一、Expression of human hepatitis C virus core antigen in tobacco plants by tobacco mosaic virus-based vector system（论文文献综述）
程德杰[1]（2021）在《核内含体蛋白b调控烟草脉带花叶病毒复制的分子机制》文中指出马铃薯Y病毒属（Potyvirus）包括160多种病毒,是最大的植物病毒属。该属的马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）和烟草脉带花叶病毒（tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV）等多种病毒给世界农业生产造成了巨大损失。种植抗病品种是防治病毒病最为经济有效的方法,但目前生产中缺乏有效的抗病品种。鉴定与植物病毒互作的寄主因子不仅能够阐明病毒侵染的分子机制,还能通过基因编辑培育抗病毒品种。除此之外,筛选弱毒突变体并将其应用于交叉保护也是一种行之有效的抵抗病毒病的策略。本研究明确了TVBMV核内含体蛋白b（nuclear inclusion protein b,NIb）和寄主因子互作来调控病毒复制的分子机制。主要研究结果如下:（1）明确了NIb挟持NbRPL1调控TVBMV复制的分子机制。本氏烟50S核糖体蛋白L1（50S ribosomal protein large subunit 1 of Nicotiana benthamiana,NbRPL1）与TVBMV复制酶NIb相互作用。NbRPL1定位于叶绿体,其N末端61个氨基酸是叶绿体转运肽（chloroplast transit peptide,c TP）,该转运肽在植物体内发生切割。而且,完整的c TP对于NbRPL1及NbRPL1/NIb互作复合体靶向叶绿体至关重要。NbRPL1/NIb互作复合体与6K2诱导的囊泡共定位,但不能定位于细胞核和胞间连丝。在TVBMV侵染情况下,NbRPL1被挟持到叶绿体相关的TVBMV诱导的复制复合体（virus replication complex,VRC）中。NbRPL1的沉默抑制了TVBMV的复制和外壳蛋白积累,从而影响了病毒的系统侵染。NbRPL1沉默未影响复制相关蛋白6K2对叶绿体的靶向,但是影响了NIb在VRC中的分布。过表达NbRPL1促进了病毒的复制和NIb的蛋白积累,但未影响病毒的翻译。TVBMV侵染会激活自噬,自噬相关基因Beclin1等显着上调表达。自噬受体蛋白NbBeclin1也与TVBMV NIb互作,并且能促进NIb的降解,从而抑制病毒的复制。过表达NbRPL1减少了NbBeclin1介导NIb蛋白降解,促进了病毒RNA积累。体外实验证明NbRPL1与NbBeclin1竞争性结合NIb。TVBMV通过招募NbRPL1到叶绿体相关的VRC中来稳定NIb,从而正调控病毒的复制;而植物通过NbBeclin1识别并降解NIb,从而负调控病毒的复制。（2）明确了NIb挟持NbANXD1调控病毒侵染的分子机制。我们通过双分子荧光互补（Bi FC）、酵母双杂交（Y2H）和免疫共沉淀（Co-IP）证明了本氏烟膜联蛋白D1（annexin D1 of Nicotiana benthamiana,NbANXD1）与TVBMV复制酶NIb互作。酵母双杂交分析了NbANXD1与TVBMV其余病毒蛋白的互作,结果表明NbANXD1还与病毒的解旋酶CI互作。NbANXD1中存在四个重复的ANX结构域,单个的ANX结构域不与NIb相互作用。NbANXD1与NIb的N端和C端互作,但不与NIb的中间区域互作。在TVBMV侵染的细胞中,NbANXD1在VRC附近富集,而且NbANXD1/NIb复合体与VRC共定位。沉默NbANXD1减少了TVBMV和PVY的系统侵染。而且,ATPase与NbANXD1互作,沉默ATPase减慢了TVBMV的侵染。综上所述,TVBMV募集寄主因子NbRPL1、NbANXD1和NbATPase用于病毒复制和移动,然而植物利用NbBeclin1来抵抗病毒侵染。
张宇[2]（2019）在《ToCV检测方法建立、侵染性克隆构建及与植物蛋白互作分析》文中认为番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）为长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（Crinivirus）病毒,自2013年在我国山东爆发,现呈全国扩散趋势,严重威胁我国番茄等茄科重要经济作物的安全生产。加强该病毒的快速检测技术体系,病毒与寄主互作的分子机制等研究,可明确该病毒在我国的扩散分布,分析其对番茄等重要经济作物的潜在威胁,也可为该病毒病的科学防控提供技术手段和科学依据。利用原核表达的ToCV CP及HSP70蛋白作为抗原,制备获得CP蛋白和HSP70蛋白的多克隆抗体,稀释10,000倍,可特异性识别相应的抗原,为开发ToCV快速检测技术提供了技术资源。采用无缝克隆技术,构建了ToCV全长基因组cDNA侵染性克隆,利用农杆菌接种本氏烟BY2细胞和番茄,均接种不成功;农杆菌介导法接种本氏烟,接种成功率为15%。采用基因枪法,ToCV侵染性克隆质粒接种本氏烟和番茄,也均接种失败;利用PEG介导法接种本氏烟BY2细胞,ToCV侵染率可达60%。利用粉虱接种ToCV至番茄,采用相对定量技术测定接种病毒后番茄各部位的感病时间及病毒含量,结果表明10 dpi可在接种叶上检测到病毒,15 dpi接种叶以上的部位均可检测到病毒,接种20 dpi接种叶下部的叶片检测到病毒,且下部叶的含量最低,接种初期接种叶中病毒含量最低,随着病情发展,心叶的病毒含量最高。通过MDC染色、LC3蛋白含量,测定了ToCV感染番茄,对番茄自噬体途径的影响,结果表明,ToCV感染番茄,能够激活番茄的细胞自噬体途径。3-MA抑制番茄自噬体小泡的延伸,3-MA处理番茄叶片,可以促进番茄细胞自噬体途径ATG1上调表达,且促进ToCV的复制。而BFA促进ER和高尔基体解体,抑制自噬体途径启始;BFA处理番茄叶片,ATG1表达量和ToCV复制量均无差异。酵母双杂交结果表明,ToCV CP及CPm蛋白,均可与番茄自噬体途径ATG1蛋白发生互作。番茄ATG1蛋白参与自噬起始;因此,根据以上结果,推测ToCV激活番茄自噬体小泡形成启始阶段,促进不成熟自噬体小泡形成,以不成熟自噬体小泡双层膜作为复制位点,促进病毒复制。ToCV与番茄自噬体途径互作的详实分子机制,还需CO-IP和BiFC验证二者互作真实性,ATG1蛋白表达对ToCV复制的影响。
徐丽[3]（2019）在《Ⅰ型启动子及其终止序列对植物病毒载体系统表达效率的影响分析》文中研究表明植物RNA病毒载体表达系统是一种有潜力的外源基因瞬时表达平台,生物安全性是阻碍其应用的瓶颈问题之一。Ⅰ型启动子具有的种属间特异性,理论上可以缩小重组病毒的宿主范围降低病毒载体潜在的生物危害性。Ⅰ型启动子已被广泛应用于动物病毒载体的研究中,但在植物中却鲜有报道。植物Ⅰ型启动子能否像哺乳动物Ⅰ型启动子一样,高效地提高病毒载体的生物安全性仍有待验证。鉴于此,本论文以番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus,TBSV）为实验材料,构建本氏烟Ⅰ型启动子介导转录的TBSV病毒表达载体,通过分析接种叶片中重组GFP表达情况,探索本氏烟Ⅰ型启动子顺式调控序列、转录特性和Ⅰ型终止子对病毒载体的影响,初步明确Ⅰ型启动子介导转录的植物病毒载体表达系统的有效性和主要特征。研究发现,①本氏烟Ⅰ型启动子长度对启动子转录频率和病毒载体的表达水平无显着影响;长度仅为77 nt的启动子就可以起始病毒基因组RNA的转录;并且其启动子结构中不存在类似于动物Ⅰ型启动子的上游控制元件（Upstream control element,UCE）;②启动子转录起始位点上游T串序列以及转录起始位点核苷酸A/G互换也对启动子转录频率和病毒载体的表达效率无显着的影响;③转录起始位点下游延伸序列（延伸至+42位）对启动子转录强度具有显着的正调控作用,能够通过增强启动子转录频率提高病毒载体表达水平,效果增幅约为2倍;④源于35S启动子的ELS序列（Enhancer-like sequence）能够增强启动子转录频率和提高病毒载体表达水平3-5倍;修改后的本氏烟Ⅰ型启动子具有与35S启动子相似的转录强度;⑤本氏烟Ⅰ型启动子具有转录的非专一性,这一转录特征与转录起始位点下游延伸序列和ELS序列无关,是其自身固有的特性。受体本氏烟中的Pol Ⅱ对Ⅰ型启动子的非特异性识别是其非特异性转录产生的可能原因;⑥对本氏烟Ⅰ型启动子TATA框中的单碱基进行突变,可以在不影响Ⅰ型启动子转录效率的情况下,一定程度上提高了其转录的专一性。但是,依然不能完全杜绝受体细胞PolⅡ对Ⅰ型启动子的非特异性识别和转录;⑦Ⅰ型终止子既不能提高病毒载体的表达水平,也不能提高本氏烟Ⅰ型启动子的转录专一性,且其存在与否不会影响病毒载体的表达效率。推测TBSV病毒对其3’末端的高水平修复是产生这一结果的可能原因。相关研究初步建立起以RNA聚合酶Ⅰ介导转录植物病毒表达系统,为进一步探索Ⅰ型启动子介导的植物病毒表达系统在生物安全性上的潜力以及其在实际应用中的潜能和应用前景等奠定了基础。
黄爽,范杰英,韦正乙,邢少辰[4]（2019）在《烟草花叶病毒瞬时表达系统在医药蛋白生产中的应用》文中认为烟草花叶病毒（TMV）是目前研究最为透彻的一种植物病毒。基于烟草花叶病毒的瞬时表达系统是目前发展最迅速、应用最广泛的,具有广阔应用发展前景。该系统以表达速度快、表达量高、安全性高和易于规模化生产为最突出的特点,目前已广泛应用在疫苗、抗体和治疗性蛋白等医药蛋白生产中,有不少产品获得了市场准入或者进入了临床试验。本综述简要介绍了基于烟草花叶病毒的瞬时表达系统的发展历史,回顾和总结了该系统在生产医药蛋白领域最新的研究和应用进展,分析了存在的问题,提出了一些建议,藉此促进中国生物医药产业的发展。
战斌慧[5]（2016）在《玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白的细胞核定位及功能研究》文中研究指明玉米致死性坏死病是近年来严重危害亚洲、非洲等地玉米产区的重要病害之一,是由玉米褪绿斑驳病毒（Maize chlorotic mottle virus,MCMV）与马铃薯Y病毒科的一种或几种病毒复合侵染造成的,如玉米矮花叶病毒、小麦条纹花叶病毒、甘蔗花叶病毒等。MCMV是番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）玉米褪绿斑驳病毒属（Machlomovirus）的唯一病毒,该病毒的基因组为正义单链RNA,可以产生两条亚基因组RNA（subgenomic RNA,sgRNA）,1.47 kb的sgRNA 1和0.34 kb的sgRNA 2。病毒的外壳蛋白（capsid protein,CP）由sgRNA 1产生,除了具有结构功能外,其他功能未知。本研究以MCMVCP为研究对象,通过研究MCMVCP的细胞核定位及其进核途径,初步探索了与MCMVCP核定位相关的进核蛋白因子importin α1a（ZmIMPα1a）和importinα1b（ZmIMPα1b）在病毒侵染中的作用,为研究MCMVCP的功能打下基础。利用农杆菌浸润及玉米原生质体瞬时表达研究MCMVCP的亚细胞定位。研究发现,在本生烟的表皮细胞中,MCMVCP能够定位在细胞核中,并且在核仁中积累;在玉米原生质体中,MCMV CP能够进入细胞核中;双分子荧光互补实验（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）表明MCMV CP的二聚体或者多聚体能够进入玉米原生质体的细胞核。构建了 MCMVCP的一系列突变体,并在烟草表皮细胞中瞬时表达,以研究对MCMVCP细胞核定位起关键作用的区域,结果表明MCMV CP的N端富含碱性氨基酸的1-43 aa区域对于MCMV CP的细胞核定位起到重要作用。对MCMV CP进核的途径进行了研究。BiFC验证了 MCMV CP能够与受体分子ZmIMPα1a和ZmIMPα1b相互作用,表明MCMV CP可以通过经典的importin α/β进核途径进入细胞核。明确了 CP N端的1-43 aa区域介导了 MCMV CP与ZmIMPα1a和ZmIMPα1b的相互作用,进一步证明了其在MCMV CP细胞核定位中的重要作用。研究了 ZmIMPα1a和ZmIMPα1b在MCMV侵染过程中的功能。检测了 MCMV侵染对第一片系统侵染叶中ZmIMPα1a和ZmIMPα1b基因表达的影响。结果显示,在病毒接种后第7天和第10天,ZmIMPα1a和ZmIMPα1b基因表达显着上调。利用雀麦花叶病毒（Brome mosaic virus,BMV）介导的基因沉默体系在玉米植株中同时瞬时沉默ZmIMPα1a和ZmIMα1b基因的表达并挑战接种 MCMV（BMV-IMPα1/MCMV）,与对照植株相比（BMV-GFP/MCMV）,MCMVRNA 的积累量显着降低,说明ZmIMPα1a和ZmIMPα1b促进MCMV的侵染。另外,为了探索MCMVCP进入细胞核的功能,本研究构建了均一化酵母双杂交玉米cDNA文库,并以MCMV CP为诱饵进行文库筛选,发现CP能够与具有转录激活功能的MCMVP32相互作用。构建了研究蛋白是否具有转录调节功能的荧光素酶报告系统,利用此系统发现在玉米原生质体中MCMV CP能够激活荧光素酶报告基因的表达,这说明CP可能具有转录激活功能。
钟雪,齐广勋,康岭生,刘剑锋,杨向东[6]（2012）在《利用植物叶绿体表达重组药用蛋白和疫苗研究进展》文中研究表明植物是医用药物的重要来源之一,约占整个医用药物市场的1/4以上。现代生物技术的发展进一步拓宽了植物在医药领域的应用范围,许多具有重要应用价值的重组药用蛋白在植物中获得成功表达,部分重组药用蛋白已进入商业化应用阶段。与其他重组药用蛋白生产系统相比,植物叶绿体生产系统具有独特的优势,如外源基因的高效和稳定表达、多基因表达、环境安全等。利用植物叶绿体表达系统生产的重组药用蛋白和疫苗已达40多种。本研究对近年来利用叶绿体表达重组药用蛋白和疫苗的研究进展进行了综述,并就植物叶绿体表达重组药用蛋白方面的几个问题进行了探讨。
巩智刚,徐芳,周海鹏,王雯雯,王玉华[7]（2012）在《叶绿体转化及其用于疫苗表达研究的最新进展》文中进行了进一步梳理随着植物转基因研究的不断深入,核基因组转化的转基因沉默现象严重影响了基因工程的应用效果。植物叶绿体遗传转化以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作,外源基因定点整合及母性遗传特性能较好地解决"顺式失活"和"位置效应"等类的基因沉默问题和转基因逃逸等安全问题,成为植物基因工程发展的新方向,在工业、农业及医药生物领域发挥了重要作用,也为生产廉价、安全的植物疫苗提供了新思路。本文在简要介绍叶绿体转化的原理、转化方法与优势的基础上,重点综述了近年来通过该技术表达的一些重要的病毒抗原和细菌抗原。最后,对叶绿体转化技术在表达外源基因方面存在的问题进行分析。未来随着叶绿体基因表达、调控机制研究的逐渐深入及相关技术体系的日臻完善,叶绿体转化有望成为疫苗生产的生力军。
钟雪[8]（2012）在《口服SARS候选亚基疫苗S-RBD在烟草叶绿体中的表达研究》文中认为叶绿体转基因技术是目前植物基因工程领域的研究热点之一。该技术通过外源基因在叶绿体基因组中的定点整合，实现外源重组蛋白在植物中的高效、稳定表达。与其他植物表达系统相比，叶绿体表达系统具有表达效率高、多基因共转化、无位置效应、环境安全等诸多方面的优势。叶绿体表达系统的优势为实现重组药用蛋白的低成本、安全、规模化生产提供了有利的条件，特别是为实现疫苗的口服提供了一条新的技术途径。严重急性冠状呼吸综合症（Severe acute respiratory syndrome，SARS）是由突变的冠状病毒（SARScoronavirus，SARS-CoV）引起的一类新的传染性疾病。该病原体具有传播速度快，潜伏期短，病死率高的特点，曾一度给我国乃至全世界造成重大损失。目前SARS疫情虽然在世界范围内已得到控制，但SARS病毒很有可能依然存在于部分野生动物宿主中。在适当的条件下，这些病毒很有可能再次传染给人类，并在人群中迅速蔓延。目前人类还尚未开发出有效的SARS治疗药物，因此，除了隔离或阻断病毒传染措施外，研发安全、高效、特异性SARS疫苗无疑是控制病原的最为经济和有效的手段。本研究针对SARS亚基疫苗研究中的重要靶序列-S蛋白受体结合区（Receptor binding domain，RBD），利用叶绿体转基因技术，将S-RBD与载体分子CTB（Chlora toxin B subunit）融合基因合导入到烟草叶绿体基因组中，获得稳定表达口服SARS亚基疫苗的叶绿体转基因烟草植株，为口服SARS亚基疫苗及相关佐剂的研发和疫苗的规模化生产提供一套低成本、安全、高效的技术平台。本研究主要取得如下结果：1．根据烟草密码子的偏爱性，对SARS CoV S糖蛋白受体结合区（S-RBD）的核苷酸序列进行人工优化；利用常规分子操作技术，将优化后的S-RBD序列连接到载体pLD-CTB上，构建叶绿体表达载体pLD-CTB-mRBD，并进行测序验证；2.在已建立的烟草叶绿体转化技术体系的基础上，利用基因枪转化方法，通过多轮、高压（500-700mg/L壮观霉素）筛选，将CTB-mRBD融合基因导入到烟草叶绿体基因组中，共获得转化再生植株35株；3. PCR、Southern杂交检测结果表明，外源融合基因已整合到烟草叶绿体基因组中，并以获得同质化，共获得同质化叶绿体转基因烟草植株9株；4.利用叶绿体转基因烟草植株进行SDS-PAGE分析表明，外源融合蛋白（～34KD）在烟草叶绿体中获得成功表达。
关正君[9]（2011）在《樱桃番茄的HBsAg基因转化及其突变体特性研究》文中指出乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染会导致全世界每年有上百万的人死于肝癌或肝硬化。当前预防乙肝有效的措施是采用乙肝疫苗。目前乙肝病毒基因工程疫苗主要以酵母为载体进行生产。随着转基因植物口服疫苗的发展,编码乙肝病毒抗原的目的基因被整合到植物基因组中。樱桃番茄（Lycopersicon esculentum var. cerasiforme）是普通番茄的一个亚变种,是茄科番茄属的一年生或多年生的草本植物。其营养丰富,可以生食。本研究构建了一个携带有乙肝病毒表面抗原（HBV surface antigen, HBsAg）基因的植物表达载体,并通过农杆菌介导转化樱桃番茄。在转化过程中,意外获得一株转基因三倍体突变体。由于转基因植物的大田种植和推广应用可能存在一定的风险,因而在进行基因转化的基础研究过程中,后续研究进而转为对该三倍体突变体的生长特性（包括生理生化、抗性以及形态发生特性等方面）进行研究。1植物表达载体的构建与樱桃番茄的转化成功构建了含有adr亚型HBsAg S基因的植物表达载体pCAMBIA1301/HB,并获得了表达HBsAg S基因的转基因樱桃番茄植株。PCR鉴定和Southern杂交检测结果表明,HBsAg S基因已经整合到转化的樱桃番茄基因组中。HBsAg蛋白在转基因樱桃番茄植株中的表达量分别为100.36ng/g叶片鲜重和127.54ng/g果实鲜重。该部分内容已在vaccine2010 vol.28 No.46发表。2温室栽培转基因樱桃番茄突变体的生理生化特性分析通过Hyg（潮霉素）筛选、PCR鉴定、Southern blotting检测和流式细胞分析,获得了一株HBsAg转基因樱桃番茄突变体,该转基因樱桃番茄突变体为三倍体,长势良好,但种子败育。本试验对温室栽培的转基因樱桃番茄突变体生理生化特性进行了详细的评价。结果表明,经PCR鉴定, HBsAg基因仍然稳定表达在温室栽培的转基因樱桃番茄突变体基因组中。流式细胞仪分析结果表明,该突变体是三倍体。与非转化樱桃番茄相比,温室栽培转基因突变体表现出较高的叶绿素含量和蛋白质含量、较好的保水能力和膜渗透性、以及较强的抗氧化酶活性。该研究结果已被Russian journal of genetics接收,将于2011 vo1.47 No.8发表。3转基因樱桃番茄突变体愈伤组织对盐胁迫的生理响应盐度是影响植株生长的重要因素。研究转基因植物在盐胁迫逆境条件下的生理响应,可以明确转基因植物在生长和发育过程中的抗盐性和抗逆性。鉴于转基因樱桃番茄突变体在温室栽培过程中有较强的抗性,本试验以HBsAg转基因樱桃番茄突变体愈伤组织为试验材料,研究了其在不同盐浓度下的生理生化变化。结果表明：1) NaCl处理转基因樱桃番茄突变体愈伤组织时,盐的半致死浓度为80mmol/L。转基因樱桃番茄突变体愈伤组织耐盐的阈值大约在60mmol/L-100mmol/L。2)盐胁迫下,随着NaCl浓度梯度的增加,突变体愈伤组织的SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）、CAT（过氧化氢酶）和APX（抗坏血酸过氧化物酶）活性呈先升高后降低的趋势。在盐浓度大于40mmol/L时,各酶活性开始受到盐胁迫的影响,但CAT活性变化较小。相同盐浓度胁迫下,突变体愈伤组织各酶活性均明显高于非转基因樱桃番茄,表明突变体愈伤组织耐盐性较强。3)NaCl胁迫下,突变体愈伤组织的H202（过氧化氢）含量、MDA（丙二醛）含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量和电导率均随NaCl处理浓度的增加而持续升高。但在相同NaCl浓度胁迫下,与非转基因樱桃番茄愈伤组织相比,突变体愈伤组织的H202含量、MDA含量和电导率较低,可溶性糖含量和脯氨酸含量较高,表明突变体的抗逆性较强。4)随着盐胁迫的加重,突变体愈伤组织叶绿素含量均有下降趋势。且在相同处理浓度下,突变体愈伤组织中的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量均高于非转基因樱桃番茄愈伤组织。表明在盐胁迫条件下突变体愈伤组织的光合作用较强。以上结果表明,转基因樱桃番茄突变体愈伤组织的耐盐性明显提高,与SOD、POD和APX活性变化以及可溶性糖含量的积累密切相关。4转基因樱桃番茄突变体组培苗对盐胁迫的生理响应本试验以HBsAg转基因樱桃番茄突变体组培苗为试验材料,分析了其在不同盐浓度下的生理生化变化,旨在为突变体温室栽培的抗性研究提供前期理论基础。研究结果表明：1) NaCl处理转基因樱桃番茄突变体组培苗的过程中,盐的半致死浓度为150mmol/L。转基因樱桃番茄突变体组培苗耐盐的阈值大约在100mmol/L-200mmol/L。2)盐胁迫下,突变体组培苗SOD、POD、CAT、APX活性和脯氨酸含量随着NaCl浓度的增大呈先升高后降低的趋势。在盐浓度大于60mmol/L时,各抗氧化酶活性开始受到盐胁迫的影响。在100mmol/LNaCl浓度胁迫下,脯氨酸的积累量达到顶峰。相同盐浓度胁迫下,突变体组培苗各酶活性以及脯氨酸含量均高于非转基因樱桃番茄。3)随着NaCl浓度逐渐增大,突变体组培苗的H202含量、MDA含量、可溶性糖含量和电导率均随NaCl处理浓度的增大而大幅度增加。但在相同NaCl浓度胁迫下,突变体组培苗的H202含量、MDA含量和细胞膜渗透性均低于非转基因樱桃番茄。4)盐胁迫处理明显降低了各组培苗的叶绿素含量,总体上随着胁迫强度的加剧,叶绿素含量呈下降趋势。在同一盐浓度处理下,突变体组培苗的叶绿素a、b含量及总叶绿素含量均高于非转基因樱桃番茄组培苗,表明突变体的光合作用较强。以上结果表明,SOD和APX活性的变化、可溶性糖和脯氨酸的积累以及叶绿素含量的变化与转基因樱桃番茄突变体组培苗的耐盐性较强有关。5转基因樱桃番茄突变体发育过程中的形态结构变异基于转基因樱桃番茄突变体的倍性、生理生化特性以及抗性都发生明显的变化,本研究从胚胎学角度研究其变异特性。以相同培养条件下的非转化樱桃番茄和转基因樱桃番茄突变体叶片为试验材料进行愈伤诱导,通过石蜡切片技术和电子显微镜技术观察了其在外植体分化和愈伤发育过程中形态发生的变化特征。组织学分析表明,培养21d时,在突变体愈伤组织块的腋生部位出现不定芽原基,进而发育成不定芽。培养35d时,同时出现各种类型的胚状体。表明转基因樱桃番茄突变体在再生过程中,同时出现器官发生和体细胞胚发生两种途径,且以器官发生为主；非转基因樱桃番茄只通过一种形态发生途径即体细胞胚发生进行再生。进一步通过扫描电镜和透射电镜观察其细胞超微结构变化。结果表明,与非转基因樱桃番茄相比,突变体愈伤组织细胞在发育的各个阶段,一些细胞器的形态和数量（如高尔基体、线粒体、叶绿体等）有明显的变异。进一步证明转基因樱桃番茄突变体在形态建成和器官发育的过程中出现变异。该部分研究结果将于《电子显微学报》2011年vo1.30 No.2发表。6转基因樱桃番茄突变体发育过程中的生理生化变化生理生化变化是形态发生的基础。本研究以转基因樱桃番茄突变体叶片外植体器官发生和体细胞胚发生的诱导为基础进行组织培养,研究了突变体叶片再生过程中外植体抗氧化酶活性和某些生理参数（生长量、可溶性蛋白质含量、叶绿素含量、抗氧化酶活性以及IAA氧化酶活性等）的变化趋势。结果表明：樱桃番茄转基因突变体在器官发生和体细胞胚发生过程中抗氧化酶活性有明显的变化。在培养初期SOD活性逐渐增高,在培养21d时达到最大活性,此后其活性缓慢降低。POD活性在整个发育过程中呈下降趋势。CAT活性整体呈上升趋势,但变化幅度较小。IAAO（吲哚乙酸氧化酶）活性在培养42d前表现为缓慢的上升趋势,并在42d活性最高。表明SOD和POD活性与器官发生的早期事件密切相关。IAAO活性与芽的形成有关。突变体的愈伤增长率在培养21-28d时快速降低,在28d后又表现为快速的增长趋势。该现象的出现是由于突变体在愈伤分化期间,首先出现了器官发生方式所致。突变体愈伤组织的可溶性蛋白质含量在整个发育过程中变化趋势与非转基因樱桃番茄相似,但发生变化的时期不同。表明可溶性蛋白质含量与器官发生密切相关。该部分研究结果已被《核农学报》录用,将于2011 vol.25 No.3发表。综上所述,本研究成功地进行了HBsAg/adr基因在樱桃番茄中的表达,并获得一株转基因突变体。研究表明,该突变体的倍性、生理生化特性、抗性以及形态发生途径都发生了明显的变异。
徐成武[10]（2008）在《转基因植物中重组人表皮生长因子基因表达分析》文中研究表明人表皮生长因子（hEGF）是一种能促进细胞发生有丝分裂的强烈刺激物,作为上皮细胞的分裂原,可以促进上皮细胞增殖分化,从而加速损伤组织的再生和修复。转基因植物作为药用蛋白生物反应器的研究和开发能够以很低的费用大批量生产外源活性蛋白如动物疫苗、抗体、氨基酸等,可以为人类医学和生命科学研究提供诊断试剂和蛋白质药物,具有产生极大的应用价值和商业价值,成为近年来植物分子生物学研究的热点之一。转基因植物作为表达药用蛋白的反应器,与传统的生产方法相比,具有许多优点。本研究通过PCR鉴定植物表达载体pSH-hEGFS,利用农杆菌介导真空渗透法在叶用莴苣中瞬时表达,分析pSH-hEGFS的表达特征。通过农杆菌介导法将携带内质网滞留信号肽SEKDEL编码序列的重组人表皮生长因子基因（hEGF）导入烟草,分析转基因烟草中重组人表皮生长因子基因表达特征及产物表达量,hEGF基因表达对植株是否产生影响,为研制以转基因植物为生物反应器生产人表皮生长因子等药物奠定了基础。研究结果如下:1、利用农杆菌介导真空渗透法研究植物表达载体pSH-hEGFS（包含报告基因GUS）在叶用莴苣中的瞬时表达情况,结果表明在处理后第4—6天,比色法分析莴苣叶片中GUS蛋白活性可达最高值29.2U/g。2、采用农杆菌介导法,将pSH-hEGFS遗传转化烟草,经抗生素抗性筛选获得抗性植株,通过GUS组织化学染色分析、PCR检测以及RT-PCR分析,证明重组人表皮生长因子基因已整合到烟草基因组中并已表达,成功获得了含有hEGF基因的转基因烟草。3、利用间接法ELISA检测,结果表明转基因烟草中重组人表皮生长因子表达量最高达叶片总可溶蛋白的0.003%。4、通过对转基因烟草植物学性状如株型、叶型、茎叶角度、茎围、节距、花序及花色观测,发现与对照非转基因烟草相比,转基因烟草的这些表型基本没有发生变化,证明hEGF基因表达对植株未产生影响。
二、Expression of human hepatitis C virus core antigen in tobacco plants by tobacco mosaic virus-based vector system（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Expression of human hepatitis C virus core antigen in tobacco plants by tobacco mosaic virus-based vector system（论文提纲范文）
（1）核内含体蛋白b调控烟草脉带花叶病毒复制的分子机制（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 马铃薯Y病毒属病毒的危害及基因组结构 |
| 1.2 马铃薯Y病毒属病毒的复制 |
| 1.2.1 病毒的复制位点 |
| 1.2.2 病毒因子的作用 |
| 1.2.3 寄主因子的作用 |
| 1.3 核内含体蛋白b(NIb)的结构和功能 |
| 1.3.1 NIb结构 |
| 1.3.2 NIb在 VRC中参与病毒复制 |
| 1.3.3 NIb和寄主因子互作 |
| 1.3.4 NIb和类泛素化修饰 |
| 1.3.5 NIb和自噬 |
| 1.3.6 NIb和致病性 |
| 1.4 本论文相关的寄主因子在病毒侵染中的作用 |
| 1.4.1 核糖体蛋白参与病毒侵染 |
| 1.4.2 膜联蛋白参与病毒侵染 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物 |
| 2.1.2 菌株与质粒 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 载体构建 |
| 2.3.1 PVY侵染性克隆构建 |
| 2.3.2 瞬时表达载体构建 |
| 2.3.3 原核表达载体构建 |
| 2.3.4 酵母表达载体构建 |
| 2.3.5 病毒诱导的基因沉默载体构建 |
| 2.3.6 质粒定点突变 |
| 2.4 植物总RNA提取和RT-PCR |
| 2.5 病毒接种和瞬时表达 |
| 2.5.1 病毒接种 |
| 2.5.2 瞬时表达 |
| 2.6 蛋白提取和免疫印迹 |
| 2.7 酶联免疫吸附测定法 |
| 2.8 荧光定量PCR |
| 2.9 免疫共沉淀 |
| 2.10 Pull down |
| 2.11 酵母双杂交 |
| 2.12 亚细胞定位和双分子荧光互补 |
| 2.13 叶脉坏死染色 |
| 2.14 病毒诱导的基因沉默 |
| 2.15 双荧光素酶活性实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 NbRPL1和NbBeclin1 调控TVBMV复制 |
| 3.1.1 NbRPL1和NIb互作 |
| 3.1.2 叶绿体转运肽调控NbRPL1和NIb/NbRPL1 互作复合体靶向叶绿体 |
| 3.1.3 TVBMV招募NbRPL1 到病毒复制复合体 |
| 3.1.4 NbRPL1 沉默减慢了TVBMV的侵染 |
| 3.1.5 NbRPL1 过表达促进TVBMV NIb和 RNA的积累 |
| 3.1.6 NbRPL1 干扰NbBeclin1对NIb的结合和降解 |
| 3.2 NbANXD1 协同NbATPase调控TVBMV侵染 |
| 3.2.1 NbANXD1与TVBMV NIb相互作用 |
| 3.2.2 NIb与 NbANXD1 的互作区域 |
| 3.2.3 NbANXD1在VRC附近积累 |
| 3.2.4 沉默NbANXD1 减少了TVBMV和 PVY的积累 |
| 3.2.5 NbATPase和 NbANXD1 互作 |
| 3.2.6 沉默NbATPase减慢了TVBMV侵染 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NbRPL1和NbBeclin1 调控TVBMV复制 |
| 4.1.1 NbRPL1被TVBMV挟持到VRC中参与病毒复制 |
| 4.1.2 核糖体蛋白是马铃薯Y病毒属病毒侵染的关键寄主因子 |
| 4.1.3 NbRPL1和NbBeclin1 调控TVBMV NIb的降解 |
| 4.1.4 叶绿体转运肽调控病毒侵染 |
| 4.2 NbANXD1和ATPase协同调控TVBMV侵染 |
| 4.2.1 膜联蛋白调控病毒侵染 |
| 4.2.2 寄主ATPase调控病毒的侵染 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 7.1 PVY SYR-I型分离物全长侵染性克隆的构建和应用 |
| 7.1.1 前言 |
| 7.1.2 结果 |
| 7.1.3 讨论 |
| 7.1.4 结论 |
| 7.2 引物 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）ToCV检测方法建立、侵染性克隆构建及与植物蛋白互作分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 番茄褪绿病毒 |
| 1.1.1 病毒简介 |
| 1.1.2 番茄褪绿病毒主要基因及其功能简介 |
| 1.1.3 番茄褪绿病毒检测技术 |
| 1.1.4 番茄褪绿病毒病主要防控技术 |
| 1.2 细胞自噬 |
| 1.2.1 细胞自噬的形式及过程 |
| 1.2.2 细胞自噬的分子机制 |
| 1.2.3 细胞自噬的研究方法 |
| 1.2.4 细胞自噬在抗病毒反应中的作用 |
| 1.2.5 细胞自噬防御病毒侵染的机制 |
| 1.2.6 病毒逃避被细胞自噬降解的分子机制 |
| 1.3 构建植物病毒侵染性克隆的方法及意义 |
| 1.3.1 侵染性克隆的种类及特点 |
| 1.3.2 构建侵染性克隆的方法 |
| 1.3.3 侵染性克隆在植物病毒研究中的应用 |
| 1.4 酵母双杂交技术原理以及在植物病毒研究中的应用 |
| 1.4.1 酵母双杂交的原理 |
| 1.4.2 酵母双杂交技术的优劣 |
| 1.4.3 酵母双杂交系统在植物病毒研究中的应用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 番茄褪绿病毒CP及 HSP70 蛋白多克隆抗体制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 Trizol提取番茄叶片总RNA |
| 2.1.3 RT-PCR扩增目的片段 |
| 2.1.4 大肠杆菌DH5α及 BL21 感受态的制备 |
| 2.1.5 原核表达载体构建 |
| 2.1.6 CP及 HSP70 蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.1.7 SDS-PAGE电泳 |
| 2.1.8 CP蛋白及HSP70 蛋白多克隆抗体制备及检测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 番茄褪绿病毒CP及 HSP70 基因的扩增 |
| 2.2.2 目的基因连接克隆载体并测序 |
| 2.2.3 目的片段连接原核表达载体 |
| 2.2.4 阳性克隆的PCR鉴定 |
| 2.2.5 CP及 HSP70 蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.2.6 CP多克隆抗体检测 |
| 2.2.7 HSP70 多克隆抗体检测 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 番茄褪绿病毒c DNA侵染性克隆构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 番茄褪绿病毒全基因组扩增 |
| 3.1.3 同源重组构建侵染性克隆 |
| 3.1.4 ToCV全基因组融合植物表达载体pCB-301-CH策略 |
| 3.1.5 利用农杆菌接种番茄褪绿病毒侵染性克隆 |
| 3.1.6 番茄褪绿病毒侵染性克隆接种BY2 细胞 |
| 3.1.7 利用基因枪接种本氏烟及番茄 |
| 3.1.8 dot-ELISA检测番茄褪绿病毒 |
| 3.1.9 RT-PCR检测番茄褪绿病毒 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 番茄褪绿病毒基因组全长扩增 |
| 3.2.2 获得的番茄褪绿病毒基因组片段连接克隆载体 |
| 3.2.3 植物表达载体和目的片段线性化 |
| 3.2.4 同源重组融合RNA11-4kb及 RNA21-4kb至载体 |
| 3.2.5 pCB-RNA1 1-4 kbp、pCB-RNA2 1-4 kbp质粒线性化及 RNA1 4-8 kbp、RNA2 4-8 kbp 片段扩增 |
| 3.2.6 番茄褪绿病毒侵染性克隆载体构建 |
| 3.2.7 农杆菌接种番茄褪绿病毒侵染性克隆 |
| 3.2.8 番茄褪绿病毒侵染性克隆接种BY2 细胞 |
| 3.2.9 基因枪接种番茄褪绿病毒侵染性克隆 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 番茄褪绿病毒激活番茄自噬体途径促进病毒复制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 MDC染色观察叶片中自噬小泡数量 |
| 4.1.3 Western Blotting检测LC3II/I蛋白的含量 |
| 4.1.4 细胞自噬激活/抑制剂处理番茄后对叶片中ToCV病毒含量的影响 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 MDC染色观察BY2 细胞及番茄叶片中自噬小泡数量 |
| 4.2.2 Western Blotting检测LC3II/LC3I蛋白含量 |
| 4.2.3 细胞自噬体途径对ToCV病毒复制的影响 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 番茄褪绿病毒衣壳蛋白CP/CPm与自噬蛋白互作 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 番茄接种番茄褪绿病毒的发病时间及病毒在寄主中的扩散趋势 |
| 5.1.3 番茄感染番茄褪绿病毒后ATG相关基因的荧光定量分析 |
| 5.1.4 同源重组构建番茄褪绿病毒CP、CPm及番茄ATG蛋白酵母表达载体 |
| 5.1.5 酵母双杂交实验 |
| 5.1.6 CP及 CPm蛋白互作结构域筛选 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 番茄褪绿病毒在寄主中的扩散趋势 |
| 5.2.2 自噬相关基因表达量分析 |
| 5.2.3 无缝克隆技术构建酵母表达载体 |
| 5.2.4 酵母双杂技术筛选与CP或 CPm互作的寄主靶标蛋白 |
| 5.2.5 CP或 CPm与寄主蛋白的互作结构域筛选 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附录 B 主要试剂的配方 |
| 致谢 |
（3）Ⅰ型启动子及其终止序列对植物病毒载体系统表达效率的影响分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 植物RNA病毒载体表达系统 |
| 1.2 启动子、终止子与RNA病毒表达载体 |
| 1.3 TBSV病毒表达载体 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验中病毒表达载体的构建 |
| 2.2.1 Ⅰ型启动子顺式调控序列系列病毒表达载体的构建 |
| 2.2.2 Ⅰ型启动子转录特性系列病毒表达载体的构建 |
| 2.2.3 Ⅰ型终止子系列病毒表达载体的构建 |
| 2.3 重组质粒的农杆菌转化(冻融法)及筛选鉴定 |
| 2.4 农杆菌渗滤(Agro-infiltration)接种本氏烟 |
| 2.5 本氏烟叶片接种部位GFP荧光检测 |
| 2.6 叶片可溶性总蛋白(Total soluble proteins,TSPs)的提取 |
| 2.7 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.8 Western Blots检测 |
| 2.9 本氏烟叶片中GFP表达量测定 |
| 2.10 本氏烟叶片总RNA提取和RT-PCR检测 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Ⅰ型启动子顺式调控序列对病毒载体的影响研究 |
| 3.1.1 启动子长度对病毒载体的影响 |
| 3.1.2 T串及转录起始位点核苷酸种类对病毒载体的影响 |
| 3.1.3 转录起始位点下游延伸序列对病毒载体的影响 |
| 3.1.4 ELS序列(Enhancer-like sequence)对病毒载体的影响 |
| 3.2 Ⅰ型启动子转录特性对病毒载体的影响研究 |
| 3.2.1 Ⅰ型启动子转录专一性及转录强度比较 |
| 3.2.2 ELS和转录起始位点下游序列对Ⅰ型启动子转录专一性影响 |
| 3.2.3 突变Ⅰ型启动子核心序列对其转录专一性的影响 |
| 3.3 Ⅰ型终止子对病毒载体的影响 |
| 3.3.1 不同来源Ⅰ型终止子对病毒载体的影响 |
| 3.3.2 Ⅰ型终止子对Ⅰ型启动子转录专一性的影响 |
| 3.3.3 载体3'末端旁侧序列对病毒载体表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 植物RNA病毒载体表达系统的生物安全性问题 |
| 4.2 植物Ⅰ型启动子结构特点与转录特性 |
| 4.3 病毒3'末端的自我修复与病毒表达载体的构建 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）烟草花叶病毒瞬时表达系统在医药蛋白生产中的应用（论文提纲范文）
| 1 TMV-TES的发展简介 |
| 2 TMV-TES技术在医药蛋白生产中的应用 |
| 2.1 在疫苗中的作用 |
| 2.2 抗体在抗体中的应用 |
| 2.3 在其它医药蛋白中的应用 |
| 3 存在的问题及展望 |
| 作者贡献 |
（5）玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白的细胞核定位及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 概述 |
| 1.1 玉米褪绿斑驳病毒概述 |
| 1.1.1 玉米褪绿斑驳病毒 |
| 1.1.2 玉米褪绿斑驳病毒基因组结构 |
| 1.1.3 玉米褪绿斑驳病毒生物学特性 |
| 1.1.4 玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白的研究 |
| 1.2 部分番茄丛矮病毒科病毒编码的外壳蛋白功能研究概述 |
| 1.2.1 外壳蛋白参与病毒的粒子组装、系统移动及症状形成 |
| 1.2.2 外壳蛋白具有沉默抑制子的功能 |
| 1.2.3 外壳蛋白引起HR反应 |
| 1.3 细胞核定位的研究概述 |
| 1.3.1 核定位信号及相应的蛋白进核途径的研究 |
| 1.3.2 importin α/β途径中的能量代谢 |
| 1.3.3 importin α蛋白的研究进展 |
| 1.4 细胞核在RNA病毒侵染过程中的功能概述 |
| 1.4.1 动物RNA病毒对细胞核结构及细胞核蛋白的影响 |
| 1.4.2 细胞核在植物RNA病毒侵染中的功能 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒、菌种和植物材料 |
| 2.1.2 载体、引物及测序 |
| 2.1.3 酶及生化试剂 |
| 2.2 常用溶液、试剂及培养基配置 |
| 2.3 基本实验方法 |
| 2.3.1 PCR |
| 2.3.2 PCR切胶回收/PCR产物直接回收 |
| 2.3.3 酶切、连接及转化 |
| 2.3.4 质粒提取 |
| 2.3.5 阳性克隆验证 |
| 2.3.6 植物总RNA提取、去DNA、反转录及qRT-PCR |
| 2.3.7 酵母感受态的制备及转化 |
| 2.3.8 玉米原生质体的分离及转化 |
| 2.3.9 病毒接种 |
| 2.3.10 用Nano~(TM)Drop测量核酸的浓度 |
| 第三章 MCMV CP的细胞核定位 |
| 3.1 在烟草表皮细胞中MCMV CP定位于细胞核并在核仁中积累 |
| 3.1.1 瞬时表达载体的构建 |
| 3.1.2 农杆菌制备及烟草表皮细胞浸润 |
| 3.1.3 MCMV CP定位于烟草表皮细胞的细胞核中并在核仁中积累 |
| 3.2 在玉米原生质体中MCMV CP进入细胞核中 |
| 3.2.1 载体构建 |
| 3.2.2 MCMV CP在玉米原生质体中定位于细胞质和细胞核 |
| 3.2.3 MCMV CP在酵母中可以自身互作 |
| 3.2.4 MCMV CP在玉米原生质体中自身互作并在细胞核中聚集 |
| 3.3 MCMV CP的N端影响其细胞核定位 |
| 3.3.1 软件预测MCMV CP的定位信号 |
| 3.3.2 突变体构建 |
| 3.3.3 MCMV CP的N端碱性氨基酸序列是其核定位所必须的 |
| 3.4 MCMV CP的N端碱性氨基酸影响其自身互作 |
| 3.4.1 载体构建 |
| 3.4.2 酵母中检测N端碱性氨基酸对MCMV CP自身互作的影响 |
| 3.5 结论与讨论 |
| 第四章 MCMV CP与ZmIMPα1a/ZmIMPα1b的相互作用 |
| 4.1 ZmIMPα基因的克隆 |
| 4.1.1 ZmIMPα基因的克隆 |
| 4.1.2 ZmIMPα基因的序列比对 |
| 4.2 BiFC验证MCMV CP与ZmIMPα的相互作用 |
| 4.2.1 载体构建 |
| 4.2.2 BiFC验证MCMV CP与ZmIMPα1a/ZmIMPα1b的相互作用 |
| 4.2.3 BiFC验证MCMV CP与ZmIMPα2的相互作用 |
| 4.3 MCMV CP的N端在与ZmIMPα1互作中的重要性 |
| 4.3.1 载体构建 |
| 4.3.2 BiFC验证MCMV CP突变体与ZmIMPα1的相互作用 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 第五章 ZmIMPα1a和ZmIMPα1b参与MCMV侵染 |
| 5.1 importin α进化树分析 |
| 5.2 病毒侵染后ZmIMPα1a/ZmIMPα1b的表达情况 |
| 5.2.1 实验材料的准备 |
| 5.2.2 qRT-PCR引物设计及引物特异性检测 |
| 5.2.3 ZmIMPα1a和ZmIMPα1b在病毒侵染后的表达情况 |
| 5.2.4 ZmIMPα2在病毒侵染后的表达情况 |
| 5.3 玉米植株中沉默ZmIMPα1α和ZmIMPα1b影响MCMV侵染 |
| 5.3.1 载体构建 |
| 5.3.2 浸润接种烟草 |
| 5.3.3 BMV病毒粒子接种玉米后挑战接种MCMV |
| 5.3.4 BMV沉默效果的检测 |
| 5.3.5 瞬时沉默ZmIMPα1a和ZmIMPα1b影响MCMV的积累 |
| 5.4 结论与讨论 |
| 第六章 MCMV CP的功能解析 |
| 6.1 总RNA的提取及mRNA的分离 |
| 6.1.1 玉米材料的准备 |
| 6.1.2 玉米总RNA的提取 |
| 6.1.3 mRNA的分离 |
| 6.2 第一链cDNA的合成及dsDNA的合成 |
| 6.2.1 cDNA第一链的合成 |
| 6.2.2 dsDNA的合成 |
| 6.2.3 去除dsDNA的小片段 |
| 6.3 均一化处理并检测 |
| 6.3.1 cDNA准备 |
| 6.3.2 变性及杂交 |
| 6.3.3 DSN处理 |
| 6.3.4 第一次PCR扩增 |
| 6.3.5 DSN均一化效果的qRT-PCR检测 |
| 6.3.6 第二次PCR扩增 |
| 6.4 构建酵母双杂交cDNA文库及文库质量检测 |
| 6.4.1 构建酵母双杂交cDNA文库 |
| 6.4.2 文库质量检测 |
| 6.5 酵母双杂交文库的筛选 |
| 6.5.1 转录自激活和蛋白毒性的检验 |
| 6.5.2 文库筛选 |
| 6.5.3 阳性克隆测序及生物信息学分析 |
| 6.5.4 阳性克隆的确定 |
| 6.6 探索CP是否具有转录调节功能 |
| 6.6.1 系统构建 |
| 6.6.2 蛋白提取及荧光素酶报告基因测量 |
| 6.6.3 数据分析 |
| 6.7 结论与讨论 |
| 6.7.1 构建高质量的均一化酵母双杂交玉米cDNA文库 |
| 6.7.2 阳性克隆的分析 |
| 6.7.3 荧光素酶报告系统 |
| 6.7.4 MCMV CP转录激活活性的分析 |
| 结论与展望 |
| 1. 主要结果与结论 |
| 2. 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附表一 引物列表 |
| 附录二 正向遗传学筛选抗黄瓜花叶病毒的抗性基因 |
| 附录三 玉米褪绿斑驳病毒P32的功能研究 |
| 个人简介 |
（6）利用植物叶绿体表达重组药用蛋白和疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 植物叶绿体表达系统的特点 |
| 2 重组药物蛋白在植物叶绿体中的表达 |
| 3重组疫苗在植物叶绿体中的表达 |
| 4植物叶绿体表达重组药用蛋白和疫苗的几个问题 |
| 4.1宿主选择 |
| 4.2翻译后加工 |
| 4.3叶绿体表达重组药用蛋白的功能 |
| 4.4重组疫苗的口服 |
| 4.5安全性问题 |
| 5 展望 |
（7）叶绿体转化及其用于疫苗表达研究的最新进展（论文提纲范文）
| 1 叶绿体遗传转化技术概述 |
| 1.1 叶绿体遗传转化的原理 |
| 1.2 叶绿体遗传转化的方法 |
| 1.3 叶绿体遗传转化的优势 |
| 2 叶绿体遗传转化技术用于疫苗表达的研究进展 |
| 2.1 疫苗抗原的高效表达 |
| 2.2 生产疫苗抗原的物种扩展 |
| 2.3 叶绿体遗传转化表达的疫苗抗原 |
| 2.3.1 病毒抗原 |
| 2.3.2 细菌抗原 |
| 3 叶绿体遗传转化技术表达外源蛋白存在的问题与挑战 |
| 3.1 多效性 |
| 3.2 诱导表达系统 |
| 3.3 其它 |
| 4 小结 |
| 作者贡献 |
| 致谢 |
（8）口服SARS候选亚基疫苗S-RBD在烟草叶绿体中的表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物叶绿体表达系统 |
| 1.1.1 叶绿体转基因技术的原理 |
| 1.1.2 叶绿体表达系统的优势 |
| 1.1.3 叶绿体基因组的转化方法 |
| 1.2 利用植物表达系统生产重组药用蛋白和疫苗研究进展 |
| 1.2.1 生产重组药用蛋白方面 |
| 1.2.2 生产重组疫苗抗原方面 |
| 1.3 利用叶绿体表达重组疫苗时需要考虑的问题 |
| 1.3.1 宿主选择 |
| 1.3.2 翻译后加工 |
| 1.3.3 叶绿体表达重组药用蛋白的功能 |
| 1.3.4 重组疫苗的口服 |
| 1.3.5 安全性问题 |
| 1.4 SARS 候选亚基疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 SARS病原的发现 |
| 1.4.2 SARS-CoV生物学特征 |
| 1.4.3 SARS疫苗的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 1.6 本研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 研究技术路线 |
| 第二章 SARS 候选亚基疫苗 RBD 在烟草叶绿体中表达研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种及质粒 |
| 2.1.3 主要分子生物学试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 S-RBD序列优化 |
| 2.2.2 植物表达载体pLD-CTB-mRBD载体的构建 |
| 2.2.3 烟草叶绿体遗传转化体系的建立 |
| 2.2.4 阳性植株检测 |
| 2.2.5 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 植物表达载体 pLD-CTB-mRBD 构建 |
| 3.1.1 mRBD 基因的优化 |
| 3.1.2 表达载体 pLD-CTB-mRBD 构建 |
| 3.2 烟草叶绿体遗传转化体系的建立 |
| 3.2.1 烟草无菌苗的获得 |
| 3.3 基因枪介导法对烟草的遗传转化 |
| 3.3.1 基因枪轰击转化 |
| 3.3.2 多轮筛选及转化植株再生 |
| 3.4 转基因植株检测 |
| 3.4.1 PCR 检测 |
| 3.4.2 Southern 杂交 |
| 3.5 SDS-PAGE 蛋白电泳 |
| 第四章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
| 后记 |
（9）樱桃番茄的HBsAg基因转化及其突变体特性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 乙肝表面抗原基因在樱桃番茄中的转化及其表达 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 乙肝病毒表面抗原(HBsAg)在转基因植物中的表达研究进展 |
| 1 引言 |
| 2 乙肝表面抗原(HBsAg)基因的分子生物学及其功能 |
| 3 目标基因和表达载体的选择 |
| 3.1 目标基因的选择 |
| 3.2 表达载体的选择 |
| 4 HBsAg转基因植物表达体系 |
| 4.1 HBsAg基因在转基因植物中的稳定表达 |
| 4.2 HBsAg基因在转基因植物中的暂态表达 |
| 5 HBsAg在转基因植物中的表达水平 |
| 6 其它乙肝抗原在转基因植物中的表达 |
| 7 基于植物的HBsAg免疫原性研究和临床试验 |
| 8 当前存在问题和展望 |
| 第二节 本研究目的和意义 |
| 第二章 植物表达载体的构建与樱桃番茄的转化 |
| 1 试验材料和试验试剂 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 基本培养基 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 植物表达载体的构建 |
| 2.2 根癌农杆菌LBA4404感受态制备 |
| 2.3 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的转化 |
| 2.4 根癌农杆菌质粒的提取和鉴定 |
| 2.5 樱桃番茄无菌苗的获得 |
| 2.6 樱桃番茄外植体的转化 |
| 2.7 转化植株的DNA提取和PCR鉴定 |
| 2.8 转化植株的Southern杂交 |
| 2.9 ELISA检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 根癌农杆菌质粒pCAMBIA1301/HB的构建和转化 |
| 3.2 转化植株的PCR鉴定和Southern杂交检测 |
| 3.3 ELISA分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二篇 HBsAg转基因樱桃番茄突变体特性研究 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 番茄突变体研究进展 |
| 1 植物突变体来源途径 |
| 1.1 自然突变 |
| 1.2 人工诱变 |
| 1.3 插入突变 |
| 2 番茄突变体研究进展 |
| 2.1 自然突变在番茄突变体研究中的应用 |
| 2.2 物理诱变和化学诱变在番茄突变体研究中的应用 |
| 2.3 插入突变在番茄突变体研究中的应用 |
| 第二节 植物组织培养与形态发生 |
| 1 植物组织培养形态发生的基本理论 |
| 2 形态发生的遗传学理论 |
| 2.1 体细胞胚发生的遗传学理论 |
| 2.2 芽器官发生的遗传学理论 |
| 2.3 根器官发生的遗传学理论 |
| 2.4 花器官发生的遗传学理论 |
| 3 植物组织培养的技术创新 |
| 3.1 气态或物理环境的操作 |
| 3.2 薄细胞层和合成种子技术 |
| 4 结论和展望 |
| 第三节 盐胁迫下植物抗性机制研究进展 |
| 1 植物对盐胁迫的反应 |
| 1.1 盐胁迫对植物形态的影响 |
| 1.2 盐胁迫对植物生理生化特性的影响 |
| 2 利用组织培养研究植物耐盐机理与筛选耐盐突变体 |
| 3 利用基因转化研究植物抗盐性 |
| 4 耐盐突变体鉴定 |
| 5 番茄耐盐性研究进展 |
| 5.1 番茄耐盐生理研究 |
| 5.2 转基因耐盐番茄的研究进展 |
| 第四节 本研究目的和意义 |
| 第二章 温室栽培转基因樱桃番茄突变体生理生化特性研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验试剂和仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 温室栽培转基因樱桃番茄突变体的PCR鉴定 |
| 2.2 温室栽培转基因樱桃番茄突变体的倍性分析 |
| 2.3 温室栽培转基因樱桃番茄突变体的生理生化特性 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 转基因樱桃番茄突变体愈伤组织对盐胁迫的生理响应 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验试剂和仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 盐胁迫对转基因樱桃番茄突变体愈伤组织生长的影响 |
| 2.2 不同浓度NaCl胁迫对转基因樱桃番茄突变体愈伤组织抗氧化酶活性的影响 |
| 2.3 不同浓度NaCl胁迫对转基因樱桃番茄突变体愈伤组织某些生理参数的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 转基因樱桃番茄突变体组培苗对盐胁迫的生理响应 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验试剂和仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 盐胁迫对转基因樱桃番茄突变体组培苗生长的影响 |
| 2.2 不同浓度NaCl胁迫对转基因樱桃番茄突变体组培苗抗氧化酶活性的影响 |
| 2.3 不同浓度NaCl胁迫对转基因樱桃番茄突变体组培苗某些生理参数的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五章 转基因樱桃番茄突变体发育过程中的形态结构变异 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验试剂和仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因樱桃番茄突变体形态发生过程中的显微结构变化 |
| 2.2 转基因樱桃番茄突变体形态发生过程中的超微结构变化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第六章 转基因樱桃番茄突变体发育过程中的生理生化变化 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验试剂和仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因樱桃番茄突变体在器官发生和体细胞胚发生过程中抗氧化酶活性的变化 |
| 2.2 转基因樱桃番茄突变体在器官发生和体细胞胚发生过程中某些生理参数的变化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三篇 全文总结 |
| 第一节 本研究创新点 |
| 第二节 本研究结论 |
| 第三节 下一步研究工作 |
| 参考文献 |
| 图版说明 |
| Explanation of plates |
| 图版 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 攻读博士学位期间参与的主要科研项目 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）转基因植物中重组人表皮生长因子基因表达分析（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 表皮生长因子研究进展 |
| 1.1 表皮生长因子的来源 |
| 1.2 表皮生长因子的分子结构特征 |
| 1.3 表皮生长因子的生物学活性及作用机制 |
| 1.4 表皮生长因子的应用及价值 |
| 2 转基因植物作为药用蛋白生物反应器研究进展 |
| 2.1 转基因植物表达外源蛋白的主要方法 |
| 2.2 转基因植物表达外源生物活性蛋白 |
| 2.3 转基因植物作为药用蛋白生物反应器的问题与解决方法 |
| 2.4 转基因植物表达人表皮生长因子研究分析与展望 |
| 第二部分 转基因烟草中重组人表皮生长因子基因表达分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 主要生物化学试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 常用培养基 |
| 1.6 常用溶液 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 植物表达载体pSH—hEGFS鉴定 |
| 2.2 植物瞬时表达分析 |
| 2.3 烟草遗传转化 |
| 2.4 再生植株的检测 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 植物表达载体pSH—hEGFS鉴定 |
| 3.2 植物瞬时表达分析 |
| 3.3 烟草遗传转化及抗性植株的获得 |
| 3.4 抗性植株的GUS组织化学染色 |
| 3.5 抗性植株的PCR检测 |
| 3.6 转基因植株的RT-PCR检测 |
| 3.7 ELISA间接法检测转基因植株中重组人表皮生长因子表达量 |
| 3.8 转基因烟草植物学性状观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组人表皮生长因子基因表达分析 |
| 4.2 瞬时表达系统 |
| 4.3 重组蛋白亚细胞定位 |
| 4.4 间接法ELISA检测中的问题 |
| 参考文献 |
| 图版 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、Expression of human hepatitis C virus core antigen in tobacco plants by tobacco mosaic virus-based vector system（论文参考文献）
- [1]核内含体蛋白b调控烟草脉带花叶病毒复制的分子机制[D]. 程德杰. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]ToCV检测方法建立、侵染性克隆构建及与植物蛋白互作分析[D]. 张宇. 湖南大学, 2019(01)
- [3]Ⅰ型启动子及其终止序列对植物病毒载体系统表达效率的影响分析[D]. 徐丽. 宁夏大学, 2019(02)
- [4]烟草花叶病毒瞬时表达系统在医药蛋白生产中的应用[J]. 黄爽,范杰英,韦正乙,邢少辰. 分子植物育种, 2019(21)
- [5]玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白的细胞核定位及功能研究[D]. 战斌慧. 中国农业大学, 2016(04)
- [6]利用植物叶绿体表达重组药用蛋白和疫苗研究进展[J]. 钟雪,齐广勋,康岭生,刘剑锋,杨向东. 农业生物技术学报, 2012(09)
- [7]叶绿体转化及其用于疫苗表达研究的最新进展[J]. 巩智刚,徐芳,周海鹏,王雯雯,王玉华. 基因组学与应用生物学, 2012(03)
- [8]口服SARS候选亚基疫苗S-RBD在烟草叶绿体中的表达研究[D]. 钟雪. 吉林师范大学, 2012(03)
- [9]樱桃番茄的HBsAg基因转化及其突变体特性研究[D]. 关正君. 西北大学, 2011(08)
- [10]转基因植物中重组人表皮生长因子基因表达分析[D]. 徐成武. 贵州大学, 2008(03)