶向能力和良好的药物控释性能且更为有效和安全的纳米药物递送平台。通过对环糊精的化学功能化,最近开发了一系列在酸性和氧化应激条件下具有高度可调控水解行为的响应性材料。体外细胞培养和不同动物模型的在体实验研究结果证明,基于这些载体材料构建的纳米粒对低pH值和高ROS刺激具有较好的响应性及良好的生物安全性。鉴于血管内皮损伤后局部存在炎症微酸性环境和增高的氧化应激,通过整合优化活性氧和pH响应性的环糊精材料的比例,构建活性氧和pH双响应性纳米粒,可以作为一种新型有效和安全的纳米平台,用于血管炎症部位的药物递送。此外,结合分子靶向策略还可以进一步增强血管的靶向性和体内双响应性纳米粒治疗的有效性。本研究课题基于前期合成的pH响应性和活性氧（ROS）响应性的载体材料,以雷帕霉素为模型药物,构建了pH和ROS双响应的纳米药物递送系统,在大鼠颈动脉球囊损伤的血管炎症模型中,通过与非响应性、pH或ROS单一响应性纳米粒治疗比较,考察和评价了pH和ROS双响应性纳米粒的治疗优势以及双响应性主动靶向载药纳米粒在体防治血管再狭窄的效果。研究内容:1.基于β-CD的载体材料的合成1.1 pH响应性β-环糊精材料（ACD）的合成先将1 g β-CD 溶解在8 mL无水DMSO中,然后加入4 mL的2-甲氧基丙烯（MP）,磁力搅拌溶解并与有机试剂充分混匀,最后加入16 mg的吡啶对甲苯磺酸盐（PTS）。室温条件下反应3 h,然后加入0.3 mL三乙胺终止反应。得到的产物加超纯水沉淀,离心,洗涤3次冻干得到白色粉末。1.2 活性氧响应性β-环糊精材料（OCD）的合成将5.55 g 4-PBAP加入到36 mL无水二氯甲烷（DCM）中充分溶解,然后加入7.65 g 1,1’-羰基二咪唑（CDI）。室温条件下磁力搅拌反应0.5 h,再加入40 mL DCM,用30 mL超纯水洗涤三次。再用饱和NaCL洗涤有机相,无水Na2SO4干燥,真空浓缩得到 CDI 活化的 PBAP（CDI-PBAP）。随后,将 250 mg β-CD 和 1.52 g CDI-PBAP 加入至20 mL无水二甲基亚砜中,再加入800 mg DMAP反应过夜。最后,加入超纯水沉淀、离心收集,洗涤三次后冻干得到白色粉末。采用FT-IR和1H NMR对合成的上述两种响应性载体材料进行表征。2.不同纳米粒的制备采用纳米沉淀/自组装法制备基于不同材料的载RAP纳米粒。具体过程如下:精确称取 50 mg PLGA,ACD,OCD或ACD/OCD以不同的质量比混合（80:20、60:40、50:50、40:60、20:80）的载体材料和10 mg RAP共同溶于2 mL有机溶剂中,得到有机相。对于PLGA和ACD纳米粒,使用乙腈;OCD纳米粒,使用无水甲醇;ACD/OCD采用1:1（v/v）无水甲醇和乙腈混合溶剂制备有机相。另将0.6 mL卵磷脂无水乙醇溶液（10mg/mL）和9 mg DSPE-PEG2000溶解在10 mL的去离子水中,油浴加热至65℃ 1 h。然后,将有机相缓慢加入至上述的预热溶液中,磁力搅拌2 h。最后获得的纳米粒溶液用去离子水透析24 h,冻干后即得到不同的载RAP纳米粒（RAP/ACD NP,RAP/AOCD NP,RAP/OCD NP及RAP/PLGA NP）。空白纳米粒,Cy5或Cy7.5荧光标记的纳米粒均通过类似的方法制备获得3.不同纳米粒的表征不同NPs在水溶液中的粒径及粒径分布,Zeta电位通过马尔文粒径仪检测。取新鲜制备的纳米混悬液,滴加到载膜铜网上,室温晾干后透射电子显微镜下观察纳米粒子形态并拍照采集图像。同样将制备好的纳米粒混悬液滴加至云母片,喷金晾干后采用透射电子显微镜观察纳米粒形态并拍照采集图像。载RAP纳米粒在加入适量无水甲醇和乙腈混合溶液后离心,取上清通过高效液相色谱法（HPLC）检测RAP载药量。此外,Cy5或Cy7.5的含量通过荧光光谱仪测定。4.不同空白纳米粒体外水解实验将不同的纳米粒分别分散于pH 5、pH 6、pH 7.4以及加入1 mM H202 0.01 M的PBS缓冲液中。37℃孵育不同时间后,于设定时间点采集样品测定纳米粒溶液在500 nm波长处的透光率。最后,根据透光率计算纳米粒的水解百分比。5.载雷帕霉素纳米粒的体外药物释放实验将新鲜制备冻干的pH/ROS双响应性载RAP纳米粒5 mg分别分散在8 mL不同pH值（pH 5、pH 6、pH 7.4）以及加入 1 mM H2O2 0.01 M 的 PBS 缓冲液中,置于37℃孵箱内震荡混匀。在既定的不同时间点,将含有纳米粒的溶液以19118 g离心,取适量上清液并补充等量相同介质。HPLC检测RAP药物浓度,绘制纳米粒的药物累积释放曲线。单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP仍用相同的方法检测其不同时间点的累积药物释放量,绘制相应药物释放曲线。6.纳米粒的细胞吞噬实验将鼠主动脉血管平滑肌细胞株（MOVAS）以2×105个/孔的密度接种于12孔板中,孵育24小时后,去除培养基并加入相同浓度的Cy5荧光标记的不同纳米粒,在37℃条件下与平滑肌细胞孵育不同的时间。观察前,用溶酶体探针LysoTracker Green染色标记晚期核内体和溶酶体,DAPI染色细胞核。采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察并采集荧光图像。同样,在平滑肌细胞孵育24小时后,加入不同浓度梯度的Cy5标记基于不同载体制备的纳米粒与细胞共同孵育6小时后,考察细胞对纳米粒的剂量依赖性吞噬。另外,通过流式细胞术定量细胞对Cy5标记的不同纳米粒的吞噬,荧光活化细胞分选（FACS）测定荧光强度。考察孵育时间及纳米粒剂量对血管平滑肌细胞吞噬行为的影响。7.不同载雷帕霉素纳米粒体外抑制rVSMCs增殖和迁移的作用研究MOVAS细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组仅加入PDGF-BB,继续培养24h后,用CCK-8法检测细胞活性。采用8 μm孔径的Transwell小室评价载不同RAP纳米粒对PDGF-BB诱导的大鼠VSMCs迁移的影响。将MOVAS细胞以2×105个/孔的密度接种于12孔板中。37℃卵孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP 及 RAP/AOCD NP）与平滑肌细胞共同孵育。阳性对照组加入PDGF-BB,而正常对照组不加PDGF-BB和游离的雷帕霉素。6 h后,胰酶消化收集细胞,200μL培养基重悬,将不同治疗组的细胞分别加至Transwell上室,下室则加入600 μL含0.5%FBS和20 ng/mL PDGF-BB的培养基。孵箱内静置8 h后,用棉签轻轻擦去Transwell膜上方未迁移的细胞。4%多聚甲醛固定细胞,0.1%结晶紫染色。最后光学显微镜下观察拍照,随机选取5个视野计数染色细胞的数量并进行统计学分析。8.细胞周期检测MOVAS细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组加入PDGF-BB。细胞与不同载药纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化并收集细胞,70%乙醇固定,4℃孵育过夜。通过洗涤后,将不同载药纳米粒干预的细胞与RNase在37℃条件下孵育30分钟,然后用碘化丙啶在4℃避光条件下进行细胞染色30分钟。最后通过流式细胞术检测平滑肌细胞在G1、S、G2/M期的比例并进行统计分析。9.免疫印迹分析将MOVAS细胞分别与不同载RAP纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化细胞,加入细胞裂解液,使细胞完全裂解,然后4℃条件下,12000 g离心30 min,收集上清,用BCA试剂盒测定蛋白浓度,进一步通过Western blotting检测细胞周期相关蛋白的表达水平。将含有50 μg蛋白的样本在10%十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上分离,电泳转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭,在4℃条件下,将膜与一抗体孵育过夜:（1）Cyclin D1 抗体,稀释1:200;（2）p27kip1抗体,稀释1:250;（3）β-actin抗体,稀释1:1000。然后在37℃条件下,将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗共同孵育1 h,二抗稀释倍数为1:1500。洗涤三次后,通过增强型化学发光试剂盒荧光成像显示特异性条带,同时进行半定量分析。10.不同纳米粒的细胞毒性实验研究将MOVAS细胞以10000个/孔的密度接种于96孔板,培养24 h后,加入不同浓度梯度的空白纳米粒（PLGA NP,ACD NP,OCD NP及AOCD NP）,共同孵育24 h后,CCK-8法检测细胞的活性。11.SD大鼠颈动脉球囊损伤再狭窄模型的建立雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉起效后,颈部脱毛备皮,消毒,行颈前部正中切口,钝性分离皮下软组织及颈前肌肉组织,暴露颈动脉分叉,游离左侧颈总动脉及颈内、颈外动脉,将2F Fogarty取栓球囊导管由颈外动脉切口插入至颈总动脉近心端,PTCA压力泵以适当压力充盈球囊,旋转并回撤球囊至颈外动脉,重复三次,完全剥脱颈总动脉血管内皮。然后,尾静脉注射伊文思蓝评价血管内皮损伤情况。12.颈动脉损伤部位酸性炎症微环境和氧化应激水平的考察与评价采用细胞内pH荧光探针BCECF-AM对颈动脉损伤部位组织的pH值变化进行定性评价。在颈动脉球囊损伤模型建立后,于不同时间点取材损伤的颈动脉组织,O.C.T.包埋后,冰冻组织切片（8 pm）。然后,用10 μM ROS荧光探针DCFDA或5μM超氧阴离子荧光探针DHE分别对组织切片进行染色,检测球囊损伤局部组织ROS及超氧阴离子水平。另外,采用相应诊断试剂盒分别对损伤局部组织过氧化氢（H202）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性进行检测。ELISA试剂盒分别检测丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）的表达水平。同样,典型促炎细胞因子α-肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素1 β（IL-1 β）的表达水平也通过ELISA试剂盒分别检测。13.靶向Ⅳ型胶原的双响应性载RAP纳米粒的构建将靶向血管内皮下Ⅳ型胶原的多肽（KLWVLPKGGGC-Am）溶解在含有5 mmol/L EDTA的中性PBS缓冲液中,以二硫键/TCEP摩尔比1:1的比例,加入适量的TCEP断键溶液还原。然后,将多肽和DSPE-PEG-MAL以5:4的摩尔比,在4%乙醇溶液中,室温条件下磁力搅拌反应4h,合成KLWVLPKGGGC-DSPE-PEG三嵌段共聚物,未结合的游离肽通过透析去除。最后,将载体材料OCD/ACD以80:20质量比,DSPE-PEG-peptide/DSPE-PEG以1:9摩尔比混合,采用纳米沉淀自组装的方法,制备靶向IV型胶原的双响应性载RAP纳米粒。14.靶向纳米粒体外胶原结合实验的研究将Ⅳ型胶原溶解在0.25%醋酸中,配制浓度为0.5 mg/mL的胶原溶液。将100μL胶原溶液加入到96孔板中,4℃条件下孵育过夜。在胶原涂层或没有胶原涂层的孔板中先用50%血清封闭1 h后,再加入100μL用25%牛血清配制的Cy7.5荧光标记的双响应性靶向纳米粒（Cy7.5/TAOCD NP）,纳米粒浓度（0.2 mg/ml）。孵育1 h后,用包含0.05%吐温20的PBS缓冲液洗板3次。最后,通过IVIS光谱系统观察并拍摄孔板荧光图像。15.纳米粒体内靶向血管内皮损伤部位的研究大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉分别注射Cy7.5荧光标记的不同纳米粒（Cy7.5/PLGA NP,Cy7.5/ACD NP,Cy7.5/OCD NP 及 Cy7.5/AOCD NP）,在体循环8 h后,取材完整的颈动脉及主要脏器,进行小动物活体荧光成像（IVIS）观察纳米粒在血管内皮损伤部位的荧光强度及组织分布情况并进行定量分析。另外,在颈动脉球囊损伤后,经尾静脉注射Cy7.5荧光标记的双响应性纳米粒（Cy7.5/AOCD NP）,在预设不同观察时间点取材损伤的颈动脉组织,离体成像观察和定量分析荧光强度,评价纳米粒的靶向和滞留时间变化情况。16.靶向纳米颗粒与损伤颈动脉的特异性结合的评价在大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉注射Cy5荧光标记的靶向纳米粒（Cy5/TAOCD NP,25 μg/kg）。在体循环0.5 h后,给予安乐死,取材颈动脉组织,Tissue-Tek O.C.T.包埋,冰冻组织切片（5μm）,FITC标记的抗体染色血管内皮下IV型胶原,DAPI染核后,盖玻片封片,通过CLSM观察颈动脉组织荧光分布及靶向纳米粒与胶原共定位情况。17.不同载雷帕霉素纳米粒对SD大鼠颈动脉球囊损伤的疗效评价将30只雄性SD大鼠随机分为6组（n=5）,包括假手术组（正常组）、生理盐水治疗组（模型组）,以及RAP/PLGA纳米粒组、RAP/ACD纳米粒组、RAP/OCD纳米粒组及RAP/AOCD纳米粒组。除假手术组外,其余各组大鼠均按上述方法实施颈动脉球囊损伤。在颈动脉球囊血管成形术后,分别于术后即刻（0d）,4 d,8 d,12 d尾静脉注射RAP终浓度为1 mg/kg的不同载RAP纳米粒。在另一项单独设计的实验研究中,RAP/AOCD纳米粒或RAP/TAOCD纳米粒在大鼠颈动脉球囊损伤后即刻（0 d）,5 d,10 d分别以终浓度1 mg/kg的RAP经尾静脉注射给药。在血管成形术后第14 d,给予大鼠安乐死。原位灌注后取材损伤的颈动脉段及主要脏器,进行组织学和免疫组化研究,考察相关标志物表达水平。18.双响应性纳米粒的急性毒性和载雷帕霉素纳米药物治疗对SD大鼠的长期毒性评价实验12只雄性SD大鼠（180-250g）随机分为4组（n=3）。在AOCD纳米粒组,尾静脉注射不同剂量（250、500或1000 mg/kg）AOCD纳米粒。正常对照组给予尾静脉注射生理盐水。仔细观察各组动物的相关毒性症状和行为活动状况。在规定的时间点称量检测体重变化。在给药后第14 d,给予大鼠实施安乐死,即刻采集血样进行血液学和生化相关指标分析。收集主要脏器并称重,分析计算脏器指数（每只大鼠的器官重量与体重之比）,同时制作组织切片H&E染色观察其病理变化。健康雄性SD大鼠16只,体重（180-250 g）随机分为4组（n=4）。空白纳米粒组按11.5 mg/kg AOCD NP治疗（相当于RAP纳米粒的治疗剂量1 mg/kg）,另外两组分别按1 mg/kg RAP/AOCD NP或 3 mg/kg RAP/AOCD NP,尾静脉注射,每周 2 次,连续 12周。正常对照组大鼠则给予静脉注射生理盐水。治疗期间,每天动态观察各组动物死亡率、外貌、全身状况和行为异常等情况。每周记录食物和水的消耗以及体重变化情况。第12周,给予安乐死。采集血液样本,化验分析具有代表性的血液学和生化指标。取主要脏器包括心、肝、脾、肺、肾并称重计算脏器指数。同时制备组织学切片,H&E染色观察病理变化。另外,用抗CD3抗体和抗CD19抗体对脾脏组织切片进行免疫组化染色,评价长期载RAP纳米药物对SD鼠免疫功能的影响。19.双响应性载雷帕霉素纳米粒长期治疗后小鼠脾脏T、B淋巴细胞的定量研究实验将24只雄性C57BL/6J小鼠（18-22 g）随机分为4组（n=6）。正常对照组给予生理盐水,空白纳米粒组按11.5 mg/kg（相当于载RAP纳米粒治疗剂量1 mg/kg）剂量尾静脉注射AOCD NP。另外两组小鼠分别给予RAP/AOCD NP,1 mg/kg或3 mg/kg,尾静脉注射,每周2次,连续给药12周。在治疗期间,观察小鼠的一般身体状况的任何变化,包括外貌,摄食、饮水,行为活动及死亡率等。第12周,对小鼠实施安乐死。取脾脏并将分离的脾脏组切成小块,加入无菌PBS缓冲液,对组织进行彻底研磨,然后在淋巴细胞分离培养基中离心收集细胞。将FITC标记的抗CD3抗体及PE标记的抗CD19抗体在4℃条件下,与脾脏组织提取的淋巴细胞共同避光孵育30 min后,用流式细胞染色缓冲液洗涤细胞2次,PBS缓冲液重悬细胞。最后,采用流式细胞仪对脾脏组织中T细胞和B细胞的百分率进行定量分析,评价RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统的影响。研究结果:1.pH和ROS双响应性纳米粒的制备基于β-环糊精（β-CD）,通过单步缩醛化反应合成pH响应性的载体材料（ACD）,傅里叶红外光谱和核磁共振氢谱检测证实ACD被成功合成。根据ACD 1H NMR谱计算,环缩醛与线性缩醛的摩尔比约为0.62,缩醛化度约为90%。此外,（OCD）通过在β-CD分子上将氧化敏感性苯硼酸酯单元4-PBAP以羰基键合的方式引入β-CD合成ROS响应性载体材料,1H NMR谱证实,每个β-CD分子大约有7个PBAP单元。采用改良的纳米沉淀/自组装法制备基于上述两种不同响应性的载体材料的双响应性纳米粒,将ACD和OCD以不同重量配比,构建了 pH/ROS双响应性纳米粒。基于ACD/OCD的不同纳米粒,在质量比为 100:0、80:20、60:40、50:50、40:60、20:80、0:100 时,分别命名为 ACD NP、AOCD8020 NP、AOCD6040 NP、AOCD5050 NP、AOCD4060 NP、AOCD2080 NP和OCD NP。透射电镜（TEM）观察,在不考虑组成分差异的情况下,所制备的纳米粒均为球形,形态规则,粒径均一。马尔文粒径电位检测显示所有制备的纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到186±4 nm。不同纳米粒的粒径分布相对较窄。提示ACD与OCD载体材料具有良好的混合相容性。2.不同双响应性纳米粒的体外水解特性基于载体材料ACD和OCD构建的pH/ROS双响应纳米粒的体外水解,在含有1mM H2O2及不同pH值的PBS缓冲液中进行。对于ACD NP,在pH 5或pH 6的微酸性条件下均表现出明显的快速水解,而H2O2的存在对其水解几乎无任何影响,具有良好的响应低pH的特性。相对于ACD NP,OCD NP的水解则与pH无关,在H202存在的条件下,OCD NP水解迅速。相比在不同的pH值,OCD NP在pH值为5、6或7.4时均表现出类似的水解特性。基于载体材料ACD和OCD构建的双响应性纳米粒,它们的水解行为依赖于pH和H202,通过在含有1 mM H2O2及不同pH条件的PBS缓冲液中,比较基于不同比例ACD和OCD载体材料制备的双响应性纳米粒水解试验的结果,提示基于ACD/OCD的纳米粒具有pH和ROS双重响应的能力。AOCD2080 NP和AOCD8020 NP在1 mM H2O2和pH 5、6或7.4环境中,表现出更为理想的双响应的特性。此外,在H202存在的情况下,AOCD2080 NP在不同pH值条件下表现出较好的水解行为,因此,AOCD2080纳米粒进一步被用于后续的课题研究。采用基于ACD和OCD的复合材料,成功地构建了 pH/ROS双响应性纳米药物递送平台。值得注意的是,通过改变ACD/OCD的质量比,可以很容易地调控制备得到的纳米载体的精确的水解敏感性。3.pH和ROS双响应性载药纳米粒的制备和表征通过不同响应性空白纳米粒制备响应的载RAP纳米粒。同时,利用PLGA制备了非响应性载药纳米粒作为对照。与相应的空白纳米粒相似,四种载药纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到179±6 nm。RAP/PLGA纳米粒、RAP/ACD纳米粒、RAP/OCD纳米粒、RAP/AOCD纳米粒的载药量分别为4.5±0.4%、9.4±0.2%、8.2±0.1%、8.7±0.4%。通过体外药物释放实验研究检测了不同纳米药物的响应性释放行为。对于RAP/AOCD NP,与中性（pH=7.4）PBS缓冲液相比,RAP的释放在微酸性（pH=5或pH=6）PBS缓冲液中明显加快。同时,无论在上述三种不同pH值的PBS缓冲液中,在1mM H2O2存在的条件下都显着增加了载药纳米粒的药物释放速度。因此,RAP/AOCD NP表现出理想的pH/ROS双响应的释药能力,这与相应的空白纳米粒AOCD2080 NP的双响应性水解特性相吻合。另外,单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP药物释放也同样符合相应纳米载体的水解性能。通过利用基于pH响应性和ROS响应性材料设计的纳米复合材料可以简单、成功地构建出pH/ROS双响应性载RAP纳米粒。4.体外rVSMCs对双响应纳米粒的摄取Cy5标记的双响应性纳米粒（Cy5/AOCD NP）与VSMCs孵育1 h后,VSMCs中的荧光信号随着Cy5/AOCD纳米粒的剂量的增加而明显增强,提示细胞对纳米粒的内吞呈现剂量依赖性的特点。与激光共聚焦显微镜观察结果一致,流式细胞术荧光激活细胞分选（FACS）定量进一步证实了 VSMCs对Cy5/AOCD NP的有效细胞摄取呈剂量依赖的方式。在相同剂量的Cy5/AOCD NP下,随着孵育时间的延长,Cy5荧光在VSMCs中的分布也随之增加。而且,通过溶酶体探针Lysotracker对晚期核内体和溶酶体进行染色,发现血管平滑肌中内吞Cy5/AOCD NP从核内体/溶酶体转运到细胞质中（核内体/溶酶体逃逸现象）。同样,FACS的分析表明,随着孵育时间的增加,VSMCs内吞Cy5/AOCDNP的作用增强。这些结果充分表明,大鼠VSMCs可以有效地内吞基于ACD和OCD材料构建的pH/ROS双响应性纳米粒。在酸性和氧化应激微环境的亚细胞细胞器中,与pH响应性或ROS响应性的纳米粒相比,双响应性纳米粒能够更快地释放负载的药物分子。5.双响应性载药纳米粒的体外生物学效应不同响应性纳米粒的细胞毒性均较PLGA纳米粒低。载雷帕霉素纳米粒在相对低剂量下具有较低的细胞毒性。经RAP原料药和不同的RAP纳米粒治疗24小时,可显着抑制VSMCs的迁移。值得注意的是,与游离RAP相比,所有载药纳米粒都显示出明显更强的抑制VSMCs迁移效果。此外,响应性载药纳米粒对VSMCs迁移的抑制作用比非响应性载药纳米粒（RAP/PLGA NP）更为显着。值得注意的是,双响应性纳米药物治疗（RAP/AOCD NP）的抑制血管平滑肌细胞增殖的效果最好,与单一响应性纳米粒治疗相比差异显着。而且,不同载药纳米粒治疗对细胞周期的影响的实验表明,载RAP纳米粒主要通过抑制细胞G1/S的转化从而抑制VSMCs的增殖。载RAP纳米粒使细胞周期停滞在G1期的机制研究表明,双响应性载RAP纳米粒抑制VSMCs增殖通过上调p27Kip1和下调cyclin D1表达使细胞停滞于G1期。6.双响应性载RAP纳米粒在体靶向治疗血管再狭窄以大鼠颈动脉球囊损伤为模型,建立大鼠血管炎症性疾病模型,并通过Evan’s蓝染色证实明显的内皮剥脱损伤。pH敏感性荧光探针检测颈动脉损伤局部pH值的变化显示:正常动脉显示明显的绿色荧光,而球囊损伤后第1、7、14天分离的动脉组织荧光信号明显较弱,表明损伤动脉中存在相对酸性的微环境。用DHE和DCFHDA荧光探针对大鼠颈动脉冰冻组织切片进行染色,与正常动脉相比,球囊损伤后第1天颈动脉荧光强度轻度升高。而在损伤后第7天和第14天,可以观察到明显的增强荧光。这些结果证实动脉损伤部位存在氧化应激,很大程度与炎症的进展有关。双响应性纳米粒对损伤颈动脉的靶向性研究表明,纳米粒对内皮损伤的颈动脉具有靶向性,定量分析显示,非响应性纳米粒和响应性纳米粒治疗组间差异并无统计学意义。载RAP纳米粒给血管再狭窄治疗带来不同程度的获益,颈动脉管腔面积显着增加,而内膜面积和增殖指数明显减少,中膜面积无明显变化。在各组载RAP纳米粒的治疗中,双响应性载药纳米粒疗效最佳。在不同的载RAP纳米粒治疗后,免疫组织化显示:总α-SMA阳性细胞数量明显减少。此外,所有纳米药物治疗组的PCNA均显着降低,但以RAP/AOCD NP组的效果最好。MMP-2结果与PCNA相似。而且,在给予响应性载药纳米粒治疗的大鼠动脉中的8-OHdG表达显着降低。定量分析显示,在双响应性载药纳米粒治疗后,动脉组织中典型的氧化应激相关标志物,包括H202、MDA和MPO的水平显着降低。另一方面,损伤颈动脉SOD活性明显降低,经RAP/AOCD NP治疗后,SOD活性得到有效恢复。同时,与模型组相比,组织损伤部位的促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素（IL）1 β的表达水平在RAP/AOCD NP治疗后也发生了显着降低。7.pH和ROS双响应性靶向Ⅳ型胶原的载药纳米粒的制备与表征通过巯基-马来酰亚胺键合,将多肽KLWVLPKGGGC与DSPE-PEG结合。通过类似改良的纳米沉淀法/自组装法成功构建了靶向Ⅳ型胶原、p H-/RO S-双响应性纳米粒（TAOCDNP）。经TEM和SEM检测,TAOCDNP呈球形,具有较窄的粒径分布。平均流体力学直径131 nm,Zeta电位-27.2±0.3 mV。雷帕霉素可以包载到TAOCD NP中,形成一种靶向、双响应性载药纳米粒（RAP/TAOCD NP）,球形结构、粒径分布窄,能够有效负载雷帕霉素。8.TAOCD NP的体内外靶向能力评价与非靶向NPs（AOCD NP）相似。共聚焦显微镜观察和流式细胞术定量分析均显示VSMCs对Cy5/TAOCD NP的吞噬呈剂量依赖性和时间依赖性方式。这些结果证实了靶向肽的加入对AOCD NP的细胞摄取行为没有显着影响。Cy7.5/TAOCD NP在体外对ⅣV型胶原的粘附表明,引入到TAOCD NP上的靶向肽维持了其对ⅣV型胶原的特异性结合能力。TAOCD NP在体靶向能力表明,Cy7.5/TAOCD NP组在血管内皮损伤部位的荧光强度明显高于Cy7.5/AOCD NP组。动脉组织切片的显微镜观察也显示Cy5/TAOCD NP有相对较强的荧光。大鼠颈动脉冰冻组织切片Ⅳ型胶原抗体免疫荧光染色显示损伤动脉中Ⅳ型胶原（绿色荧光）与红色Cy5荧光共定位,而正常动脉中未见Cy5荧光。总之,这些结果证明,经靶向Ⅳ型胶原多肽修饰可显着增强pH和ROS双响应性纳米载体对损伤颈动脉的被动靶向聚集。9.双响应性载RAP靶向纳米粒靶向治疗血管再狭窄颈动脉H&E染色显示,RAP/AOCD NP或RAP/TAOCD NP治疗均能明显抑制血管新生内膜增生。与RAP/AOCD NP治疗组相比,RAP/TAOCD NP组在增加管腔面积、减少内膜面积及降低增殖指数方面均有显着差异。同样,免疫组化分析显示,与RAP/AOCD NP相比,RAP/TAOCD NP能更有效抑制VSMCs在血管内膜的增殖,显着降低了 MMP-2和8-OHdG的表达。这些结果表明,pH-/ROS-双响应性纳米药物治疗的体内防治血管再狭窄效果可以通过靶向单元修饰进一步增强。10.安全性评价将不同浓度的AOCD NP与红细胞孵育2 h,即使在浓度为2 mg/mL时,直接观察和定量分析均未见溶血。体内急性毒性试验显示,所有AOCD NP组均正常摄食和饮水,无异常行为。所有AOCD NP治疗大鼠的脏器指数（主要脏器）均与生理盐水组相当。此外,AOCD NP组血常规及肝功能,生化等相关指标与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义此外,对主要脏器的病理组织切片H&E染色表明,AOCD NP治疗的大鼠没有明显的病理改变。另外,对双重响应性载药纳米粒（RAP/AOCD NP）也进行了体内安全性研究。生理盐水组与空白纳米粒（AOCDNP）组及RAP/AOCDNP组脏器指数无显着差异。同样,经AOCD NP或RAP/AOCD NP治疗的大鼠在血常规及肝肾功能相关的生物标志物方面与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义。主要脏器的H&E染色切片显示几乎没有损伤。此外,鉴于RAP的免疫抑制活性,长期应用双响应载RAP纳米粒对大鼠脾脏T、B淋巴细胞数量无明显影响。而且,对C57BL6J小鼠进行类似的纳米粒长期给药治疗后,流式细胞术检测小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量,结果显示在RAP/AOCD NP作用下,小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量并没有显着变化。这些结果提示,相对低剂量的RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统没有显着的负面影响。总体而言,AOCDNP和RAP/AOCD NP均具有出良好的生物安全性。研究结论:1.通过联合基于β环糊精合成的pH响应性和ROS响应性材料,同时设计了一种简单和有效的方法成功构建了 pH和ROS双响应的纳米载体。2.通过优化pH响应性材料（ACD）和ROS响应性材料（OCD）的投料质量比,制备了最佳的pH和ROS响应能力的纳米粒。3.双响应性纳米粒AOCD NP能够有效地负载RAP,在低pH值或ROS较高的环境下,触发RAP/AOCD NP释放负载的RAP。RAP/AOCD NP可以通过被rVSMCs有效内吞并在亚细胞细胞器的敏感释放,增强药物分子在细胞内的递送。相比于游离RAP,非响应性和单响应性载RAP纳米粒,RAP/AOCD NP显着的抑制了血管平滑肌细胞的增殖和迁移。4.AOCD NP能够靶向聚集在大鼠颈动脉球囊损伤的部位,通过在动脉损伤部位被动靶向和触发释放RAP,与其他载药纳米粒比较,RAP/AOCD NP在大鼠中表现出更理想的抗再狭窄作用。5.通过靶向ⅣV型胶原多肽的修饰,进一步提高了AOCD NP的靶向能力,成功制备了 pH/ROS双响应的靶向纳米递送平台TAOCD NP。负载RAP的TAOCD NP比相比RAP/AOCD NP,更有效地抑制了大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成。6.AOCD NP和RAP/AOCD NP均具有良好的生物安全性。本课题研究设计的pH/ROS双响应纳米载体和构建的纳米药物递送系统有望进一步用于治疗血管再狭窄和其他与血管炎症相关的心血管疾病。
江杨[2]（2020）在《槲皮素调控非编码RNA干预内皮细胞胆固醇损伤的分子机制及其运载体系的构建》文中研究说明心血管疾病（cardiovascular diseases,CVDs）是全球范围内导致死亡人数最高的疾病。其中,脂质代谢障碍引起的动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是CVDs的主要诱因。AS的初始阶段与血管内皮损伤关系密切,氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）在血管内皮细胞炎症和脂质损伤中扮演了重要的角色。槲皮素是饮食中最丰富的抗氧化剂之一,具有抗脂质过氧化、抗炎等作用,能有效预防和干预AS。但是,槲皮素干预AS的分子机制尚未阐明。此外,槲皮素存在水溶性差、见光易分解、作用时间短等问题,限制了其在食品领域的应用。因此,本课题在前期研究基础上,构建了Ox-LDL损伤的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）模型,从非编码RNA（ncNRA）角度分析了槲皮素减轻血管内皮损伤的作用靶点及信号通路,为阐明槲皮素干预AS的分子机制提供了新的理论依据;构建了Pickering乳液运载体系,并通过动物实验评价了载槲皮素乳液的心血管保护效果,为进一步开发相关功能食品提供了技术参考。具体研究结果如下:（1）槲皮素缓解Ox-LDL诱导HUVECs损伤细胞模型的建立。分别使用Ox-LDL（25200μg/mL）和槲皮素（10300μM）处理HUVECs,结果显示Ox-LDL降低HUVECs细胞存活率的IC50值为128.2μg/mL。结合实际情况,选择125μg/mL的Ox-LDL浓度作为后续实验的损伤浓度。此外,槲皮素在030μM浓度范围内对HUVECs细胞没有表现出毒性,选择5、10、15、20、25μM的浓度梯度用于后续实验。（2）槲皮素对内皮脂质损伤的保护作用。槲皮素预处理可以缓解Ox-LDL诱导的HUVECs细胞损伤,降低细胞内活性氧（ROS）的产生和释放。进一步分析表明,槲皮素可以显着提高细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量/酶活力,降低乳酸脱氢酶（LDH）活力,减少丙二醛（MDA）积累,有效恢复胞内氧化应激稳态。此外,槲皮素预处理还可以挽救Ox-LDL损伤导致的线粒体膜电位的丧失,进而减少细胞凋亡的发生。（3）基于全转录组高通量测序的槲皮素干预Ox-LDL诱导HUVECs细胞损伤的分子机制。通过GO功能富集、KEGG通路富集以及分层聚类分析,明确PTEN/PI3K/AKT/Caspase9轴可能是槲皮素的潜在作用通路。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白质免疫印迹法（Western-blot）验证,证明槲皮素可能通过PTEN/PI3K/AKT/Caspase9途径调控细胞抵御Ox-LDL损伤。结合转录组学及靶点预测分析（Tatgetscan7.1和Starbase2.0）结果,筛选出miR-494-3p以及MALAT1可能作为槲皮素上游作用靶点,通过内源竞争性（ceRNA）调控方式直接介导槲皮素对下游PTEN的调控作用。进一步通过qRT-PCR、Western-blot、抑制剂/过表达载体转染、双荧光素酶实验以及对表观作用效果（存活率、ROS、线粒体膜电位检测）的验证,我们证明了miR-494-3p和MALAT1可能是槲皮素的上游靶点并通过ceRNA调控方式发挥作用。槲皮素对内皮的保护效果可能是通过miR-494-3p/MALAT1/PTEN/PI3K/AKT/Caspase9轴实现的。（4）玉米醇溶蛋白/山楂果胶复合胶体颗粒（ZHPs）的构建。研究分析了不同复合比例胶体颗粒在粒径、Zeta电位以及三相接触角等方面的差异,发现当复合比例为1:1时颗粒呈现出近中性润湿性(θo/w=93o)。采用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）对ZHPs的微观结构进行观察,明确了果胶分子对玉米醇溶蛋白胶体颗粒（ZPs）的包裹状态。进一步结合傅里叶红外光谱（FTIR）和Zeta电位结果,证明复合颗粒中果胶大分子对ZPs的包裹状态是氢键和静电吸附作用的结果。所合成的复合比例为1:1的ZHPs具有良好的两亲性,可用于Pickering乳液的制备。（5）ZHPs稳定的Pickering乳液（ZHPEs）特性分析。通过乳液粒径、低场核磁（LF-NMR）和流变学等分析手段,研究了不同油相分数对ZHPEs性质的影响。结果表明,室温储藏1个月后,油相分数为0.10.4的ZHPEs有水相析出;油相分数为0.50.7的ZHPEs始终保持稳定;油相分数为0.6、0.7的ZHPEs在储藏1天后转化为半固体乳液凝胶。采用激光共聚焦显微镜（CLSM）和冷场扫描电镜（cryo-SEM）对ZHPEs界面结构进行观察。cryo-SEM结果显示,ZHPEs液滴表面密布球状颗粒属于Pickering型乳液,连续相中存在的复杂交互网络限制了液滴间的相对运动。CLSM也观察到液滴表面颗粒间的纠缠联结,这正是高油相分数ZHPEs呈现出胶体特征的原因。结果表明,通过改变ZHPEs的油相分数可以操控其流变学特性及界面结构,以满足不同情况对于乳液运载体系的多样化需求。（6）山楂果胶对ZHPEs中油相脂质氧化的抑制作用。研究了山楂果胶的羟自由基清除能力和总抗氧化能力（T-AOC）及其对ZHPEs中MDA含量的影响。相比于商品果胶,山楂果胶表现出更强的羟自由基清除能力及总抗氧化能力,这主要归因于山楂果胶分子量较低,且纯化过程中部分小分子抗氧化活性成分（山楂源活性成分）残留/接枝在山楂果胶中。MDA结果显示,未乳化的玉米胚芽油中MDA含量为25.46±1.03μmol/kg,显着高于乳液中MDA含量。而相比于商品果胶制备的Pickering乳液（ZCPEs和ZAPEs）,ZHPEs对其油相中MDA含量（8.32±0.70μmol/kg）具有明显的抑制作用表明山楂果胶自身所具有的抗氧化活性可以为乳液（油相）提供额外保护。（7）动物实验评价槲皮素的体内抗胆固醇损伤效果及Pickering乳液运载体系的递送效果。研究对不同处理组小鼠血清抗氧化酶、血脂水平和肝功指标进行检测,同时牺牲小鼠利用H&E或油红O染色等手段对其组织进行分析。结果表明,槲皮素直接给药可以显着减弱胆固醇损伤、恢复体内脂质代谢稳态,特别是可以缓解脂肪性肝损伤和主动脉血管脂质损伤。此外,相比于直接给药,通过ZHPEs递送给药相同剂量槲皮素呈现出更强的保护作用。这表明运载体系可以在不增加剂量的情况下提高槲皮素的体内作用效果。
袁杨[3]（2020）在《韭根挥发油对人脐静脉内皮细胞糖萼层作用及其机制研究》文中研究指明目的:观察韭根挥发油对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）糖萼层（ESL）的作用,及其对内皮细胞表达eNOS、caveolin-1、硫酸乙酰肝素等的影响,探讨韭根挥发油对血管内皮ESL的作用机制。方法:1.韭根挥发油的提取:将韭根洗净、阴干,用打粉机粉碎,装入圆底大烧瓶中,浸泡后放入电热套上,通过水蒸气蒸馏法,收集挥发油,再用乙醚萃取3次,得到本试验使用的韭根挥发油。2.人脐静脉内皮细胞的分离培养:洗净脐静脉,注入胶原酶Ⅰ,收集消化液,离心得到人脐静脉内皮原代细胞,使用人第VIII因子相关抗原荧光染色法进行原代细胞鉴定。用DME/F12培养基,于37℃、5%CO2的条件下培养。3.人脐静脉内皮细胞糖萼层（ESL）形态学观察及损伤模型建立:用不同浓度的脂多糖（0?g/mL、0.05?g/mL、0.1?g/mL）,分不同的时长（5min、10min、20min、30min）刺激人内皮细胞,使细胞ESL受到损伤。电镜下观察不同浓度LPS在不同时间对内皮细胞ESL形态的影响,为电镜观察ESL的形态变化筛选出适宜LPS浓度和损伤时间。4.韭根挥发油对损伤ESL的作用及机制研究:将人脐静脉内皮细胞随机分为8组,包括正常组,模型组,0.025%韭根挥发油10μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、100μL/mL等不同浓度给药组。ELISA法检测细胞培养上清液中硫酸乙酰肝素（HS）、透明质酸（HA）的含量;Western Blot方法检测人脐静脉内皮细胞eNOS、caveolin-1的表达。结果:1.400g韭根粉末可提取挥发油约0.5mL。2.胶原酶Ⅰ消化得到人脐静脉内皮细胞,细胞贴壁后呈长梭形聚集生长,使用人第VIII因子相关抗原荧光染色法对细胞进行鉴定,证明从脐静脉内消化下来的细胞为人脐静脉内皮细胞。3.人脐静脉内皮细胞ESL受损程度随着LPS浓度的升高和时间的延长而加重。电镜观察内皮细胞ESL形态,0.05?g/mL LPS刺激人脐静脉内皮细胞5min后,ESL已经开始脱落,10min时,与空白对照组相比较,ESL出现了较严重的损伤,但尚有部分残存,并未完全脱落,20min和30min时多数细胞ESL结构已不可见。而0.1?g/mL的LPS干预细胞时,内皮ESL多已消失。所以试验选择LPS对ESL损伤的合适浓度和时间分别为0.05?g/mL、10min。4.韭根挥发油干预损伤内皮细胞后,电镜下可以观察到ESL受损程度减轻;各组细胞上清液中HS、HA含量降低;韭根挥发油干预内皮细胞eNOS和caveolin-1的表达增高。结论:韭根挥发油可以促进HUVECs的生长,降低LPS对内皮细胞ESL的损伤程度,并促进其修复,其作用机制可能通过增加caveolin-1的表达,激活内皮细胞eNOS,维持HUVECs功能,促进损伤ESL修复。
王婷,叶小汉,吴锦波,冯文伟[4]（2020）在《心脉康方对兔动脉粥样硬化及NF-κB p65表达的影响》文中提出【目的】观察心脉康方对兔动脉粥样硬化及核转录因子κB（NF-κB）p65表达的影响。【方法】将37只新西兰白兔随机分成4组:假手术组（10只）、模型组（8只）、心脉康组（9只）、辛伐他汀组（10只）。模型组、心脉康组、辛伐他汀组兔给予高脂饲料喂养2周后行腹主动脉内膜球囊损伤术复制动脉粥样硬化模型,假手术组普通饲料喂养,只分离结扎股动脉,不拉伤腹主动脉内皮。术后,辛伐他汀组给予辛伐他汀2.60 mg·kg-1·d-1灌胃,心脉康组给予心脉康片0.21 g·kg-1·d-1灌胃,假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃。持续12周。给药结束后,采用苏木素-伊红（HE）染色法光镜下观察兔主动脉组织病理变化,扫描电镜观察兔主动脉血管内壁病理变化,采用蛋白免疫分析（Western Blot）法检测兔主动脉组织中NF-κB p65的表达水平。【结果】HE染色与扫描电镜结果显示:模型组血管内粥样硬化斑块明显向内膜凸起,可见损伤的内皮细胞,在硬化斑块上可见粘附的巨噬细胞;心脉康组、辛伐他汀组上述损害明显减轻。Western Blot结果显示:模型组主动脉组织NF-κB p65表达水平较假手术组明显升高（P<0.01）;心脉康组主动脉组织NF-κB p65表达水平较模型组明显降低（P<0.01）;而辛伐他汀组主动脉组织NF-κB p65表达水平与模型组比较,差异无统计学意义（P> 0.05）。【结论】心脉康方可改善兔动脉粥样硬化,保护血管内皮功能,其机制可能与下调主动脉组织NF-κB p65表达有关。
郭胜存[5]（2016）在《超声分子成像靶向活化血小板上的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体评价动脉粥样硬化易损斑块》文中进行了进一步梳理研究背景与目的动脉粥样硬化易损斑块及其并发症是危害人类健康的“头号杀手”。易损斑块（Vulnerable Plaque）不可预测的突然破损或侵蚀、血小板激活和血栓形成造成血管迅速闭塞是引发心肌梗死、脑血栓等突发致死性和非致死性心脑血管事件最重要的发病机制,其中动脉粥样硬化易损斑块的破裂又被视为最重要的始动环节。然而,动脉粥样硬化斑块的发生发展是个隐匿的慢性过程,大部分心脑血管事件发作前都没有先兆表现。因此,早期识别动脉粥样硬化易损斑块,进而指导早期的干预治疗,对于避免或延缓事件的发生有着十分重要的临床意义。但是目前临床尚无早期识别和检测动脉粥样硬化易损斑块的有效手段。随着靶向分子成像技术的新兴和发展,现有的许多无创影像手段,如：超声、核素（PET）、MRI和CT等均在对易损斑块评价进行积极的分子水平探索。其中,靶向超声分子成像（Ultrasound Molecular Imaging, UMI）是将靶向病变组织特定分子的特异性配体连接于超声微泡表面,构建成靶向超声微泡,以其作为分子探针,采用增强对比超声（Contrast Enhanced Ultrasound, CEU）的方法对粘附在血管内皮细胞上的特异分子进行分子水平超声显影,从而实现疾病分子水平上特异性诊断的目的。与其他的传统影像技术相比,超声分子成像技术具有实时、高空间及时间分辨率、无放射污染、仪器便携和价廉等优点。它是在体评价血液循环内固定的分子靶点时空变化和特征的理想方法,特别适合对斑块炎症反应和动脉血栓形成时分布在血管内皮和活化血小板上的分子靶点进行在体定位、定量和可视化。目前,国际上已有研究者成功实现了UMI靶向动脉粥样硬化斑块内皮细胞表面上的分子靶点,主要包括：靶向血小板粘附的活化的血管假性血友病因子（von Willebrand Factor, vWF）,靶向炎症的血管细胞粘附因子-1（Vascular Cell Adhesion Molecular-1, VCAM-1）和P-选择素,靶向新生血管的血管内皮生长因子受体-2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2,VEGFR-2）和白介素-8；而迄今为止,UMI靶向活化血小板和血栓来检测动脉粥样硬化表型的研究尚未见报道。然而,易损斑块内皮上的活化血小板和血栓在动脉粥样硬化斑块的发生发展方面扮演着非常重要的角色,并且与动脉斑块的易损性（Vulnerability）密切相关；再者,动脉粥样硬化血栓是无症状的、隐匿的,其可以作为高风险易损斑块的预警信号,并可以通过UMI靶向活化血小板检测到。因此,UMI靶向“斑块内皮上的活化血小板”,无疑可为临床检测动脉粥样硬化易损斑块并对其进行危险分层提供非常有价值的手段,进而指导干预治疗,避免或延缓急性心脑血管事件的发生。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体（Glycoprotein Ⅱb/Ⅲa, GP Ⅱb/Ⅲa）,亦称αⅡbβ3整合素,是高度表达于活化的血小板表面的主要受体,亦是血小板活化的一种生物标志,其可与纤维蛋白原等多种粘附蛋白的RGD序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸,Arg-Gly-Asp）的结合位点结合,是动脉粥样硬化血栓形成过程中血小板与其它血小板以及毗邻细胞之间相互作用的必需条件,更是各种因素致血小板聚集和血栓形成的最终共同通路。有研究报道,急性冠脉综合征或不稳定型心绞痛患者血液循环中血小板聚集和循环血小板表面的GP Ⅱb/Ⅲa受体的表达情况明显高于稳定型心绞痛患者或健康志愿者。因此,GP Ⅱb/Ⅲa受体是显影动脉粥样硬化斑块中聚集血小板的一个潜在的标志,可作为血栓检测及临床抗凝治疗中一种重要的靶向分子。然而,晚期动脉粥样硬化病变中血小板上GP Ⅱb/Ⅲa受体表达与斑块严重程度之间的相关性方面的研究数据是很有限的,而且活化血小板表面的GP Ⅱb/Ⅲa受体是否能够作为高风险斑块的生物标志是不清楚的,这亦是本研究首要解决的问题。含RGD序列的寡肽对GP Ⅱb/Ⅲa受体具有较高的粘附性,已有研究将RGD序列线性寡肽连接在超声微泡表面,通过靶向微泡与血栓中活化的血小板GP Ⅱb/Ⅲa受体特异性结合,成功实现了深静脉、心房血栓的靶向超声分子成像。然而由于动脉内存在高剪切应力和“轴流”特性,实现动脉血栓的靶向分子显像则需要靶向结合能力更强的微泡。有研究表明,人工合成的RGD环寡肽序列能够模拟人体内源性RGD结合位点,使其在动脉粥样硬化动脉较大血流的情况下,比含RGD序列的线性寡肽结合GPⅡb/Ⅲa受体的能力高30倍。目前,我们课题组已成功构建出携带环RGD寡肽的靶向超声微泡,并通过体内和体外实验验证了其对GPⅡb/Ⅲa受体的粘附能力,进而实现了大动脉血栓的分子成像。但是上述实验研究中所采用的大动脉急性血栓模型构建方法均未能接近体内动脉粥样硬化斑块血栓形成的病理机制,并不能反应动脉粥样硬化斑块的发生、发展及演变过程。因此,本研究应用载脂蛋白E敲除（ApoE-/-）的小鼠建立了一种真正的动脉粥样硬化斑块的动物模型,为研究UMI识别易损斑块的研究提供了模型基础。因此,本研究应用C57BL/6野生型和ApoE-/-小鼠建立不同梯度的小鼠动脉粥样硬化斑块模型。分别应用组织病理学、扫描和透射电镜方法、免疫荧光等方法,探讨动脉斑块内皮上活化血小板表面的整合素GP Ⅱb/Ⅲa受体是否能够作为动脉粥样硬化斑块不稳定性的一个生物标志及其可能的机制；并通过CEU结合靶向超声微泡（MB-cRGD）,对斑块内皮上活化血小板表面的GP Ⅱb/Ⅲa受体进行定量,进而识别易损斑块,以期为临床提供一种无创、有效识别和评价易损斑块的新方法。方法1、超声微泡的制备及理化性质鉴定将各种相关脂质材料与人工合成的磷脂环五肽或分子量相当、结构相似的同型非特异性多肽按一定比例加入20 ml蒸馏水中,在75℃水浴条件下使其完全溶解后,通入全氟丙烷气体（C3F8）,使用高速剪切仪将其剪切至形成乳白色液体制备靶向超声脂质微泡（MB-cRGD）和同型对照非靶向微泡（MB-CON）,静置、洗涤、纯化3次。制备及纯化后的微泡均置于冰箱中4℃C保存备用。显微镜观察微泡形态,并采用库尔特计数仪检测微泡的粒径大小及浓度。2、小鼠不同梯度动脉粥样硬化斑块模型的制备及分组应用C57BL/6野生型和ApoE-/-小鼠建立不同梯度的小鼠动脉粥样硬化斑块模型和对照模型,6周龄的C57BL/6和ApoE-/-雄性小鼠,分别给予普通饮食或者高胆固醇饮食（hypercholesterolemic diet, HCD,21%脂肪和0.25%胆固醇）,持续喂养30周时,各组随机选取3只小鼠,分离其腹主动脉大体标本,进行油红O染色大体染色,观察各组小鼠动脉斑块的情况。动物分组为：C57BL/6小鼠普通饮食组（C57BL/6+chow）、C57BL/6小鼠高胆固醇饲养组（C57BL/6+HCD）、ApoE-/-小鼠普通饮食组（ApoE-/-+chow）、ApoE-/-小鼠高胆固醇饲养组（ApoE-/-+HCD）。3、体内荧光验证血小板粘附于主动脉斑块内皮表面通过心脏采血法分别取C57BL/6野生型小鼠的全血,0.129M枸橼酸钠抗凝后经离心法提取浓缩血小板并制备血小板混悬液。制备的血小板混悬液与钙黄绿素-AM（Calcein-AM,300ng/ml）暗处孵育15min后,经尾静脉留置针随机分别注入以上4组（n=6）不同小鼠体内；另外,分别注入相同体积的不含血小板的钙黄绿素-AM和不含钙黄绿素-AM的PBS液体至ApoE-/-+HCD小鼠体内,作为阴性对照（n=6）和荧光对照组（n=6）。注入15min后,处死各组小鼠,收集腹主动脉,快速冰冻切片,置于普通光学及荧光显微镜下观察孵育后的血小板在各组小鼠腹主动脉斑块内皮表面的粘附情况。4、电镜检测活化血小板和动脉斑块情况靶向超声分子成像图像采集结束之后,从四种梯度斑块模型组的小鼠中各自随机取6只,取小鼠的腹主动脉样本置于2.5%戊二醛溶液固定4h后,经过标准流程处理后,行电镜观察。采用扫描电镜（工作电压20千伏）观察不同组小鼠腹主动脉管腔内表面上活化血小板的粘附情况,并人工计算10个视野（每个视野25.5x25.2 mm）中血小板的数量。此外,利用透射电镜（工作电压80千伏）检查ApoE-/-+HCD小鼠组腹主动脉组织内活化血小板的情况。5、HE、Masson和免疫组化染色检查靶向超声分子成像图像采集结束后,四种梯度斑块模型组内各自剩余的小鼠（n=6）,取小鼠腹主动脉组织经固定、脱水、石蜡包埋后做成3μm厚的石蜡切片,分别行HE、Masson染色和免疫组化染色。6、斑块组织病理学相关指数的定量每个动物的腹主动脉的HE、Masson以及免疫组化做完之后,通过面积法分别测量每个切片中的脂质沉积和胶原纤维,用占据整个面积的百分比来表示。免疫组化的阳性面积采用IPP软件分析,表示为占整个斑块或血管面积的百分比。斑块中平滑肌细胞和巨噬细胞的含量表示为占整个斑块面积的阳性百分率。斑块中GP Ⅱb/Ⅲa受体的测量方法有两种：GP Ⅱb/Ⅲa受体在在整个斑块中的表达百分率和GP Ⅱb/Ⅲa覆盖整个内皮的百分比。所有的数据测量和UMI、扫描电镜、组织学以及免疫组化的分析都是让两个对本实验设计不清楚的人进行的。动脉斑块的核/帽比值：即指通过HE、Masson可以计算出动脉斑块中脂质坏死中心的大小（necrotic core, NC）以及纤维帽（fiber cap, FC）大小,然后计算其NC与FC比值,可得到NC/FC比值；动脉斑块的易损指数：通过计算（巨噬细胞的含量+脂质沉积含量）/（平滑肌细胞含量+胶原纤维含量）的比值,即可得到斑块的易损指数。7、构建内皮细胞炎症模型和人血小板的分离培养以及免疫荧光检测人的脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC）株经传代培养种于共聚焦培养皿中,利用不同浓度梯度的肿瘤坏死因子-α （Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）刺激HUVEC, 1h后,通过细胞免疫荧光方法,检测HUVEC 上 vWF的表达情况；选取健康成年的志愿者（采血10天前未服用过任何药物）,通过肘部正中静脉采血法,各自分别取20m1全血,0.129M枸橼酸钠（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）抗凝后,经200×g离心10min获取富血小板血浆,经高速离心（1000×g） 15min纯化、清洗2次,低速离心（120×g） 3min去除红细胞碎片,纯化的血小板用完全培养基重悬后种于共聚焦培养皿培养备用。利用不同浓度梯度的vWF刺激血小板,1h后,通过血小板免疫荧光方法,检测血小板上GP Ⅱb/Ⅲa的表达情况。8、小鼠腹主动脉靶向超声分子成像及图像分析动物模型制备后,各组随机取12只小鼠将其各自均分为实验组（n=24）和封闭组（n=24）。用支架固定超声探头（15L7）于小鼠腹主动脉部位上方,调整探头位置获得良好的腹主动脉长轴切面后保持位置不变,且仪器的各项参数在整个实验过程中不变。CEU检查采用二次谐波成像（second hannonic imaging）技术进行,探头发射和接收频率分别为7.0和15MHz,机械指数（Mechanical Index,MI）为0.18,超声发射间隔时间设定为10s。0.1ml的MB-cRGD和MB-CON数量约1×106个,经尾静脉弹丸式随机（间隔30min）先后注入到实验组或封闭组的每亚组小鼠体内。其中封闭组小鼠在微泡注入前经尾静脉给予18ug/g依替巴肽以饱和整合素GP Ⅱb/Ⅲa受体。注入微泡后行CEU连续观察10min并取图后给予高MI （MI=1.9）的连续脉冲破坏3s后取本底图像,所有图像均测量声强度（video intensity, Ⅵ）均采用MCE2.7彩色编码软件进行彩色编码处理,并对超声分子成像的VI值进行定量分析。9、统计学分析方法所有实验数据都以均数±标准差表示,使用SPSS13.0统计分析软件行统计学分析,差异性检验水准均设为p<0.05（双侧）。两组间的比较采用独立样本t检验；只有一个分组因素的多组比较,若方差齐,采用单向方差分析,组间多重比较采用Bonferroni法；若方差不齐,则选用近似F检验Welch法进行方差分析,组间比较则采用Dunnett’s T3检验。有3个分组因素的多组间比较采用析因设计的方差分析,非正态分布的两个变量之间的相关分析采用Spearman相关分析。结果1、超声微泡的特性采用高速剪切法制备的MB-cRGD、MB-CON在显微镜下观察均为透亮微气泡,大小形态一致。采用库尔特计数仪测得MB-cRGD和MB-CON的平均粒径分别约为2.52±0.28μm和2.54±0.30μm,浓度分别约为（1.13±0.19）×109/ml和（1.12±0.22）×109/ml。两种微泡的粒径和浓度并无统计学差异（p>0.05）。2、动脉粥样硬化斑块模型的制备情况四组小鼠的油红O染色结果显示,ApoE-/-+HCD组小鼠的腹主动脉可见较明显的动脉粥样硬化斑块形成,其后是ApoE-/-+chow组,C57BL/6+HCD组小鼠的腹主动脉仅有少量被染成红色的脂纹形成,C57BL/6+chow组小鼠的腹主动脉血管上未见粥样硬化斑块形成。3、体内荧光验证血小板粘附于主动脉病变内皮表面新鲜提取的血小板与calcein.AM暗处孵育后,荧光显微镜下观察血小板呈现绿色荧光。荧光标记的血小板经尾静脉注射到各组小鼠体内,冰冻切片于荧光显微镜下观察荧光血小板粘附于动脉粥样硬化病变处；四组小鼠中,ApoE-/-+HCD组的病变处粘附的荧光血小板的数量最多,其后依次是ApoE-/-+chow组,C57BL/6+HCD组,C57BL/6+chow组小鼠（p<0.05）。同时,阴性对照组（单纯注入不含血小板的calcein-AM溶液）小鼠或荧光对照组（仅注入PBS溶液）小鼠的动脉粥样硬化病变内皮上均未见到荧光血小板。4、电镜观察活化血小板粘附和聚集于动脉斑块上扫描电镜观察管腔内皮表面上聚集的血小板情况,ApoE-/-+HCD组小鼠动脉粥样硬化病变处募集了较多的血小板,而且这些血小板之间相互粘附聚集在一起。类似于体内荧光验证的结果,四组小鼠中,ApoE-/-+HCD组小鼠的管腔内皮处粘附的血小板的数量最多,其后依次是ApoE-/-+chow组,C57BL/6+HCD组,C57BL/6+chow组小鼠（p<0.05）。因为血小板的大小变化比较大（1-8μm）,因此用扫描电镜根据它的大小来确定血小板是不足充分的的。为了证实扫描电镜下观察到的血小板的结构,透射电镜观察发现血小板能够被招募到动脉斑块上或粘附于内皮细胞上；同时能够清晰的观察到血小板的典型结构—微粒。再者,在ApoE-/-+HCD组小鼠的动脉粥样硬化病变处,扫描电镜观察到富含血小板,并包含大量红细胞和纤维素的血栓。5.HE.Masson和免疫组化染色检查5.1、GP Ⅱb/Ⅲa免疫组化染色结果：四组小鼠中,ApoE-/-+HCD组小鼠腹主动脉内皮表面上GP Ⅱb/Ⅲa的表达最多,其后依次是ApoE-/-+chow组,C57BL/6+HCD组,C57BL/6+chow组小鼠（p<0.05）；各组小鼠腹主动脉斑块内GP Ⅱb/Ⅲa的表达情况类似于内皮表面上GP Ⅱb/Ⅲa的表达。有趣的是,内皮表面上GP Ⅱb/Ⅲa的表达与斑块内GP Ⅱb/Ⅲa的表达具有显着的相关性（r=0.897,p<0.001）。其中,在ApoE-/-+HCD组小鼠的动脉粥样硬化病变处有富含GPⅡb/Ⅲa的血栓形成。5.2.HE、Masson染色和CD68、α-SMA的免疫组化结果：四组小鼠中,ApoE-/- +HCD组小鼠腹主动脉斑块中,表达阳性的巨噬细胞占整个斑块面积的百分比、斑块的核/帽比值（NC/FC）以及斑块的易损指数最高,其后依次是ApoE-/-+chow组,C57BL/6+HCD组,C57BL/6+chow组小鼠（p<0.05）；而各组小鼠平滑肌细胞占整个斑块面积的百分比的变化趋势正好相反。值得注意的是,斑块内皮表面上GP Ⅱb/Ⅲa的表达与斑块的易损指数和NC/FC均具有显着的相关性（r=0.922和r=0.903,各p<0.001）；整个斑块中GP Ⅱb/Ⅲa的表达与斑块的易损指数和NC/FC也均具有显着的相关性（r=0.858和r=0.857,各p<0.001）。6、细胞/血小板免疫荧光检测结果为了验证验证刺激对内皮的作用,采用不同浓度的TNF-α刺激HUVEC,免疫荧光检测HUVEC上vWF的表达,结果显示：TNF-α诱导HUVEC上vWF的表达是浓度依赖性的；而vWF诱导血小板上GPⅡb/Ⅲa的表达亦是浓度依赖性的。HUVEC或血小板只孵育二抗后不显示荧光,证明免疫荧光是特异性的。这进一步说明炎症刺激可诱导内皮细胞上vWF的活化进而启动血小板的活化或聚集,导致GP Ⅱb/Ⅲa在活化和粘附的血小板上的高度表达。因此,GP Ⅱb/Ⅲa可以作为易损斑块的生物标志的主要是由于炎症和vWF的活化,是和前期研究相一致的。7、动脉斑块的靶向成像分别随机经尾静脉弹丸式注射MB-cRGD和MB-CON 10 min后,在实验组中,MB-cRGD的CEU图像显示ApoE-/- +HCD组可见较明显腹主动脉超声显影,其后依次是ApoE-/- +chow组,C57BL/6+HCD组,C57BL/6+chow组小鼠；MB-CON在各动物组均无明显腹主动脉的超声显影增强。在封闭组中,MB-cRGD和MB-CON的CEU图像在各动物分组均未见明显腹主动脉的超声显影增强。对VI值进行定量分析：实验组和封闭组中,C57BL/6+chow小鼠组应用MB-cRGD和MB-CON的VI值各组之间均无显着性差异（p>0.05）；但在实验组中,其它3组动物应用MB-cRGD的VI值均显着高于应用MB-CON的动物分组（p<0.05）；MB-cRGD在ApoE-/-+HCD组小鼠ⅥI值是20.30±3.10,显着高于ApoE-/-+chow组（13.47±2.50,p<0.05）和C57BL/6+HCD组（6.99±1.68,p<0.05）。封闭组中,MB-cRGD在各动物分组的ⅥI值与MB-CON应用组比较均无显着性差异（p>0.05）,均显着低于实验组的ApoE-/-+HCD组（p<0.05）和ApoE-/-+chow组（p<0.05）,这进一步证明了MB-cRGD和GP Ⅱb/Ⅲa受体之间的结合是特异性的,而且可以被依替巴肽显着抑制。8、超声分子成像的Ⅵ值与组织病理学指标之间的相关分析Spearman相关分析结果发现,实验组中MB-cRGD的Ⅵ值与斑块内皮表面上和整个斑块中的GP Ⅱb/Ⅲa的表达均具有显着的相关性（r=0.877和1=0.872,各p<0.001）：而且,MB-cRGD的ⅥI值与斑块的易损指数和NC/FC亦均具有显着的相关性（1=0.883和1=0.875,各p<0.001）。结论1、动脉斑块内皮活化血小板表面的GP Ⅱb/Ⅲa受体与斑块的易损性显着相关,其可作为易损斑块的生物标志：2.GP Ⅱb/Ⅲa可通过“炎症刺激—内皮细胞vWF的活化—血小板活化或聚集”这一机制,在活化血小板上的高度表达,进而导致动脉粥样硬化斑块的不稳定。3、携MB-cRGD的超声分子成像可以定量评价动脉斑块内皮上血小板表面的GP Ⅱb/Ⅲa受体,其声强度与GP Ⅱb/Ⅲa表达水平和斑块易损性均显着相关,进而识别易损斑块,可以预防急性心血管事件的发生。
刘仁凤[6]（2020）在《活性氧响应性多功能纳米粒口服抑制动脉粥样硬化的体内外研究》文中研究说明动脉粥样硬化（AS）是造成冠心病、中风、外周血管疾病的主要原因。目前临床用于AS防治药物的疗效十分有限,且存在诸多不良反应。氧化应激是动脉粥样硬化的主要致病因素之一,然而不管是传统的食疗法还是以普罗布考为代表的小分子抗氧剂均未给动脉粥样硬化的防治带来积极作用。因此,探索新型抗氧化策略成为基于氧化应激防治AS的关键。课题组前期以（β-Cyclodextrin,β-CD）为骨架分子,合成了具有活性氧（ROS）响应性和清除性材料TPCD,其纳米粒TPCD NP在足趾肿胀、急性腹膜炎、急性肺损伤等急性炎症模型中呈现良好的疗效,且静脉注射TPCD NP能在小鼠模型中有效防治中性粒哮喘和AS等慢性炎性疾病。因此,本课题一方面拟研究口服TPCD NP是否具有抗AS作用以及潜在治疗机制;另一方面拟以其为ROS响应性功能纳米载体,负载抗炎药物Darapladib（DA）,制备一种ROS响应性多功能纳米药物TPCD-DA NP,评价其口服防治AS的效果和安全性。方法1.TPCD的合成及表征将Tempol和4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯（PBAP）共价链接在β-CD上,合成ROS响应性和清除性材料TPCD。通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、核磁共振氢谱（1H NMR）、基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF）对TPCD进行结构和分子量的确证。2.TPCD NP和TPCD-DA NP的制备与表征将磷脂酰胺聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）和卵磷脂分散在水相中,溶于甲醇中的TPCD作为油相,室温剧烈搅拌下将油相逐滴滴加在水相中,得到TPCD NP;另外将Darapladib和TPCD共同溶于甲醇作为油相,得到TPCD-DA NP。通过马尔文激光粒度仪（DLS）测定纳米粒的大小和Zeta电位,透射电子显微镜（TEM）观察纳米粒的形貌。3.TPCD NP和TPCD-DA NP活性氧响应性水解研究将TPCD NP和TPCD-DA NP分别与1 mM H2O2和PBS共孵育,在预设的时间点观察两种纳米粒的水解情况。另外,利用高效液相色谱仪测定TPCD-DA NP的载药量、包封率以及在H2O2中的累积释放曲线。4.TPCD NP抑制细胞内活性氧的产生和H2O2诱导的细胞凋亡TPCD NP与RAW264.7细胞预先孵育后,PMA处理4 h。选用DCFH-DA活性氧探针考察TPCD NP对细胞内活性氧产生的影响;另用200μM H2O2处理8 h,评价TPCD NP对高浓度H2O2所致的细胞凋亡的抑制作用。5.TPCD NP和TPCD-DA NP延缓活性氧诱导的细胞衰老和抑制细胞炎症因子的分泌在RAW264.7和Caco-2细胞上结合β-半乳糖苷酶染色染色试剂盒评价纳米粒对H2O2诱导的细胞衰老的影响;另外,通过ELISA检测两种纳米粒对RAW264.7细胞分泌MCP-1、TNF-α以及IL-1β的影响。6.TPCD NP体内抗AS效果评价6-8周龄的ApoE-/-小鼠随机分成2组,分别为模型组（高脂饮食）、空白纳米粒组（25 mg/kg TPCD NP）,高脂喂养一个月后开始口服给药,每4天一次,连续给药11周。给药结束后收集样本,主动脉油红染色评价TPCD NP对AS斑块面积的影响。7.TPCD NP治疗AS的机制研究6-8周龄的Apo E-/-小鼠随机分成2大组,一大组分别为普通饲料饮食组、高脂饲料饮食组;另一大组分别为高脂饮食组、高脂饮食同时口服TPCD NP组（25 mg/kg TPCD NP）,高脂饮食一个月后开始口服给药,每4天给药一次,连续给药11周。给药结束后收集各组小鼠粪便样本,运用16S r RNA基因测序技术检测微生物种群和含量。8.TPCD-DA NP体内抗AS效果评价6-8周龄的ApoE-/-小鼠随机分成4组,分别为模型组（生理盐水）、游离药物组（20mg/kg Darapladib）、空白纳米粒组（62.5 mg/kg TPCD NP）、载药纳米粒组（10 mg/kg TPCD-DA NP,对应TPCD NP剂量为62.5 mg/kg）。高脂饲料喂养2个月后开始口服给药,每4天一次,连续给药7周。给药结束后收集样本,主动脉油红染色评价不同给药组AS斑块面积的大小;主动脉根部免疫组化染色考察斑块的稳定性、巨噬细胞的含量;检测血清中LP-PLA2的含量以及肠中段、肠下段、结肠匀浆液中炎症因子的含量。9.TPCD NP和TPCD-DA NP体内初步安全性评价动物分组给药方案同体内抗AS效果评价实验。给药结束后收集血样,检测两种纳米粒对血常规、肝功、肾功和血脂有无影响,主要脏器HE染色观察TPCD NP和TPCD-DA NP对其有无影响。结果1.Tpl和PBAP分子通过共价键结合在β-CD骨架上,成功合成了具有ROS响应性材料TPCD。另外,通过纳米沉淀/自组装法成功制备TPCD NP和TPCD-DA NP,电镜观察其为球形形态,且纳米粒在1 mM H2O2中能够响应性水解,在PBS中的能够稳定存在。2.高效液相色谱（HPLC）检测TPCD-DA NP的载药量为16%,包封率为85%;在1 mM H2O2中5 h时药物累积释放率为82%,12 h时药物累积释放率为96%,几乎释放完全。3.体外细胞实验结果表明,TPCD NP能显着抑制RAW264.7胞内活性氧的产生,且具有剂量依赖性;TPCD NP亦能显着抑制高浓度H2O2诱导的细胞凋亡。4.TPCD NP和TPCD-DA NP能抑制过氧化氢导致的RAW264.7细胞和Caco-2细胞的衰老;ELISA检测细胞培养上清中MCP-1、TNF-α和IL-1β的含量,结果表明TPCD NP和TPCD-DA NP能显着降低细胞中炎症因子的分泌,且TPCD-DA NP干预组具有最佳疗效。5.体内疗效评价实验结果表明,TPCD NP和TPCD-DA NP干预都能显着降低ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块面积,但是TPCD-DA NP效果更优;且TPCD-DA NP治疗组小鼠主动脉根部巨噬细胞的含量更低、斑块稳定性更佳。6.ApoE-/-小鼠肠道菌群检测结果表明,高脂饮食会改变肠道菌群的组成,降低肠道菌群的丰度;TPCD NP干预后能逆转因高脂饮食导致的肠道菌群丰度的降低。7.体内安全性评价实验结果表明,口服TPCD NP和TPCD-DA NP后,小鼠的体重、血常规、肝功、肾功、血脂水平与模型组小鼠相比并无显着差异,主要脏器HE染色结果表明口服纳米粒后亦不会对脏器产生病理性改变。结论1.本课题基于ROS响应性载体材料TPCD,选择负载抗炎药物Darapladib,通过纳米沉淀/自组装法成功构建了两种纳米粒TPCD NP和TPCD-DA NP。2.体外细胞实验证明上述纳米粒具有抗炎和抗凋亡的作用,且能有效抑制胞内活性氧的水平和氧化应激所致的细胞衰老。3.在体内抗AS效果评价实验中,口服TPCD NP和TPCD-DA NP均能显着抑制主动脉斑块面积,且TPCD-DA NP干预组治疗效果更佳,具有协同作用。此外,TPCD NP能够改善因高脂饮食所致的肠道菌群丰度降低,达到降低主动脉斑块面积的效果,实现对AS发展进程的调控。4.体内初步安全性评价结果表明,TPCD NP和TPCD-DA NP可作为一类相对安全的口服治疗AS的纳米药物。综上所述,本课题一方面研究证明了口服TPCD NP对AS具有良好的防治作用,且可能是通过改善肠道菌群丰度来调控AS的进程。另一方面通过结合抗炎药物Darapladib和ROS响应性材料TPCD,制备了一种安全且具有协同作用的口服纳米药物TPCD-DA NP,有望应用于AS等相关疾病治疗。
梁笑[7]（2020）在《不同粒径三七粉体外溶出及体内药动学评价》文中研究说明目的:研究粒径对三七粉有效物质溶出和生物利用度的影响。方法:通过扫描电镜、偏光显微镜、DSC、流变仪对三七粉的表面形态,热特性和流变特性进行表征;分别以水和人工胃液为释放介质考察不同粒径三七粉的体外释放性能及不同温度水（30、40、50、100℃）温浸处理后三七粉的体外释放性能;考察粒径及水浸润温度对三七粉大鼠体内药代动力学行为的影响。采用最大给药剂量法考察不同粒径三七粉的急性毒性。结果:1.制备出粒径在59.89～213.93μm范围的6种粒度的三七粉,粉体外观呈灰黄色粉末,随着粒径减小,颜色由深变浅。扫描电镜结果显示,当粒径减小至90μm时,开始出现团聚现象;偏光结果表明随着粒径的减小,淀粉粒更易暴露出来;DSC结果表明三七粉起始糊化温度在40～50℃,与粒径无关。流变学研究表明,三七粉以不同温度水浸润后黏弹性发生变化,100℃时各粉体黏度最大。2.溶出实验结果显示,在213.93～59.89μm的粒径范围内,粉体1（213.93μm）中三七总皂苷溶出量最大。不同温度水浸润处理三七粉后的溶出实验结果显示,40℃水浸润后的三七总皂苷溶出量最大。3.大鼠血液药动学研究表明,粉体4（90.38±8.28μm）3种皂苷的AUC0-T明显高于其它粉体组。不同温度水温浸5 min处理组大鼠药动学实验结果显示,40℃温浸组三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的生物利用度要高于其它组。50℃温浸组人参皂苷Rb1的生物利用度最高。整合药动学结果表明,粉体4和40℃温浸组生物利用度最高。4.三七粉小鼠最大耐受剂量为42.72 g/kg,不同粒径三七粉灌胃对小鼠均无急性毒性作用。结论:三七粉在213.93～59.89μm粒径范围内,并非粒径越小其所含皂苷类成分的溶出量、溶出速率和生物利用度越高,粒径213.93μm三七粉溶出量和溶出速率最大,90.38μm三七粉大鼠灌胃后生物利用度最高。
李彦朝[8]（2019）在《炎症消退和神经重建在小口径组织工程血管长期通畅中的作用研究》文中提出心血管疾病是威胁人类健康的第一大疾病,全球每年有730万人死于缺血性心脏病,列各病之首。冠状动脉旁路移植术、血液透析或外周血管闭塞治疗等使小口径TEBV（TEBVs<6mm）的临床需求日益增大。但目前还未见小口径TEBV应用于临床产品的报道,究其原因主要是因为小口径TEBV移植后容易发生5方面问题:急性血栓形成、吻合口内膜增生、动脉瘤形成、感染、动脉粥样硬化进展和钙化;因此构建保持长期通畅小口径TEBV仍是领域内难题和全球性挑战。小口径TEBV在植入体内后引发的急慢性炎症反应是引起小口径TEBV血栓和内膜增生的重要诱因,目前公认的解决办法是促进TEBV的早期内皮化。内皮祖细胞（EPCs）作为促进TEBV实现在体内皮化的靶细胞,诱导其归巢并分化为内皮细胞是小口径TEBV在体构建的策略。研究表明急性炎症反应可以促进组织再生发生和骨髓EPC的动员,而炎症的及时消退对归巢干细胞的存活又十分必要,因此及时促进炎症消退对TEBV在体内皮化和保持长期通畅可能有重要作用。有研究发现神经轴突导向因子1（netrin-1）在天然血管的内皮细胞中有表达,其可作用于UNC5B和DCC受体促进血管生成,并具有抗炎作用。本研究采用层层自组装的方式构建壳聚糖纳米颗粒包裹netrin-1修饰的小口径TEBV,通过大量体内和体外实验研究其在调控巨噬细胞（MΦ）表型转化和小口径TEBV炎症消退及内皮化中的作用和机制。本研究构建的netrin-1修饰小口径TEBV植入后及时促炎症消退并顺利完成内皮化,最终在正常大鼠体内可保持14个月的通畅。但是在植入糖尿病大鼠后,由于机体脂质代谢紊乱,动脉粥样硬化易发,TEBV发生钙化的比例却极高,直接影响移植血管的通畅和功能。小口径TEBV移植是治疗糖尿病中小血管病变的重要手段,因此,如何在高糖下防止TEBV钙化、促进远期通畅,是TEBV移植治疗糖尿病血管病变需解决的关键问题。自体环境中人体除毛细血管外几乎所有血管都受交感缩血管纤维的神经支配,我们前期研究发现TEBV神经长入与平滑肌正常重建呈正相关,但其机制尚不清楚,所以深入研究神经重建对于小口径TEBV的作用具有重要意义。因此,围绕上述科学问题,我们从四个方面深入研究炎症消退和神经重建在构建抗血栓和抗高糖钙化的可保持长期通畅的TEBV中的重要作用:一、netrin-1调控小口径TEBV炎症消退及其机制研究本实验通过层层自主装方式将netrin-1包裹于壳聚糖纳米颗粒中并交联于TEBV表面,使TEBV具有良好的力学强度和长时间稳定缓释功能分子的能力以解决炎症和血栓形成问题。在体外通过流式、免疫荧光等方式检测了netrin-1对MΦ表型转化的作用,并进一步检测其上清炎症因子来验证转化效率,体内通过免疫荧光方式检测TEBV原位MΦ的浸润以及netrin-1对于炎症消退的作用。结果发现netrin-1可作用于A2b受体激活MΦ内PPARγ信号通路从而将其重编程为强表达CD163的抗炎型。在将netrin-1修饰的TEBV移植入大鼠体内后,发现netrin-1可促进在血管植入后3-7 d时原位浸润的MΦ转化为抗炎型,之后在14 d时已流出内膜表面,从而实现小口径TEBV的早期炎症消退,为归巢入的干细胞提供良好的再生微环境。二、炎症消退对小口径TEBV内皮化意义及其机制研究本部分我们研究在炎症消退中起关键作用的MΦ对EPCs增殖,迁移和血管生成能力的影响。此基础上在大鼠体内研究了小口径TEBV炎症消退和内皮化关系并探究其作用机制。首先,通过大量对比研究实验找到了提取MΦ外泌体时间、经济成本低且获得纯度高的超高速离心结合蔗糖垫方法,之后提取了不同表型MΦ的外泌体与EPCs共培养,观察其对EPCs功能的影响。结果发现促炎型MΦ外泌体可促进EPCs迁移,但长期存在不利于其增殖,而抗炎型MΦ外泌体则可明显提升EPCs的增殖和基质胶成管能力。Netrin-1修饰的小口径TEBV在植入体内后发现,其内皮化进程与炎症消退息息相关,炎症消退组的TEBV在30 d时完成早期内皮化并保持较长时间通畅,证实了及时促进TEBV炎症消退是其实现早期内皮化的必要条件。在临床血管移植中,炎症总是血栓形成和阻塞血管移植物的重要诱因,本研究将为血管移植物在宿主中的长期存活提供新的视角,也可能为其他炎症性疾病提供有效治疗方法。三、糖尿病下神经元外泌体对血管平滑肌细胞钙化作用及其机制研究本部分研究发现神经外泌体对抑制高糖条件下血管平滑肌细胞（SMC）表型转化和氧化应激具有显着作用,进一步对神经外泌体做质谱分析,发现其中含有大量的抑制氧化应激蛋白prdx-1。电镜和BCA蛋白浓度测定发现高糖状态下神经分泌外泌体的数量锐减,免疫荧光结果显示是这是由于负责囊泡运输的Rab35激活受到抑制。本研究通过外源性递送DENND1A,发现神经元内Rab35被激活,外泌体分泌功能增强恢复。之后,进一步研究了神经元外泌体对SMC作用,发现神经元外泌体可抑制高糖时SMC内的活性氧（ROS）含量升高和蛋白损伤,而其机制可能是因为外泌体可抑制高糖时SMC内线粒体膜通道过度开放和膜电位升高。在SMC培养上清加入神经元外泌体后,高糖所诱导的细胞异常增殖、迁移以及钙化均明显受到抑制,抑制剂组结果证实外泌体的这一作用很可能是通过prdx-1抑制SMC氧化应激实现的。本研究发现了神经细胞对VSMC维持正常表型的重要意义及作用机制,为临床预防和治疗糖尿病血管钙化病变提供了新的治疗策略和理论基础。四、构建二级响应修饰系统诱导小口径TEBV神经重建为保护netrin-1与DENND1A两功能分子在体发挥促进神经长入和调控长入神经功能的作用,本研究针对小口径TEBV植入体内后局部特殊微环境设计构建了外层响应ROS的包裹netrin-1水凝胶和内层响应神经递质ATP的包裹DENND1A水凝胶系统。结果发现TEBV在植入体内后水凝胶可保护因子不扩散与降解,待炎症反应发生局部产生ROS与水凝胶内的硫酮基团反应后,外层胶逐渐水解释放出netrin-1,有效促进了神经纤维生长并导向小口径TEBV外膜,实验组血管外膜在14 d时已见有神经开始长入。神经长入TEBV后释放神经递质ATP浓度逐渐增大,与内层胶内ATP适配体ssDNA发生反应,促使内层胶水解,释放DENND1A进入神经元内,从而激活神经元Rab35进一步促进高糖下外泌体分泌水平,显着降低了糖尿病大鼠TEBV的钙含量与钙盐沉积,提高了血流速度,有效抑制糖尿病下血管平滑肌表型转化导致的内膜增生与钙化,使小口径TEBV在糖尿病模型中保持了较长时间的通畅。本研究同时也为临床预防、延缓及治疗糖尿病血管钙化提供了新策略。
安雅男[9]（2020）在《破骨细胞炎症通路激活和胞葬作用抑制介导糖尿病性骨质疏松的发病机制研究》文中研究说明随着生活水平日益提高,糖尿病（DM）已经成为最常见的威胁人类和动物健康的内分泌代谢紊乱性疾病,且人和动物患糖尿病的症状相似,均伴随着严重并发症的发生。其中,糖尿病性骨质疏松（DOP）已然成为目前讨论的热点问题。DOP是一种系统性的代谢性骨病,是以骨量减少、骨质微观结构退化为特征的全身性骨骼疾病。目前发现DOP与高血糖症、钙磷代谢紊乱和胰岛素缺乏等因素有关。然而,其发病机制尚不清楚,严重影响其有效防治。DOP与体内炎症存在一定的联系。活性氧（ROS）是氧正常代谢的天然副产物,而高浓度ROS却会扰乱氧化剂与抗氧化剂的平衡,进而导致炎性疾病的发生。NLRP3炎性小体是一种蛋白质复合物,研究发现它不仅与炎性疾病有关,而且与许多代谢性疾病有关,并发现NLRP3炎性小体在机体骨吸收中起到非常重要的作用。核因子κB（NF-κB）是一种转录因子,可调节多个基因的表达并控制各种细胞功能,包括炎症信号传导等。丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）可以控制多种细胞活动,包括基因表达、有丝分裂等。特别是,MAPKs中ERK、p38和JNK在调节炎症和免疫反应中起重要作用。巨噬细胞是关键的免疫细胞,当组织受到损害时,中性粒细胞会迅速蓄积并经历凋亡而通过巨噬细胞清除凋亡细胞的过程称为胞葬作用。未能清除的凋亡细胞会加剧体内的炎症发生,因此胞葬作用在调节机体炎症反应以及促进炎症消退中起到关键作用。破骨细胞是一种巨大的多核细胞,起源于单核巨噬细胞/单核系造血前体细胞,被认为是治疗骨质疏松的靶细胞之一,在骨吸收过程中发挥重要作用。而伴侣动物的自发糖尿病模型较啮齿动物与人类临床糖尿病更相似,并且犬和人类有更相似的染色体和基因结构,更合适作为人类疾病转化医学模型。因此本研究以破骨细胞为靶细胞,以人工诱导糖尿病性骨质疏松大鼠和自发糖尿病性骨质疏松犬为疾病模型,连同人医临床样本为对象,考察高糖是否能够通过破骨细胞ROS的产生、NLRP3炎性小体介导的炎症激活及胞葬作用被抑制共同增强破骨细胞骨吸收,并且在分子以及病理水平上深入探讨了人和动物糖尿病性骨质疏松症的发病机制。首先,我们在国内外首次发现破骨细胞NLRP3炎性小体介导的炎症激活是糖尿病性骨质疏松的发病因素。利用倒置显微镜对分离的破骨细胞诱导情况进行检测;借助荧光酶标仪对ROS产生情况进行探查;通过Western blot技术对炎症相关通路蛋白MAPKs（p-ERK、p-p38、p-JNK）、NF-κB（核NF-κB、p-IκB、IKK）以及NLRP3炎症小体（ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β、NLRP3）的表达水平进行分析;使用ELISA对IL-18、IL-1β的分泌情况进行考查;应用各通路抑制剂处理探究ROS、MAPKs通路、NF-κB通路和NLRP3炎症小体之间的上下游关系。结果表明,经TRAP染色证实,分离到的SD大鼠骨髓巨噬细胞（BMMs）经M-CSF和RANKL诱导后得到的细胞均为成熟的破骨细胞;高糖能够诱导破骨细胞ROS产生且该ROS产生呈NOX2依赖性;高糖能够诱导破骨细胞MAPKs通路蛋白、NF-κB通路蛋白和NLRP3炎症小体蛋白的表达以及IL-18、IL-1β的分泌,且以上最佳诱导时间为36 h,最佳诱导浓度为35 mM;DPI（ROS抑制剂）能够显着抑制MAPKs通路蛋白、NF-κB通路蛋白和NLRP3炎性小体蛋白表达以及IL-18、IL-1β分泌;且PD98059（ERK抑制剂）、SP600125（JNK抑制剂）和SB203580（p38抑制剂）能够显着抑制NF-κB通路蛋白和NLRP3炎症小体蛋白表达以及IL-18、IL-1β分泌,但不能抑制ROS产生;BAY11-7082（NF-κB抑制剂）能够显着抑制NLRP3炎症小体蛋白表达以及IL-18、IL-1β分泌,但不能抑制ROS的产生以及MAPKs通路蛋白表达;而Ac-YVAD-cmk（Caspase-1抑制剂）对其它通路均不存在抑制作用。综上所述,高糖通过诱导破骨细胞ROS产生并激活MAPKs/NF-κB/NLRP3炎症通路诱导破骨细胞炎症发生,且ROS产生发生在MAPKs、NF-κB和NLRP3上游;MAPKs位于NF-κB和NLRP3上游;而NF-κB位于NLRP3炎性小体上游。其次,在国际上,我们率先阐明破骨细胞炎症激活以及胞葬作用抑制共同促进破骨细胞骨吸收能力的增强,是糖尿病性骨质疏松发生的主要因素。应用流式细胞术对破骨细胞胞葬作用的发生情况进行检测;利用ELISA对LXA 4的表达情况进行考查;借助Western blot技术对MertK蛋白的表达水平进行分析,通过Ac-YVAD-cmk处理探究高糖诱导破骨细胞炎症发生与胞葬作用之间的关系;使用扫描电子显微镜对破骨细胞骨吸收能力进行观察,并采用Ac-YVAD-cmk、胰岛素和LXA 4处理及基因沉默NLRP3解析胞葬作用与炎症的发生与骨吸收之间的关系。结果显示,高糖能够显着抑制破骨细胞胞葬作用的发生和LXA 4的分泌以及MertK蛋白的表达,而Ac-YVAD-cmk处理能够显着逆转高糖的上述抑制作用;高糖能够诱导破骨细胞骨吸收能力的增强,而Ac-YVAD-cmk、胰岛素和LXA 4处理、基因沉默NLRP3却能够显着抑制该增强。综上所述,高糖通过激活破骨细胞NLRP3炎性小体介导的炎症及抑制胞葬作用共同增强破骨细胞骨吸收。再次,我们通过链脲佐菌素（STZ）诱导建立了糖尿病性骨质疏松大鼠模型,在体内验证了破骨细胞炎症反应以及胞葬作用被抑制是糖尿病性骨质疏松发生的机制,并且在国内外率先发现胞葬作用增强剂LXA 4能够作为治疗糖尿病性骨质疏松的潜在药物。利用ELISA对建模鼠检测破骨细胞及骨组织标记物;采用双能X射线吸收仪探查骨密度和骨矿盐;应用HE染色考查骨小梁等骨微结构完整性;借助TRAP染色测定骨组织中破骨细胞含量;通过激光共聚焦显微镜对骨组织中Cathepsin K、p-ERK、NF-κB、NLRP3以及MertK进行共定位;使用Western blot以及ELISA分析骨组织炎症相关通路蛋白p-ERK、p-p38、p-JNK、核NF-κB、p-IκB、IKK、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β、NLRP3和MertK蛋白以及炎症细胞因子IL-18、IL-1β和TNF-α表达情况。结果表明,STZ建模组鼠血清中TRACP-5b、Cathepsin K以及尿液中脱氧吡啶啉的含量显着增加,而胰岛素和骨钙素的含量显着降低,且组织中骨密度和骨矿盐的含量也显着降低;病理组织切片显示,STZ建模组骨组织中各个骨小梁之间更为离散,数目减少并排列不整齐,且破骨细胞的含量显着增多;STZ建模组组织中破骨细胞能够与炎症通路相关蛋白以及MertK蛋白进行共定位;各炎症通路相关蛋白表达量以及炎性细胞因子的分泌量显着增加,但MertK表达显着降低,而LXA4和胰岛素处理均逆转了上述现象。综上所述,破骨细胞NLRP3炎症通路激活以及胞葬作用被抑制介导了大鼠糖尿病性骨质疏松发生。最后,我们针对人和犬糖尿病性骨质疏松临床病例样本,更进一步验证了在体内破骨细胞炎症反应以及胞葬作用被抑制是糖尿病性骨质疏松发生的机制。我们用与上述STZ诱导糖尿病性骨质疏松大鼠模型相同的实验方法,分别对人和犬的糖尿病性骨质疏松临床样本进行相关指标的检测和分析。结果发现,糖尿病性骨质疏松症病人和病犬体内骨组织中破骨细胞数量显着增多,且均能检测到炎症的激活以及胞葬作用的抑制。此结果与前面的体外实验结果及与STZ诱导糖尿病性骨质疏松大鼠模型的相应结果均一致。总之,本研究结果表明,高糖激活ROS/MAPKs/NF-κB/NLRP3炎症通路以及抑制胞葬作用介导破骨细胞骨吸收能力的增强是糖尿病性骨质疏松症的主要发病原因,并且发现胞葬作用增强剂LXA 4能够作为治疗糖尿病性骨质疏松的潜在药物。这些结果为更深入地探究糖尿病性骨质疏松症的发病机理以及为以后有针对性地治疗糖尿病性骨质疏松症奠定了重要的理论基础。
张涛[10]（2008）在《老年颅内外动脉硬化的发生及其与认知功能障碍的关系》文中提出动脉硬化是老年人最常见的疾病之一,随着人口老龄化的加速,脑血管疾病发生率也逐渐升高,颅内外动脉硬化是脑血管疾病的重要危险因素。颅内外动脉硬化与认知功能障碍之间的关系正日益引起人们的重视。本课题开展了颅内外动脉硬化临床和基础两个部分的研究:（1）观察老年人群中颅内外动脉硬化的发生特点及其与认知功能障碍的关系。（2）研究大鼠颈动脉硬化发生发展的病理变化过程及机制,大鼠海马组织病理学特点,探讨老龄大鼠认知功能的变化。第一部分老年颅内外动脉硬化的发生及其与认知功能障碍关系的临床研究目的:通过现状调查观察老年人群中颅内外动脉硬化的发生特点及其与认知功能障碍的关系。对象和方法:随机选择2005年10月-2008年2月期间,在我科就诊的65岁以上病人2115人进行了现状调查,经DSA、CTA或颈动脉B超检查颅内外动脉硬化,并进行一般临床资料收集、血清学炎性因子检测和神经心理学测试。有颅内外动脉硬化的311人;血清学炎性因子检测包括IL-6,TNF-а以及Hs-CRP;神经心理检测。对临床资料和检测结果进行单因素和多因素分析。结果:（1）颅内外动脉硬化基线特征:与无颅内外动脉硬化组相比,颅内外动脉硬化组年龄大（P<0.05）,受教育程度低（P<0.01）,体重指数、收缩压、舒张压、血糖、甘油三酯、血尿酸均较高（P<0.01）,低密度脂蛋白明显较低（P<0.01）。颅内外动脉硬化组高血压病,糖尿病和高尿酸血症明显高于无颅内外动脉硬化组,统计学差异显着（ P < 0.01）,颅内外动脉硬化组代谢综合症高于无颅内外动脉硬化组（ P < 0.05）。（2）颅内外动脉硬化的特点:颅内外动脉硬化好发于颈内动脉颅外段（39.87%）,其次为椎动脉（15.11%）、锁骨下动脉（10.29%）、颈内动脉颅内段（8.04%）、基底动脉（6.43%）、大脑中动脉（6.11%）、颈总动脉（5.14%）。大脑中动脉、椎动脉和锁骨下动脉的硬化,左侧明显高于右侧,统计学差异显着（P<0.01）。颅内外动脉硬化的311人中,女性（52.09%）所占比例高于男性（47.91%）。（3）颅内外动脉硬化组血清学IL-6（92.70±46.80vs72.88±25.12）,TNF-а（36.27±24.11vs33.96±14.78）及Hs-CRP （1.73±1.43vs1.06±0.65）高于无颅内外动脉硬化组,有统计学意义（P<0.05）（4）颅内外动脉硬化危险因素的多因素分析:颅内外动脉硬化的危险因素有年龄、血糖、血尿酸、收缩压、低密度脂蛋白;（5）颅内外动脉硬化与认知功能障碍的关系:与无颅内外动脉硬化组相比,颅内外动脉硬化组MMSE、RVR、DS、BD均明显降低（P<0.01）,ADL升高（P < 0.05）。与颅内外动脉硬化无高尿酸血症组相比,颅内外动脉硬化合并高尿酸血症组MMSE评分降低（P<0.05）。与颅内外动脉硬化无糖尿病组相比,颅内外动脉硬化合并糖尿病组MMSE评分降低,有显着性差异（P<0.01）。结论:（1）老年颅内外动脉硬化好发于颈内动脉颅外段,椎动脉、锁骨下动脉、颈内动脉颅内段、基底动脉;老年颅内外动脉硬化发病率左侧高于右侧;（2）颅内外动脉硬化的危险因素有年龄、血糖、血尿酸、收缩压、低密度脂蛋白;高血糖、高尿酸是特别值得重视的危险因素;（3）颅内外动脉硬化的老年病人中,认知功能障碍的比例增加。第二部分老龄鼠颈动脉硬化的发生及其与认知功能障碍关系的实验研究目的:通过观察不同月龄组大鼠颈动脉组织学特点和大鼠海马组织学特点,研究大鼠颈动脉硬化发生发展的病理变化过程及机制,探讨老龄大鼠认知功能的变化。对象和方法: 30只大鼠按不同月龄分组,分别为低龄组,成年组和老龄组,每组各10只。对各组大鼠颈动脉进行显微结构和超微结构的观察,并检测血清学炎性因子变化,行为学（穿梭箱和Morris水迷宫检测）检测大鼠认知功能的变化。结果:（1）老年大鼠颈动脉组织学结构特点:与低龄组大鼠相比,老龄大鼠内膜结构破坏严重,各层结构欠清晰,内皮细胞出现形态改变、脱落衰老凋亡现象。有红细胞等附着。在颈动脉内,TNF-α与IL-6 mRNA表达量随年龄递增,老龄组表达量最多。（2）与低龄组相比,成年组血清ICAM-I、TNF-α升高（P<0.05）;老龄组血清ICAM-I、TNF-α、IL-6、IL-1显着升高（P<0.01）,Hs-CRP浓度升高（P<0.05）。（3）老龄组大鼠海马神经细胞数量减少,齿状回区和CA3区神经细胞排列稀疏,破坏较严重。老龄组大鼠海马神经细胞、胶质细胞、神经毡和神经髓鞘均出现广泛的老化、凋亡改变。老龄组大鼠神经细胞内细胞器出现肿胀等损伤改变。（4）老龄组大鼠认知功能特点:与成年组相比,老龄组主动回避反应率（AAR）、被动回避反应率（PAR）及空间分辨力的下降（P<0.05）,大鼠的学习记忆能力受损;水迷宫定位航行实验中,平均逃避潜伏期和游泳距离长。水迷宫空间搜索实验中,老龄组初次找到平台的时间长,跨越平台的次数少。平均游泳速度结果表明组间差异并非运动功能下降。穿梭箱实验和水迷宫实验表明老龄大鼠条件性学习记忆能力和空间学习记忆能力的损害。结论:（1）低龄组大鼠动脉内皮特点:内皮排列规则流畅,内膜表面光滑,内皮细胞长梭型,胞浆和细胞器丰富,核区饱满,核膜完整,细胞间紧密连接,膜表面有大量微绒毛结构;成年组大鼠动脉内皮细胞特点:内皮细胞完整性较好,欠光滑,内皮排列与血管长径一致较规则,内皮细胞胞浆稀少,细胞器减少,含丰富吞饮小泡,细胞核所在部位隆起,突出于管腔,细胞表面有红细胞,膜表面微绒毛减少,内皮细胞与内皮下层分界欠清晰;老龄组大鼠动脉内皮细胞特点:内皮排列规则欠流畅,表面欠光滑,内皮细胞胞浆稀薄,形态明显异常,体积缩小,细胞核嵌于内弹性膜间缝隙内,膜表面呈大小不等的火山口状缺损,可见血小板、血细胞核细胞碎屑纤维素等附着,膜表面微绒毛消失,细胞连接疏松;内皮细胞改变有三种即形态改变,萎缩和脱落。内弹性膜不规则,粗细不均,并且有断裂、分层现象,甚至消失。（2）老龄大鼠血清学炎性因子ICAM-I, TNF-α,IL-6,IL-1,Hs-CRP升高;（3）老龄大鼠海马神经元呈退行性改变,（4）老龄大鼠认知功能下降。
二、动脉粥样硬化的扫描电镜研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、动脉粥样硬化的扫描电镜研究进展（论文提纲范文）
（1）pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一章 pH和 ROS双响应性纳米粒的构建及其表征 |
| 1.1 pH响应性和ROS响应性β-环糊精载体材料的合成及其理化性质表征 |
| 1.2 pH和 ROS双响应性纳米粒的构建及其表征 |
| 1.3 pH和 ROS双响应性纳米药物的体外水解及药物释放 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 pH和 ROS双响应性纳米药物的体外生物学功能评价 |
| 2.1 SD大鼠主动脉VSMCs对纳米粒的吞噬作用研究 |
| 2.2 双响应性载RAP纳米粒对SD大鼠VSMCs增殖和迁移的影响 |
| 2.3 双响应性载RAP纳米粒对PDGF-BB诱导大鼠的VSMCs相关蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 pH和 ROS双响应性纳米药物在SD大鼠颈动脉球囊损伤部位的靶向能力及抑制血管新生内膜增生的疗效评价 |
| 3.1 SD大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立 |
| 3.2 p H和 ROS双响应性纳米粒对大鼠颈动脉内皮损伤部位的靶向能力评价 |
| 3.3 pH和 ROS双响应性载RAP纳米粒对SD大鼠颈动脉球囊损伤部位炎症及氧化应激水平的影响 |
| 3.4 pH和 ROS双响应性载RAP纳米药物在SD大鼠颈动脉球囊损伤模型中抑制血管新生内膜增生的疗效观察 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物的构建、靶向性及其防治PTA术后再狭窄的疗效 |
| 4.1 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物的构建及表征 |
| 4.2 pH和 ROS双响应性靶向纳米粒对SD大鼠颈动脉内皮损伤部位的靶向研究 |
| 4.3 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物在SD大鼠颈动脉PTA术后血管再狭窄防治中的疗效评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 pH和 ROS双响应性载RAP纳米药物的初步安全性评价 |
| 5.1 pH和 ROS双响应性空白纳米粒的急性毒性评价 |
| 5.2 pH和 ROS双响应性纳米药物的长期毒性评价 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 纳米药物递送系统在血管再狭窄防治中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）槲皮素调控非编码RNA干预内皮细胞胆固醇损伤的分子机制及其运载体系的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 动脉粥样硬化(AS)的研究进展 |
| 1.1.1 动脉粥样硬化(AS)的现状与危害 |
| 1.1.2 动脉粥样硬化(AS)的主要风险因素 |
| 1.1.3 动脉粥样硬化(AS)的相关病理事件 |
| 1.1.4 动脉粥样硬化(AS)的形成过程 |
| 1.1.5 动脉粥样硬化(AS)与内皮损伤 |
| 1.1.6 动脉粥样硬化(AS)与地中海饮食、高黄酮摄入的关系 |
| 1.2 槲皮素(食品功能因子)的概述 |
| 1.2.1 槲皮素的简介 |
| 1.2.2 槲皮素的生物活性与病理事件 |
| 1.2.3 槲皮素与疾病 |
| 1.2.4 槲皮素的代谢产物 |
| 1.2.5 槲皮素与PI3K/AKT信号通路、心血管疾病(CVDs)之间的关系 |
| 1.3 非编码RNAs(ncRNAs)的研究进展 |
| 1.3.1 NcRNAs的简介 |
| 1.3.2 微小RNAs(miRNAs) |
| 1.3.3 长链非编码RNAs(lncRNAs) |
| 1.4 皮克林(Pickering)乳液运载体系的研究进展 |
| 1.4.1 Pickering乳液的简介 |
| 1.4.2 胶体颗粒的界面行为 |
| 1.4.3 食品级颗粒稳定Pickering乳液 |
| 1.4.4 Pickering乳液的表征方法 |
| 1.4.5 Pickering乳液作为功能因子运载体系的研究进展 |
| 1.5 研究目的、内容及意义 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 研究意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 试验方法 |
| 2.4.1 体外细胞分子生物学实验 |
| 2.4.2 Pickering乳液递送体系的构建 |
| 2.4.3 动物实验 |
| 2.5 数据分析方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 槲皮素对Ox-LDL诱导HUVECs损伤的保护作用及分子机制 |
| 3.1.1 Ox-LDL诱导HUVECs细胞损伤模型的建立 |
| 3.1.2 槲皮素无毒性剂量范围的筛选 |
| 3.1.3 槲皮素对Ox-LDL处理的HUVECs细胞存活率的影响 |
| 3.1.4 槲皮素对Ox-LDL处理的HUVECs细胞氧化应激水平的影响 |
| 3.1.5 槲皮素对Ox-LDL诱导的HUVECs细胞线粒体功能障碍的干预作用 |
| 3.1.6 槲皮素通过介导PTEN/PI3K/AKT/Caspase9 信号通路保护HUVECs免受Ox-LDL诱导的损伤 |
| 3.1.7 槲皮素通过调控miR-494-3p保护HUVECs免受Ox-LDL诱导的损伤 |
| 3.1.8 MALAT1 作为槲皮素的上游靶点调控miR-494-3p |
| 3.1.9 槲皮素对Ox-LDL诱导HUVECs损伤保护作用的分子机制 |
| 3.2 玉米蛋白/山楂果胶复合颗粒(ZHPs)稳定的Pickering乳液(ZHPEs)递送体系的构建 |
| 3.2.1 山楂果胶的理化性质和分子量分布 |
| 3.2.2 玉米醇溶蛋白/山楂果胶复合颗粒(ZHPs)的合成与表征 |
| 3.2.3 玉米醇溶蛋白/果胶复合颗粒(ZHPs)稳定的Pickering乳液(ZHPEs)的制备与表征 |
| 3.2.4 乳液对脂质氧化稳定性的影响 |
| 3.2.5 乳液装载槲皮素的效果 |
| 3.3 直接/递送给药槲皮素对C57BL/6J小鼠胆固醇损伤的干预作用 |
| 3.3.1 直接/递送给药槲皮素对小鼠体重的影响 |
| 3.3.2 直接/递送给药槲皮素对小鼠血清内抗氧化指标的影响 |
| 3.3.3 直接/递送给药槲皮素对小鼠血脂的影响 |
| 3.3.4 直接/递送给药槲皮素对小鼠肝功五项的影响 |
| 3.3.5 直接/递送给药槲皮素对小鼠主要器官外观、重量的影响 |
| 3.3.6 小鼠主要器官微观组织形态H&E染色观察 |
| 3.3.7 小鼠肝脏脂质积累油红O染色观察 |
| 3.3.8 小鼠主动脉大体、切片油红O染色观察 |
| 3.3.9 小鼠主动脉切片H&E染色观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 动脉粥样硬化(AS)相关实验模型的选择 |
| 4.2 槲皮素体外实验浓度选择及合理性 |
| 4.3 高通量测序与槲皮素ceRNA作用网络 |
| 4.4 ZHPs复合颗粒的组装及其界面润湿性 |
| 4.5 大分子凝胶网络赋予高油相分数ZHPEs胶体特征 |
| 4.6 乳液(ZHPEs)对活性成分生物利用率的影响 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）韭根挥发油对人脐静脉内皮细胞糖萼层作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 韭根的药用植物学特征 |
| 1.1 韭根概述 |
| 1.2 韭根的药用文献考证 |
| 1.3 韭根的现代药学研究 |
| 1.3.1 韭根的药理学研究 |
| 1.3.2 韭根的主要化学成分 |
| 1.3.3 韭根挥发油的药学研究 |
| 1.3.4 韭根挥发油的主要成分 |
| 1.3.5 韭根挥发油的提取 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 人脐静脉内皮细胞分离培养及ESL损伤模型建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 人脐静脉内皮细胞的分离、培养及鉴定 |
| 2.2.1 原代提取的器械准备 |
| 2.2.2 原代提取的实验步骤 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 细胞复苏 |
| 2.2.6 细胞计数 |
| 2.2.7 人脐静脉内皮细胞的鉴定 |
| 2.3 人脐静脉内皮细胞糖萼层损伤模型的建立 |
| 2.3.1 实验分组 |
| 2.3.2 扫描电镜制样 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 正常人脐静脉内皮细胞在光镜下的形态 |
| 2.4.2 人脐静脉内皮细胞的鉴定 |
| 2.4.3 不同浓度脂多糖在不同作用时间下对糖萼层的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 韭根挥发油对HUVECs损伤ESL作用及机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验药物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CCK-8 检测韭根挥发油对HUVECs生长的影响 |
| 3.2.2 电镜观察韭根挥发油对HUVECs损伤ESL的作用 |
| 3.2.3 ELISA法测各组细胞培养上清液中HS和 HA的含量 |
| 3.2.4 Western blot检测HUVECs caveolin-1和eNOS的表达 |
| 3.2.5 统计学处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 韭根挥发油对HUVECs生长的影响 |
| 3.3.2 韭根挥发油对HUVECs损伤ESL形态的影响 |
| 3.3.3 韭根挥发油对损伤HUVECs糖萼层的保护作用 |
| 3.3.4 韭根挥发油对损伤HUVECs表达e NOS和 caveolin-1 的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）心脉康方对兔动脉粥样硬化及NF-κB p65表达的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药物与试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 动物模型建立[10]、分组与给药 |
| 1.5 观察指标与方法 |
| 1.5.1 苏木素-伊红（HE）染色法观察兔腹主动脉组织病理变化 |
| 1.5.2 扫描电镜观察腹主动脉内壁 |
| 1.5.3 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测兔腹主动脉组织NF-κB p65表达 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组兔主动脉组织HE染色病理变化比较 |
| 2.2 各组兔主动脉内壁扫描电镜结果比较 |
| 2.3 各组兔主动脉组织NF-κB p65蛋白表达水平比较 |
| 3 讨论 |
（5）超声分子成像靶向活化血小板上的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体评价动脉粥样硬化易损斑块（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 缩略词表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（6）活性氧响应性多功能纳米粒口服抑制动脉粥样硬化的体内外研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 活性氧响应性载药纳米粒的构建及其理化性质评价 |
| 2.1 活性氧响应性纳米粒的制备及其表征 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 2.2 活性氧响应性载药纳米粒的制备表征及其性能评价 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 活性氧响应性载药纳米粒体外生物学评价 |
| 3.1 TPCD NP抑制细胞活性氧的产生 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 结果 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.2 TPCD NP抑制活性氧诱导的细胞凋亡 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.2.3 讨论 |
| 3.3 TPCD NP和TPCD-DA NP延缓活性氧诱导的细胞衰老 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.3.3 讨论 |
| 3.4 TPCD NP和TPCD-DA NP抑制细胞炎症因子的产生 |
| 3.4.1 材料与方法 |
| 3.4.2 结果 |
| 3.4.3 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 活性氧响应性载药纳米粒抑制动脉粥样硬化的体内初步评价 |
| 4.1 TPCD NP抑制动脉粥样硬化的效果评价 |
| 4.1.1 材料与方法 |
| 4.1.2 结果 |
| 4.1.3 讨论 |
| 4.2 TPCD NP抑制动脉粥样硬化的潜在机制 |
| 4.2.1 材料与方法 |
| 4.2.2 结果 |
| 4.2.3 讨论 |
| 4.3 TPCD-DA NP抑制动脉粥样硬化的效果评价 |
| 4.3.1 材料与方法 |
| 4.3.2 结果 |
| 4.3.3 讨论 |
| 4.4 口服TPCD-DA NP的安全性评价 |
| 4.4.1 材料与方法 |
| 4.4.2 结果 |
| 4.4.3 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 活性氧响应性仿HDL纳米粒的构建及体外抗动脉粥样硬化作用评价 |
| 5.1 活性氧响应性仿HDL纳米粒的制备及其表征 |
| 5.1.1 材料与方法 |
| 5.1.2 结果 |
| 5.1.3 讨论 |
| 5.2 活性氧响应性仿HDL纳米粒的体外抗动脉粥样硬化作用评价 |
| 5.2.1 材料与方法 |
| 5.2.2 结果 |
| 5.2.3 讨论 |
| 5.3 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 巨噬细胞在动脉粥样硬化发生发展过程中的作用 |
| 参考文献 |
| 在读硕士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（7）不同粒径三七粉体外溶出及体内药动学评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 不同粒径三七粉的制备与表征 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药材与试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 2 实验方法与结果 |
| 2.1 三七粉的制备 |
| 2.2 不同温度水温浸处理后的三七粉混悬液制备 |
| 2.3 三七粉的性状研究 |
| 2.4 三七粉热特性研究 |
| 2.5 流变学研究 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 三七粉体外溶出研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药材及试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 2 实验方法与结果 |
| 2.1 三七中皂苷类成分含量测定方法的建立 |
| 2.2 以水为溶出介质的溶出实验 |
| 2.3 三七粉在人工胃液中的溶出行为研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同粒径三七粉的溶出行为 |
| 3.2 不同温度水温浸润下的三七粉溶出行为 |
| 4 小结 |
| 第三章 三七粉在大鼠体内药代动力学研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药材及试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 动物 |
| 2 实验方法与结果 |
| 2.1 UHPLC-MS/MS定量方法的建立 |
| 2.2 不同粒径三七粉的药动学研究 |
| 2.3 不同温度水温浸后三七粉的药动学研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 血浆预处理方法的选择 |
| 3.2 给药剂量的设置 |
| 3.3 整合药动权重参数的选择 |
| 4 小结 |
| 第四章 三七粉小鼠急性毒性研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药材及试剂 |
| 1.2 动物 |
| 2.实验方法与结果 |
| 2.1 供试品溶液的配制 |
| 2.2 动物分组及给药方案 |
| 2.3 一般生长状况观察 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 三七在心血管循环系统相关疾病中的应用 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（8）炎症消退和神经重建在小口径组织工程血管长期通畅中的作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 前言 |
| 第二部分 netrin-1 调控小口径TEBV炎症消退及其机制研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 炎症消退对TEBV内皮化作用及机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四部分 糖尿病下神经元外泌体对抑制血管平滑肌细胞钙化作用及机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五部分 构建二级响应修饰系统诱导小口径TEBV神经重建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 小口径组织工程血管 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间学术成果或奖励 |
| 致谢 |
（9）破骨细胞炎症通路激活和胞葬作用抑制介导糖尿病性骨质疏松的发病机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 糖尿病性骨质疏松的研究进展 |
| 1.1 糖尿病性骨质疏松的研究背景 |
| 1.2 糖尿病性骨质疏松的流行病学 |
| 1.3 糖尿病性骨质疏松发病机制的研究现状 |
| 1.4 糖尿病性骨质疏松的治疗 |
| 第二章 炎症的研究进展 |
| 2.1 炎症的概述 |
| 2.2 ROS |
| 2.3 炎症相关通路 |
| 第三章 胞葬作用的研究进展 |
| 3.1 胞葬作用的概述 |
| 3.2 胞葬作用的特征 |
| 3.3 胞葬作用的信号 |
| 3.4 胞葬作用与炎症之间的关系 |
| 3.5 胞葬作用参与疾病 |
| 第四章 破骨细胞与骨质疏松症的研究进展 |
| 4.1 破骨细胞概述 |
| 4.2 破骨细胞与骨质疏松症的关系 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 高糖诱导破骨细胞ROS产生并激活MAPKs/NF-κB/NLRP3炎症通路 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 高糖激活NLRP3炎性小体介导的炎症与其对破骨细胞胞葬抑制作用共同增强破骨细胞骨吸收 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 破骨细胞NLRP3炎症通路激活和胞葬作用抑制介导大鼠糖尿病性骨质疏松发生 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 糖尿病性骨质疏松症发生机制的人与犬临床确证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）老年颅内外动脉硬化的发生及其与认知功能障碍的关系（论文提纲范文）
| Abstract |
| 摘要 |
| 论文正文 老年颅内外动脉硬化的发生及其与认知功能障碍的关系 |
| 第一部分 老年颅内外动脉硬化的发生及其与认知功能障碍关系的临床研究 |
| 前言 |
| 对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 老龄鼠颈动脉硬化的发生及其与认知功能障碍关系的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 文献综述一 颈动脉粥样硬化的临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 颈动脉硬化与老年认知功能障碍的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表的论文 |
| 英文论着 |
四、动脉粥样硬化的扫描电镜研究进展（论文参考文献）
- [1]pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究[D]. 张润军. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [2]槲皮素调控非编码RNA干预内皮细胞胆固醇损伤的分子机制及其运载体系的构建[D]. 江杨. 山东农业大学, 2020(08)
- [3]韭根挥发油对人脐静脉内皮细胞糖萼层作用及其机制研究[D]. 袁杨. 兰州大学, 2020(01)
- [4]心脉康方对兔动脉粥样硬化及NF-κB p65表达的影响[J]. 王婷,叶小汉,吴锦波,冯文伟. 广州中医药大学学报, 2020(10)
- [5]超声分子成像靶向活化血小板上的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体评价动脉粥样硬化易损斑块[D]. 郭胜存. 南方医科大学, 2016(02)
- [6]活性氧响应性多功能纳米粒口服抑制动脉粥样硬化的体内外研究[D]. 刘仁凤. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [7]不同粒径三七粉体外溶出及体内药动学评价[D]. 梁笑. 安徽中医药大学, 2020(03)
- [8]炎症消退和神经重建在小口径组织工程血管长期通畅中的作用研究[D]. 李彦朝. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [9]破骨细胞炎症通路激活和胞葬作用抑制介导糖尿病性骨质疏松的发病机制研究[D]. 安雅男. 吉林大学, 2020(08)
- [10]老年颅内外动脉硬化的发生及其与认知功能障碍的关系[D]. 张涛. 第三军医大学, 2008(03)