一、浙江蝮蛇毒碱性磷酯酶A的分离纯化及其性质的研究（论文文献综述）
盛欢[1]（2019）在《毒蛇咬伤后心肌酶和肝功能指标动态变化用于预后判断的价值评估》文中研究指明目的本研究通过回顾性分析安徽中医药大学第一附属医院急诊科收治的蝮蛇咬伤患者225例,对其住院期间的临床资料进行整理与统计学分析,动态观察蝮蛇咬伤患者心肌酶及肝功能指标,得出每个时间截断点上影响患者预后的因素,进行分析对比,从而有利于对疾病及早干预和治疗。方法回顾性分析安徽中医药大学第一附属医院急诊科2013年3月到2017年11月收治的225位蝮蛇咬伤患者的临床资料,且入选病例参照本研究的纳入标准、剔除标准。首先采集患者的姓名、性别、年龄、咬伤部位、职业分布、咬伤至入院时间、住院天数、住院总费用、是否口服中药等一般资料,根据抽血送检的实验室指标,主要收集并动态观察的指标为白细胞计数（WBC）、超敏C反应蛋白（HS-CRP）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、尿素氮（UREA）、血肌酐（SCR）、凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）,其中心肌酶3项指标为CK、CK-MB、LDH,肝功能3项指标为ALT、AST、TBIL。3次指标送检及观察时间分别为入院后24小时内、住院第3天、住院第5天。根据住院第5天患者咬伤后临床表现及复查的WBC、HS-CRP、CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、TBIL、UREA、SCR、PT、APTT检测指标,将患者分为痊愈组和好转组。运用SPSS 21.0软件,对一般资料及两组患者入院后24小时内、住院第3天、住院第5天的心肌酶及肝功能指标分别进行正态性检验和方差分析,对符合正态分布及方差齐性的计量资料采用两独立样本t检验,对非正态分布及方差不齐数据采用两独立样本秩和检验（Mann-whitney U检验）,数据用均数±标准差（sx±）表示,计数资料采用卡方检验。显着性水平是P﹤0.05。结果1.好转组住院总费用及天数均高于痊愈组,住院天数（z=7.427,P﹤0.01）、住院总费用（z=6.794,P﹤0.01）,差异有统计学意义;2.患者入院后予我院协定方蛇伤冲剂口服,其口服中药痊愈率占33.33%,未口服中药痊愈率占12%。χ2=11.762,p﹤0.01,差异有统计学意义;3.入院后24小时内,两组中肌酸激酶（z=5.795,p﹤0.01）、肌酸激酶同工酶（z=4.280,p﹤0.01）、乳酸脱氢酶（z=3.287,p=0.001）、丙氨酸氨基转移酶（z=4.429,p﹤0.01）、天门冬氨酸氨基转移酶（z=4.354,p﹤0.01）、总胆红素（z=2.265,p=0.024）差异有统计学意义;4.住院第3天,两组中肌酸激酶（z=1.849,p=0.064）、肌酸激酶同工酶（z=1.270,p=0.204）、乳酸脱氢酶（z=1.587,p=0.113）、丙氨酸氨基转移酶（z=1.707,p=0.088）、天门冬氨酸氨基转移酶（z=1.761,p=0.078）、总胆红素（z=0.894,p=0.372）差异无统计学意义（p均大于0.05）;5.住院第5天,两组中肌酸激酶（z=5.222,p﹤0.01）、乳酸脱氢酶（z=5.084,p﹤0.01）、丙氨酸氨基转移酶（z=3.744,p﹤0.01）、天门冬氨酸氨基转移酶（z=5.019,p﹤0.01）、总胆红素（z=2.641,p=0.008）差异有统计学意义;肌酸激酶同工酶（z=0.971,p=0.331）差异无统计学意义。结论1)痊愈组的住院总费用及天数均少于好转组（但好转组患者均最终痊愈出院）;2)经口服蛇伤冲剂（院内协定方）后,可明显改善患者临床症状;3)建议观察并监测入院后24小时内CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、TBIL及除外CK-MB的第5天CK、LDH、ALT、AST、TBIL指标,可不监测住院第3天的心肌酶及肝功能指标,即可有效评估患者预后,减少住院花费。
徐小娜[2]（2019）在《海洋链霉菌抗补体活性菌株筛选及活性产物研究》文中认为补体系统是人体非常重要的免疫防御系统之一,其在消除微生物入侵和维持机体的平衡等生理过程中起着重要作用。但是,补体系统如果过度激活会引起类风湿性关节炎、老年性痴呆及急性呼吸窘迫综合征等多种疾病。天然产物来源的抗补体活性成分具有可持续生产,且能在体内被直接消化吸收等优点因此引起了国内外学者广泛的关注。由于微生物易于培养、易于基因工程改良,且微生物来源的产品质量容易控制,所以微生物来源的抗补体活性物质具有良好的应用前景。然而,目前对微生物来源抗补体活性物质的研究还非常有限。海洋放线菌次级代谢产物复杂多样,且具有众多生物活性,如抗细菌、抗真菌、抗病毒、细胞毒性和抗肿瘤活性,因此海洋放线菌已成为新药研究与开发的新来源,但目前对海洋放线菌的抗补体活性物质的研究还处于起步阶段。本课题首先筛选了具有抗补体活性的海洋来源链霉菌,并对两株产抗补体活性物质的菌株星海链霉菌Streptomyces xinghaiensis NRRL B24674T（简称 S187）和海洋链霉菌Streptomyces sp.DUT11（简称DUT11）进行了深入研究,得到以下主要结果:（1）对分离自大连星海湾和小平岛海平面以下约10m处的海泥样品中的42株海洋放线菌进行了抗补体活性物质生产菌筛选,发现7株海洋放线菌的发酵液具有良好的抗补体活性。对这7株放线菌进行了 16S rRNA基因序列分析,发现这些海洋放线菌分别属于不同的种,提示可产生抗补体活性物质的海洋放线菌菌株有丰富的生物多样性。（2）进一步研究了具有良好抗补体活性的菌株星海链霉菌S187抗补体活性物质的生产,对其抗补体活性次级代谢产物的发酵培养基进行优化,并对抗补体活性物质进行了分离纯化和结构解析。首先,选取7种不同培养基对菌株S187进行了发酵条件优化,确定M12培养基为最佳培养基,并对其发酵条件进行优化,确定最佳发酵条件为:初始pH为7.0,温度为28 ℃,培养时间为6天。然后,比较了野生菌株S187和抗补体活性消失的突变菌株△sinH-P3的次级代谢物,寻找抗补体活性物质,液相色谱分析发现两个菌株的多个次级代谢物含量存在差别,结合液相质谱质谱联用分析,初步判断了抗补体活性化合物所对应的液相色谱对应峰。最后,通过抗补体活性追踪的方法,对菌株S187发酵提取物粗品进行了分离纯化,采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、薄层层析色谱和高效液相色谱等各种分离纯化的方法,从粗提物中纯化获得4个小分子化合物,经过理化性质、质谱和核磁共振分析（1H-NMR和13C-NMR）,并结合文献值对照,最终确定这4个化合物分别为2-吡咯甲酸、对羟基苯甲酸、邻羟基苯甲腈和邻氨基苯甲酸。活性测试表明,这4个化合物均有抗补体活性,其CH50分别为2.0 ± 0.3、0.8 ± 0.1、2.4± 0.5和2.5 ± 0.6 mmol/L。（3）以可生产抗补体活性物质的海洋链霉菌DUT11为研究对象,对其基因组序列进行分析,分析基因组次级代谢物生物合成基因簇信息,发现存在衣霉素生物合成基因簇。对DUT11的菌丝体和发酵液进行分析,发现均有衣霉素存在,进而通过优化培养基大量发酵获得粗提物,对抗补体活性组分进行薄层层析色谱、正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱和重结晶等各种分离纯化的方法,最终获得9个化合物,经过理化性质和高分辨质谱分析,确定了 5个化合物的结构,分别是衣霉素I、衣霉素II、衣霉素V、衣霉素VII、衣霉素X,其余4个化合物是经过理化性质和波谱分析（LC-MS、1H-NMR和13C-NMR）,并结合文献值对照,确定其结构分别是3-吲哚甲酸、对羟基苯甲酸、2-吡咯甲酸和无活菌素。在抗补体活性测试中除了无活菌素外,其它8个化合物均具有抗补体活性,其中衣霉素X的抗补体活性最好,其CH50为 0.041 ± 0.03 mg/mL。（4）对海洋链霉菌DUT11的衣霉素及抗补体活性物质发酵生产的最佳条件进行了优化。该菌株在NaCl浓度为10%时可以生长,NaCl浓度为3%时菌株生长最好,衣霉素的产量最大,为30.78 mg/L;而NaCl的浓度在0-5%时抗补体活性没有明显的变化。其次,对链霉菌株DUT11进行衣霉素生产培养基优化,确定了 M33培养基作为基础培养基。最后,采用了响应面方法对其培养条件进行优化,确定了衣霉素生产的最佳工艺条件为:可溶性淀粉的浓度（A）、黄豆粉的浓度（B）和酵母粉的浓度（C）分别为49.97、24.88和4.15 g/L,衣霉素的产量可到达57.03 mg/L;而抗补体活性物质生产的最佳工艺条件为A、B和C分别为47.56、18.00和3.92 g/L,提示该菌株可产生除衣霉素外的其他抗补体活性物质。本研究通过对抗补体活性物质生产菌的筛选,证明了许多海洋放线菌具有产生抗补体活性物质的潜力。同时,对星海链霉菌S187和海洋链霉菌DUT11的抗补体活性物质进行了分离纯化和结构鉴定,所取得的结果为进一步开发微生物来源的抗补体活性物质以及高效经济地生产抗补体活性药物提供了借鉴。
贺宜龙[3]（2014）在《眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化及鉴定》文中研究指明蛇毒中含有多种具有药理作用的多肽及蛋白质,三指蛋白属于其蛋白家族中的一种。近年来,三指蛋白止痛无成瘾性、无依赖性,用量少,镇痛作用时间长等优点已不断引起人们的关注,揭示其镇痛机制,从而开发出选择性高、安全性好、副作用小的镇痛药已成为亟待解决的问题。本文旨在探寻基于蛇毒三指蛋白的镇痛小肽并研究其镇痛作用,将眼镜蛇毒进行胃蛋白酶水解后分离纯化,寻找可口服并能快速起效的镇痛小肽,为研究三指蛋白的镇痛机制奠定一定基础并为相关研究提供参考依据。本实验首先将眼镜蛇蛇毒进行沸水浴处理以获得含有三指蛋白在内的热稳定性高的碱性蛋白混合物,再模拟胃部条件不同时间梯度水解眼镜蛇蛇毒,用热板法检测不同水解时长的产物的镇痛活性;采用高效液相色谱对水解产物进行分离纯化以及纯度鉴定;用热板法观察所得小肽的镇痛作用。结果表明眼镜蛇蛇毒经胃蛋白酶适当水解后灌胃有显着镇痛效果,并且水解6 h后对小鼠灌胃的镇痛效果最好,10 min即可起效并且药效稳定维持至48h以上;腹腔注射组与灌胃组结果相反,随着水解程度的加深至彻底水解,腹腔注射水解混合小肽基本无镇痛效应。HPLC分离纯化后在12 min左右收集的组分经热板法验证与之前结果较一致,经纯化后进行MALDI-TOF鉴定,其分子量约为1267.727,比对数据库确定其氨基酸序列为KDHRGTRIER,合成此段小肽,通过对小鼠灌胃的镇痛实验效果来看,10 min即观察到明显痛阈提高,镇痛持续时间较长,可维持48 h,小鼠痛阈值可提高60%左右,与之前的结果较一致。初步认为我们已获得快速起效、镇痛药效时间长且可口服的镇痛小肽,其镇痛机制尚待进一步研究。
谢香庭[4]（2012）在《菌株Hansschlegelia zhihuaiae S113水解甲磺隆的羧酸酯酶分离纯化及其酶学特性研究》文中进行了进一步梳理磺酰脲类除草剂是非常重要的一类除草剂,可用于防除大多数农作物杂草。磺酰脲类除草剂通过抑制乙酰乳酸合酶（ALS）酶活而阻断了细菌、真菌、植物体内的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等侧链氨基酸的生物合成途径。磺酰脲类除草剂在除草性能上具备用量少、效率高且可用于多种农作物的优点,但其存在的缺点亦不容忽视。磺酰脲类除草剂属于弱酸,在中性或碱性土壤中,甲磺隆、氯嘧磺隆及胺苯磺隆等降解非常缓慢,残留期长达数月甚至超过一年。除草剂在土壤中的残留能对下茬敏感性农作物如豆类和油菜等产生药害,导致巨大的经济损失。生物修复因其经济安全,方便高效的优点成为消除磺酰脲类除草剂残留污染的重要手段。去酯化是磺酰脲类除草剂的一个重要的降解途径和脱毒手段。本研究发现菌株Hansschlegelia zhihuaiae S113可通过去酯化使磺酰脲变成相关的无除草活性的羧酸化衍生物。目前,已有土壤微生物通过去酯化降解磺酰脲类除草剂如噻吩磺隆和甲磺隆的报道,但关于催化去酯化的羧酸酯酶的定量测定、酶学特性、分离纯化等还没有相关报道。本研究将对菌株S113中水解甲磺隆的羧酸酯酶进行分离纯化,进而研究该纯酶的酶学特性。这项研究对于相关基因的克隆及酶制剂的开发应用奠定了良好的基础。本研究所获得的主要结果如下：通过HPLC-MS/MS测定,发现菌株S113通过去酯化途径降解甲磺隆,代谢产物为去酯后相应的酸。通过硫酸铵分级沉淀、DEAE离子交换层析及PAGE切胶回收从菌株S113中分离纯化了甲磺隆羧酸酯酶。甲磺隆羧酸酯酶为二聚体,分子量是86kDa,等电点约为8.4。该酶的最适pH范围是7.5-8.0。在pH6.0～8.5范围内酶活比较稳定,在该pH范围内的缓冲液中保温一小时酶活还保持在初始的85%以上。甲磺隆羧酸酯酶的最适温度是40℃。在高达45℃缓冲液中处理1h后,此酶的酶活还能保持初始的85%左右。在55℃缓冲液中处理之后,酶活还保留初始的20～40%,65℃时酶活基本丧失。此酶能被金属离子Ag+, Cd2+and Zn2+（1.0mM）、有机磷农药甲胺磷（2.0mM）、表面活性剂SDS抑制90%以上的酶活,而Ni2+（1.0mM）能抑制40～50%的酶活。该酶能使具甲基酯键或乙基酯键的磺酰脲类除草剂去酯化。有意思的是,此酶对各类具一个酯键的磺酰脲除草剂的米氏常数Km值相近。此酶对于噻吩磺隆的催化效率比其他磺酰脲除草剂高了至少10倍,而对这些除草剂的催化常数则是相近的。
张建波[5]（2012）在《北方地区蝮蛇咬伤后脏器损伤及凝血系统影响研究》文中指出目的蝮蛇是北方地区野外蛇咬伤的主要蛇种，国内常见的各类蝮蛇均为剧毒蛇，咬伤后可引起脏器损伤、凝血功能异常、DIC样综合征等全身表现，及局部出血、坏死等局部表现。我科为北方地区蛇咬伤救治中心，年接诊北京各城郊区及周边省市蛇咬伤病例逾200例。本研究回顾性分析部分蝮蛇咬伤病例资料，系统性阐述北方地区蝮蛇咬伤后脏器功能及凝血系统功能变化及DIC样综合征，以对其临床特点具备必要的认识，对临床治疗及病情观察提供必要的指导及理论依据。背景各类毒蛇咬伤在国内大部分地区均有一定数量的报道，涉及蝮蛇、竹叶青蛇、眼镜蛇等蛇种，报道内容涉及脏器损伤、凝血系统异常、DIC样综合征、MODS、呼吸循环衰竭，及部分蛇毒的分析等等，但对于某一地区或具体蛇种的大样本致伤情况尚未见报道。方法1病例搜集：以2008年6月至2011年9月解放军总医院第一附属医院急救部接诊并收治的蝮蛇咬伤病例为研究对象，按照中国中西医结合学会修订的临床分型标准，选择伤情评定为重度以上的患者，按其资料完整性分别研究脏器损伤及凝血系统功能障碍。2研究方法：筛选出检验结果等资料完整的病例共128例，分别治疗中多次采血检验血常规、血凝、生化及尿、便常规、便潜血等。将20例健康成人的相应指标作为正常对照，分别用t检验（或t’检验）分析比较两组间部分指标有无差异，若P＜0.05表示有显着性差异。对于血凝指标，以时间曲线表达变化规律；对于确诊DIC样综合征的病例情况，以时间曲线说明发生例数，并以实际数据列表举例。结果北方地区蝮蛇咬伤局部症状较为明显，可发生局部肿胀、皮下出血、局部皮肤软组织坏死等，但创口/创面一般愈合良好，罕有化脓感染；复视、呼吸困难等神经毒表现轻微，发生率低；伤后24h之内即可发生机体明显炎症反应，WBC显着性增高，可持续2～4天不等，10.2%的患者可先后出现PLT下降，多数可于5天内恢复正常；约11.7%的患者发生肝功异常，可持续5～6天以上；5.5%的患者发生轻度肾功异常，约2～4天内即可恢复；21.9%的患者发生心肌酶异常，可持续6天或更长时间，但ECG一般无典型改变；MODS发生率约0.8%。凝血系统影响明显，最短于24h之内检出异常，一般于伤后2472h之内，持续27天不等。可造成PT、TT延长、Fg降低，APTT变化不显着，有9.4%的患者可发生DIC样综合征。D-Dimer在24h内即可升高，可能对凝血系统异常有早期预测价值。皮下出血发生较多，但如救治得当，一般不发生颅内出血、内脏出血等并发症。经治疗出院时总体有效率91.4%，治愈率60.9%，无治疗无效情况。出院后随访1月，各类轻微后遗症发生率约7.8%，一般不留肢体残疾等后遗症。结论北方地区蝮蛇咬伤以凝血系统损害、心肌损害、肝功损害为主，严重者可发生MODS、DIC样综合征，有出血倾向，局部症状较重，多数有皮下出血。经及时、合理治疗，24h内就诊患者一般治疗有效率91.4%，治愈率60.9%，一般不留肢体残疾等后遗症，不发生严重颅内出血、脏器出血等情况。
乔玉莉[6]（2012）在《广西眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响》文中认为目的从广西产眼镜蛇（Naja）蛇毒中分离纯化磷脂酶A2（phospholipase A2, PLA2）,并研究其理化性质及其对肝癌细胞生长的影响。方法（1）采用凝胶过滤层析法和离子交换层析法分离眼镜蛇粗毒,经平板法和自动电位滴定法测定各峰的PLA2活性,得到具有PLA：活性的组分Ⅰ（命名为DEAE Ⅰ）,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）和MALDI-TOF鉴定其纯度并测定分子量。（2）通过自动电位滴定法测定DEAE Ⅰ的最适温度、最适pH及热稳定性。并通过动物急性毒性实验,研究DEAE Ⅰ的LD5o。（3）通过MTT实验研究DEAE Ⅰ对正常成人肝细胞（HL-7702）和肝癌细胞（SMMC-7721）的细胞毒性,并用倒置相差显微镜观察细胞形态的改变。（4）利用扫描电镜观察DEAE Ⅰ对细胞形态学改变的影响。（5）采用流式细胞术,用Annexin Ⅴ/PI双染色法检测细胞凋亡,用PI染色法检测细胞周期,观察PLA2对细胞凋亡及周期的影响,进一步推测其作用机制。结果（1）通过凝胶过滤层析法和离子交换层析法,分离得到具有PLA2活性的组分Ⅰ（即DEAE Ⅰ）,自动电位滴定法测DEAE Ⅰ的PLA2活力为66.12μmol/（mg*min）;经SDS-PAGE,得出该组分的分子量约为14.4KD,且基本达电泳纯。该组分经HPLC-TSK2000凝胶柱鉴定,仅有单一峰,且基本对称,说明该组分基本达90%以上。经MALDI-TOF鉴定的分子量为13282.02Da。（2）自动电位法测得DEAE Ⅰ的最适温度约为50℃,最适pH在6.0附近,且具有良好的热稳定性。急性毒性实验结果显示,DEAE Ⅰ对昆明小鼠的半数致死剂量（LD50）为13.86±0.057mg/Kg,表明对动物的毒性较小。（3）将DEAE Ⅰ作用于HL-7702及SMMC-7721,通过其对细胞的剂量依赖性和时间依赖性的筛选,确定DEAE Ⅰ的最佳作用浓度为200μg/ml,最佳最用时间为48h。将200μg/ml的DEAE Ⅰ作用于细胞,发现其对HL-7702细胞的抑制率为66.34±12.62%：对SMMC-7721的抑制率为77.82±9.70%。统计分析表明,DEAE Ⅰ对细胞的抑制率与10μg/ml的CDDP对细胞的抑制率差别无统计学意义（p>0.05）；与粗毒（3μg/ml）、G50Ⅰ （40μg/ml）和CM Ⅰ （80μg/ml）比较,p<0.05,表明DEAE Ⅰ与之差别有统计学意义。将DEAE Ⅰ对SMMC-7721的抑制率与HL-7702比较,发现其对SMMC-7721的抑制作用稍强（p<0.05）。（4）细胞形态学的扫描电镜结果显示,DEAE Ⅰ作用24h能使少部分HL-7702和SMMC-7721形成有膜包围的含有核和细胞质碎片的大小不一的凋亡小体状结构,且细胞死亡较少；作用48h,两株细胞均见到明显的凋亡小体样结构,但HL-7702坏死较多。（5）流式细胞仪检测凋亡结果显示,DEAE Ⅰ作用24h后,HL-7702和SMMC-7721无明显的凋亡发生。延长作用时间至48h,DEAE Ⅰ作用于SMMC-7721诱导出现明显的凋亡,凋亡率为33.03%；而作用于HL-7702细胞的凋亡率仅为5.62%,但细胞碎片比较大增；而CDDP对两株细胞的抑制率分别为41.92%和87.37%。（6）细胞周期结果显示,DEAE Ⅰ作用24h后,HL-7702细胞S期值略增高,其他时相均有所下降；而SMMC-7721的细胞周期G0/G1期增加；而CDDP作用与两株细胞24h后,均见凋亡峰。作用48h后,DEAE Ⅰ可使两株细胞的G0/G1期数值均增加,CDDP可使HL-7702出现大量坏死。结论（1）分离得到的组分DEAE Ⅰ具有磷脂酶A：的酶活力,经SDS-PAGE和MALDI-TOF鉴定其分子量为13282.02Da。（2）电位滴定法测得的DEAE Ⅰ的最适温度在50℃左右,最适pH约为6.0,并具有良好的热稳定性。动物急性毒性实验表明DEAE Ⅰ对小鼠的毒性较小。（3）MTT结果显示200μg/ml的DEAE Ⅰ对细胞的作用与10μg/ml的CDDP相当；将DEAE Ⅰ对SMMC-7721的抑制率与HL-7702比较,发现其对SMMC-7721的抑制率稍强。（4）细胞形态学的电镜观察,DEAE Ⅰ能诱导SMMC-7721的凋亡,但对HL-7702的诱导作用稍弱。（5）采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,发现DEAE Ⅰ作用两株细胞48h均能诱导凋亡,但对HL-7702的诱导作用稍弱；并能使两细胞的G0/G1期增加。
程果[7]（2011）在《蚯蚓提取物镇痛有效成分分离纯化及镇痛作用的研究》文中研究说明本文为了探索蚯蚓提取物中的镇痛有效成分,对蚯蚓体内镇痛活性物质进行了分离纯化,研究其镇痛活性和作用,研究方法和结果如下：一.分离纯化：利用30%硫酸铵沉淀法对蚯蚓组织匀浆进行蛋白分离,分离产物利用27mm（MD34）透析袋（MW：12000-14000）进行透析。采用CM Sephadex C-50阳离子交换层析从蚯蚓蛋白粗提物中分离纯化出5个波峰,并采用Bulbring法筛选出其中两种可能具有镇痛活性的组分,分别为ACAE-C和ACAE-D;再利用Sephadex G-75凝胶过滤层析进一步分离纯化得到4个波峰,分别为ACAE-C1、ACAE-C2、ACAE-D1、ACAE-D2。利用SDS-PAGE样品凝胶,在Biosens SC805凝胶成像系统上成像,以Marker为对照,通过系统软件计算样品分子量,ACAE-C1分子量大约为28.3kD, ACAE-D1分子量约为26.4～32.3kD之间,ACAE-D2分子量约为26.0～31.8kD之间。二.镇痛成分的作用研究：1.小鼠热板法,测定了经Bulbring法筛选出的2个镇痛活性组分的镇痛作用。实验发现,ACAE-C和ACAE-D能够有效的提高痛阈,延长小鼠发生舔足反应的时间2.醋酸扭体法,实验发现,ACAE-C和ACAE-D能够有效的提高痛阈,减少小鼠因疼痛引起的扭体反应,并发现,蚯蚓提取物对痛阈的影响强度与剂量成正比,给药60min后,镇痛效果最佳,从而进一步证实了ACAE-C和ACAE-D的镇痛效果。3.Bulbring法,制备大鼠膈肌-膈神经离体模型,分别刺激膈神经和膈肌,筛选具有镇痛活性组分,并研究其作用靶点。实验发现,ACAE-C1组分对电刺激膈神经引起的肌肉收缩具有一定的抑制作用,对电刺激膈肌引起的肌肉收缩现象没有影响,其对电刺激神经引起的肌肉收缩的抑制作用抑制率可以达到50%-55%。三.动物实验采用经硫酸铵沉淀法制备的蚯蚓蛋白粗提物对小鼠Ⅱ度烫伤模型进行治疗,发现通过创面涂抹进行了5倍稀释或10倍稀释的蚯蚓蛋白粗提物,可以有效增加烫伤愈合面积,提高烫伤愈合率,加快结痂和痂皮脱离速度。通过免疫组织化学染色诊断发现,在烫伤初期蚯蚓蛋白粗提物可以加速肉芽组织对创面的充填,烫伤中后期可以加速血管细胞再生和减少炎性细胞的浸润。本实验首先通过CM Sephadex C-50阳离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析,从蚯蚓蛋白组分中分离纯化到一种具有镇痛活性较强的物质的ACAE-C1,该组分是一种小分子蛋白质,分子量约为28.3kD；其次研究了各级纯化产物对动物镇痛作用的影响,发现ACAE-C和ACAE-D具有镇痛活性；再次利用蚯蚓蛋白组分对小鼠Ⅱ度烫伤进行治疗,发现该组分具有加速创面愈合,减少炎性产物渗出的作用。
郝彩[8]（2011）在《广东舟山眼镜蛇（Naja naja atra）蛇毒心脏毒素和磷脂酶A2的分离纯化与性质鉴定》文中指出蛇毒是由蛇的毒液腺分泌出的一种天然毒蛋白,化学成分非常复杂,含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他非蛋白类小分子物质,具有广泛的生物学活性。心脏毒素和磷脂酶A2是蛇毒液中含量较为丰富的组分,由于其具有多种药理学活性和较高的临床应用价值,近年来得到了广泛的关注和深入的研究。而获得单一的活性成分是对其进行理化性质分析、药理活性检测和临床应用的前提。传统的眼镜蛇蛇毒分离纯化方法过程繁复,耗时较长,而且一般仅应用于实验室,工艺较难放大用于规模化生产。因此,本课题拟在实验室前期工作的基础上,参考浙江大学童富淡等人的分离纯化方法,采用有机溶剂对眼镜蛇粗毒进行预处理,并结合层析方法欲建立一种简便、得率高、产物纯度高且适用于规模化分离纯化眼镜蛇毒心脏毒素等小分子功能多肽的工艺路线。并对纯化出的功能多肽进行初步的理化性质和药理学性质鉴定,为研制开发新的蛇毒多肽类药物提供一定的实验基础和理论依据。方法与结果1.本文建立了简单有效可同时从广东舟山眼镜蛇蛇毒中分离纯化出磷脂酶A2和心脏毒素两种组分的方法。即采用有机沉淀预处理结合凝胶过滤和离子交换层析完成。该方法纯化得到的产物纯度和得率都比较高,且适用于多种产地的舟山眼睛蛇毒的分离纯化。2.对磷脂酶A2组分GI2的理化性质及药理学性质进行了鉴定。该组分的分子量约为14300Da,纯度和得率分别为99%和9.5%。PLA2酶活力可达133μmol·mg-1·min-1,其最适反应温度和pH分别为60℃和8.5,具有较高的热稳定性,金属离子对酶活性有较大影响,Ca2+、Mg2+可增强PLA2的酶活性,K+、Ni2+对酶活性稍有抑制,Fe2+、Cu2+、Zn2+、Co2+和Cr2+对酶活性有较强的抑制作用。蛙心灌流实验及MTT实验结果表明,该组分还具有较强的心脏毒性,并能够以剂量依赖性方式抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖。3.对心脏毒素组分GI3的理化性质及药理学性质进行了鉴定。该组分的分子量为6725.8Da,纯度和得率分别为99%和10.1%。Edman降解法测定了N末端30个氨基酸序列,LKCNKLVPLFYKTCPAGKNLCYKMFMVSNL,通过同源性检索,发现它与心脏毒素保守序列具有较高的同源性,证明它是一种心脏毒素。这种毒素的半数致死剂量为2.4795mg/kg,通过热板实验测得其具有长效的镇痛活性,并且呈剂量相关性。另外对乳腺癌细胞MCF-7具有剂量相关的细胞毒性。结论1.建立了从舟山眼睛蛇蛇毒中同时分离纯化磷脂酶A2和心脏毒素两种成分的有效方法。2.经性质鉴定,发现离子交换主峰GI2是一种磷脂酶A2组分,其纯度和得率分别为99%和9.5%,相对分子质量为14300Da。该酶热稳定性较高,最适反应温度和pH分别为60℃和8.5,金属离子对其酶活性有一定的影响。另外它还具有心脏毒性和细胞毒性。3.经性质鉴定,发现离子交换主峰GI3是一种心脏毒素组分,其纯度和得率分别为99%和10.1%,相对分子质量为6725.8Da。N末端序列测定和同源性检索证实GI3是心脏毒素。其具有较强的镇痛活性和细胞毒性。
王晴川,刘广芬[9]（2009）在《蛇毒的非抗毒血清解毒剂研究进展》文中进行了进一步梳理对于蛇毒的解毒和蛇伤的治疗,除了特效的抗毒血清外,一些化学物质,包括植物药,动物体中成分,化学药品等,通过不同作用方式,对蛇毒也有不同程度的解毒作用,有的也已试用于临床,以弥补抗毒血清的不足。本文综述了这方面的进展。
顾海峰[10]（2007）在《柿子单宁的性质、结构及其与几种蛇毒蛋白的相互作用研究》文中进行了进一步梳理本文采用无水甲醇为提取溶剂从柿子果肉中提取单宁，通过考察提取剂种类、提取温度、时间、提取次数及料液比等因素来确定了柿子单宁的最佳提取工艺；采用大孔树脂101结合超滤分离实现了柿子单宁的分离纯化及分级制备，得到了高分子量单宁（HMWT）和小分子量单宁（SMWT）两个级分。采用高效液相-电喷雾质谱联用（HPLC-ESI-MS）对小分子结构进行了初步鉴定；采用凝胶渗透色谱（GPC）、傅立叶红外光谱（FT-IR）以及硫解和酸解结合HPLC-ESI-MS等方法分析了HMWT分子量分布以及单体结构；并对HMWT与SMWT在不同体系中的的抗氧化活性及HMWT与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用进行了系统研究；同时重点研究了HMWT在体外对江浙蝮蛇毒（AhPVP）、尖吻蝮蛇毒（AaVP）、眼镜蛇毒（NnaVP）中蛋白酶活的抑制能力及体内对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的解毒效果；并结合SDS-PAGE凝胶电泳、红外光谱（FT-IR）、圆二色谱（CD）初步研究了HMWT与蛇毒蛋白的相互作用机理。主要研究结果如下：1．柿子单宁的最佳提取工艺为：新鲜果肉去皮打浆后，以含1％HCL的无水甲醇作为提取介质，料液比1∶12，90℃加热回流提取，提取3次，每次40min。2．提取液经大孔树脂101除糖去杂，聚砜超滤膜分级得到红色的HMWT粉末以及淡黄色SMWT粉末，HMWT缩合单宁（CT）含量93.4％，SMWT总酚（TP）含量为87.4％。两者具有典型的酚类物质显色特征，易溶于水，乙醇，甲醇等溶剂，其中HMWT在水中的最大溶解度为100mg／mL。3．经HPLC-ESI-MS鉴定SMWT主要为没食子酸及分子量分别为461，461，603的三个未知化合物。HMWT分子量分布在1.16×104u-1.54×104u之间，重均分子量1.39×104u，数均分子量1.28×104u，FT-IR表明HMWT具有原花青素的基本骨架结构，硫解和酸解的HPLC-ESI-MS表明其主要组成单体为：表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），表儿茶素没食子酸酯（ECG），（表）没食子儿茶素（E）GC及一种未知结构的单体。4．HMWT在2-脱氧-D-核糖体系，甲基紫体系，水杨酸体系中对羟基自由基的最大抑制率分别为90.47％、96.46％和87.77％；对邻苯三酚自氧化以及亚油酸脂质过氧化的最大抑制能力分别为56.57％和69.63％。在所有的体系中HMWT的抗氧化能力与加入量呈明显的剂量效应关系，且HMWT的抗氧化能力要优于相同浓度下的葡萄籽原花青素，大大强于SMWT，是柿子单宁抗氧化作用的主导成分。5．HMWT与明胶和BSA均具有较强的结合能力，明胶、BSA与HMWT质量比达到1.6∶1时单宁沉淀率达到最大。HMWT与BSA结合的适宜条件为：温度40℃，反应时间30min，体系pH5.0，0.5mol／L的NaH2PO4为溶解介质。荧光光谱和紫外吸收光谱法分析表明，HMWT可以有规律地使BSA内源荧光猝灭，其猝灭机理可认为是HMWT与BSA形成复合物的静态猝灭、HMWT与BSA的作用力为疏水作用力和静电作用力，同时由F（?）rster非辐射能量转移理论计算得出HMWT与BSA结合位置的距离为1.63nm，结合位点0.99。6．HMWT溶液在光照、温度大于60℃、pH大于7条件下稳定性较差；具有较好的抗氧化性和抗还原性；食品添加剂中β-环状糊精有利于增加HMWT的热稳定性、淀粉在溶液中含量超过O.5％时易与HMWT发生复合作用，柠檬酸三钠对稳定性有较大的影响，柠檬酸、EDTA则影响较小；金属离子中Fe3+，AL3+，Zn2+对HMWT有着较强的结合作用，Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+则影响较小。7．当蛇毒蛋白与HMWT质量比为1∶1时，HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP中蛋白质水解酶、磷脂酶A2、L-氨基酸氧化酶、精氨酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、类凝血酶的酶活均基本完全抑制，且呈明显的剂量效应关系。8．HMWT对昆明小鼠腹腔注射的LD50值为301.84mg／kg，具有良好的安全性。当蛇毒蛋白与HMWT质量比为1∶1时，HMWT对AhPVP，AaVP，NnaVP引起的肌肉毒性有极显着（p＜0.01）的抑制作用，肌酸激酶（CK）的酶活抑制率分别为63.30％，55.06％，61.82％，肌肉组织病理学观察也显示出明显的剂量效应关系，高剂量组小鼠肌纤维损伤明显好转。当蛇毒蛋白与HMWT质量比为1∶1时，HMWT能够极显着（p＜0.01）降低AhPVP，AaVP引起的皮下出血，出血抑制率分别为98.6％，96.9％，HMWT对出血的抑制呈明显的剂量效应关系。9．5LD50剂量的AhPVP、AaVP、NnaVP注射入昆明小鼠腹腔后，口服灌胃HMWT后可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活时间分别延长4-6倍、3-5倍和2-4倍，高剂量的HMWT可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒小鼠存活率分别提高到75％、50％和25％。腹腔注射HMWT后可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活时间分别延长15-30倍、15-20倍和5-15倍，高剂量组对各种蛇毒的解毒作用强，小鼠存活率达100％。静脉注射HMWT对小鼠的急救效果最佳，HMWT中剂量组即可使各组小鼠存活率达100％，低剂量组也能大大延长存活时间并且存活率分别达到了50％、75％、50％。三种解救方式对蛇毒引起的毒害均有急救效果，口服灌胃虽然存活率不高但能有效的延长存活时间，而腹腔注射和静脉注射则能有效提高存活率。口服预防给药HMWT可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活时间分别延长3-5倍、3-5倍和1-3倍，说明服用HMWT对蛇毒引起的毒害有一定的预防作用。10．SDS-PAGE结果表明HMWT与蛇毒蛋白结合形成沉淀是导致酶失活的重要原因，虽然HMWT对蛇毒中蛋白质组分的结合表现出一定的非特异性，但对不同组分结合能力和选择性明显不同，且为非可逆结合。AhPVP经Sephadex G-75两次纯化及DEAE Sephadex A-50离子交换层析得到分子量14000的电泳纯磷脂酶A2。红外及圆二色谱结合表明，HMWT中的酚羟基与PLA2中的氨基的相互作用在结合过程中起着重要的作用，且HMWT对PLA2的a-螺旋结构有强烈的破坏作用。
二、浙江蝮蛇毒碱性磷酯酶A的分离纯化及其性质的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、浙江蝮蛇毒碱性磷酯酶A的分离纯化及其性质的研究（论文提纲范文）
（1）毒蛇咬伤后心肌酶和肝功能指标动态变化用于预后判断的价值评估（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 1.前言 |
| 1.1 中医学与毒蛇咬伤 |
| 1.2 西医学与毒蛇咬伤 |
| 1.3 本文研究的意义 |
| 2.临床研究 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.2 研究方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 结果 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 5.1 蝮蛇流行病学现状 |
| 5.2 研究结果分析 |
| 6 问题与优势 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（2）海洋链霉菌抗补体活性菌株筛选及活性产物研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词表 |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 天然产物抗补体活性物质研究进展 |
| 1.1.1 多糖类化合物 |
| 1.1.2 黄酮类化合物 |
| 1.1.3 甾体类化合物 |
| 1.1.4 皂苷类化合物 |
| 1.1.5 萜类化合物 |
| 1.1.6 生物碱类化合物 |
| 1.1.7 酶类化合物 |
| 1.1.8 其它类化合物 |
| 1.2 海洋放线菌代谢活性物质研究进展 |
| 1.2.1 海洋放线菌概述 |
| 1.2.2 抗补体活性物质 |
| 1.2.3 抗肿瘤活性物质 |
| 1.2.4 抗菌活性物质 |
| 1.2.5 酶抑制活性物质 |
| 1.2.6 其它活性物质 |
| 1.3 海洋放线菌基因组挖掘研究进展 |
| 1.3.1 海洋放线菌基因组测序 |
| 1.3.2 基因组挖掘技术发现新型化合物 |
| 1.4 本文研究目的及意义 |
| 2 海洋放线菌抗补体活性菌株的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料、试剂及仪器 |
| 2.2.1 实验菌株 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 主要试剂及耗材 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 溶液的配制 |
| 2.3.2 临界补体浓度的测定 |
| 2.3.3 不同菌株次级代谢产物的补体活性测定 |
| 2.3.4 基因组DNA的提取 |
| 2.3.5 16S rRNA的PCR扩增及系统发育分析 |
| 2.3.6 菌株的耐盐实验 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 临界补体浓度的确定 |
| 2.4.2 海洋放线菌抗补体活性菌株的筛选 |
| 2.4.3 16S rRNA的扩增及序列比对分析 |
| 2.4.4 菌株的耐盐性质 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 星海链霉菌S187抗补体活性物质的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 主要试剂及耗材 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌株S187发酵培养条件优化及产物富集培养 |
| 3.3.2 菌株S187发酵液的热稳定性测试 |
| 3.3.3 菌株S187萃取物的抗补体活性测定 |
| 3.3.4 菌株S187次级代谢产物的提取分离 |
| 3.3.5 突变菌株△sinH-P3次级代谢产物的提取分离 |
| 3.3.6 次级代谢产物的高效液相色谱分析及结构鉴定 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 菌株S187培养发酵条件 |
| 3.4.2 菌株S187发酵液的热稳定性能 |
| 3.4.3 菌株S187次级代谢物的抗补体活性 |
| 3.4.4 突变菌株△sinH-P3和野生型菌株S187次级代谢产物比对 |
| 3.4.5 菌株S187次级代谢产物的结构鉴定 |
| 3.4.6 化合物的抗补体活性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 海洋链霉菌DUT11抗补体活性物质的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验菌株 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 试剂及耗材 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌株DUT11形态学观察 |
| 4.3.2 菌株DUT11耐盐实验 |
| 4.3.3 菌株DUT11全基因组序列测定、注释与分析 |
| 4.3.4 菌株DUT11发酵培养基优化及产物富集培养 |
| 4.3.5 菌株DUT11次级代谢产物的提取分离 |
| 4.3.6 菌株DUT11次级代谢产物的分析及结构鉴定 |
| 4.3.7 菌株DUT11次级代谢产物活性测试 |
| 4.3.8 衣霉素发酵条件优化 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 菌株DUT11形态特征 |
| 4.4.2 菌株DUT11耐盐性能 |
| 4.4.3 菌株DUT11全基因组序列测定、注释与分析 |
| 4.4.4 菌株DUT11次级代谢产物的结构鉴定 |
| 4.4.5 菌株DUT11次级代谢产物的活性分析 |
| 4.4.6 衣霉素的富集发酵培养条件 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 核磁谱图 |
| 附录B 海洋链霉菌16S rRNA序列扩增及测序信息 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（3）眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 疼痛疾病 |
| 1.2 疼痛产生的机制 |
| 1.3 镇痛药 |
| 1.4 镇痛毒素 |
| 1.4.1 蛇毒(Snake venom,SV) |
| 1.4.1.1 蛇毒的镇痛机制 |
| 1.4.1.2 蛇毒类药物的应用 |
| 1.4.2 芋螺毒素(Conotoxin,CTX) |
| 1.4.3 河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) |
| 1.4.4 蜘蛛毒素(Spider toxin, ST) |
| 1.4.5 蝎毒素(Scorpion venom,SV) |
| 1.5 蛇毒三指蛋白(three-finger protein) |
| 1.5.1 蛇毒三指蛋白的结构多样性 |
| 1.5.1.1 额外的二硫键 |
| 1.5.1.2 N末端以及C末端的延伸 |
| 1.5.1.3 Bulongin以及相关毒素 |
| 1.5.1.4 三指蛋白的糖基化 |
| 1.5.1.5 非共价二聚物 |
| 1.5.1.6 共价二聚体 |
| 1.5.1.7 协同毒素 |
| 1.5.2 蛇毒三指蛋白的分类 |
| 1.5.3 蛇毒三指蛋白的功能位点 |
| 1.5.4 蛇毒三指蛋白的理化性质 |
| 1.5.5 蛇毒三指蛋白的应用 |
| 1.5.5.1 在镇痛方面的应用 |
| 1.5.5.2 在其他领域的应用 |
| 1.6 三指蛋白研究的目的及意义 |
| 1.7 研究的主要内容 |
| 1.8 本研究的技术路线 |
| 第二章 眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 获取蛇毒三指蛋白 |
| 2.3.2 胃蛋白酶水解 |
| 2.3.3 给药方式 |
| 2.3.4 镇痛活性测定 |
| 2.3.5 HPLC法分离纯化 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 蛇毒酶解液对小鼠进行腹腔注射及灌胃给药的影响 |
| 2.4.2 镇痛小肽的分离纯化 |
| 2.4.3 收集组分的镇痛活性 |
| 2.4.4 有效组分的纯化 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 活性肽的鉴定与合成 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 活性肽的鉴定 |
| 3.3.1.1 肽段纯化 |
| 3.3.1.2 质谱检测 |
| 3.3.1.3 查询条件 |
| 3.3.2 活性肽的合成 |
| 3.3.3 合成肽的镇痛活性测定 |
| 3.3.4 合成肽的HPLC |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 活性肽的分子量及氨基酸序列 |
| 3.4.2 活性肽的合成 |
| 3.4.3 合成肽的镇痛活性 |
| 3.4.4 合成肽与活性肽的液相色谱对比 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（4）菌株Hansschlegelia zhihuaiae S113水解甲磺隆的羧酸酯酶分离纯化及其酶学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语说明 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一、磺酰脲除草剂研究进展 |
| 1 磺酰脲类除草剂的简介 |
| 2 磺酰脲类除草剂的作用机理 |
| 3 磺酰脲除草剂的药害 |
| 3.1 磺酰脲类除草剂对后茬作物的药害 |
| 3.2 磺酰脲类除草剂对其他环境生物的影响 |
| 4 磺酰脲类除草剂在土壤中的行为 |
| 4.1 吸附 |
| 4.2 淋溶 |
| 4.3 水解 |
| 4.4 光解 |
| 5 横酰脲类除草剂的微生物降解情况 |
| 5.1 降解磺酷脲类除草剂的微生物 |
| 5.2 横酷服类除草剂的微生物降解途径 |
| 二、蛋白质的分离纯化技术概述 |
| 1 蛋白质提取方法 |
| 1.1 水溶液提取 |
| 1.2 酶提取 |
| 1.3 有机溶液提取 |
| 1.4 超声波提取 |
| 2 蛋白质的分离与提纯 |
| 2.1 基于分子大小差异的分离 |
| 2.2 基于溶解度不同进行的分离技术 |
| 2.4 基于选择性吸附差异的分离 |
| 2.5 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化-亲和层析 |
| 3 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第一章 甲磺隆羧酸酯酶的分离纯化 |
| 第一节 甲磺隆羧酸酯酶定性检测方法和粗酶液反应体系研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 菌株的培养 |
| 1.5.2 粗酶液的制备 |
| 1.5.3 粗酶液酶活测定方法 |
| 1.5.4 甲磺隆羧酸酯酶的定位 |
| 1.5.5 甲磺隆羧酸酯酶的诱导情况试验 |
| 1.5.6 蛋白质含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株生长曲线和产酶曲线 |
| 2.2 粗酶制备方法提取效率的比较 |
| 2.3 甲磺隆羧酸酯酶的定域 |
| 2.4 甲磺隆羧酸酯酶的类型 |
| 2.5 甲磺隆羧酸酯酶催化的反应 |
| 第二节 甲磺隆羧酸酯酶的分离纯化过程 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌种、培养基、粗酶液制备方法、酶活反应体系 |
| 1.2 试验用溶液、试剂及仪器设备 |
| 1.3 甲磺隆羧酸酯酶性质的确定 |
| 1.4 甲磺隆羧酸酯酶的分离纯化 |
| 1.5 凝胶过滤层析法测定活性甲磺隆羧酸酯酶的分子量 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 甲磺隆羧酸酯酶的分离纯化过程 |
| 2.2 凝胶过滤层析法测定活性甲磺隆羧酸酯酶的分子量 |
| 本章小结 |
| 第二章 甲磺隆羧酸酯酶的酶学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 甲磺隆羧酸酯酶来源 |
| 1.2 试验用试剂、溶液及仪器设备 |
| 1.3 酶的热稳定性与最适温度 |
| 1.4 酶的酸碱稳定性与最适pH |
| 1.5 金属离子、表面活性剂和酶抑制剂对酶活性的影响 |
| 1.6 酶的动力学与底物特异性测定 |
| 1.7 酶的等电点测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 甲磺隆羧酸酯酶的热稳定性与最适温度 |
| 2.2 甲磺隆羧酸酯酶的酸碱稳定性与最适pH |
| 2.3 金属离子、表面活性剂和酶抑制剂对甲磺隆羧酸酯酶的影响 |
| 2.4 酶的动力学参数与底物特异性研究 |
| 2.5 酶的等电点测定 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本论文主要创新点 |
| 附录 文中所用试剂配方 |
| 致谢 |
（5）北方地区蝮蛇咬伤后脏器损伤及凝血系统影响研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 北方地区蝮蛇咬伤后脏器损伤的临床研究 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第二部分 北方地区蝮蛇咬伤后凝血系统的影响研究 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 典型病例1 |
| 典型病例2 |
| 典型病例图片 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的文章 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）广西眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1、广西眼镜蛇毒磷脂酶A_2的分离纯化及理化性质究 |
| (1) 材料与方法 |
| (2) 结果 |
| (3) 讨论 |
| 2、蛇毒PLA_2对肝癌细胞生长的影响 |
| (1) 材料与方法 |
| (2) 结果 |
| (3) 讨论 |
| 3、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）蚯蚓提取物镇痛有效成分分离纯化及镇痛作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 蚯蚓有效成分分离纯化及作用的研究进展 |
| 1.1 蚯蚓抗菌肽 |
| 1.2 蚯蚓纤溶酶相关成分的分离纯化及作用 |
| 1.3 蚯蚓抗氧化系成分的分离纯化及作用 |
| 2 动物源性镇痛物质分离纯化的研究进展 |
| 2.1 蝎毒镇痛活性物质分离纯化及作用 |
| 2.2 蛇毒镇痛活性物质分离纯化及作用 |
| 2.3 蜘蛛镇痛活性物质分离纯化及作用 |
| 2.4 蚯蚓镇痛抗损伤有效物质的分离纯化及作用 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第二章 蚯蚓镇痛活性物质的分离纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验样品与动物 |
| 1.2 主要的试剂及仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 蚯蚓蛋白组分粗提 |
| 2.2 CM Sephadex C-50阳离子交换层析 |
| 2.3 膈神经-膈肌模型筛选活性组分 |
| 2.4 Sephadex G-75凝胶过滤层析 |
| 2.5 凝胶过滤层析产物对离体神经性兴奋性的影响 |
| 2.6 分子量测定 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 蚯蚓粗提物的制备 |
| 3.2 蚯蚓提取物CM Sephadex C-50阳离子交换层析色谱 |
| 3.3 活性组分筛选(Bulbring法制备大鼠膈肌-膈神经模型) |
| 3.4 蚯蚓提取物Sephadex G-75凝胶过滤层析 |
| 3.5 蚯蚓镇痛活性成分对离体神经性兴奋性的影响 |
| 3.6 分子量的测定 |
| 4 讨论与分析 |
| 4.1 蚯蚓蛋白组分的粗提工艺优化和材料筛选 |
| 4.2 CM Sephadex C-50阳离子交换层析的材料选择和工艺优化 |
| 4.3 Sephadex G-75凝胶过滤层析的材料选择及工艺优化 |
| 4.4 蚯蚓镇痛活性成分对离体神经性兴奋性的影响 |
| 4.5 蚯蚓镇痛活性分离纯化技术的改良方向 |
| 4.6 分离纯化工艺小结 |
| 第三章 蚯蚓镇痛活性物质的作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验样品与动物 |
| 1.2 主要的试剂及仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 镇痛粗提产物对小鼠烫伤的影响 |
| 2.2 阳离子交换层析产物镇痛作用的测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 镇痛提取物对小鼠烫伤的影响 |
| 3.2 阳离子交换层析产物的镇痛作用 |
| 4 讨论与分析 |
| 4.1 镇痛提取物对小鼠烫伤的治疗作用 |
| 4.2 镇痛活性的功用 |
| 5. 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩词表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）广东舟山眼镜蛇（Naja naja atra）蛇毒心脏毒素和磷脂酶A2的分离纯化与性质鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 序言 |
| 1.2 蛇毒中的毒素及活性因子概述 |
| 1.2.1 神经毒素（neurotoxin, NT） |
| 1.2.2 心脏毒素（Cardiotoxin, CTX） |
| 1.2.3 磷脂酶A_2 （Phospholipase A_2，PL_A2） |
| 1.3 分离纯化原理及主要方法 |
| 1.3.1 层析前蛋白质预处理 |
| 1.3.2 离子交换层析 |
| 1.3.3 凝胶过滤 |
| 1.3.4 疏水层析 |
| 1.3.5 亲和层析 |
| 1.3.6 舟山眼镜蛇毒的分离纯化 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 眼镜蛇毒分离纯化方法的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 蛇毒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蛇粗毒的预处理 |
| 2.2.2 初级分离纯化方法的建立 |
| 2.2.3 浓缩透析 |
| 2.2.4 二次纯化方法的建立 |
| 2.2.5 冷冻干燥 |
| 2.2.6 分离纯化方法适用性考察 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 蛇粗毒的预处理 |
| 2.3.2 初级分离纯化方法的建立 |
| 2.3.3 二次分离纯化方法的建立 |
| 2.3.4 分离纯化方法适用性考察 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 眼镜蛇毒分离物的得率及纯度测定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 BCA 法测定蛋白含量 |
| 3.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 蛋白浓度及得率 |
| 3.3.2 SDS-PAGE |
| 3.3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 磷脂酶A_2（PLA_2）活性组分的性质鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 蛇毒样品 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 实验动物 |
| 4.1.5 细胞株 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PLA_2 的纯度与分子量鉴定 |
| 4.2.2 心脏毒性鉴定（离体蛙心实验） |
| 4.2.3 磷脂酶A_2 活性的测定 |
| 4.2.4 影响PLA_2 酶活性的因素分析 |
| 4.2.5 PLA_2 热稳定性的考察 |
| 4.2.6 细胞毒性的测定（MTT 法） |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 PLA_2 的纯度与分子量鉴定 |
| 4.3.2 心脏毒性鉴定 |
| 4.3.3 磷脂酶A_2 活性测定 |
| 4.3.4 影响PLA_2 酶活性的因素分析 |
| 4.3.5 PLA_2 热稳定性考察 |
| 4.3.6 细胞毒性测定（MTT 法） |
| 4.3.7 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 心脏毒素活性组分的性质鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 蛇毒样品 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.1.5 细胞株 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Gl3 的纯度测定（HPLC） |
| 5.2.2 Gl3 的分子量测定（质谱法） |
| 5.2.3 Gl3 的N 末端蛋白序列测定及同源性检索 |
| 5.2.4 急性毒性试验 |
| 5.2.5 镇痛活性测定 |
| 5.2.6 细胞毒性测定 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 纯度测定（HPLC） |
| 5.3.2 分子量鉴定 |
| 5.3.3 N 末端氨基酸序列测定及同源性检索 |
| 5.3.4 急性毒性实验 |
| 5.3.5 镇痛实验(热板法) |
| 5.3.6 细胞毒性测定(MTT 法) |
| 5.3.7 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 本文的创新之处 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）蛇毒的非抗毒血清解毒剂研究进展（论文提纲范文）
| 1 中草药 (包括其它植物药) |
| 1.1 磷脂酶A2抑制剂 |
| 1.2 三磷酸腺苷酶 (ATPase) 抑制剂 |
| 1.3 蛋白沉淀剂 |
| 1.4 其它 |
| 2 动物体中的天然抗蛇毒蛋白 |
| 2.1 抗出血蛋白 (Anti-haemorrhagic proteins, AHP) |
| 2.1.1 蛇类血清: |
| 2.1.2 温血动物血清:已分离到抗出血组分的动物有负鼠 (Opossum) , 犭蒙 (Mongoose) 和刺猬 (hedgehog) 。 |
| 2.2 抗神经毒蛋白 (anti-neurotoxic protein, ANP) |
| 2.3 抗肌毒性因子 (Antimyotoxic factor) |
| 3 药理解毒剂 |
| 3.1 螯合剂 |
| 3.2 巯基化合物和其它含硫还原剂 |
| 3.3 蛋白酶类 |
| 3.4 PLA2抑制剂 |
| 3.5 糖皮质类固醇 ( Glucocorticosteroids) |
（10）柿子单宁的性质、结构及其与几种蛇毒蛋白的相互作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1 柿子资源综合利用现状 |
| 1.1 柿子果肉的综合利用 |
| 1.2 柿叶的综合利用 |
| 1.3 柿皮和柿蒂的综合利用 |
| 2 柿子果肉单宁的国内外研究进展 |
| 2.1 柿子单宁结构分析的研究进展 |
| 2.2 柿子单宁生理活性的研究进展 |
| 2.2.1 柿子单宁抗氧化活性的研究进展 |
| 2.2.2 柿子单宁解蛇毒能力的研究进展 |
| 3 研究目的、意义及内容 |
| 第二章 柿子单宁提取工艺的优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料和仪器设备 |
| 1.1.1 试验原料 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 仪器及设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 柿子果肉的基本组成分析 |
| 1.2.1.1 水分含量测定 |
| 1.2.1.2 还原糖含量测定 |
| 1.2.1.3 总糖含量测定 |
| 1.2.1.4 粗脂肪含量测定 |
| 1.2.1.5 总蛋白含量测定 |
| 1.2.1.6 维生素C含量测定 |
| 1.2.2 柿子单宁的提取工艺 |
| 1.2.2.1 提取方法 |
| 1.2.2.2 总酚(TP)含量的测定 |
| 1.2.2.3 缩合单宁(CT)含量的测定 |
| 1.2.2.4 提取溶剂的选择 |
| 1.2.2.5 提取次数的选择 |
| 1.2.2.6 果实前处理对提取的影响 |
| 1.2.2.7 提取条件的单因素试验 |
| 1.2.2.8 正交试验的设计方案 |
| 1.2.3 不同品种、不同组织中柿子单宁含量分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 柿子果肉的基本成分分析 |
| 2.2 柿子单宁的提取工艺及含量测定 |
| 2.2.1 提取溶剂的选择 |
| 2.2.2 提取次数的选择 |
| 2.2.3 果实前处理的选择 |
| 2.2.4 提取条件的单因素试验 |
| 2.2.4.1 提取温度的影响 |
| 2.2.4.2 提取时间的影响 |
| 2.2.4.3 酸浓度对提取率的影响 |
| 2.2.4.4 不同料液比对提取率的影响 |
| 2.2.5 正交试验结果分析 |
| 2.3 不同品种、柿子不同组织单宁含量的比较分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 柿子单宁的分离纯化及结构分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料和仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 仪器及设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 柿子单宁的大孔树脂纯化工艺 |
| 1.2.1.1 大孔树脂静态吸附量的测定 |
| 1.2.1.2 大孔吸附树脂静态解吸率的测定 |
| 1.2.1.3 大孔树脂的静态吸附动力学特征 |
| 1.2.1.4 上样速率对柿子单宁吸附效果的影响 |
| 1.2.1.5 流出液重复过柱对吸附率的影响 |
| 1.2.1.6 不同溶剂对洗脱效果的影响 |
| 1.2.1.7 洗脱曲线的考察 |
| 1.2.1.8 树脂重复使用次数考察 |
| 1.2.1.9 柿子单宁粗品的制备 |
| 1.2.2 柿子单宁的超滤分级工艺 |
| 1.2.2.1 超滤膜组件的选择 |
| 1.2.2.2 超滤透过速率的选择 |
| 1.2.2.3 超滤循环次数的选择 |
| 1.2.2.4 超滤膜重复使用次数考察 |
| 1.2.2.5 超滤膜的清洗 |
| 1.2.2.6 SMWT及HMWT的制备及其基本性质 |
| 1.2.3 柿子单宁各级分的HPLC分析及SMWT的HPLC-ESI-MS鉴定 |
| 1.2.4 凝胶渗透色谱法(GPC)测定HMWT相对分子量分布 |
| 1.2.5 傅立叶红外光谱(FT-IR)分析 |
| 1.2.6 HMWT硫解、酸水解产物的HPLC及HPLC-ESI-MS分析 |
| 1.2.6.1 HMWT的硫解及产物的HPLC-MS分析 |
| 1.2.6.2 HMWT的酸水解反应 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 柿子单宁的大孔吸附树脂纯化工艺 |
| 2.1.1 大孔吸附树脂对柿子单宁的静态吸附试验 |
| 2.1.2 101大孔吸附树脂对柿子单宁的动态吸附试验 |
| 2.1.2.1 上样流速对柿子单宁吸附率的影响 |
| 2.1.2.2 流出液重复过柱对树脂吸附率的影响 |
| 2.1.2.3 不同溶剂对柿子单宁洗脱效果的影响 |
| 2.1.2.4 洗脱曲线的考察 |
| 2.1.2.5 101大孔树脂重复使用次数 |
| 2.1.2.6 柿子单宁的制备 |
| 2.2 柿子单宁的超滤分级工艺 |
| 2.2.1 超滤膜组件的选择 |
| 2.2.2 超滤膜透过速率的选择 |
| 2.2.3 超滤循环次数的选择 |
| 2.2.4 超滤重复使用次数考察 |
| 2.2.5 超滤膜的清洗 |
| 2.3 SMWT及HMWT的基本特性 |
| 2.3.1 外观特性与感官评定 |
| 2.3.2 紫外吸收与显色反应 |
| 2.3.3 溶解性 |
| 2.4 柿子单宁不同级分的HPLC及HPLC-ESI-MS分析 |
| 2.5 HMWT的GPC分析 |
| 2.6 傅立叶红外光谱(FT-IR)分析 |
| 2.7 HMWT硫解、酸水解产物的HPLC及HPLC-ESI-MS分析 |
| 2.7.1 HMWT硫解产物的分析 |
| 2.7.2 HMWT酸水解产物的分析 |
| 2.7.2.1 水解产物在540nm处的HPLC-ESI-MS的分析 |
| 2.7.2.2 水解产物在280nm处的HPLC-ESI-MS的分析 |
| 2.8 HMWT的单体的结构鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 柿子单宁的分离纯化工艺 |
| 3.2 柿子单宁各级分的结构鉴定 |
| 第四章 柿子单宁抗氧化活性、蛋白质结合能力及稳定性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料和仪器设备 |
| 1.1.1 试验原料 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 仪器及设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 柿子单宁在不同体系中的抗氧化能力测定 |
| 1.2.1.1 柿子单宁在2-脱氧-D-核糖体系中清除羟基自由基的能力 |
| 1.2.1.2 柿子单宁在甲基紫体系中清除羟基自由基的能力 |
| 1.2.1.3 柿子单宁在水杨酸体系中清除羟基自由基的能力 |
| 1.2.1.4 柿子单宁清除超氧阴离子自由基的能力 |
| 1.2.1.5 柿子单宁抑制亚油酸脂质过氧化的能力 |
| 1.2.2 HMWT与蛋白质的相互作用 |
| 1.2.2.1 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 |
| 1.2.2.2 HMWT与明胶、BSA结合能力的测定 |
| 1.2.2.3 温度对HMWT与BSA结合反应的影响 |
| 1.2.2.4 时间对HMWT与BSA结合反应的影响 |
| 1.2.2.5 pH值对HMWT与BSA结合反应的影响 |
| 1.2.2.6 无机盐对HMWT与BSA结合反应的影响 |
| 1.2.2.7 HMWT对BSA的荧光猝灭作用 |
| 1.2.3 HMWT溶液的稳定性 |
| 1.2.3.1 光照对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 1.2.3.2 温度对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 1.2.3.3 pH对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 1.2.3.4 氧化剂对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 1.2.3.5 还原剂对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 1.2.3.6 β-环状糊精对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 1.2.3.7 常见食品添加剂对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 1.2.3.8 金属离子对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 柿子单宁的抗氧化能力 |
| 2.1.1 柿子单宁对羟基自由基的清除能力 |
| 2.1.2 柿子单宁对邻苯三酚自氧化的抑制作用 |
| 2.1.3 柿子单宁抑制亚油酸脂质过氧化能力 |
| 2.2 HMWT与蛋白质的相互作用 |
| 2.2.1 HMWT和明胶、BSA的结合反应 |
| 2.2.2 影响HMWT和BSA结合反应的动力学因素 |
| 2.2.2.1 温度对HMWT和BSA结合反应的影响 |
| 2.2.2.2 时间对HMWT和BSA结合反应的影响 |
| 2.2.2.3 pH值对HMWT和BSA结合反应的影响 |
| 2.2.2.4 无机盐对HMWT和BSA结合反应的影响 |
| 2.2.3 HMWT对BSA的荧光猝灭作用 |
| 2.2.3.1 HMWT对BSA荧光光谱的影响 |
| 2.2.3.2 HMWT对BSA荧光猝灭的类型 |
| 2.2.3.3 HMWT与BSA结合的热力学性质 |
| 2.2.3.4 HMWT与BSA结合位点数 |
| 2.2.3.5 HMWT与BSA作用距离的计算 |
| 2.3 HMWT溶液的稳定性 |
| 2.3.1 光照对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 2.3.2 温度对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 2.3.3 pH对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 2.3.4 氧化剂对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 2.3.5 还原剂对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 2.3.6 β-环状糊精对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 2.3.7 常见添加剂对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 2.3.8 金属离子对HMWT溶液稳定性的影响 |
| 3 讨论 |
| 第五章 HMWT与蛇毒蛋白的相互作用及解毒研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料和仪器设备 |
| 1.1.1 实验原料 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 仪器及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 酶活测定及SDS-PAGE电泳样品的前处理 |
| 1.2.2 HMWT对蛇毒蛋白中酶活力的影响 |
| 1.2.2.1 HMWT对蛋白水解酶活力的影响 |
| 1.2.2.2 HMWT对磷脂酶A_2酶活力的影响 |
| 1.2.2.3 HMWT对L-氨基酸氧化酶活力的影响 |
| 1.2.2.4 HMWT对精氨酸脂酶活力的影响 |
| 1.2.2.5 HMWT对乙酰胆碱酯酶活力的影响 |
| 1.2.2.6 HMWT对类凝血酶活力的影响 |
| 1.2.3 HMWT的急性毒性试验 |
| 1.2.3.1 急性毒性预试验 |
| 1.2.3.2 小鼠腹腔注射(i.P)给药的急性毒性试验 |
| 1.2.3.3 小鼠ip.给药的LD_(50)值测定 |
| 1.2.4 HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP所致的小鼠肌肉毒性的影响 |
| 1.2.4.1 小鼠血清中肌酸激酶(CK)的测定 |
| 1.2.4.2 小鼠趾长伸肌(EDL肌)组织切片制作 |
| 1.2.5 HMWT对AhPVP、AaVP所致的小鼠皮下出血的影响 |
| 1.2.6 HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用 |
| 1.2.6.1 AhPVP、AaVP、NnaVP对小鼠的致死作用 |
| 1.2.6.2 不同给药方式中HMWT的剂量设置 |
| 1.2.6.3 口服灌胃HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用 |
| 1.2.6.4 腹腔注射HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用 |
| 1.2.6.5 静脉注射HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用 |
| 1.2.6.6 预防给药HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用 |
| 1.2.7 AhPVP中PLA_2的分离纯化 |
| 1.2.7.1 粗蛇毒分离前处理 |
| 1.2.7.2 分离过程中PLA_2活性的检测 |
| 1.2.7.3 AhPVP中PLA_2的Sephadex G-75层析分离 |
| 1.2.7.4 AhPVP中PLA_2的Sephadex DEAE A-50纯化 |
| 1.2.7.5 用SDS-PAGE检测所得组分的纯度 |
| 1.2.8 AhPVP、AaVP、NnaVP及PLA_2与HMWT的相互作用 |
| 1.2.8.1 HMWT与AhPVP、AaVP、NnaVP相互作用的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.8.2 HMWT与PLA_2相互作用的红外光谱分析 |
| 1.2.8.3 HMWT与PLA_2相互作用的圆二色谱分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 HMWT对蛇毒中主要酶活力的影响 |
| 2.1.1 对蛋白水解酶活力的影响 |
| 2.1.2 对磷脂酶A_2活力的影响 |
| 2.1.3 对L-氨基酸氧化酶活力的影响 |
| 2.1.4 对精氨酸酯酶活力的抑制 |
| 2.1.5 对乙酰胆碱酯酶活力的抑制 |
| 2.1.6 对类凝血酶活力的抑制 |
| 2.2 HMWT急性毒性试验 |
| 2.3 HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP所致的小鼠肌肉毒性的影响 |
| 2.3.1 小鼠血清中肌酸激酶(CK)的测定 |
| 2.3.2 组织切片观察 |
| 2.4 HMWT对AhPVP、AaVP所致的小鼠皮下出血的影响 |
| 2.5 HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用 |
| 2.5.1 口服灌胃HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用 |
| 2.5.2 腹腔注射HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用 |
| 2.5.3 静脉注射HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用 |
| 2.6 预防给药HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用 |
| 2.7 AhPVP中PLA_2的纯化 |
| 2.7.1 AhPVP中PLA_2的Sephadex G-75柱层析分离 |
| 2.7.2 AhPVP中PLA_2的Sephadex DEAE A-50纯化 |
| 2.7.3 纯化所得组分的SDS-PAGE检测 |
| 2.8 AhPVP、AaVP、NnaVP及PLA_2与HMWT的相互作用 |
| 2.8.1 HMWT与AhPVP、AaVP、NnaVP相互作用的SDS-PAGE分析 |
| 2.8.2 PLA_2与HMWT的相互作用的红外光谱分析 |
| 2.8.3 PLA_2与HMWT的相互作用的圆二色谱分析 |
| 3 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、浙江蝮蛇毒碱性磷酯酶A的分离纯化及其性质的研究（论文参考文献）
- [1]毒蛇咬伤后心肌酶和肝功能指标动态变化用于预后判断的价值评估[D]. 盛欢. 安徽中医药大学, 2019(02)
- [2]海洋链霉菌抗补体活性菌株筛选及活性产物研究[D]. 徐小娜. 大连理工大学, 2019(01)
- [3]眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化及鉴定[D]. 贺宜龙. 昆明理工大学, 2014(06)
- [4]菌株Hansschlegelia zhihuaiae S113水解甲磺隆的羧酸酯酶分离纯化及其酶学特性研究[D]. 谢香庭. 南京农业大学, 2012(01)
- [5]北方地区蝮蛇咬伤后脏器损伤及凝血系统影响研究[D]. 张建波. 中国人民解放军医学院, 2012(01)
- [6]广西眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响[D]. 乔玉莉. 广西医科大学, 2012(09)
- [7]蚯蚓提取物镇痛有效成分分离纯化及镇痛作用的研究[D]. 程果. 湖南农业大学, 2011(04)
- [8]广东舟山眼镜蛇（Naja naja atra）蛇毒心脏毒素和磷脂酶A2的分离纯化与性质鉴定[D]. 郝彩. 华南理工大学, 2011(12)
- [9]蛇毒的非抗毒血清解毒剂研究进展[J]. 王晴川,刘广芬. 海峡药学, 2009(07)
- [10]柿子单宁的性质、结构及其与几种蛇毒蛋白的相互作用研究[D]. 顾海峰. 华中农业大学, 2007(S2)