一、应用间接免疫荧光技术快速检测猪细小病毒抗原（论文文献综述）
王改丽,呼延含蓉,程荣华,郭衍冰,郝良玉,刘沂霖,李昱洁,姚新华[1]（2022）在《犬瘟热病毒检测方法研究进展》文中研究表明犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）引起犬的一种急性、高度接触性传染病。该病的流行严重危害犬及毛皮动物养殖业的健康发展,且对濒危物种保护造成严重威胁。因此,准确、快速检测CDV感染是有效防控疫病传播的关键技术手段。论文介绍了CDV基因组结构、犬瘟热流行病学特点和临床症状,综合论述了CDV检测方法的研究进展,包括病毒分离鉴定、电镜观察、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析技术、聚合酶链反应、环介导等温核酸扩增技术和重组酶聚合酶等温扩增技术等,并对不同检测方法的优缺点进行比较,以期为有效诊断和防控CDV感染提供技术参考。
苗春,李伟,杨思成,邵军军,常惠芸[2]（2022）在《非洲猪瘟诊断技术研究进展》文中研究指明非洲猪瘟防控目前暂无安全有效疫苗可用,因此快速、可靠的检测方法对其防控至关重要。目前应用的非洲猪瘟诊断技术主要表现在病原、核酸、抗原与抗体四个方面:病原检测主要有红细胞吸附和病毒分离方法,核酸检测目前已开发出实时荧光定量PCR（qPCR）、多重PCR（mPCR）、微滴数字PCR（ddPCR）、巢氏PCR（nested-PCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（RPA）、交叉引物扩增技术（CPA）、原位杂交技术（ISH）以及生物传感器技术等,抗原检测常用荧光抗体试验（FAT）、抗原ELISA、侧向流动免疫色谱分析（LFA）等,而抗体检测主要通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接荧光抗体试验（IFA）、胶体金快速免疫层析法（GICA）、免疫印迹法（IBT）等方法。每种诊断技术都有其特点,从而为不同情况下的ASFV诊断提供了多种选择。未来,其他技术如CRISPR等与上述技术的结合应用,以及不同诊断技术的联合应用,将成为非洲猪瘟诊断技术发展的趋势。
杨旭琼,杨金易,王弘[3]（2022）在《病毒性动物疫病诊断技术研究进展》文中研究表明动物疫病的大暴发不仅严重影响畜牧业的生产与发展,造成巨大经济损失,而且会严重危害人类健康。病毒性疫病的增加使得动物疫病更加复杂,流行趋势更加严峻。灵敏、特异、快速地诊断动物疫病是实施疫病防控措施的关键环节。基于PCR技术及等温扩增技术的分子生物学诊断解决了传统病原学诊断费时费力、免疫血清学存在的窗口期等问题并摆脱了对高精度温控设备的依赖,成为目前常用的病原体筛查方法。但大多数检测方法一次只能检测到一个或几个病原体,且复杂的试验流程及对设施的高要求降低了立即干预突发疫情的能力,同时无法满足某些检测分析需求。近年来,学科间相互渗透融合的高通量诊断技术发展迅速,具有同时监测、检测和表征成百上千个靶点的能力,能满足在多种环境下的病原体快速检测的需求,是生命科学发展过程中一种重要的生物学检测手段。笔者从病原学、免疫血清学、分子生物学及高通量诊断等方面对主要的病毒性动物疫病检测技术进行了综述,展望未来动物疫病诊断检测技术的发展,以期为动物疫病快速诊断提供更多的方案思路,提升动物疫病的防控能力。
宋继军[4]（2021）在《猪圆环病毒2型悬浮培养及灭活疫苗工艺优化》文中研究表明猪圆环病毒病（Porcine Circovirus disease,PCVD）在世界范围内普遍存在,是影响世界养猪产业的重大疾病之一,同时也是影响中国养猪产业能否健康顺利发展的重大疾病之一。猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type2,PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、皮炎肾病综合征（PNDS）的主要病原,PMWS在加拿大最早被发现。此病可以造成养猪业的巨大损失。目前无有效的药物治疗此病,接种疫苗被认为是最有效的防控办法。而疫苗制备过程中,抗原的制备是最重要的环节,直接影响疫苗的质量。目前,大部分生物制品企业多采用转瓶培养工艺或偶见采用微载体全悬浮培养工艺进行猪圆环病毒2型抗原的培养。运用传统的转瓶工艺,培养出的病毒效价低、批间差异大、质量不稳定、生产成本高;运用微载体全悬浮培养技术又存在剪切力耐受度低、血清用量高、生产成本高、转球工艺复杂等不足。从行业发展和产业化背景等考虑,应用悬浮培养细胞系通过生物反应器培养参数的控制开展大规模动物病毒培养,可以起到降本增效、提高产品品质和提高企业的核心竞争力。本研究采用纯悬浮培养细胞技术和细胞生物反应器生产猪圆环病毒2型抗原,摸索并优化纯悬浮培养过程中涉及的重点质量控制点,开展对抗原纯化和抗原灭活生产工艺的研究,为大规模生产抗原提供可靠的数据支持,同时对应用该工艺制备的疫苗产品进行质量、安全性和效力性评估。（1）PK15细胞培养技术全悬浮培养研究采用PK15全悬浮培养细胞,用体积为150 ml的平行生物反应器系统,摸索适合悬浮细胞培养的各种参数,包括初始接种细胞密度的优化、溶氧参数的确定、pH参数的确定、搅拌转速选择、补液方式的优化。研究结果表明最佳培养条件为:细胞接种密度为5×105cells/ml;溶氧参数为40～50%;pH参数为7.0～7.4,当7.2时细胞生长最佳;搅拌转速为100～120 r/min;补液方式采取逐步加液。（2）猪圆环病毒2型（LG株）悬浮培养参数研究采用PK15细胞的全悬浮培养研究参数,运用平行生物反应器,对猪圆环病毒2型（LG株）悬浮培养参数开展进一步研究,包括接毒细胞浓度的优化、接毒剂量的优化、收毒时间的优化、全悬浮和转瓶培养方法的比较等。研究结果表明:最佳细胞接种浓度为5×105cells/ml;最佳接毒剂量确定为5%同步接种;最佳收获时间确定为120小时;全悬浮培养法收获的病毒滴度优于转瓶培养法收获的病毒滴度。（3）猪圆环病毒2型（LG株）抗原纯化工艺的研究对纯悬浮培养工艺收获的猪圆环病毒2型（LG株）抗原液进行细胞破碎优化和抗原纯化研究。细胞破碎采用低温超高压细胞破碎仪与传统冻融方法比较。抗原纯化引入中空纤维柱过滤和膜包过滤的方式进行纯化,比较纯化前后蛋白含量和病毒效价变化。研究结果表明:采用低温超高压细胞破碎仪能够很好的破碎悬浮培养后的细胞,与传统的反复冻融方法相比,具有破碎效果好和生产效率高等特点;0.45μm和100 k D中空纤维过滤技术可以很好地用于猪圆环病毒2型（LG株）疫苗的纯化生产工艺中,有效地提高了疫苗质量,产业化前景较好。（4）猪圆环病毒2型（LG株）抗原灭活工艺的研究采用灭活剂BEI与传统的灭活剂甲醛对猪圆环病毒2型（LG株）抗原液进行灭活效果比较,并做灭活检验。同时针对新的灭活剂开展安全性试验和免疫效力试验。研究结果表明:采用1.0‰浓度的BEI在32℃条件下48小时能够完全灭活猪圆环病毒2型（LG株）,灭活后的病毒安全试验和效力试验合格;用此方法制备的疫苗抗体产生的时间和抗体效价峰值均优于传统工艺甲醛灭活的疫苗。（5）猪圆环病毒2型（LG株）试验室试制的研究采用优化确定的全悬浮细胞培养工艺、抗原处理工艺及灭活工艺在试验室试制了3批猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗,进行全项半成品和成品检验。研究结果表明:经过对实验室试制的半成品和成品样本等进行检测,证明新摸索的工艺所确定的参数能够符合圆环灭活疫苗（LG株）的生产要求,说明在实验室条件下能够制备出符合规定的合格疫苗。（6）猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗安全性试验研究采用优化确定的全悬浮细胞培养工艺、抗原处理工艺及灭活工艺在生产车间试制了5批猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗,进行全项成品检验后,开展了单剂量免疫仔猪试验、单剂量重复免疫仔猪试验、大剂量免疫仔猪试验和母猪安全性试验等安全性试验研究。研究结果表明:用新工艺方法生产的猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗,对仔猪和妊娠母猪安全可靠、无毒副作用。（7）猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗效力性试验研究采用优化确定的全悬浮细胞培养工艺、抗原处理工艺及灭活工艺在生产车间试制了5批猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗,进行全项成品检验后,进行灭活疫苗效力性试验研究,包括疫苗免疫攻毒效检猪增重率评价试验、运用荧光定量PCR法评价疫苗免疫效力试验、免疫攻毒后病毒排毒规律及组织病毒载量测定试验、疫苗免疫持续期与抗体消长规律测定试验、最小免疫剂量试验及抗体与攻毒保护相关性试验、猪圆环病毒灭活疫苗（LG株）保存期试验、猪圆环病毒灭活疫苗（LG株）母猪被动免疫试验。研究结果表明:用新工艺方法生产的猪圆环病毒2型（LG株）灭活疫苗,通过疫苗免疫可有效抵御强毒攻击引起的猪只增重率下降,以增重率指标作为评价疫苗免疫效果的指标,简便易行,直观可信,能够反映出疫苗真实效果;荧光定量PCR方法能够定量检测病毒载量,可作为疫苗免疫效果评价指标之一;疫苗免疫刺激产生的抗体能够抵抗强毒的攻击;疫苗免疫持续期至少为6个月,该疫苗具有良好的免疫原性,刺激产生抗体快,持续时间长,能够提供充分的免疫保护;疫苗对仔猪最小免疫剂量为每头猪0.5 ml,用最小免疫剂量接种试验猪,于免疫28日后血清抗体全部阳转和免疫保护率为100%,抗体效价越高,获得的免疫保护效力越好,血清抗体效价可以作为PCV2灭活疫苗效力检验手段之一,用IPMA法测定血清抗体效价达到800倍以上,可获得100%免疫保护率;疫苗的保护期确定为2～8℃下保存,保存期为18个月;疫苗对母猪安全是安全的,被动免疫母猪对所产仔猪具有良好的免疫保护作用。上述研究结果表明,应用优化后的PK15细胞全悬浮培养技术、生物反应器大规模生产猪圆环病毒2型（LG株）抗原技术、抗原纯化技术、抗原灭活技术等最终制备的猪圆环病毒2型（LG株）灭活成品疫苗,各项检测指标都符合现行国家标准,安全性和免疫效果评价,对仔猪和母猪安全且免疫效果良好,可替代传统工艺生产的疫苗用于圆环病毒2型疾病的防控。优化工艺后生产的疫苗具有抗原含量高、杂蛋白含量低、无副反应、批间稳定、生产效率高、生产成本低等优点,符合国家科技发展需求,能够提高企业的技术竞争力,增加企业的净利润,拥有很好的市场应用前景。
邓启霞,吕其壮,张琦,卓严玲,邓家华[5]（2021）在《猪圆环病毒2型感染诊断技术研究进展》文中研究表明猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是一种可引起猪呼吸疾病综合征、猪皮炎和肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种疾病的主要病原体。PCV2与不同的病毒或细菌混合感染引发的疾病具有不同的临床特征,导致其病因难以检测,无法提前预防和及时阻断传染,继而导致养猪业经济损失惨重。因此,先进的PCV2感染诊断技术对于PCV2的预防、诊断及预后显得尤为重要,本文综述了近几年PCV2感染诊断技术的研究现状及发展趋势,以期为今后PCV2感染诊断技术的研发指明方向。
蔡梦露[6]（2021）在《牛肠道病毒非结构蛋白3C单抗的制备及其检测病毒抗原的应用》文中研究指明肠道病毒（Enterovirus,EV）属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员,它所引起的感染严重危害人类的健康和养殖业的发展。目前,肠道病毒分为12个肠道病毒种和3个鼻病毒种;其中,E种和F种肠道病毒主要感染牛,引起牛临床上呈现发热、咳嗽、严重腹泻、黏膜炎症以及繁殖障碍等症状。HY12毒株是由本实验室于2012年从吉林省某牛场的病牛体内分离到的国内首株E种肠道病毒,其研究虽然取得了较多进展,但有关该病毒编码的非结构蛋白的研究较为缺乏。本研究应用RT-PCR技术扩增出HY12毒株非结构蛋白3C的基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-3C,通过IPTG诱导表达和尿素纯化包涵体的方法纯化得到重组蛋白,并以此作为抗原免疫健康的BALB/c小鼠,经3次免疫后,采集其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过筛选和亚克隆等过程获得了能够稳定表达3C单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,将其命名为3C9。对该单克隆抗体进一步的鉴定结果表明,该单克隆抗体具有较好的反应原性和反应特异性。以获得的3C单克隆抗体为基础,建立了检测牛肠道病毒抗原的免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）,确定出该方法的最佳反应条件:一抗最佳稀释倍数为1:150及最佳反应时间为60 min、酶标二抗的最佳稀释倍数为1:1500及最佳反应时间为60 min。特异性、敏感性和重复性的实验结果表明,本研究所建立的IPMA方法具有特异、敏感、快速、重复性好和操作简单等优点,且与间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）有较高的符合率。以建立的IPMA方法对本实验室现有的E种、F种和G种肠道病毒进行了检测,结果表明本方法可用于检测E种、F种肠道病毒。综上,本研究基于3C单克隆抗体建立的IPMA方法为今后牛肠道病毒感染的检测、检疫及防控提供了一种新的有效手段。
孔桂慧[7]（2021）在《鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定及其免疫原性初步探究》文中提出鸭新型呼肠孤病毒病是由鸭新型呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）引起的一种鸭禽传染病,其典型病变特征为肝脏肿大出血、脾脏坏死、鸭只体重减轻。2017年11月,菏泽地区商品鸭场的10日龄樱桃谷鸭出现以肝脏肿大出血、脾脏坏死为特征的传染病,对养殖业造成了巨大损失。本研究为该病的有效防控提供了技术支持。主要内容包括:1.NDRV的分离鉴定无菌取菏泽地区10日龄商品代樱桃谷肉鸭的肝脏、脾脏并研磨,将病料过滤后分别接种SPF鸡胚、SPF鸭胚、鸭胚成纤维细胞（DEF细胞）和非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）,培养3～5 d后,收集死亡胚体尿囊液和病变细胞上清液使用NDRVσC基因特异性引物进行RT-PCR鉴定及测序分析。结果显示,分离到1株NDRV,命名为NDRV017株,该分离株与NCBI上9株NDRV参考毒株的相似性在95.3～99%之间。2.灭活疫苗的初步研制将病毒液接种到Vero细胞,待细胞病变程度达80%时,使用3‰甲醛灭活36h,制备NDRV油乳剂灭活疫苗。3.灭活疫苗的免疫原性探究将种鸭二免后28 d的种蛋孵化出的1日龄雏鸭作为试验鸭,同时设同批次未免疫种鸭的后代作为阴性对照,人工感染用NDRV株为NDRV017E3株。阴性对照组腿肌接种灭菌PBS 0.8 m L,其余三组分别腿肌接种等体积8个ELD50的NDRV017E3株（病毒含量为4.50×105/羽）,攻毒10 d后处死动物并采集脾脏组织。以脾脏是否坏死作为判断指标,发现母源抗体对雏鸭的保护率为53.3%,卵黄抗体对雏鸭的保护率为40%,与阳性对照组相比,母源抗体可有效降低雏鸭感染NDRV风险（P<0.05）,对雏鸭具有较好地保护作用;统计各组体重的增重情况,结果显示,与阴性对照组相比,阳性对照组雏鸭体重降低16%（P<0.05）,母源抗体组、卵黄抗体组分别降低4.57%（P>0.05）、9.43%（P>0.05）。结果表明,樱桃谷种鸭免疫该疫苗28 d后,50%以上的后代雏鸭可通过携带的母源抗体获得保护,优于市场上商品疫苗的免疫保护效果。
蔡晓庆[8]（2021）在《水貂阿留申病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用》文中进行了进一步梳理水貂阿留申病（Aleutian mink disease,AMD）是由水貂阿留申病毒（Aleutian mink disease virus,AMDV）引起的一种慢性传染性疾病,以水貂的繁殖障碍和免疫抑制为主要特征。貂群中AMDV可以通过水平和垂直两种方式传播,一旦感染会造成严重的经济损失。目前,该病的防控尚未出现有效疫苗,预防水貂阿留申病最好的措施是“源头控制”、“早发现、早剔除”,及时净化种群。目前已建立了多种AMDV的检测方法,如ELISA、对流免疫电泳法、荧光定量PCR等,但仍满足不了该病的防控。“早诊断、早发现”从而实现水貂种质资源筛选和保护的技术需求。本实验研究建立了AMDV微滴式数字PCR（droplet digital PCR,dd-PCR）定量检测方法,该方法具有灵敏度高、易定量等特点。通过对养殖场临床样品和环境样品的检测应用,表明该方法能够通过粪便棉拭子样品和环境样品的检测实现病原的早发现,为水貂引种、阿留申病净化和种质资源保护提供了技术支撑。1.AMDV的dd-PCR检测方法的建立根据AMDV经典毒株ADV-G毒株的基因全长,设计PCR扩增引物,并成功扩增出VP2基因,连接转化后构建到p MD18-T载体上,成功制备AMDV质粒标准品。参考山东省地方标准（标准号DB/T4204-2020）里的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测方法的引物探针,在此基础上对引物探针的浓度、退火温度、升降温速率等进行优化,开展了针对微滴式数字PCR的灵敏性试验、特异性试验、重复性试验,最终建立了AMDV的dd-PCR检测方法。与山东地方标准里发布的AMDV的RT-qPCR检测方法做比较,以质粒标准品为样本,两种试验方法的线性关系表明:dd-PCR（R2=1）和RT-qPCR（R2=0.994）均具有良好的线性关系;灵敏性试验结果显示:RT-qPCR的最低检测量是143 copies/μL,dd-PCR的最低检测量约为1.43copies/μL;特异性试验结果显示:dd-PCR检测AMDV为阳性,水貂肠炎细小病毒（MEV）、犬瘟热病毒（CDV）和水貂流感病毒（MIV）等其他病毒均为阴性;重复性试验表明:组内实验和组间实验的变异系数（CV%）均小于3%。因此,该检测方法具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的优点。2.AMDV的dd-PCR检测方法的初步应用收集507份来自疑似发病水貂场的临床样品,使用本试验建立的dd-PCR检测方法与山东省地方标准建立的RT-qPCR检测方法分别进行核酸检测,结果检出总的阳性率分别为40.63%（206份）和26.43%（134份）。其中,261份组织样品的检出核酸阳性率分别为41.76%（109份）和34.86%（91份）,246份环境样品的检出核酸阳性率分别为39.43%（97份）和17.48%（43份）,表明dd-PCR具有更高的灵敏度,能够对粪便棉拭子和环境样品等病毒含量低的样本进行有效检测。用Kappa方法对dd-PCR与RT-qPCR检出结果分析表明Kappa系数为0.88,表明二者具有良好的符合率。3.AMDV VP2基因的遗传进化分析本研究对dd-PCR检测到的来自山东不同地区、不同样品的部分阳性样本进行了基因测序,共获得17株AMDV的VP2基因序列,采用邻接法构建了系统发育树。遗传进化分析发现AMDV山东分离株VP2基因序列形成A、B、C三个分支,而来源于潍坊同一养殖场的环境样品W-SD11和W-SD12分别在A/C分支,表明不同基因型的AMDV可以共存于同一水貂养殖场。11株山东AMDV聚集在A和B分支中,与国外分离株（AMDV-Far East株、AMDV-Utah株、AMDV-TR株）遗传关系密切,提示山东省内水貂源AMDV可能与水貂品种引进相关。C分支中4株山东AMDV（W-SD19、W-SD20、W-SD21、W-SD27）的VP2基因序列与吉林、大连等地水貂养殖场的AMDV基因遗传关系密切,而山东省水貂国内引种多来自于东北地区,进一步提示山东省水貂源AMDV与水貂引种密切相关。
胡斌[9]（2020）在《猪细小病毒、猪圆环病毒病Ⅱ型和副猪嗜血杆菌SYBR Green Ⅰ多重荧光定量PCR检测方法的建立》文中认为近年来,随着养猪业的发展,与之伴随的疾病也越来越复杂。猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）和猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）在临床养殖过程中常出现混合感染,且PCV2感染后会使猪产生免疫抑制,容易激发或并发其他传染病原,副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）是一种典型的“机会主义”病原,常作为继发病原伴随PCV2导致混合感染。准确而快速的诊断这几种病原,从而提供针对性的治疗,对养猪业的健康发展意义重大。荧光定量PCR检测技术具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、能定量等优点,广泛应用于病原诊断。本研究拟建立一种三重实时定量PCR检测方法,并结合熔解曲线分析,实现对PPV、PCV2和Hps单独或混合感染的快速诊断。为此,做了以下研究:（一）分别建立了PPV,PCV2,Hps的荧光定量PCR检测方法。根据PPV的VP2基因、PCV2的cap基因和Hps的infB基因保守区域设计特异性引物,并将扩增片段克隆载体后构建质粒标准品。以不同稀释度的标准品为模板进行SYBR GreenΙ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了三种荧光定量PCR检测方法。该方法对三种病原的检测灵敏性分别是146拷贝/μL、121个拷贝/μL和72个拷贝/μL,三对引物均不与其他常见病原存在交叉反应,重复性和特异性较好,可用于临床组织病料检测。（二）建立了可同时检测PPV和PCV2的双重荧光定量PCR检测方法。利用上述PPV与PCV2特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,通过调节引物浓度、退火温度等条件,建立了PPV与PCV2双重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法。该方法的灵敏性可达167拷贝/μL和140拷贝/μL,引物与其他病原无交叉反应,特异性和重复性较好,临床组织病料检测结果与普通PCR一致,证明该方法可为快速鉴别诊断这两种病毒的混合感染提供技术支持。（三）建立了可同时检测PPV和Hps的双重荧光定量PCR检测方法。利用上述PPV与Hps特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,通过调节引物浓度、退火温度等条件,建立PPV与Hps双重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法,通过对该方法的灵敏度、特异性、重复性和临床组织病料检测验证,证明该方法可用于这两种病原的快速鉴别诊断。（四）建立了可同时检测PCV2和Hps的双重荧光定量PCR检测方法。利用上述PCV2与Hps特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,调节引物浓度、退火温度等条件,建立了PCV2与Hps双重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法。通过对该方法的灵敏度、特异性、重复性和临床组织病料检测验证,结果表明该方法可用于这两种病原的快速鉴别诊断。（五）建立了可同时检测PPV、PCV2和Hps的三重荧光定量PCR检测方法。利用上述PCV2、PPV与Hps三对特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,调节引物浓度、退火温度等条件,建立PCV2、PPV与Hps三重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法,可在同一条熔解曲线上产生了3个特异性的Tm峰值,且不与其他病原发生交叉反应,具有良好的重复性和特异性,为快速诊断这三种疾病提供技术支持,也为这三种疾病的免疫程序修订提供依据。
柳亚茹[10]（2019）在《猪圆环病毒2型抗原抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用》文中研究说明猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型（Porcine Cirovirus Type 2,PCV2）感染所致,临床症状表现为断奶仔猪的多系统衰竭综合征、皮炎肾病综合征及母猪的繁殖障碍等,是严重危害养猪业健康发展的重要疾病之一,给世界各国养猪产业造成了巨大经济损失。该病快速诊断与检测技术的研究一直是各国学者研究的热点课题。虽然目前已经建立了聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、直接免疫荧光、病毒分离鉴定等诊断与检测技术,但缺少可快速读取检测数值的技术方法。因此,开展PCV2抗原抗体快速读取检测数值技术的研究对于该病的成功防控十分必要。本论文基于原核表达纯化的Cap蛋白,建立了PCV2抗体荧光微球免疫层析快速检测技术,基于可配对的PCV2单克隆抗体,建立了PCV2抗原荧光微球免疫层析快速检测技术,丰富了PCV2抗原抗体的快速检测技术。本研究成功扩增出702 bp的Cap基因,构建了pET30a（+）-Cap的原核表达载体,表达了分子量约为36 Ku的含有His标签Cap融合蛋白;通过条件优化,确定了最佳蛋白诱导表达条件,转速180 rpm,IPTG诱导终浓度为0.5 mM,诱导时间5 h,诱导温度为37℃;通过亲和层析的方式成功纯化出Cap融合蛋白,纯化后的蛋白浓度为1.5mg/mL。免疫印迹分析试验表明,纯化的蛋白可与PCV2特异性多抗发生反应,具有良好的反应原性。以表达纯化的含His标签Cap融合蛋白标记荧光微球,实验室已有的无标签的Cap蛋白、兔源PCV2高免血清IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线（T）和质控线（C）上,点膜仪参数设置为Speed 30 mm/sec,1.0μL/cm,建立了猪圆环病毒2型抗体荧光微球免疫层析快速检测方法。荧光微球标记蛋白抗原的终浓度为50μg/mL,最佳反应条件为待检测血清样品进行20倍稀释,在100μL样品中加入3μL偶联抗原的荧光微球,混合均匀后孵育5 min,加入加样孔,待样液完全浸润NC膜时开始计时,反应15min,用干式免疫荧光分析仪读取T/C比值,判定结果。经对8个不同地区的340份血清样品的检测,同时同商品化猪圆环病毒ELISA抗体检测试剂盒比较,特异性符合率为94.2%,敏感性符合率为99.63%,总体符合率为98.53%;试验结果表明,建立的PCV2抗体荧光微球免疫层析快速检测方法具有快速、简便、敏感、特异等特点,可用于生产临床上猪圆环病毒2型抗体的快速检测。以2株PCV2特异性单抗5C、4E11,基于双抗夹心的方法建立PCV2抗原荧光微球免疫层析检测方法。以5C单抗标记荧光微球,1 mg/mL的4E11单抗、1 mg/mL羊抗小鼠IgG分别包被在检测线（T）和质控线线（C）上,点膜仪参数设置,为Speed 40mm/sec,1.0μL/cm,抗体荧光微球偶联的终浓度为150μg/mL。检测最佳条件:含PCV2的样本稀释20倍,每100μL样品中加入单抗偶联的荧光微球7μL,加入稀释板内混合均匀,室温孵育5 min,加入加样孔,待样液完全浸润NC膜时开始计时,反应12 min,最后用干式免疫荧光分析仪读取T/C比值,判定结果的。对临床收集和制备的120份样品进行了检测,同时同商品化PCV2 PCR检测试剂盒比较,特异性符合率为97.22%,敏感性符合率为100%,总体符合率为99.17%;结果表明,研制的PCV2抗原荧光微球免疫层析快速检测方法具有快速、简便、敏感、特异等特点,可用于PCV2的临床样本快速检测和PCV2疫苗生产中的半成品快速检测与质量控制。
二、应用间接免疫荧光技术快速检测猪细小病毒抗原（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用间接免疫荧光技术快速检测猪细小病毒抗原（论文提纲范文）
（1）犬瘟热病毒检测方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 基因组结构 |
| 2 流行病学特点 |
| 3 临床表现 |
| 4 犬瘟热病毒检测技术 |
| 4.1 病原检测 |
| 4.1.1 病毒分离鉴定 |
| 4.1.2 电镜观察 |
| 4.1.3 包涵体检测 |
| 4.2 免疫学检测技术 |
| 4.2.1 琼脂扩散试验 |
| 4.2.2 酶联免疫吸附试验 |
| 4.2.3 血清中和试验 |
| 4.2.4 免疫荧光技术 |
| 4.2.5 免疫组织化学技术 |
| 4.2.6 胶体金免疫层析技术 |
| 4.3 分子生物学检测方法 |
| 4.3.1 聚合酶链反应 |
| 4.3.2 环介导等温扩增技术 |
| 4.3.3 重组酶聚合酶等温扩增技术 |
| 4.4 其他检测方法 |
| 5 结语 |
（2）非洲猪瘟诊断技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 ASF病原学检测 |
| 1.1 病原检测 |
| 1.1.1 病毒分离鉴定 |
| 1.1.2 红细胞吸附试验（haemadsorption test,HAD) |
| 1.2 核酸检测 |
| 1.2.1 PCR |
| 1.2.2 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR) |
| 1.2.3 多重PCR(multiplex polymerase chain reaction,m PCR) |
| 1.2.4 微滴数字PCR(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR) |
| 1.2.5 巢氏PCR(nested-PCR） |
| 1.2.6 环介导等温扩增技术（loop mediated isothermal amplification,LAMP) |
| 1.2.7 重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification,RPA) |
| 1.2.8 交叉引物扩增技术（cross priming amplification,CPA) |
| 1.2.9 原位杂交技术（in situ hybridization,ISH) |
| 1.2.1 0 生物传感器技术 |
| 2 血清学检测 |
| 2.1 抗体检测 |
| 2.1.1 酶联免疫吸附试验（ELISA) |
| 2.1.2 间接荧光抗体试验（indirect fluorescent anti-body test,IFA) |
| 2.1.3 胶体金快速免疫层析法（gold immunochromatography assay,GICA) |
| 2.1.4 免疫印迹法（immunoblotting test,IBT) |
| 2.2 抗原检测 |
| 2.2.1 荧光抗体试验（fluorescent antibody test,FAT) |
| 2.2.2抗原ELISA |
| 2.2.3 侧向流动免疫色谱分析（lateral flow assay,LFA) |
| 2.3 常用检测技术比较 |
| 3 展望 |
（3）病毒性动物疫病诊断技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 病原学诊断 |
| 2 免疫血清学诊断 |
| 2.1 酶联免疫吸附试验 |
| 2.2 化学发光免疫分析 |
| 3 分子生物学诊断 |
| 3.1 基于PCR的检测技术 |
| 3.2 环介导等温扩增技术 |
| 4 高通量诊断 |
| 4.1 生物芯片技术 |
| 4.1.1 固液相芯片 |
| 4.1.2 微流控芯片 |
| 4.2 新型生物传感器 |
| 4.3 下一代测序技术 |
| 4.4 CRISPR/Cas系统 |
| 5 小结与展望 |
（4）猪圆环病毒2型悬浮培养及灭活疫苗工艺优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 猪圆环病毒概述 |
| 1.1.1 病毒生物学特性 |
| 1.1.2 病毒基因结构 |
| 1.2 流行病学研究 |
| 1.2.1 猪圆环病毒病发病史 |
| 1.2.2 猪圆环病毒易感动物 |
| 1.2.3 猪圆环病毒传播途径 |
| 1.3 疫苗种类 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 弱毒活疫苗 |
| 1.3.3 亚单位疫苗 |
| 1.3.4 其它疫苗 |
| 1.4 生物反应器种类和发展 |
| 1.5 悬浮培养技术的应用 |
| 1.6 悬浮培养的细胞系 |
| 1.6.1 幼仓鼠肾细胞 |
| 1.6.2 中国仓鼠卵巢细胞 |
| 1.6.3 非洲绿猴肾细胞 |
| 1.6.4 犬肾细胞 |
| 1.6.5人胚胎肾细胞293 |
| 1.6.6 猪肾细胞 |
| 1.6.7 其它细胞 |
| 1.7 产业化背景-为何要做悬浮培养 |
| 1.7.1 行业要求和标准 |
| 1.7.2 行业发展趋势 |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞和毒种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.1.5 试验动物管理 |
| 2.1.6 病毒载量测定操作规范 |
| 2.1.7 培养液配置 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 PK15细胞培养技术全悬浮培养研究 |
| 2.2.2 猪圆环病毒2型(LG株)悬浮培养参数研究 |
| 2.2.3 猪圆环病毒2型(LG株)抗原纯化工艺的研究 |
| 2.2.4 猪圆环病毒2型(LG株)抗原灭活剂的优化 |
| 2.2.5 猪圆环病毒2型(LG株)实验室试制的研究 |
| 2.2.6 猪圆环病毒2型(LG株)安全性试验研究 |
| 2.2.7 猪圆环病毒2型(LG株)灭活疫苗效力性试验研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PK15细胞培养技术全悬浮培养研究 |
| 3.1.1 初始接种细胞密度的优化 |
| 3.1.2 溶氧(DO)参数的确定 |
| 3.1.3 pH参数的确定 |
| 3.1.4 搅拌转速选择 |
| 3.1.5 补液方式的优化 |
| 3.2 猪圆环病毒2型(LG株)悬浮培养参数研究 |
| 3.2.1 接毒细胞浓度的优化 |
| 3.2.2 接毒剂量的优化 |
| 3.2.3 收毒时间的优化 |
| 3.2.4 全悬浮和转瓶培养方法的比较 |
| 3.3 猪圆环病毒2型(LG株)抗原纯化工艺的研究 |
| 3.3.1 细胞破碎 |
| 3.3.2 抗原液的纯化 |
| 3.4 猪圆环病毒2型(LG株)抗原灭活剂的优化 |
| 3.4.1 BEI灭活猪圆环病毒2型(LG株)抗原试验结果 |
| 3.4.2 两种灭活剂灭活效果结果 |
| 3.4.3 安全性试验 |
| 3.4.4 免疫效力试验 |
| 3.5 猪圆环病毒2型(LG株)实验室试制研究 |
| 3.5.1 抗原的生产及半成品检验结果 |
| 3.5.2 成品疫苗检验结果 |
| 3.6 猪圆环病毒2型(LG株)灭活疫苗安全性试验研究 |
| 3.6.1 单剂量免疫仔猪试验 |
| 3.6.2 单剂量重复免疫仔猪试验 |
| 3.6.3 大剂量免疫仔猪试验 |
| 3.6.4 母猪免疫安全性试验 |
| 3.7 猪圆环病毒2型(LG株)灭活疫苗效力性试验研究 |
| 3.7.1 疫苗免疫攻毒效检试验猪增重率评价试验 |
| 3.7.2 运用荧光定量PCR法评价疫苗免疫效力 |
| 3.7.3 免疫攻毒后病毒排毒规律及组织病毒载量测定 |
| 3.7.4 疫苗免疫持续期与抗体消长规律测定试验 |
| 3.7.5 最小免疫剂量试验及血清抗体与攻毒保护相关性试验 |
| 3.7.6 猪圆环病毒灭活疫苗(LG株)保存期试验 |
| 3.7.7 猪圆环病毒灭活疫苗(LG株)母猪被动免疫试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PK15细胞培养技术全悬浮培养研究 |
| 4.2 猪圆环病毒2型(LG株)悬浮培养参数研究 |
| 4.3 猪圆环病毒2型(LG株)抗原纯化工艺的研究 |
| 4.3.1 细胞破碎 |
| 4.3.2 抗原液的纯化 |
| 4.4 猪圆环病毒2型(LG株)抗原灭活剂的优化 |
| 4.5 猪圆环病毒2型(LG株)实验室试制研究 |
| 4.6 猪圆环病毒2型(LG株)灭活疫苗安全性试验研究 |
| 4.7 猪圆环病毒2型(LG株)灭活疫苗效力性试验研究 |
| 4.7.1 疫苗免疫攻毒效检试验猪增重率评价试验 |
| 4.7.2 运用荧光定量PCR法评价疫苗免疫效力 |
| 4.7.3 免疫攻毒后病毒排毒规律及组织病毒载量测定 |
| 4.7.4 疫苗免疫持续期与抗体消长规律测定试验 |
| 4.7.5 最小免疫剂量试验及血清抗体与攻毒保护相关性试验 |
| 4.7.6 猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)保存期试验 |
| 4.7.7 猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)母猪被动免疫试验 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）猪圆环病毒2型感染诊断技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 分子生物学检测技术 |
| 1.1 PCR技术 |
| 1.1.1 常规PCR |
| 1.1.2 多重PCR |
| 1.1.3 竞争PCR |
| 1.1.4 套式(巢式)PCR |
| 1.1.5 荧光定量PCR |
| 1.1.6 数字PCR技术 |
| 1.2 限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP) |
| 1.3 原位杂交技术(ISH) |
| 1.4 DNA芯片技术 |
| 1.5 环介导等温扩增技术(LAMP) |
| 1.6 重组酶聚合酶扩增技术 |
| 2 血清学检测技术 |
| 2.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2 间接免疫荧光(IFA) |
| 2.3 免疫组织化学技术(IHC) |
| 2.4 免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA) |
| 2.5 免疫胶体金技术(ICS) |
| 3 病原学检测技术 |
| 4 现场快速检测技术 |
| 5 小结 |
（6）牛肠道病毒非结构蛋白3C单抗的制备及其检测病毒抗原的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肠道病毒的概况 |
| 1.2 肠道病毒的形态特征及基因组结构 |
| 1.3 肠道病毒感染的流行病学 |
| 1.4 肠道病毒感染的检测方法研究 |
| 1.5 单克隆抗体的研究进展 |
| 第二章 牛肠道病毒3C蛋白的原核表达及纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛肠道病毒3C蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及纯化 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 检测牛肠道病毒抗原IPMA方法的建立及初步应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定及其免疫原性初步探究（论文提纲范文）
| 符号及缩略词说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 呼肠孤病毒发展 |
| 1.2 DRV的病原学特点 |
| 1.2.1 形态和结构 |
| 1.2.2 宿主 |
| 1.2.3 理化特性及血凝性 |
| 1.3 DRV的致病性 |
| 1.3.1 流行病学特点及临床症状 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.4 DRV的诊断 |
| 1.4.1 分离与鉴定 |
| 1.4.2 分子生物学鉴定 |
| 1.4.3 血清学诊断 |
| 1.5 呼肠孤病毒病防控的研究进展 |
| 1.5.1 弱毒疫苗 |
| 1.5.2 灭活疫苗 |
| 1.5.3 其他生物制品 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料背景 |
| 2.1.2 试验用胚、试验动物 |
| 2.1.3 试验毒株 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 试验相关溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物的合成 |
| 2.2.2 分离与鉴定 |
| 2.2.3 RT-PCR检测及测序分析 |
| 2.2.4 生物学及理化特性研究 |
| 2.2.5 一步生长曲线的绘制 |
| 2.2.6 灭活疫苗的研制 |
| 2.2.7 灭活疫苗的检验 |
| 2.2.8 灭活疫苗免疫父母代种鸭后抗体水平检测 |
| 2.2.9 母源抗体对商品代雏鸭的被动保护试验 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRV的分离与鉴定 |
| 3.1.1 病毒的分离与传代 |
| 3.1.2 RT-PCR鉴定结果 |
| 3.1.3 测序结果与分析 |
| 3.1.4 生物学及理化特性鉴定结果 |
| 3.1.5 一步生长曲线的绘制 |
| 3.2 灭活疫苗的研制 |
| 3.2.1 病毒液的制备 |
| 3.2.2 病毒液的纯净性检验 |
| 3.2.3 病毒含量(TCID_(50))的测定 |
| 3.2.4 疫苗的制备 |
| 3.2.5 灭活疫苗的检验 |
| 3.3 疫苗的免疫原性探究 |
| 3.3.1 灭活疫苗免疫父母代种鸭后抗体水平检测结果 |
| 3.3.2 母源抗体对商品代雏鸭的被动保护试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NDRV的分离与鉴定 |
| 4.2 灭活疫苗的制备 |
| 4.3 灭活疫苗的免疫原性探究 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（8）水貂阿留申病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 AMDV的病原学概述 |
| 1.2.1 AMDV的基因组结构特征 |
| 1.2.2 AMDV的非结构蛋白 |
| 1.2.3 AMDV的结构蛋白 |
| 1.3 流行病学及临床症状 |
| 1.3.1 流行病学特征 |
| 1.3.2 国内外流行情况 |
| 1.3.3 临床症状 |
| 1.4 病理变化 |
| 1.5 AMDV的诊断方法 |
| 1.5.1 血清学诊断 |
| 1.5.1.1 碘凝结实验(IAT) |
| 1.5.1.2 对流免疫电泳法 |
| 1.5.1.3 酶联免疫吸附试验 |
| 1.5.1.4 抗原抗体免疫复合物检测法 |
| 1.5.1.5 间接免疫荧光实验 |
| 1.5.1.6 补体结合试验 |
| 1.5.1.7 其他血清学检测技术 |
| 1.5.2 分子生物学诊断 |
| 1.5.2.1 聚合酶链式反应 |
| 1.5.2.2 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.5.2.3 数字PCR检测 |
| 1.6 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 相关试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 临床样品的检测 |
| 2.2.1.1 病料的采集处理 |
| 2.2.1.2 病毒DNA的提取 |
| 2.2.1.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.1.4 PCR检测 |
| 2.2.1.5 凝胶电泳检测 |
| 2.2.2 质粒标准品的制备 |
| 2.2.2.1 目的基因片段PCR扩增 |
| 2.2.2.2 PCR产物凝胶电泳 |
| 2.2.2.3 PCR产物的纯化 |
| 2.2.2.4 PCR产物回收 |
| 2.2.2.5 胶回收产物T载体连接 |
| 2.2.2.6 连接产物的转化 |
| 2.2.2.7 菌液的PCR鉴定及序列测定 |
| 2.2.2.8 质粒DNA小量纯化 |
| 2.2.3 AMDV微滴式数字PCR检测方法的建立 |
| 2.2.3.1 毒株的选择 |
| 2.2.3.2 AMDV微滴式数字PCR引物探针的设计与合成 |
| 2.2.3.3 AMDV微滴式数字PCR的操作流程 |
| 2.2.3.4 AMDV微滴式数字PCR反应条件的优化 |
| 2.2.3.5 AMDV微滴式数字PCR标准曲线的建立 |
| 2.2.3.6 AMDV微滴式数字PCR的灵敏性试验 |
| 2.2.3.7 AMDV微滴式数字PCR的特异性试验 |
| 2.2.3.8 AMDV微滴式数字PCR的重复试验 |
| 2.2.4 AMDV实时荧光定量PCR方法 |
| 2.3 AMDV微滴式数字PCR检测方法的初步应用 |
| 2.3.1 临床样品的采集 |
| 2.3.2 试验方法 |
| 2.3.2.1 组织样品处理 |
| 2.3.2.2 AMDV的 DNA的提取 |
| 2.3.2.3 dd-PCR检测AMDV的操作流程 |
| 2.3.2.4 dd-PCR检测AMDV的组织样品 |
| 2.3.2.5 dd-PCR检测AMDV的环境样品 |
| 2.3.2.6 dd-PCR检测AMDV的不同组织脏器 |
| 2.3.2.7 VP2 基因的遗传测序分析 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 质粒标准品的制备 |
| 3.2 AMDV微滴式数字PCR反应条件的优化 |
| 3.2.1 退火温度的优化 |
| 3.2.2 引物浓度的优化 |
| 3.2.3 探针浓度的优化 |
| 3.2.4 升降温速率的优化 |
| 3.3 dd-PCR与 RT-qPCR的线性关系结果与分析 |
| 3.4 dd-PCR与 RT-qPCR的灵敏性试验结果与分析 |
| 3.5 dd-PCR与 RT-qPCR的特异性试验结果与分析 |
| 3.6 dd-PCR的重复性试验结果与分析 |
| 3.7 AMDV微滴式数字PCR检测方法的初步应用结果与分析 |
| 3.7.1 AMDV的 dd-PCR组织样品的结果与分析 |
| 3.7.2 AMDV的 dd-PCR环境样品的结果与分析 |
| 3.7.3 AMDV的 dd-PCR不同脏器的结果与分析 |
| 3.8 AMDV的 VP2 基于的遗传进化分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 AMDV微滴式数字PCR检测检测方法的建立 |
| 4.2 AMDV的 dd PCR的应用 |
| 4.3 AMDV分离株的遗传进化分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）猪细小病毒、猪圆环病毒病Ⅱ型和副猪嗜血杆菌SYBR Green Ⅰ多重荧光定量PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 猪细小病毒简介及检测方法研究进展 |
| 2.1 病原学特点 |
| 2.2 流行病学特点 |
| 2.3 检测方法 |
| 3 猪圆环病毒Ⅱ型及其诊断方法研究进展 |
| 3.1 病原学特点 |
| 3.2 流行病学特点 |
| 3.3 诊断方法 |
| 4 副猪嗜血杆菌病检测方法研究进展 |
| 4.1 病原学特点 |
| 4.2 流行病学特点 |
| 4.3 检测方法 |
| 第二章 猪细小病毒、猪圆环病毒2 型和副猪嗜血杆菌SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 阳性质粒的构建 |
| 2.2 反应条件优化结果 |
| 2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.4 扩增产物熔解曲线分析 |
| 2.5 特异性检测 |
| 2.6 重复性试验结果 |
| 2.7 敏感性检验 |
| 2.8 病料检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪细小病毒与猪圆环病毒Ⅱ型双重SYBR Green Ⅰ实时PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 体系优化结果 |
| 2.2 熔解曲线分析 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 2.5 敏感性检验 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 猪细小病毒与副猪嗜血杆菌双重SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 体系优化结果 |
| 2.2 熔解曲线分析 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 2.5 敏感性检验 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 猪圆环病毒Ⅱ型与副猪嗜血杆菌双重SYBR Green Ⅰ实时PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 体系优化结果 |
| 2.2 熔解曲线分析 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 2.5 敏感性检验 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型和副猪嗜血杆菌三重SYBR Green Ⅰ实时PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 体系优化结果 |
| 2.2 熔解曲线分析 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 2.5 敏感性检验 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件(A) |
| 附件(B) |
| 附件(C) |
| 附件(D) |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（10）猪圆环病毒2型抗原抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪圆环病毒病的概述 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 猪圆环病毒病的流行病学 |
| 1.1.3 发病机理 |
| 1.1.4 症状 |
| 1.1.5 猪圆环病毒病的诊断方法 |
| 1.2 猪圆环病毒cap蛋白研究进展 |
| 1.2.1 圆环cap蛋白的简介 |
| 1.2.2 圆环cap蛋白的检测方法、疫苗研究 |
| 1.3 荧光微球为标记物的免疫层析试纸条 |
| 1.3.1 免疫层析试纸条 |
| 1.3.2 荧光微球 |
| 1.3.3 荧光微球在免疫层析技术中的应用 |
| 1.3.4 胶体金免疫层析方法比较 |
| 1.3.5 检测原理及结果判断 |
| 1.4 研究的意义及目的 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 重组菌种 |
| 2.1.2 荧光微球免疫层析材料等试验材料 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 试剂制备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 猪圆环Cap基因克隆及原核表达方法 |
| 2.2.2 猪圆环病毒2 型抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 2.2.3 猪圆环病毒2 型抗原荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Cap基因克隆及重组表达质粒构建 |
| 3.2 Cap重组蛋白的表达及鉴定 |
| 3.3 蛋白表达条件的优化 |
| 3.4 PCV2 抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 3.5 PCV2 抗原荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪圆环cap蛋白表达 |
| 4.2 PCV2 抗体荧光微球免疫层析快速检测试纸条的建立与应用 |
| 4.3 PCV2 抗原荧光微球免疫层析快速检测试纸条的建立与应用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、应用间接免疫荧光技术快速检测猪细小病毒抗原（论文参考文献）
- [1]犬瘟热病毒检测方法研究进展[J]. 王改丽,呼延含蓉,程荣华,郭衍冰,郝良玉,刘沂霖,李昱洁,姚新华. 动物医学进展, 2022(01)
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- [6]牛肠道病毒非结构蛋白3C单抗的制备及其检测病毒抗原的应用[D]. 蔡梦露. 吉林大学, 2021(01)
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- [8]水貂阿留申病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用[D]. 蔡晓庆. 山东农业大学, 2021(01)
- [9]猪细小病毒、猪圆环病毒病Ⅱ型和副猪嗜血杆菌SYBR Green Ⅰ多重荧光定量PCR检测方法的建立[D]. 胡斌. 河南科技学院, 2020
- [10]猪圆环病毒2型抗原抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用[D]. 柳亚茹. 山东农业大学, 2019(01)