一、痘苗病毒天坛株非必需区与病毒生物学性状的关系（论文文献综述）
杜倩[1]（2020）在《山羊痘病毒N1蛋白生物学功能及其机制初步探究》文中提出羊痘是当前危害最为严重的家畜痘病毒病,可感染山羊、绵羊等家畜,患病动物可出现发热、全身性起痘、呼吸道和消化道损伤及淋巴结肿大,造成孕羊流产,死亡率极高,给全球养羊行业带来了巨大的经济损失。为解决这一难题,迫切需要加强对羊痘病毒感染致病机制的研究。本课题以痘苗病毒天坛株（VTT）为载体研究山羊痘病毒（GTPV）N1（gN1）蛋白的生物学功能,探究山羊痘致病机制。具体试验内容如下:1、利用噬斑纯化法对课题组已制备的3株重组病毒VTTΔN1L（删除vN1L基因的重组病毒）、VTTN1Lrev（N1L基因删除后再拯救的重组病毒,vN1L基因）、VTTgN1L（GTPV N1L基因替换vN1L基因的重组病毒）进行筛选、纯化,并利用普通PCR和荧光定量PCR对重组病毒进行目的基因及纯度验证。2、将克隆纯化的重组病毒及亲本毒株接种于BHK-21、MDCK、Hela、PK-15细胞,分析病毒的遗传稳定性、宿主范围、复制能力以及毒力的差异。3、将重组病毒和亲本毒株颅内接种小鼠,通过小鼠临床表现和死亡情况观察、脑组织病理学检测,分析病毒在不同组织器官分布情况,以及小鼠各组织器官中炎症因子、Th1类、Th2类因子转录水平,评价3株重组病毒致病力的差异。4、对小鼠脑组织进行转录组测序,并对测序数据进行生物信息学分析,筛选小鼠脑组织出现的差异表达基因,随后对这些差异表达基因进行功能注释,分析vN1L和gN1L基因的可能作用机制。5、构建重组质粒pEGFP-gN1L,并将其转染至BHK-21细胞,探究gN1蛋白的亚细胞定位。结果显示:1、经6-8代噬斑挑选后获得了纯化的重组病毒VTTgN1L、VTTN1Lrev、VTTΔN1L。2、3株重组病毒均可在BHK-21细胞中稳定遗传30代以上,且宿主范围无明显差异;VTTgN1L在BHK-21、MDCK、Hela、PK-15细胞中的复制速度最快,其次分别为VTTΔN1L、VTTN1Lrev和VTT,进一步证实vN1L基因是病毒复制非必需基因。3、亲本毒株和重组病毒接种于小鼠后,除VTTΔN1L组外其余3组小鼠均出现食欲不振、被毛粗乱、聚堆发抖等现象,死亡率及半数致死量结果显示,VTTgN1L毒力最强,其次是VTTN1Lrev、VTT,VTTΔN1L毒力最小;从病理损伤来看VTTgN1L脑组织损害最为严重,最小的是VTTΔN1L;4株病毒均可透过血脑屏障,但VTTgN1L可感染除脑以外的心、肝、脾、肺等脏器,VTTN1Lrev和VTT分别可感染脑、肝和肺或脾等器官,VTTΔN1L只可感染脑和肺等器官,从而说明gN1可替代vN1蛋白的作用且致病力高于vN1蛋白,缺失vN1L基因后可以显着降低病毒的侵袭力;荧光定量检测各类细胞因子结果显示,VTTΔN1L诱导小鼠促炎因子TNF-α和IL-1β的表达量高于VTTgN1L、VTTN1Lrev、VTT,VTTgN1L、VTTN1Lrev病毒诱导小鼠抗炎因子IL-10的表达量显着高于VTTΔN1L病毒组,说明gN1和vN1蛋白具有抗炎症作用。4、转录组分析结果显示,VTTgN1L、VTTΔN1L、VTTN1Lrev比较对照组VTT共有421个差异表达基因,其中上调表达基因282个,下调表达基因139个。VTTgN1L病毒组小鼠与VTT病毒组小鼠相比鉴定出174个差异表达基因,其中下调表达基因59个,上调表达基因115个;VTTN1Lrev病毒组小鼠与VTT病毒组小鼠相比鉴定出86个差异表达基因,其中下调表达基因30个,上调表达基因56个;VTTΔN1L病毒组小鼠与VTT病毒组小鼠相比鉴定出161个差异表达基因,其中下调表达基因50个,上调表达基因111个。VTTΔN1L vs VTT鉴别出炎症相关基因0个,免疫相关基因5个,凋亡相关基因3个;VTTgN1L vs VTT鉴别出炎症相关基因1个,免疫相关基因8个,凋亡相关基因6个;VTTN1Lrev vs VTT鉴别出炎症相关基因1个,免疫相关基因2个,凋亡相关基因4个;VTTgN1L vs VTTN1Lrev鉴别出炎症相关基因0个,免疫相关基因2个,凋亡相关基因5个。5、亚细胞定位结果显示:gN1蛋白在细胞质中表达。结论:vN1L基因既是病毒复制非必需基因也是毒力基因,在致病性方面gN1蛋白可以替代vN1蛋白的作用且致病力强于vN1,缺失vN1L基因VTT病毒致病性显着减弱;gN1L和vN1L基因均具有抗炎症和抗凋亡作用并且作用机制相似;gN1和vN1蛋白也具有抗炎症作用;gN1蛋白在胞浆中表达,说明不作为遗传物质影响宿主功能。
邱冉[2]（2020）在《基于痘病毒天坛株的H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的构建及其免疫原性分析》文中指出流感病毒（Influenza virus）是流行性感冒病毒的简称,属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）,分为甲（A）、乙（B）、丙（C）、丁（D）四型,可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病。禽流感（Avian influenza）就是一种由甲型流感病毒引起的传染病,这种传染病不仅可在鸟类、禽类中快速传播,还可感染人类。H5N1亚型属于高致病性禽流感病毒,在1997年首次被发现可以感染人类,截至目前,已经有近千例H5N1感染患者,且死亡率高达50%以上,给人类健康和社会经济带来了巨大的影响和损失。流感疫苗是当今社会对于流感防控最经济、最有效的手段。但是如今市场上销售的流感疫苗主要是以鸡胚基质为主的流感病毒灭活疫苗,传统鸡胚工艺具有很强的局限性,尤其当流感爆发甚至形成大流行时,鸡胚生产周期长,鸡胚的供给不足会成为限制疫苗大量生产的主要因素。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）是含有病毒结构蛋白的空心颗粒,不含病毒基因组,具有更高的安全性,且与全病毒疫苗颗粒结构相似,可以诱发机体较强的免疫作用,并且病毒样颗粒主要通过体外细胞表达,不依赖于鸡胚的生产系统。痘病毒天坛株是上世纪中国用于预防天花的疫苗株,同时也非常适合作为外源蛋白的表达载体。它基因组巨大,非必需基因多,可容纳较长的外源基因片段;宿主范围广泛,可在多种不同细胞系内扩增;安全性高,有长期的人体应用历史。本研究的目的是以痘病毒天坛株为表达载体,在Vero细胞内表达H5N1亚型禽流感VLPs,并通过免疫小鼠对其免疫原性进行分析。首先设计并构建了含H5N1病毒HA、NA基因的重组痘病毒穿梭质粒pSCCK-HA/NA,利用pSCCK-HA/NA转染预先感染了痘病毒天坛株的Vero细胞,经过多轮荧光筛选后成功获得表达H5N1亚型禽流感病毒HA、NA蛋白的重组痘病毒rVTT-HA/NA,Western blot鉴定HA、NA蛋白表达正确。通过蔗糖密度梯度离心纯化获得病毒样颗粒,电镜下可以看到形态大小与H5N1病毒类似的颗粒,经Lowry法测定纯化后的VLPs总蛋白含量为93.49μg/mL,经SRID测定HA蛋白含量为24.58μg/mL。以VLPs剂量1μg/只、5μg/只、10μg/只对小鼠进行免疫,同时以H5N1全病毒灭活疫苗剂量1μg/只免疫组作为阳性对照。体液免疫结果表明:5μg/只、10μg/只剂量组血清抗体中和活性均大于1:40,10μg/只剂量组最高可以达到1:180,且在第八周的中和活性与全病毒灭活疫苗组相当;ELISA检测IgG抗体,三剂量组在加强免疫后均可看到IgG效价的明显升高,且效价维持平稳,至第八周未见明显下降。细胞免疫结果表明病毒样颗粒三个剂量组所诱发的脾脏CD8+T细胞比例均高于全病毒灭活疫苗组,脾脏分泌细胞因子IFNγ的淋巴细胞比例也比全病毒灭活疫苗组高,证明病毒样颗粒诱发的细胞免疫效果较强。本研究为新型病毒样颗粒流感疫苗的研发提供了一定的基础。
辛佳亮[3]（2019）在《表达山羊痘病毒N1L基因重组痘苗病毒的构建及其生物学特性研究》文中研究指明为探究山羊痘病毒（Goatpox virus,GTPV）N1L基因（gN1L）的生物学功能,本研究以痘苗病毒天坛株（vaccinia virus Tiantan,VTT）N1L基因（vN1L）片段为左右同源重组臂,构建了含有VACV早/晚期强复合启动子（PE/L）、绿色荧光蛋白（EGFP）基因及大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（gpt）基因的转移载体质粒pLR-EGFP-gpt。分别向pLR-EGFP-gpt插入vN1L和gN1L基因表达盒,构建了转移载体质粒pLR-EGFP-gpt-N1Lrev和pLR-EGFP-gpt-gN1L。将上述构建的三个转移载体分别与VTT共转染于BHK-21细胞中,通过逐代对表达绿色荧光蛋白的重组病毒蚀斑进行筛选和鉴定,最终获得了缺失vN1L基因的重组毒株VTTΔN1L、缺失后再拯救vN1L基因的重组毒株VTTN1Lrev及用gN1L基因替换vN1L基因的毒株VTTgN1L。通过体外细胞试验和动物体内试验评估重组病毒与亲本毒株的稳定性、宿主范围、复制以及毒力的差异。结果显示:构建的三种重组病毒均可在BHK-21细胞中稳定遗传15代以上,且宿主范围无明显差异;VTT N1Lrev在BHK-21细胞中的复制速度最快,其次分别为VTTgN1L、VTT和VTTΔN1L。初步证实vN1L和N1L基因具有促进病毒复制速度的功能。体内外毒力试验显示:VTTN1Lrev毒力最强,其次分别为VTTgN1L、VTT和VTTΔN1L,其中VTTgN1L和VTT的毒力并无明显差异,VTTΔN1L毒力最低。结论,vN1L和gN1L基因均是病毒复制和毒力的相关基因,且gN1L基因可部分恢复gN1L基因的功能。
罗锋[4]（2017）在《猪痘病毒江西分离株全基因组测序及其复制非必需区的筛选》文中认为猪痘（Swinepox,SWP）是由猪痘病毒（Swinepox Virus,SWPV）引起猪的一种以皮肤损伤、形成痘疹和结痂为特征的猪传染病,病猪能自行康复,对养猪业造成的损失极小。猪痘病毒具有严格的宿主特异性（在自然状态下只感染猪）、基因组大（146kb）、复制非必需区（Non-essential Regions,NERs）多、可以插入大片段的外源基因等特点,因此,猪痘病毒特别适合作为基因工程疫苗载体。而目前GenBank收录的猪痘病毒全基因序列仅有一株（17077-99株）,且基因组全部150个阅读框中已报道的只有四个位点（TK、ORF020-021、ORF032、ORF043）被证实能被缺失。本研究先对两株猪痘病毒江西分离株进行全基因组测序分析,在此基础之上对其进行复制非必需区（NER）筛选,以及猪痘病毒NER缺失毒株的生物学特性测定,旨在筛选到稳定、高效表达外源基因的复制非必需区,为今后基于猪痘病毒载体的基因工程疫苗研究提供高效的外源基因插入位点;同时分析不同NER缺失与SWPV毒力的关系,以期发现与猪痘病毒毒力相关的基因。1.猪痘病毒江西分离株全基因组测序及分析根据SWPV 17077-99株设计42对引物对两株猪痘病毒江西分离株SWPV-JX08株和SWPV-JX20G株进行全基因组进行分段PCR扩增并测序,得到SWPV-JX08株全长146297bp,SWPV-JX20G株全长146240bp,与17077-99株同源性分别为97.3%、97.4%,两株测序毒株间同源性为97.8%;基因差异主要集中分布在ORF1-ORF30和ORF120-ORF140范围内,其中ORF019、ORF126和ORF131的基因差异较大。SWPV江西分离株全基因组序列测定结果为下一步开展复制非必需区（NER）的引物设计等工作提供了亲本病毒完整、精确的序列背景。2.猪痘病毒江西分离株复制非必需区的筛选根据全基因组测序结果,以SWPV-JX20G株为亲本病毒,利用融合PCR方法成功构建了49株基因缺失重组猪痘病毒转移载体,通过转染和多轮纯化实验结果表明49株重组毒株均能稳定表达外源蛋白,证明该49个基因为SWPV-JX20G株猪痘病毒的复制非必需区。3.7株NER缺失重组猪痘病毒生物学特性测定通过多轮纯化增殖实验获得7株重组猪痘病毒毒株（ORF020-021、TK、ORF108-110、ORF124、ORF124-127、ORF127、ORF136）,并对重组病毒引起PK15细胞的细胞病变作用、荧光斑大小、TCID50,PCV2-Cap蛋白表达量以及对保育猪致病性等数据进行测定。结果显示（1）、重组猪痘病毒体外增殖能力:ORF136基因缺失重组猪痘病毒体外增殖能力最强(TCID50为10-12.5/0.1mL,荧光斑平均大小为309.9μm),其余依次为ORF127、ORF124-127、ORF124、TK、ORF020-021、ORF108-110;（2）、在PCV2-Cap蛋白表达量上,ORF136与ORF124表达量相当,ORF108-110次之,其它依次为ORF020-021、ORF127、TK、ORF127;（3）、对猪痘病毒的致弱能力上,依次为ORF136、ORF020-021、ORF108-110、ORF124、ORF124-127、ORF127;（4）、最终表明ORF136可能为猪痘病毒SWPV-JX20G的严格复制非必需区,且与猪痘病毒毒力相关。
郭丽娇[5]（2017）在《天坛株痘苗病毒TC/TK基因缺失株的筛选与鉴定》文中研究说明目的:本研究致力于构建一株减毒且免疫原性高的痘苗病毒载体。方法:通过同源重组技术删除痘苗病毒天坛株的TK2L-TC7L基因,利用EGFP和Cre/Lox P重组系统筛选基因缺失痘苗病毒TK/TC VTT。体外实验中,痘苗病毒TK/TC VTT和VTT通过结晶紫染色和MTS检测分析扩散能力和细胞毒性。体内实验中,通过鼻腔和颅内注射对比小鼠体重变化和死亡率分析基因缺失病毒TK/TC VTT的体内毒力;以及特异性抗体水平和T细胞增殖分析TK/TC VTT的免疫原性。结果:成功构建了基因缺失痘苗病毒TK/TC VTT,TK2L-TC7L基因缺失不影响病毒的正常复制且遗传稳定性好,而且显着减弱了病毒毒力并有效诱导机体的免疫应答。结论:本研究为未来医学领域提供了一种减毒、高效的痘苗病毒载体疫苗。
王世兵,陈侃,孔祥东[6]（2014）在《基于痘苗病毒载体的恶性肿瘤基因治疗研究进展》文中研究说明基因治疗一直是肿瘤生物治疗的重要策略,而以溶瘤痘苗病毒为载体的肿瘤治疗近年来受到较多关注。该文总结了目前用于恶性肿瘤治疗的痘苗病毒和基于痘苗病毒载体的基因治疗研究进展及其在各个领域的成果。
文波[7]（2013）在《基于三种病毒载体的新型HCV疫苗在恒河猴中的免疫学应答分析》文中认为丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）经血传播后可引起急慢性肝炎甚至肝癌。HCV疫苗的研发对于HCV的防治至关重要，而目前还没有安全有效的抗HCV疫苗，但是部分HCV感染者能够自行清除病毒，所以HCV疫苗的研发充满希望和挑战。研究显示体液免疫反应强度，抗体中和能力以及特异性细胞免疫反应（CTL）水平是疫苗成功的关键因素，而病毒载体疫苗在上述方面具有一定优势。恒河猴与人类近缘，系统免疫反应接近人类，而相对于黑猩猩又更易获取，所以本课题在前期研究的基础上，大量制备了基于三种病毒载体的新型HCV疫苗对恒河猴进行了免疫试验。其中包括：基于复制缺陷的腺病毒5型载体HCV疫苗（rAd-HCV），复制缺陷的痘苗病毒载体（天坛株）的HCV疫苗（rNTV-HCV），以及基于整合缺陷慢病毒的假病毒颗粒疫苗（HCVpp），三种疫苗均以HCV1b包膜糖蛋白E1E2以及非结构蛋白NS3作为靶标抗原。采用四种不同的免疫组合：rAd-HCV+HCVpp+rNTV-HCV, HCVpp+rNTV-HCV, HCVpp+rAd-HCV,以及rNTV+rAd-HCV。每组选用4只恒河猴进行序贯联合免疫，另外采用含HBV CS1和SS1抗原基因的DNA以及痘病毒载体作为无关对照进行了实验。实验通过长期（76周）的观测取样，重点监测猴体内HCV特异性体液免疫与细胞免疫反应，同时检测抗体血清对HCV病毒的中和能力，以及多种免疫应答相关的细胞因子水平的变化，以评价基于病毒载体的新型HCV疫苗单独或组合免疫方案在非人灵长类动物的免疫效果，为选取进行临床应用的疫苗和免疫方案提供依据。我们的主要检测结果如下：1)单纯采用rAd-HCV疫苗免疫能在恒河猴体内诱导产生滴度范围在102.3-3.5的HCV E1特异性IgG抗体，抗E2及NS3抗体滴度较低。所得的免疫血清对HCV假病毒具有较明显的中和能力，其针对1a亚型HCV假病毒（简称1a）的中和率为36.6%，1b亚型HCV假病毒（简称1b）为48.7%。所诱导产生的抗原特异性细胞免疫反应较弱，仅有单一样本检测到针对E2肽池和NS3肽池的弱阳性反应。2) rNTV-HCV疫苗基础免疫即能使恒河猴产生明显的抗原特异性细胞与体液免疫应答。在初次免疫后，实验组动物的抗体滴度E1为103.35±0.39,E2为103.01±0.35，NS3为102.65-2.77，体液免疫诱导效果优于HCVpp基础免疫组。而且，rNTV-HCV免疫组血清的病毒中和能力在强度（1b56.7%）和中和谱（能中和1a，1b）上均优于HCVpp。同时，rNTV-HCV免疫使恒河猴产生了较强的抗原特异性细胞免疫应答（中位数597;311-1210SFC/Million PBMC）。可见rNTV-HCV具有较强的HCV特异性细胞与体液免疫应答双重诱导能力。3) HCVpp疫苗作为基础免疫抗原能诱导恒河猴产生较为明显的体液免疫应答。在进行两次接种后，采用HCVpp进行基础免疫的实验组猴血清中HCV特异性抗体滴度均出现增强：抗E1滴度值为102.34-2.55，抗E2滴度值为102.73-2.81，抗NS3滴度值为102.24-2.37。免疫血清具有良好的病毒中和能力（1b43.1%），但是细胞免疫检测无明显的阳性结果（异常反应除外）。与rNTV-HCV比较，HCVpp疫苗的免疫原性相对较弱。4)序贯联合免疫效果的比较：采用rAd-HCV+HCVpp免疫策略进行了接种后，其血清抗E1抗体滴度增强至103.8±0.12，而最终的抗E2和NS3滴度则无明显增加。血清的病毒中和能力有所增强，其针对1b的中和率提升了10%，但是交叉中和谱不变。细胞免疫应答方面，采用一针HCVpp加强免疫即对rAd-HCV基础免疫的恒河猴具有增强效果。采用HCVpp+rNTV-HCV和rAd+HCVpp+rNTV-HCV免疫策略后，与基础免疫结果相比，实验猴的血清抗体滴度和中和能力均未见有效增强，仅使两组的细胞免疫反应有所增强。其中rNTV-HCV疫苗的加强免疫能使已采用了rAd-HCV+HCVpp联合免疫策略的恒河猴ELISPOT反应点数上升至中位数324（范围：10-1518）SFC/Million PBMC，增强较为明显。采用HCVpp+rAd-HCV以及rNTV-HCV+rAd-HCV免疫策略的两组实验猴的抗体滴度与基础免疫后的检测结果相比均获得明显增加，分别提高至103.05±0.15和103.88±0.18，E2的抗体滴度升至102.77±0.35和103.48±0.22。并且各组免疫血清的病毒中和能力也获得增强，能有效中和1a，1b，5a三个型别的HCV假病毒。细胞免疫方面，rAd-HCV能增强本底较低的HCVpp基础免疫组的特异性T细胞反应；而对已获得有效激活的rNTV-HCV基础免疫组，rAd-HCV的加强免疫的增强效果更为明显。采用rNTV-HCV基础免疫的恒河猴能被rAd-HCV有效加强，其T细胞反应检测值为各组最高（中位数1545;范围：818-2210SFC/Million PBMC）。并且该免疫方案能使实验猴的Th1和Th2细胞因子均获得增强，其中Th1型细胞因子的增强更为明显。基于上述结果我们认为，对于恒河猴，单纯rAd-HCV和HCVpp疫苗均表现出明显的体液免疫诱导能力而细胞免疫应答较弱，仅rNTV-HCV表现出明显的细胞和体液免疫双重诱导能力。采用序贯联合免疫时，rNTV-HCV+rAd-HCV免疫方案的效果较其他免疫方案具有明显优势，十分适合进一步进行深入研究和开发。
刘铮,刘颖,邵一鸣[8]（2013）在《正痘病毒基因结构及功能研究的几项进展》文中研究指明正痘病毒载体在重组疫苗研究中有广泛前景,但其罕见但较为严重的副反应阻碍了发展。正痘病毒属中具有较宽宿主范围的痘苗病毒和牛痘病毒具有典型的宿主范围基因K1L、CP77和C7L。这三个基因对不同宿主细胞具有选择性,可以扰乱宿主细胞信号通路,并且与病毒的毒力相关。
阚式绂[9]（2013）在《减毒痘苗病毒天坛株的构建、致病性及免疫原性研究》文中进行了进一步梳理痘苗病毒天坛株作为疫苗，在我国消灭天花的历史上居功至伟。近年来，痘苗病毒天坛株作为活病毒载体在预防艾滋病、狂犬病和流感等传染病方面取得了巨大成就。然而，颅内接种实验表明，痘苗病毒天坛株对小鼠的致死率较高，具有一定的神经毒性。临床接种痘苗病毒天坛株疫苗也可能导致少数接种者出现严重副作用，例如脑炎、结膜炎、心肌炎及全身性发痘等。因此，如何构建更加低毒、更加安全且高效的痘苗病毒天坛株疫苗或载体成为研究的热点。通过同源重组和Cre-LoxP技术，定点敲除痘苗病毒基因组中的复制非必需基因，是构建减毒疫苗或载体的有效方法。基因重组作为基因工程的重要技术之一，包括同源重组、位点特异性重组以及转座重组。同源重组技术，又叫基因打靶技术，是目前研究痘苗病毒基因功能、构建减毒型痘苗病毒疫苗和载体的主要方法。该技术通过构建含有左右重组臂、启动子和筛选标记基因的穿梭载体，使病毒基因组与外源DNA序列发生重组，进而定点修饰或缺失基因组上某一目的基因，构建缺失型痘苗病毒。进而，通过体外和体内实验对缺失型痘苗病毒的生长动力学、病毒粒子表型、细胞间传播能力、毒力、宿主范围和免疫原性等特性进行系统分析。在构建缺失型毒株的过程中，通常需要引入筛选标记基因，用于病毒筛选。然而，筛选标记基因作为外源基因的存在不符合商业疫苗生物安全的要求，在研究过程中需要将其删除。Cre-LoxP系统作为一种特异性重组技术，能够定点将外源基因删除，广泛用于重组病毒、细菌和转基因动物等的研究。Cre重组酶能够特异性的识别LoxP位点（两个反向重复序列）和其间的间隔区域。当两个同向LoxP序列位于同一条DNA链上，Cre重组酶能有效切除位于两个LoxP序列之间的序列。本研究基于传统痘苗病毒天坛株，分别构建了缺失TC7L-TK2L基因（15,26225,450）和TA35R基因（138,881139,570）的弱毒株vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3。其中，TC7L-TK2L基因包括TC7L、TC6L、TC5L、TC4L、TC3L、TC2L、TC1L、TN1L、TN2L、TM1L、TM2L、TK1L和TK2L共13个片段。vMVTT1缺失了TC7L-TK2L基因，vMVTT2缺失了TA35R基因，vMVTT3同时缺失了TC7L-TK2L和TA35R基因。通过体内和体外实验对缺失型病毒的生长动力学、细胞间传播能力、病毒表型、毒力下降水平、宿主范围以及免疫原性进行了分析。首先，在BHK-21、Vero、MDCK、HeLa和PK15五种细胞中，通过结晶紫染色实验和MTT实验等多种方法分析了缺失型毒株（vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3）和野生型VTT在细胞间传播能力、复制能力、病毒表型及细胞毒性和宿主范围之间的差异，并对缺失毒株的遗传稳定性进行了评估。然后，通过鼻内和颅内感染途径分别用vMVTT1、vMVTT2、vMVTT3和野生型VTT感染小鼠，通过统计小鼠体重下降程度和死亡情况分析缺失TC7L-TK2L基因和TA35R基因后天坛株痘苗病毒毒力下降水平；用缺失型毒株通过皮内途径感染家兔，观察家兔接种部位病灶变化大小和程度，进一步分析缺失型毒株对皮肤的损伤程度及其毒力下降水平。最后，分别用vMVTT1、vMVTT2、vMVTT3和野生型VTT接种BALB/c小鼠，检测血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的含量和特异性抗体水平，并进行攻毒保护实验，分析小鼠的免疫水平，进而评价vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3的免疫原性。结果表明，通过同源重组和Cre-LoxP系统，成功构建了缺失TC7L-TK2L基因和TA35R基因且不含外源基因的减毒痘苗病毒天坛株vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3，均具有良好的遗传稳定性。电镜结果表明缺失TC7L-TK2L基因和TA35R基因不影响天坛株病毒粒子的形态发生。但是，对其生长动力学、细胞间传播能力、毒力和免疫原性有较大影响。与野毒相比较，vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3在PK15、Vero、HeLa、MDCK和BHK-21细胞中的复制能力均下降，复制能力由大到小依次为VTT> vMVTT2> vMVTT1> vMVTT3。细胞与细胞间传播能力依次为VTT>vMVTT2>vMVTT1>vMVTT3，其中vMVTT3仅在BHK-21细胞上有一定的传播能力，在Vero、HeLa、MDCK和PK15细胞中传播能力较弱。MTT实验表明缺失型毒株对5种细胞的杀伤能力依次为VTT>vMVTT2> vMVTT1>vMVTT3。家兔皮肤致病力实验表明，VTT组对兔皮的损伤最大，毒性最强，vMVTT3组对兔皮基本无损伤，毒性最弱。而vMVTT1组和vMVTT2组对家兔皮肤均有致病力，且vMVTT2皮肤致病力较强。另外，痘斑形成的大小与感染缺失型病毒的滴度也有较大关系。通过鼻内和颅内接种途径感染小鼠，结果表明接种途径对病毒毒力的评估有较大影响。鼻内接种途径实验表明vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3毒力明显下降，其中vMVTT3毒力下降约100倍。而颅内接种实验表明vMVTT2毒力下降80倍，vMVTT1和vMVTT3毒力下降3200倍。另外，细胞因子检测和中和试验结果表明缺失TC7L-TK2L基因和TA35R基因对天坛株痘苗病毒的免疫原性几乎没有影响，接种小鼠后没有显着降低其免疫应答水平，仍可诱导产生较高水平的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ，并可刺激小鼠体内产生高水平中和抗体。攻毒保护试验结果表明vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3作为疫苗对小鼠具有较好的保护作用，用高剂量（500×LD50）的野生型VTT攻击小鼠也没有出现死亡。综上所述，本研究所构建的三个缺失型毒株的毒力均有不同程度的下降，其中vMVTT3毒力下降最为明显且保持了较好的免疫原性，具有作为疫苗或载体的潜能。本实验基于VTT，在不引进外源标记基因的条件下，同时缺失TC7L-TK2L和TA35R两段基因，并成功获得毒力下降且免疫原性较好的缺失型痘苗病毒天坛株，具备作为疫苗或载体的潜能，在各种传染性疾病的防治等领域具有较好的应用前景。
刘铮[10]（2013）在《缺失宿主范围基因的重组痘苗病毒载体构建及在HIV-1抗原重组疫苗中的应用》文中进行了进一步梳理痘苗病毒已被广泛应用于作为其它病原或肿瘤疫苗的重组载体,能诱导体液和细胞免疫和黏膜免疫反应,在艾滋疫苗研究中包括临床前以及人体实验中HIV-1重组痘苗病毒活载体疫苗研究最为广泛。痘苗病毒天坛株（VTT）是中国消灭天花的主要疫苗株,其预防天花的效果和人群的耐受性及安全性已经在几十年的长期实践中得到了充分的验证。痘苗病毒天坛株在我国曾作为疫苗载体用于许多新疫苗的研究中。为进一步增强天坛载体的安全性和作为HIV疫苗的免疫原性,本研究选择删除天坛株编码的宿主范围基因C7L和K1L,以及包含着两个基因的C8L-K3L基因片段进行新型天坛痘苗载体的系列研究。本研究以母本VTT为出发毒株,构建了7株缺失重组病毒VTTΔC7L、VTTΔK1L, VTTΔC7LK1L、VTKgpeΔC7L、VTKgpeΔK1L、VTTΔC7LK1L-gag和VTTΔC8-K3-gag.对这7株病毒进行CEF、Vero、BHK-21和HeLa细胞系中的复制动力学评价,发现所有毒株的复制能力均有所下降,尤其是VTTAC7LK1L、 VTTAC7LK1L-gag和VTTΔC8-K3-gag,增殖能力下降10倍以上。在动物模型中,两个宿主范围基因都缺失的、VTTΔC7LK1L、VTTΔC7LK1L-gag和VTTΔC8-K3-gag减毒效果最显着,在小鼠和裸鼠中不造成损伤,并且只在最高剂量时对兔皮肤产生0.4-0.5cm的皮肤红晕斑,而母本VTT可以造成1.48cm的红晕斑及产生溃烂。只缺失K1L基因的毒株减毒效果居中,而单独缺失C7L基因的毒株其减毒效果最弱。为降低痘苗病毒的载体反应,同时增加针对外源HIV基因的免疫原性,本研究进行了单独免疫载体的评价及四种疫苗免疫策略研究。发现缺失重组痘苗病毒免疫两次,中间间隔8周时,其载体特异性体液免疫和细胞免疫应答与VTKgpe相比均有显着降低。而与DNA联合免疫的策略可诱导更高水平的HIV特异性细胞免疫应答,尤其是DNA初免三次后,加强免疫痘苗病毒,其诱导的IFN-γ阳性T细胞数均可达到650-700/106细胞。而在所有免疫策略中,缺失重组痘苗病毒诱导的HIV特异性免疫应答均与VTKgpe在同一水平。本研究获得了毒力下降明显且免疫原性较高的疫苗载体,并为研究更好的免疫策略研究奠定了基础。
二、痘苗病毒天坛株非必需区与病毒生物学性状的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、痘苗病毒天坛株非必需区与病毒生物学性状的关系（论文提纲范文）
（1）山羊痘病毒N1蛋白生物学功能及其机制初步探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写索引 |
| 引言 |
| 第一章 痘病毒概要 |
| 1.1 羊痘病毒的概述 |
| 1.1.1 分类及基本特征 |
| 1.1.2 羊痘的流行病学 |
| 1.1.3 临床症状和病理变化 |
| 1.1.4 羊痘病毒属基因组 |
| 1.1.5 相关蛋白及其功能 |
| 1.1.6 SGPV的防控与根除 |
| 1.2 痘苗病毒的概述 |
| 1.2.1 补体 |
| 1.2.2 细胞因子 |
| 1.2.3 趋化因子 |
| 1.3 痘病毒N1蛋白 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 重组痘苗病毒的生物学特性及毒力分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物的设计 |
| 2.2.2 重组病毒的筛选及鉴定 |
| 2.2.3 重组病毒的鉴定 |
| 2.2.4 重组病毒和VTT病毒的滴度测定 |
| 2.2.5 重组病毒和VTT病毒的拷贝数测定 |
| 2.2.6 重组病毒与亲本毒株生长性能差异比较 |
| 2.2.7 重组病毒与亲本毒株在不同细胞内的扩散水平 |
| 2.2.8 重组病毒与亲本毒株对细胞毒性的检测 |
| 2.2.9 重组病毒对小鼠的神经毒性分析 |
| 2.2.10 重组病毒在小鼠体内的分布及病理变化观察 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组病毒的筛选 |
| 2.3.2 重组病毒的鉴定 |
| 2.3.3 重组病毒的纯度 |
| 2.3.4 重组病毒的遗传稳定性 |
| 2.3.5 重组病毒和VTT病毒的滴度 |
| 2.3.6 重组病毒和VTT病毒的拷贝数 |
| 2.3.7 重组病毒与亲本毒株生长性能差异比较 |
| 2.3.8 重组病毒与亲本毒株在不同细胞内的扩散水平 |
| 2.3.9 重组病毒与亲本毒株的细胞毒性 |
| 2.3.10 重组病毒对小鼠的神经毒性 |
| 2.3.11 重组病毒在小鼠体内的分布及小鼠的病理变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组病毒N1L基因的作用机制探究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 试验材料 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 样品测序 |
| 3.2.2 RNA-Seq原始数据的处理及生物信息学分析 |
| 3.2.3 差异表达基因的实时荧光定量PCR验证 |
| 3.2.4 亲本毒株和重组病毒对小鼠各组织器官细胞因子转录表达的影响 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 亲本毒株与重组毒株感染小鼠脑组织RNA-seq测序数据评估 |
| 3.3.2 差异表达基因的实时荧光定量PCR验证 |
| 3.3.3 亲本毒株和重组病毒对小鼠各组织器官细胞因子转录表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 GTPV N1蛋白亚细胞定位研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 细胞、质粒及病毒毒株 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 pEGFP-gN1L重组质粒的构建 |
| 4.2.2 GTPVN1(gN1)蛋白在细胞中的定位检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 pEGFP-gN1L重组质粒的构建结果 |
| 4.3.2 N1(gN1)蛋白在细胞中的定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）基于痘病毒天坛株的H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的构建及其免疫原性分析（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感疫苗 |
| 1.3 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.4 痘病毒天坛株载体 |
| 1.5 研究目的 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 实验材料 |
| 2.1 实验用细胞、病毒、菌种 |
| 2.2 实验用试剂 |
| 2.3 实验用仪器 |
| 2.4 主要试剂的配制 |
| 第三章 实验方法 |
| 3.1 穿梭质粒pSCCK的设计 |
| 3.2 重组质粒pSCCK‐HA/NA的构建 |
| 3.3 重组痘病毒rVTT‐HA/NA的构建 |
| 3.4 重组痘病毒rVTT‐HA/NA的鉴定 |
| 3.5 病毒样颗粒的表达与纯化 |
| 3.6 病毒样颗粒免疫原性分析 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 穿梭质粒pSCCK结构 |
| 4.2 重组质粒pSCCK‐HA/NA的构建与鉴定 |
| 4.3 重组痘病毒rVTT‐HA/NA的构建与鉴定 |
| 4.4 病毒样颗粒的表达与纯化 |
| 4.5 病毒样颗粒免疫原性分析 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（3）表达山羊痘病毒N1L基因重组痘苗病毒的构建及其生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 痘苗病毒的研究概况 |
| 1.1.1 痘苗病毒的基本特征 |
| 1.1.2 痘苗病毒的生活周期 |
| 1.1.3 痘苗病毒的应用研究 |
| 1.2 羊痘病毒的研究概况 |
| 1.2.1 分类及基本特征 |
| 1.2.2 羊痘的流行病学 |
| 1.2.3 临床症状和病理变化 |
| 1.2.4 组织嗜性和致病机理 |
| 1.2.5 羊痘病毒编码的毒力相关的蛋白及其功能 |
| 1.2.6 痘病毒N1L基因研究概况 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 表达山羊痘病毒N1L基因重组痘苗病毒的构建、筛选及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株及细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 病毒基因组提取 |
| 2.2.3 目的基因的扩增 |
| 2.2.4 目的片段的回收 |
| 2.2.5 目的片段的连接、转化和小提 |
| 2.2.6 转移载体质粒的构建及鉴定 |
| 2.2.7 重组质粒的大量制备 |
| 2.2.8 重组病毒的制备、筛选及鉴定 |
| 2.2.9 重组病毒的遗传稳定性 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目的基因的扩增结果 |
| 2.3.2 重组转移载体质粒的鉴定结果 |
| 2.3.3 重组病毒的构建及筛选 |
| 2.3.4 重组病毒的鉴定 |
| 2.3.5 重组病毒的遗传稳定性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 表达山羊痘病毒N1L基因的重组痘苗病毒的生物学特性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组病毒和野毒的滴度测定 |
| 3.2.2 天坛株痘苗病毒的SYBR Green I real-timePCR检测方法 |
| 3.2.3 重组病毒和野毒的生长趋势 |
| 3.2.4 重组病毒在不同细胞内的扩散水平 |
| 3.2.5 重组病毒和野毒对不同细胞的毒性检测 |
| 3.2.6 重组病毒对小鼠的体重影响 |
| 3.2.7 重组病毒对小鼠生理影响 |
| 3.2.8 重组病毒对小鼠的神经毒性 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组病毒和亲本毒株的病毒滴度测定 |
| 3.3.2 天坛株痘苗病毒SYBR Green I real-timePCR检测方法 |
| 3.3.3 重组病毒和野毒的生长趋势 |
| 3.3.4 重组病毒在不同细胞内的扩散水平 |
| 3.3.5 重组病毒和野毒的细胞毒力检测 |
| 3.3.6 重组病毒VTT△N1L和VTT对小鼠体重的影响 |
| 3.3.7 重组病毒VTTΔN1L和VTT对小鼠生理影响 |
| 3.3.8 重组病毒对小鼠的神经毒性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）猪痘病毒江西分离株全基因组测序及其复制非必需区的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪痘病毒的研究进展 |
| 1.1.1 猪痘病毒概述 |
| 1.1.2 猪痘病毒形态学及理化特性 |
| 1.1.3 猪痘病毒分子生物学特性 |
| 1.2 猪痘病毒载体疫苗研究进展 |
| 1.2.1 猪痘病毒载体的构建 |
| 1.2.2 猪痘病毒载体疫苗的应用 |
| 1.3 痘病毒复制非必需区(NER)的研究 |
| 1.3.1 复制非必需区(NER) |
| 1.3.2 不同痘病毒复制非必需区(NER)的研究 |
| 第二章 猪痘病毒江西分离株全基因组测序及分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 猪痘病毒和病毒液 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 实验试剂的配制 |
| 2.1.4 实验器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪痘病毒全基因组测序引物设计 |
| 2.2.2 猪痘病毒DNA的提取 |
| 2.2.3 猪痘病毒基因组PCR扩增 |
| 2.2.4 PCR扩增产物纯化 |
| 2.2.5 测序及序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 基因组PCR扩增结果 |
| 2.3.2 测序序列分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第三章 猪痘病毒江西分离株复制非必需区的筛选 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 猪痘病毒、细胞株及质粒 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.1.4 实验器材 |
| 3.2 构建猪痘病毒表达PCV2-Cap蛋白重组毒株的方法 |
| 3.2.1 融合PCR引物设计 |
| 3.2.2 猪痘病毒DNA的提取 |
| 3.2.3 融合PCR法构建重组转移载体 |
| 3.2.4 融合PCR产物的纯化及浓度测定 |
| 3.2.5 转染 |
| 3.2.6 重组病毒的纯化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 融合PCR方法的扩增结果 |
| 3.3.2 转染结果 |
| 3.3.3 重组病毒的纯化结果 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 第四章 7株NER缺失重组猪痘病毒生物学特性测定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞株、单克隆抗体及实验动物 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 实验试剂的配制 |
| 4.1.4 实验器材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转染及重组猪痘病毒的纯化 |
| 4.2.2 重组猪痘病毒的增殖 |
| 4.2.3 重组猪痘病毒的鉴定 |
| 4.2.4 重组猪痘病毒对PK15细胞的CPE作用 |
| 4.2.5 重组猪痘病毒感染PK15细胞荧光斑大小 |
| 4.2.6 重组猪痘病毒对PK15 细胞的TCID50 |
| 4.2.7 重组猪痘病毒表达PCV2-Cap蛋白的效果 |
| 4.2.8 重组猪痘病毒对保育猪的致病性 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组病毒的增殖结果 |
| 4.3.2 重组病毒的鉴定结果 |
| 4.3.3 重组猪痘病毒对PK15细胞的CPE作用 |
| 4.3.4 重组猪痘病毒感染PK15细胞荧光斑大小 |
| 4.3.5 重组猪痘病毒对PK15 细胞的TCID50 |
| 4.3.6 重组猪痘病毒表达PCV2-Cap蛋白的效果 |
| 4.3.7 重组猪痘病毒对保育猪的致病性 |
| 4.3.8 重组猪痘病毒生物学特性分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 讨论 |
| 4.4.2 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）天坛株痘苗病毒TC/TK基因缺失株的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 一、痘苗病毒疫苗的研究进展 |
| 二、痘苗病毒载体的研究进展 |
| 第二部分 研究内容 |
| 一、基因缺失型痘苗病毒的构建与筛选 |
| 二、基因缺失型痘苗病毒的生物学特性与毒力分析 |
| 三、基因缺失型痘苗病毒的免疫原性研究 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（6）基于痘苗病毒载体的恶性肿瘤基因治疗研究进展（论文提纲范文）
| 1痘苗病毒的生物学特点 |
| 2重组痘苗的构建和筛选 |
| 3痘苗病毒治疗恶性肿瘤 |
| 4痘苗病毒载体介导外源基因治疗恶性肿瘤 |
| 5溶瘤痘苗病毒的临床相关试验进展 |
| 5.1野生型的溶瘤痘苗病毒的相关临床试验数据 |
| 5.2溶瘤痘苗病毒的相关临床试验进展 |
| 6痘苗病毒与其它治疗方法联合治疗恶性肿瘤 |
| 7展望与讨论 |
（7）基于三种病毒载体的新型HCV疫苗在恒河猴中的免疫学应答分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 HCV 概述 |
| 1.2 HCV 的药物治疗 |
| 1.3 影响 HCV 疫苗研发的相关因素 |
| 1.4 HCV 疫苗研发现状 |
| 1.5 本研究所用病毒载体在疫苗领域的研究进展 |
| 1.5.1 腺病毒载体疫苗的研究进展 |
| 1.5.2 痘病毒载体疫苗的研究进展 |
| 1.5.3 慢病毒载体疫苗的研究进展 |
| 1.6 立题依据与研究思路 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 试剂与材料 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 重要仪器与设备 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 腺病毒载体 HCV 疫苗(rAd-HCV)的大量制备 |
| 2.2.2 复制缺陷型痘苗病毒载体 HCV 疫苗(rNTV-HCV)的大量制备 |
| 2.2.3 HCVpp 的大量制备 |
| 2.2.4 Western blot 检测目的基因的表达 |
| 2.2.5 动物免疫与采血 |
| 2.2.6 血液生化检测 |
| 2.2.7 抗体 ELISA 检测 |
| 2.2.8 中和抗体检测 |
| 2.2.9 ELISPOT 检测 |
| 2.2.10 Luminex 多重（猴）细胞因子检测 |
| 2.2.11 流式检测 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 rAd-HCV 疫苗基础免疫在恒河猴中的免疫应答 |
| 3.1.1 rAd-HCV 疫苗的构建与体外表达鉴定 |
| 3.1.2 rAd-HCV 疫苗对恒河猴的免疫接种 |
| 3.1.3 rAd-HCV 疫苗所诱导的抗原特异性抗体 |
| 3.1.4 rAd-HCV 疫苗所诱导的 HCV 中和抗体 |
| 3.1.5 rAd-HCV 疫苗单纯免疫所诱导的抗原特异性 T 细胞反应 |
| 3.1.6 分节讨论 |
| 3.2 rNTV-HCV 疫苗基础免疫在恒河猴中的免疫应答 |
| 3.2.1 rNTV-HCV 疫苗的构建与体外表达鉴定 |
| 3.2.2 rNTV-HCV 疫苗对恒河猴的免疫接种 |
| 3.2.3 rNTV-HCV 疫苗基础免疫所诱导的体液免疫应答 |
| 3.3.4 rNTV-HCV 疫苗基础免疫所诱导的 HCV 中和抗体 |
| 3.3.5 rNTV-HCV 疫苗基础免疫所诱导的抗原特异性细胞免疫应答 |
| 3.3.6 分节讨论 |
| 3.3 HCVpp 疫苗免疫在恒河猴中的免疫应答 |
| 3.3.1 HCVpp 疫苗的构建与体外表达鉴定 |
| 3.3.2 HCVpp 疫苗对恒河猴的免疫接种 |
| 3.3.3 HCVpp 疫苗所诱导的抗原特异性抗体 |
| 3.3.4 HCVpp 疫苗所诱导的 HCV 中和抗体 |
| 3.3.5 HCVpp 疫苗所诱导的抗原特异性 T 细胞反应 |
| 3.3.6 分节讨论 |
| 3.4 三种 HCV 疫苗序贯联合免疫在恒河猴中的免疫应答分析 |
| 3.4.1 三种 HCV 疫苗的序贯联合免疫 |
| 3.4.2 联合加强免疫所诱导的抗原特异性抗体 |
| 3.4.3 联合加强免疫所诱导的 HCV 中和抗体 |
| 3.4.4 序贯联合免疫所诱导的抗原特异性细胞免疫反应 |
| 3.4.5 rNTV-HCV+rAd-HCV 免疫策略具有 Th1 和 Th2 细胞因子双向诱导能力 |
| 3.4.6 分节讨论 |
| 3.5 全文总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读学位期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）正痘病毒基因结构及功能研究的几项进展（论文提纲范文）
| 1 K1L基因编码蛋白的结构与功能 |
| 2 CP77蛋白的结构与功能 |
| 3 C7L基因编码蛋白的功能 |
| 4 痘苗病毒天坛株研究概况 |
| 5 小结与展望 |
（9）减毒痘苗病毒天坛株的构建、致病性及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 痘苗病毒特性及部分基因的功能 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 痘苗病毒的分类地位及基本特点 |
| 1.3 痘苗病毒的生活周期 |
| 1.4 痘苗病毒天坛株的生物学特性 |
| 1.5 痘苗病毒基因组及相关功能基因 |
| 1.6 减毒天坛株痘苗病毒 |
| 1.7 病毒与宿主细胞间的相互作用 |
| 第2章 痘苗病毒在预防传染性疾病及治疗肿瘤中的应用 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 ACAM2000--第二代天花疫苗 |
| 2.3 第三代天花疫苗 CCSV |
| 2.4 CJ-50300 疫苗 |
| 2.5 第三代天花疫苗 LC16m8 |
| 2.6 痘苗病毒疫苗 CVI-78 |
| 2.7 改良的痘苗病毒安哥拉株 |
| 2.8 痘病毒载体 |
| 2.9 MVA 株痘苗病毒载体 |
| 2.10 第四代疫苗载体 NYVAC |
| 2.11 VACV 的发展前景 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 穿梭载体质粒的构建及 PE/L-EGFP 表达盒的验证 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 痘苗病毒多基因缺失株的构建、筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 痘苗病毒多基因缺失株的毒力检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 痘苗病毒多基因缺失株的免疫原性检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读研究生期间取得的科研成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（10）缺失宿主范围基因的重组痘苗病毒载体构建及在HIV-1抗原重组疫苗中的应用（论文提纲范文）
| 主要英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 前言 |
| 一. 痘苗病毒的生物学特征 |
| 二. 痘苗病毒载体的应用 |
| 三. 痘病毒载体在HIV疫苗研究中的应用 |
| 四. 研究的目的和意义 |
| 第二部分 实验材料与方法 |
| 一. 实验材料 |
| 二. 实验方法 |
| 第三部分 结果与分析 |
| 一. 重组痘苗病毒的构建 |
| 1. 穿梭质粒的构建 |
| 2. 重组痘苗病毒的构建、纯化和鉴定 |
| 二. 重组痘苗病毒的体外复制及安全性评价 |
| 1. 重组痘苗病毒体外复制动力学研究 |
| 2. 重组痘苗病毒的安全性评价实验 |
| 三. 缺失C7L/K1L基因对载体免疫原性 |
| 1. VTT载体免疫一次诱导的免疫应答 |
| 2. 重组VTT载体免疫多次诱导的免疫应答 |
| 四. 缺失C7L和/或K1L基因VTT载体疫苗的免疫原性研究 |
| 1. 重组痘苗病毒免疫一次针对外源HIV基因免疫原性 |
| 2. 重组痘苗病毒免疫两次针对外源HIV基因免疫原性 |
| 3. DNA疫苗初免一次-痘苗病毒多次加强免疫针对外源HIV基因免疫原性 |
| 4. DNA疫苗初免三次-痘苗病毒多次加强免疫针对外源HIV基因免疫原性 |
| 五.重组痘苗病毒针对载体本身免疫原性比较 |
| 1. 重组痘苗病毒免疫一次针对载体本身免疫原性 |
| 2. 重组痘苗病毒免疫两次针对载体本身免疫原性 |
| 3. DNA疫苗初免一次-痘苗病毒多次加强免疫针对载体本身免疫原性 |
| 4. DNA疫苗初免三次-痘病毒加强免疫针对载体本身免疫原性 |
| 第四部分 讨论 |
| 一. 研究背景 |
| 二. 痘苗病毒宿主范围基因的功能 |
| 三. 降低痘苗病毒毒力的改造策略 |
| 四. 降低载体反应的分析 |
| 五. 不同免疫策略之间的比较与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 正痘病毒宿主范围基因结构及功能研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 博士期间论文发表情况 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、痘苗病毒天坛株非必需区与病毒生物学性状的关系（论文参考文献）
- [1]山羊痘病毒N1蛋白生物学功能及其机制初步探究[D]. 杜倩. 广西大学, 2020(07)
- [2]基于痘病毒天坛株的H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的构建及其免疫原性分析[D]. 邱冉. 武汉生物制品研究所, 2020(01)
- [3]表达山羊痘病毒N1L基因重组痘苗病毒的构建及其生物学特性研究[D]. 辛佳亮. 广西大学, 2019(12)
- [4]猪痘病毒江西分离株全基因组测序及其复制非必需区的筛选[D]. 罗锋. 江西农业大学, 2017
- [5]天坛株痘苗病毒TC/TK基因缺失株的筛选与鉴定[D]. 郭丽娇. 长春中医药大学, 2017(06)
- [6]基于痘苗病毒载体的恶性肿瘤基因治疗研究进展[J]. 王世兵,陈侃,孔祥东. 中国细胞生物学学报, 2014(01)
- [7]基于三种病毒载体的新型HCV疫苗在恒河猴中的免疫学应答分析[D]. 文波. 吉林大学, 2013(04)
- [8]正痘病毒基因结构及功能研究的几项进展[J]. 刘铮,刘颖,邵一鸣. 病毒学报, 2013(04)
- [9]减毒痘苗病毒天坛株的构建、致病性及免疫原性研究[D]. 阚式绂. 吉林大学, 2013(08)
- [10]缺失宿主范围基因的重组痘苗病毒载体构建及在HIV-1抗原重组疫苗中的应用[D]. 刘铮. 中国疾病预防控制中心, 2013(03)