一、反式-BPDE诱发人胎气管上皮细胞H-ras癌基因点突变的研究（论文文献综述）
于涛[1]（2019）在《PPP1R13L基因可变剪接在多环芳烃类所致肺癌变过程中的特征分析及机制研究》文中认为目的:近年来,肺癌以其不断攀升的发病率和死亡率迅速成为全球范围内严重威胁人类健康的恶性疾病之一。因此,找寻在肺癌发生发展过程中的有效生物学标志对提高肺癌患者的生命质量和生存时间具有非常重要的意义。pre-mRNA的可变剪接是控制基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制,也是引起癌症表达的天然来源。许多癌基因受可变剪接调控,而某一个或某些可变剪接异构体的转换,可能在肿瘤发生、发展中起关键作用,成为癌症的特异性可变剪接模式。PPP1R13L是一种新的癌基因,存在2个常见可以编码蛋白的可变剪接异构体PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV,两者在环境致癌物所致肺癌的发生发展中可能发挥不同的生物学功能,呈现出某种肺癌特异性可变剪接模式。本研究通过基因芯片和生物数据库等方法筛选与肺癌相关的癌基因PPP1R13L的可变剪接异构体,并采用临床肺癌及癌旁组织样本、BPDE诱导细胞恶性转化模型及体外细胞转染模型深入挖掘和探讨PPP1R13L基因两个候选可变剪接异构体在肺癌变过程中的特征表达和相关机制。阐明高表达PPP1R13L-SV可以通过抑制P53的凋亡功能,促进细胞恶性转变,认为PPP1R13L-SV是PPP1R13L基因在肺鳞癌恶性变过程中的特异性可变剪接模式,为肺癌特异性可变剪接模式的研究提供重要的理论基础,也为其精准预防和早期诊断提供新的思路和靶标。研究方法:首先,自2013年6月至2018年6月,收集中国医科大学附属第一医院胸心外科及辽宁省肿瘤医院胸外科行肺癌手术治疗的患者组织样本100余例。签写知情同意书后实施。通过患者咨询和病理报告结果填写调查表:除记录既往病史、家族史、生活方式等一般人口学特征之外,还要详细记录肿瘤类型、分期、肿瘤大小、淋巴结转移等肺癌病理学特征。根据Affymetrix基因芯片技术和生物信息学软件（UCSC等）的综合分析结果,对可能与肺癌发生发展相关的PPP1R13L基因可变剪接异构体进行预测和筛选,并通过RACE试验验证各可变剪接异构体。在癌组织及其癌旁组织中,采用实时定量及RT PCR检测PPP1R13L候选可变剪接体和P53基因mRNA的表达水平,Western blot观察PPP1R13L候选转录本蛋白表达情况,整体及分层分析PPP1R13L候选转录表达与其临床病理特征之间的关联,并通过实时定量PCR和Western blot结果分析在癌组织中P53表达与PPP1R13L候选可变剪接异构体的相关性。其次,采用低剂量多环芳烃类致癌物BPDE体外诱导16HBE建立细胞恶性转化模型,通过细胞划痕、Transwell小室体外侵袭实验、软琼脂克隆实验、裸鼠成瘤实验等观察不同代数转化细胞恶性程度的变化,并对致瘤组织进行HE染色和免疫组化分析其病理类型,鉴定16HBE细胞是否成功癌变,P53基因测序分析恶性转化后细胞的P53基因型。在恶性转化过程中,采用realtime PCR和Western blot检测PPP1R13L基因两种可变剪接异构体mRNA水平和蛋白表达的变化,观察两者之间表达的变化规律。最后,设计PPP1R13L基因两种可变剪异构接体的过表达质粒和siRNA,分别体外转染293T和16HBE细胞,同时利用CRISPR-Cas9体系精准敲除PPP1R13L-L转录本构建内源性下调PPP1R13L-L的16HBE和16HBE-40T细胞模型,在明确施加环境致癌因子BPDE后,采用流式细胞仪比较各组转染细胞的凋亡差异,免疫荧光实验检测染毒前和染毒后各组转染细胞P53核内表达变化。结果:1.根据基因芯片技术和UCSC数据库筛选,RACE实验检测确定在人群和细胞系中均有表达且可能与肺癌相关的PPP1R3L转录本PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV,排除患者信息收集不全和组织质量不达标准的样本,最终样本量确定为98例。在98例肺癌患者中,PPP1R13L-SV可变剪接异构体在癌组织中mRNA表达水平明显高于癌旁（P<0.05）,而P53基因mRNA表达水平在癌旁组织中明显升高（P<0.05）,在临床病理特征分层分析中发现,与癌旁组织比较,年龄大于60岁（包括60岁）的人群PPP1R13L-SV可变剪接异构体mRNA表达水平明显升高,而P53基因mRNA表达水平在癌组织中表达明显降低（P<0.05）。吸烟患者PPP1R13L-SV可变剪接异构体在肺癌组织中mRNA表达水平要明显高于癌旁组织（P<0.05）。在鳞癌组织中PPP1R13L-SV可变剪接异构体mRNA表达水平升高,同时P53基因mRNA表达水平降低（P<0.05）,而且在肺腺癌和肺鳞癌组织蛋白检测对比分析中也发现同样的趋势。在肺鳞癌组织中,当肿瘤直径≥3cm时,PPP1R13L-SV明显高表达（P<0.05）,同时P53基因低表达（P<0.05）,在有淋巴结转移的情况下,PPP1R13L-SV高表达（P=0.054,为临界值,认为差异具有统计学意义）,在恶性肿瘤高分期组（Ⅲ/Ⅳ期）,PPP1R13L-SV呈高水平表达（P<0.05）,而P53基因呈低水平表达（P<0.05）,PPP1R13L-SV可变剪接异构体mRNA或蛋白表达水平与P53 mRNA或蛋白表达水平呈负相关（P<0.05）。在15例肺癌患者癌、癌旁及远端组织,PPP1R13L-SV可变剪接体在癌、癌旁及远端组织中mRNA表达水平呈下降趋势（F=11.183,P<0.05）,但癌旁与远端组织中PPP1R13L-SV蛋白表达无明显差别。2.通过1μM BPDE体外诱导16HBE细胞恶性转化,随着细胞恶性转化代数的增加,细胞核质比逐渐变大,由分散生长状态变为成簇聚集生长,细胞划痕面积比值呈逐渐下降趋势（P<0.05）,细胞的侵袭能力及恶性增殖能力不断增强,16HBE-40T侵袭能力及恶性增殖能力与LK2几乎相同。在裸鼠成瘤试验中,通过对成瘤组织病理切片HE染色和免疫组化,鉴定为肺鳞癌,并对16HBE-40T细胞P53 exon5-8测序分析,确定为P53野生型。而在细胞恶性转化过程中,PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV可变剪接异构体mRNA表达水平均呈波浪式上升,P53 mRNA表达水平则曲折下降,在蛋白检测中PPP1R13L-SV和P53蛋白与mRNA水平的表达趋势均相同,而PPP1R13L-L蛋白表达则与其mRNA表达水平具有不一致性。3.设计PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV的过表达质粒和siRNA,分别体外转染293T和16HBE细胞。过表达质粒有绿色荧光标签,转染48h后荧光显微镜下可见绿色荧光,PPP1R13L-L或PPP1R13L-SV在各自转染细胞中的mRNA水平和蛋白表达量均高于转染EV质粒的细胞,siRNA转染细胞并无荧光表达,仅是通过mRNA水平和蛋白表达量的变化判断转染效率。PPP1R13L-L或PPP1R13L-SV在各自siRNA转染细胞中mRNA水平和蛋白表达量均低于转染NC对照组细胞,证明细胞转染模型构建成功。BPDE染毒24h后,各组细胞凋亡率均有升高的趋势。在转染siRNA未染毒的293T细胞中,与NC组比较,si PPP1R13L-L和si PPP1R13L-SV组凋亡均明显增加（P<0.05）,但经BPDE染毒后,仅si PPP1R13L-SV组凋亡显着增加（P<0.01）;在过表达质粒转染的293T细胞中,未染毒处理时,与EV组比较,OE PPP1R13L-L和OE PPP1R13L-SV组细胞凋亡均无明显变化。但经BPDE染毒后,OE PPP1R13L-SV组细胞凋亡比EV组明显减少（P<0.05）,16HBE细胞各组凋亡情况与293T细胞表现基本一致。同样我们在免疫荧光试验中发现,经BPDE染毒24h后,与未染毒时相比,各组细胞核内荧光强度均有升高的趋势。与NC组比较,si PPP1R13L-L和si PPP1R13L-SV组核内红色荧光强度均明显增加（P<0.05）,但经BPDE染毒后,仅si PPP1R13L-SV组核内红色荧光强度明显增加（P<0.05）;OE PPP1R13L-SV组细胞核内红色荧光强度比EV组明显减少（P<0.05）,转染的16HBE细胞核内红色荧光强度与293T细胞表现基本一致。利用CRISPR-Cas9体系精准敲除PPP1R13L-L转录本构建内源性下调PPP1R13L-L的16HBE和16HBE-40T细胞模型,在荧光显微镜下观察,可见过细胞表达绿色荧光蛋白,Westen blot检测后确定转染成功。BPDE染毒24h后,各组细胞凋亡率均有升高的趋势。未染毒处理时,16HBE Cas+kdL3组和16HBE-40T Cas+kdL3组细胞凋亡无明显差别;但BPDE染毒后,16HBE Cas+kdL3组细胞凋亡比16HBE-40T Cas+kdL3组明显升高（P<0.05）,而16HBE-40T Cas+EV组和16HBE-40T Cas+kdL3组细胞凋亡并无明显差别,免疫荧光实验细胞内荧光强度的变化与凋亡检测结果一致。结论:1.在人群肺癌组织样本研究中提出PPP1R13L-SV可能通过影响P53的表达而成为在肺鳞癌发生发展的过程中起关键作用的可变剪接模式,可能作为预测肺鳞癌恶性转化的生物标志。2.BPDE体外诱导16HBE细胞恶性转化,根据基因测序和病理分析鉴定获得的16HBE-40T为P53野生型肺鳞癌细胞,并且PPP1R13L-SV是16HBE细胞在BPDE诱导下向肺鳞癌转化过程中的特异性可变剪接模式。3.高表达PPP1R13L-SV可以通过抑制P53的凋亡功能,促进细胞恶性转变,认为PPP1R13L-SV是PPP1R13L基因在肺鳞癌恶性变过程中的特异性可变剪接模式。
乌日汗,常福厚[2]（2015）在《基因多态性与吸烟交互作用致肺癌易感性的研究进展》文中认为肺癌是人类最常见的癌症之一。目前,肺癌的发病率和病死率在恶性肿瘤中居首位,致癌环境在肺癌的发病因素中起到重要的作用,但肿瘤的发生并不单纯取决于致癌环境,个体易感性在肿瘤的发生发展过程中有不可忽视的作用。越来越多的研究表明,肺癌的发生是遗传因素和环境因素交互作用的结果。本文对近年来基因多态性与吸烟交互作用与肺癌易感性的研究进行阐述,并对存在不同结果的原因及研究发展进行讨论。
李艳勃[3]（2014）在《淋巴瘤患者PAH-DNA加合物及CYP1A1、GSTM1基因多态性的研究》文中进行了进一步梳理目的探讨多环芳烃（PAH）-DNA加合物和代谢酶基因细胞色素氧化酶P4501A1（CYP1A1）与谷胱苷肽硫转移酶M1（GSTM1）基因多态性与淋巴瘤发病的关系。方法通过竞争性酶联免疫吸附法测定54例淋巴瘤病人及34例对照组骨髓液中PAH-DNA加合物含量,采用限制性片段长度多态性PCR法（PCR-RFLP）测定上述标本CYPlA1、GSTM1基因多态性。结果淋巴瘤病人较对照组骨髓液中PAH-DNA加合物含量增多（x±s病例组2498±1250pg/mL,对照组1882±797pg/mL）,差异有统计学意义（t=0.006, p<0.05）; GST M1基因缺失型淋巴瘤组占85.2%,对照组58.8%,差异有统计学意义（X2=7.73, P<0.05）, GSTM1基因型缺失者患淋巴瘤风险是GSTM1表达者的4.03倍（95%CI:1.51-10.76, p<0.05）; CYP1A1变异型是野生型患淋巴瘤风险的1.36倍（95%CI:0.56-3.31, p>0.05）, GSTM1缺失者PAH-DNA加合物水平≥2200pg/mL时患淋巴瘤的危险性增加（OR=9.53,95%CI:2.397-37.99,P<0.05）。结论PAH-DNA合和物可能参与淋巴瘤的发病,GSTM1缺失与淋巴瘤发生有关,并且增加患淋巴瘤的风险。
朱佳杰[4]（2011）在《肺癌发生相关基因的研究进展》文中研究表明肺癌是世界范围内发病率和死亡率增长最快、预后最差的恶性肿瘤之一。根据WHO最新统计,肺癌死亡率已跃居癌症死亡率之首[1]。由此对于肺癌发生的相关基因的研究就有重要的意义。随着分子生物学技术的飞速发展,近年来,对
冯艳铭[5]（2008）在《慢病毒介导的亲环素A（CyPA）siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的实验研究》文中研究表明肺癌是常见的恶性肿瘤,被认为是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。全球每年新增120万病例,中国每年有60万人死于肺癌,在中国肺癌5年生存率仅8.9%,非小细胞肺癌占肺癌的85%以上,而非小细胞肺癌中85%以上又都属中晚期肺癌而失去根治性手术治疗的机会。肺癌的发生是环境因素和遗传因素共同作用的结果,多种基因在肺癌的发生和发展中均起到了非常重要的作用,蛋白组学的发展使得在非小细胞肺癌（Non-small celllung cancer,NSCLC）发现了许多高表达和低表达蛋白,亲环素A（Cyclophilin A,CyPA）就是众多相关蛋白之一。CyPA是本课题组应用双向电泳技术（2-DE）在肺腺鳞癌组织中发现的特异性高表达的差异蛋白,CyPA是功能相关的蛋白家族成员之一,具有肽基脯氨基顺反异构酶活性,能催化细胞内蛋白质的折迭、装配和运输,起分子伴侣的作用。新近研究表明,CyPA参与了许多癌的发生和发展过程,其促进癌细胞生长的作用在胰腺癌研究中,取得了很有说服力的结果。RNA干扰（RNAi）技术具有快速、高效、易行的特点,在基因功能研究、基因治疗方面显示了巨大的前景。慢病毒载体介导的短发夹RNA（shRNA）表达载体能感染非分裂细胞和终末分化细胞,并且在感染后整合到宿主细胞的基因组,进行长时间的稳定表达,适合体内实验研究。研究目的1.假设特异性地沉默CyPA基因可能是抑制非小细胞肺癌生长的有效方法,为此,本课题首先构建慢病毒介导的CyPA siRNA系统。2.本课题旨在研究CyPA在NSCLC发生中的作用,以寻求其作为基因治疗新靶点的依据。因此,采用慢病毒介导的CyPA siRNA,分别在体内体外水平研究CyPA基因沉默对非小细胞肺癌细胞生长的抑制作用,对已筛选的肺癌相关蛋白CyPA的基因进行生物学功能研究。材料与方法1.CyPA mRNA和蛋白在NSCLC细胞和组织的表达水平1.1采用双链嵌合荧光染料SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术,设计特异性引物,提取NSCLC A549、H1299及人正常支气管上皮细胞BEAS-2B细胞的总RNA,反转录获得cDNA进行PCR,低熔点琼脂糖凝胶回收纯化PCR扩增产物,取1μl的纯化产物,作10倍系列稀释共9个梯度,取后6个稀释梯度的模板做标准曲线,分别建立内对照β-actin和目的基因CyPA定量标准曲线。检测A549、H1299及BEAS-2B细胞CyPAmRNA的表达水平,以BEAS-2B细胞作为对照,用2-ΔΔCt计算CyPAmRNA相对表达量,通过PCR产物的熔解曲线评价其特异性。1.2收集45例NSCLC手术病人切除的肺癌组织,22例对应的癌旁组织,33例对应的正常肺组织制成组织芯片,其中鳞癌25例,腺癌20例;按TNM分期标准Ⅰ+Ⅱ期27例,Ⅲ期18例,用SP免疫组化方法和组织芯片技术,观察CyPA在NSCLC癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达和分布情况以及与临床病理指标的关系。2.构建并筛选慢病毒介导的CyPA siRNA有效靶点和制备病毒颗粒2.1首先设计并合成4对CyPA基因siRNA靶序列寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生Lv-shCyPA慢病毒质粒载体,PCR及测序筛选鉴定阳性克隆。2.2将阳性克隆Lv-shCyPA慢病毒质粒载体与pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞,包装制备5个假包装病毒颗粒（Lv-shCyPA）并感染NSCLC A549、H1299细胞,Western Blot分析CyPA蛋白表达水平,筛选CyPA siRNA有效靶点并进行该靶点高滴度病毒包装,命名为Lv-shCyPA。2.3待A549、H1299细胞生长至50%～70%融合度时,将Lv-shCyPA分别按照MOI值为2、5、10、20、40感染A549细胞、H1299,根据表达荧光的细胞百分数优化MOI值。3.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞生长的体外研究3.1待A549、H1299细胞生长至50%～70%融合度时,按照优化的MOI值,加入适量的病毒,每孔细胞加Polyberne（5μg/ml）,正常培养传代4～5次,以GFP为报告基因镜下筛选GFP强表达的克隆,分离培养,建立了CyPA稳定沉默的细胞系A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA。3.2将Lv-shCyPA分别按照A549细胞（MOI=20）、H1299（MOI=5）感染NSCLC A549、H1299细胞,感染第5天提取细胞总RNA,采用荧光定量RT-PCR检测CyPA mRNA表达水平。3.3取对数生长期的CyPA稳定沉默的细胞系A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA,胰酶消化后重悬成2×104/ml的细胞悬液,每孔接种100μl于96孔板,分别在培养1d、2d、3d、4d、5d、6d时终止培养,MTT法检测细胞增殖情况。3.4将Lv-shCyPA按照A549细胞（MOI=20）、H1299（MOI=5）感染A549、H1299细胞,用不含EDTA的0.25%胰酶消化感染第5天的细胞培养物,4℃70%乙醇固定细胞,加1mlPI（50μg/ml）染色,4℃避光30min,进行细胞周期及凋亡检测。3.5阴性对照病毒颗粒按上述步骤进行平行实验,未感染病毒的A549、H1299分别作为实验对照组。4.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞裸鼠移植瘤生长的作用4.1 A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA细胞悬液（5×107/ml）,注射于裸鼠协腹皮下,每组5～6只裸鼠,注射体积为100μl/只。4.2裸鼠成瘤后每四天测量1次移植瘤体积,从注射起测量到第38d,肿瘤体积=（长×宽2）×0.5,根据移植瘤体积绘制移植瘤生长曲线。4.3阴性对照病毒颗粒感染的A549、H1299按上述步骤进行致瘤,未感染病毒的A549、H1299分别作为实验对照组。5.统计学处理利用SPSS12.0软件对数据进行统计分析,采用t检验对不同感染条件下细胞CyPA蛋白、mRNA、细胞增殖率、细胞周期分布、凋亡率以及裸鼠移植瘤瘤体、重量与对照组比较;秩和检验比较不同组织CyPA蛋白表达水平的差异,以α=0.05为检验水准。结果1.CyPA mRNA和蛋白在NSCLC细胞和组织的表达水平1.1荧光定量RT-PCR检测A549、H1299、BEAS-2B细胞中CyPA mRNA的表达水平,结果显示:肺腺癌细胞A549、H1299中CyPA mRNA呈高表达,其表达水平与BEAS-2B细胞相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。1.2组织芯片免疫组织化学技术检测,结果显示:CyPA蛋白的阳性信号见于肺癌细胞浆、肺泡上皮细胞浆,呈棕色颗粒状,其分布以广泛性表达为主,偶见局灶性或散在性分布;正常肺组织未见或少见棕色颗粒沉着。NSCLC癌组织及癌旁组织中CyPA的表达水平明显高于正常肺组织中CyPA蛋白的表达水平,其差异有统计学意义（P＜0.05）,CyPA蛋白在正常组织、癌旁组织及肺癌组织中的阳性表达率分别为9.09%（3/33）、53.62%（12/22）、82.22%（37/45）,CyPA在正常组织、癌旁组织及肺癌组织中的表达水平依次呈递增趋势;肺腺癌与肺鳞癌组织中CyPA蛋白的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）;不同TNM分期的的癌组织CyPA蛋白的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。2.慢病毒介导的CyPA siRNA的有效靶点有效的CyPA siRNA靶序列是5’-GTGAAAGAAGGCATGAATA-3’,根据该序列制备的CyPA siRNA假包装病毒颗粒滴度为2×109TU/ml。3.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299中CyPA基因的沉默作用Lv-shCyPA感染A549、H1299细胞,CyPA mRNA和蛋白表达水平均下降,与对照组相比,CyPA mRNA相对表达量分别为0.048和0.1452,CyPA mRNA的沉默效率分别为95.2%和85.48%,CyPA蛋白水平相对表达量分别为13.48%和14.7%,其表达抑制效率分别为86.52%和85.3%,CyPA mRNA与蛋白的表达水平具有一致性,其表达水平与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。阴性对照A549/NC、H1299/NC组CyPA mRNA和蛋白的表达水平与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。4.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞生长的抑制作用MTT法分析不同条件下A549、H1299细胞的生长状态,结果显示:A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA细胞生长明显平缓,感染第5d细胞增殖率下降,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞术分析不同条件下细胞各周期分布,结果显示:不同条件下细胞G0-G1期、S期细胞比例与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）;A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA细胞G2-M期细胞相对减少,细胞凋亡率增加,与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）;而A549/NC、H1299/NC组G2-M期比例、细胞凋亡率与对照组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。5.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用未感染病毒组及阴性对照病毒颗粒感染组的细胞接种裸鼠后,移植瘤在第4d出现可见肿瘤,然后生长迅速,而A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA感染组可见肿瘤在接种后6d出现,移植瘤生长明显迟缓。接种后第38d,A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA组移植瘤体积小、重量轻,与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）,CyPA基因沉默组移植瘤瘤体重量平均降低了77.76%和78.85%。而A549/NC、H1299/NC组细胞接种后形成的移植瘤体积、重量与对照组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论1.CyPA蛋白在正常肺组织、NSCLC癌旁组织及癌组织中的表达水平依次呈递增趋势,尤其是在癌组织中呈高表达水平;同时在NSCLC A549、H1299细胞中CyPA mRNA亦呈高表达水平,CyPA mRNA的表达水平与BEAS-2B细胞相比差异有统计学意义,提示CyPA可能参与了非小细胞肺癌的发生发展。2.筛选出有效的CyPA siRNA靶序列为5’-GTGAAAGAAGGCATGAATA-3’,制备的Lv-shCyPA经体外观察对NSCLC A549、H1299中CyPA基因的表达有沉默作用,对NSCLC A549、H1299生长有抑制作用。3.慢病毒介导的CyPA siRNA在裸鼠移植瘤实验中也显示出一定的抑瘤作用,为肺癌的基因治疗和药物治疗提供新的治疗策略。
傅娟[6]（2008）在《反式二羟环氧苯并（a）芘相关原癌基因表达及HER2/neu生物特性研究》文中进行了进一步梳理苯并（a）芘（B[a]P）是一种广泛存在的多环芳烃（PAHs）类环境污染物,主要由含碳物质的高温分解和不完全燃烧产生,它较多的存在于煤烟、香烟的烟雾、熏烤食品、汽车尾气中。肿瘤流行病学调查及实验室研究发现B[a]P具有较强致癌性,它与肿瘤的发生密切相关,尤其与人类肺癌的发生高度有关。2006年,B[a]P已被世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer,IARC）从第二类A组“很可能对人类致癌物”改为第一类“人类致癌物”。BaP是间接致癌物,需在体内代谢生成活性代谢终产物才具有强烈的致癌作用。BaP代谢过程复杂,可产生20多种氧化代谢产物和大量结合物,如环氧化物、酚、醌、二醇、二氢二醇、二醇环氧化物和四醇等。其中以反式二氢二醇环氧苯并（a）芘[anti-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo（a）pyrene, anti-BPDE]致癌活性最强。anti-BPDE具有亲电子性,易与蛋白质和核酸大分子反应,特别易于与嘌呤残基反应。它通过攻击DNA亲核位点与其共价结合形成BPDE-DNA加合物,引起DNA碱基突变,从而使癌基因和/或抑癌基因表达或功能改变,另外它还可以与蛋白质及转录因子结合,影响细胞的代谢及细胞周期的正常进行,引起细胞发生恶性转化。尽管国内外专家学者对BaP的致癌进行了很多研究,但其分子机制仍不十分清楚。因此,本研究从文献中搜索与人类肺癌高度相关的原癌基因,并检测它们在反式BPDE恶性转化细胞中的基因转录及翻译水平上表达变化→应用RNA干扰技术抑制癌基因HER2/neu表达→抑制HER2/neu基因表达对反式BPDE恶性转化细胞生物学特性的影响进行研究,为探索环境污染物B（a）P的致癌分子机制提供一定依据,为肿瘤的基因预防、早期诊断及治疗提供理论与技术基础。现将结果报告如下:第一部分反式二羟环氧苯并（a）芘主要相关原癌基因表达研究目的:苯并（a）芘（B[a]P）作为广泛存在的一种典型的多环芳烃类环境污染物,研究证明它具有致癌性,与人类肺癌发生密切相关。反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘（反式-BPDE）是B[a]P体内代谢的终致癌产物,尽管已进行过一些研究,但其致癌的分子机制特别是相关原癌基因的研究仍不十分清楚,本研究通过文献检索发现在人类肺癌中高表达的原癌基因,通过QRT-PCR和Western blot技术检测这些原癌基因在反式-BPDE诱导转化16HBE细胞中表达变化,为其致癌的分子机制研究及生物学标志的筛选提供一定资料。方法:通过国内外文献检索分析与人类肺癌高度相关的表达增高的4条原癌基因,找出可能与环境污染物苯并（a）芘密切相关的癌基因。分别提取反式BPDE恶性转化16HBE细胞（16HBE-T）与溶剂DMSO对照组细胞（16HBE-N）的总RNA和总蛋白,应用逆转录荧光定量PCR方法和Western blot的方法,分别检测HER2/neu, c-myc, cyclin D1和K-ras癌基因相应mRNA和蛋白表达水平,并用细胞免疫化学方法验证蛋白表达水平改变及检测各蛋白表达定位。结果:RT-PCR和QRT-PCR试验结果均显示16HBE-T与16HBE-N两组间HER2/neu、c-myc、cyclin D1、K-ras癌基因表达在转录水平存在有差异。再经蛋白水平检测分析验证,发现在BPDE转化细胞中这些癌基因亦存在蛋白水平高表达,免疫细胞化学技术分析蛋白表达定位无异常变化。结论:初步筛选了在反式BPDE恶性转化16HBE细胞中表达增高的原癌基因,发现这些原癌基因激活可能是反式BPDE致癌分子机制之一。为进一步研究环境污染物苯并（a）芘导致人类肺癌发生提供一些基础的资料。第二部分抑制反式二羟环氧苯并（a）芘高表达原癌基因HER2/neu的研究目的:HER2/neu基因是在第一部分研究的基础上,确认出的与反式BPDE诱导16HBE恶变细胞有关的重要的高表达原癌基因。虽然在其他一些肿瘤细胞中对HER2/neu基因已进行了一些研究,但其在BPDE致癌机制中所起的作用却不清楚。本部分是为了探讨HER2/neu基因在反式BPDE恶性转化细胞及其致癌机制中的作用,应用RNA干扰技术建立较稳定的特异性抑制反式BPDE恶性转化细胞中HER2/neu基因表达的细胞。方法:从GenBank调出HER2/neu基因全长,应用生物信息学知识设计三条RNA干扰的特异性有效靶序列,采用化学合成方法得到HER2/neu小分子干扰RNA （siRNA）,通过脂质体转染介导技术转染16HBE-T细胞,用逆转录荧光定量PCR方法和Western blot技术分析瞬时转染HER2/neu siRNAs后HER2/neu表达抑制水平。筛选出siRNA有效靶序列后,再通过构建pSIREN-RetroQ-neu逆转录病毒表达HER2/neu shRNA载体,转染RetroPackTM PT67细胞后产生的携带HER2/neu shRNA病毒颗粒感染16HBE-T细胞。再经嘌呤霉素培养筛选得到稳定的细胞克隆株。结果:成功应用RNA干扰技术抑制了16HBE-T细胞中HER2/neu基因表达,并构建了HER2/neu shRNA逆转录病毒真核表达载体,利用RetroPackTM PT67包装细胞产生携带HER2/neu shRNA病毒颗粒感染16HBE-T细胞,建立稳定抑制HER2/neu表达的细胞株。结论:筛选了RNA干扰HER2/neu基因表达的特异性有效靶序列,快速建立了HER2/neu shRNA逆转录病毒真核表达载体,并得到了稳定抑制HER2/neu表达的细胞株,为下一步研究探索HER2/neu基因在反式BPDE恶变细胞中的作用奠定基础。第三部分抑制HER2/neu表达对反式二羟环氧苯并（a）芘恶性转化细胞的影响目的:在反式BPDE恶性转化细胞中利用RNA干扰技术建立HER2/neu表达抑制体系的基础上进行基因干扰后细胞生物学特性的研究,并观察对其他相关原癌基因蛋白表达的影响。方法:应用流式细胞技术、MTT方法及软琼脂集落实验分别检测了16HBE-T经RNA干扰前后细胞周期及细胞凋亡、细胞增殖活力及软琼脂集落形成率方面的影响。应用Western blot方法检测了应用两个不同有效靶位点的siRNA干扰抑制HER2/neu表达后的c-myc和cyclin D1蛋白表达的影响。结果:HER2/neu表达抑制的细胞中出现G0/G1期阻滞,并伴随S期细胞周期比例下降。稳定抑制HER2/neu表达细胞株（HBE-T-neu）中细胞增殖活力比干扰对照组细胞HBE-T-N和16HBE-T明显下降。软琼脂集落形成率在HBE-T-neu细胞中有意义的下降。蛋白印迹实验结果表明不同有效靶位点的siRNA抑制HER2/neu表达后伴随有c-myc和cyclin D1蛋白表达的不同程度下降。结论:抑制HER2/neu基因表达可对反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞的恶性表型有一定的逆转作用。推测HER2/neu基因可能在反式二羟环氧苯并（a）芘的致癌机制中起重要作用。
徐国蕊[7]（2007）在《卷烟烟气凝集物诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化的实验研究》文中研究指明目的：检测卷烟烟气凝集物（cigarette smoking condensates，CSC），对体外培养的永生化人支气管上皮细胞（immortalized human bronchial epithelial cells，BEP2D）的恶性转化能力，欲建立单因素吸烟致肺癌的细胞模型，并检测不同转化时期差异表达的基因，为深入研究吸烟致肺癌发生多阶段过程中的细胞和分子机理提供实验依据。方法：首先用四唑盐（MTT）比色实验，检测CSC对BEP2D慢性毒性效应，依据细胞相对存活率，筛选慢性转化剂量，从细胞生长动力学、形态学、血清抗性、锚着独立性及裸鼠成瘤等方面对其转化特性进行鉴定，再利用人类全基因组寡核苷酸芯片，筛选对照及不同染毒代龄细胞间差异表达基因。同时，利用二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）和氢化乙锭（HE）活性氧标记技术，初步探测了CSC对BEP2D及转化细胞的氧化损伤作用。结果：CSC对BEP2D以细胞毒性致死效应为主，随着CSC剂量增加，细胞存活比率下降，据此，我们选定细胞相对存活率在60％-80％下0.001支烟／ml（LHC-8）为转化剂量，其对应的酒精浓度0.0005 ml／ml（酒精／LHC-8）作为溶剂对照，取CSC处理后P10代、P20代、P30代、P40代细胞，对其转化特性进行鉴定，发现第P30代和P40代细胞出现了明显的生长速度加快，倍增时间缩短，对血清抗性及锚着独立性增加。差异表达基因比较结果显示，大多数差异表达基因为下调，极少数基因为上调，其中位于启动子区域表达下调的基因，与肺癌关键基因的甲基化有关。另对CSC致BEP2D细胞的氧化损伤初步探索发现，CSC能够引起BEP2D细胞内产生大量活性氧（ROS），并有剂量效应；而慢性转化细胞则逐渐获得了一些抗氧化诱导能力，其机制有待进一步探讨。结论：单因素CSC可能对BEP2D细胞有慢性转化效应，有待裸鼠实验进一步证实；转化机制可能与细胞获得抗氧化能力有关。本结果为今后深入研究吸烟致肺癌发病机理奠定基础。
顾其华[8]（2007）在《苯并芘肺内注射诱发大鼠肺肿瘤及绿茶的预防作用机制初步研究》文中指出目的：肺癌的发病率在工业化国家里持续居高不下，发展中国家的肺癌发病率仍在不断上升。因而人们转而注重肺癌的预防，希望通过化学预防策略降低肺癌的发病率。最佳的化学预防策略是通过日常饮食降低肺癌的发病风险。茶为全球最普遍的饮料之一，年消费量仅次于水，其中绿茶的防癌作用较好，有可能是最佳的肺癌预防饮料。但目前绿茶与肺癌的关系仍存在一定的争议，绿茶预防肺癌的机制尚未完全明确。另外，肺肿瘤动物模型是评价肺癌防治方案必不可少的工具，而目前所采用的肺癌裸鼠移植瘤模型以及采用致癌剂吸入、支气管内灌注、腹腔注射等方法构建的原发性肺肿瘤模型等均存在不同程度的不足。因此，本课题试以苯并芘油剂经皮穿刺肺内注射的方法建立大鼠肺肿瘤动物模型，并以此模型评价绿茶对肺癌的预防作用，在此基础上观察绿茶对大鼠肺肿瘤组织以及对苯并芘所致大鼠肺损伤的p53和Bcl-2基因表达的影响，以初步阐明绿茶预防肺癌的机制。方法：每次以含3，4-苯并芘2mg的苯并芘-玉米油混合剂0.2mL经皮肺穿刺注射于经戊巴比妥钠麻醉后的SD大鼠右肺，每2周处理1次，共4次。并以纯玉米油肺内注射4次作为阴性对照，苯并芘-玉米油皮下注射处理2次作为阳性对照。观察大鼠肿瘤的发生情况。在绿茶预防肺肿瘤的实验中，以3，4-苯并芘油剂经皮穿刺肺内注射构建大鼠原发性肺肿瘤模型，并以1％的绿茶作为大鼠的唯一饮料干预处理，对照组以水为唯一饮料，观察绿茶处理对大鼠成瘤率的影响，并以原位杂交和免疫组织化学方法检测绿茶对大鼠肺肿瘤组织p53和Bcl-2基因表达的影响。在此基础上，进一步采用原位杂交和免疫组织化学方法观察绿茶干预处理对肺内注射3，4-苯并芘油剂后第1周、第4周、第8周及第16周大鼠肺组织p53和Bcl-2基因表达的影响。结果：所有接受玉米油肺内注射的大鼠一年内均未发生肿瘤；皮下注射组局部恶性肿瘤发生率达100％，平均晚期肿瘤摘除时间为15.83周，中位时间为16周；苯并芘-玉米油肺内注射组大鼠一年内肺部恶性肿瘤发生率为70％左右，平均晚期肿瘤摘除时间为31.54周，中位时间为30周，苯并芘肺内注射较皮下注射更难以形成肿瘤。1％的绿茶使大鼠肺恶性肿瘤发生率下降为30％，绿茶干预组大鼠肺肿瘤组织p53表达上调、Bcl-2基因表达下调，且与对照组比较Bcl-2基因表达差异有统计学意义（P＜0.05）。肺内注射3，4-苯并芘油剂后第1周、第4周、第8周及第16周大鼠肺、支气管上皮细胞、粘膜下层细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞以及肺间质细胞等组织p53和Bcl-2基因均呈过量表达，但绿茶对苯并芘处理后大鼠各个时期肺组织的p53和Bcl-2基因表达均有影响，上调p53表达，下调Bcl-2表达，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：3，4-苯并芘油剂大鼠肺内注射是一种简便可靠的肺肿瘤模型构建方法。绿茶对苯并芘所致的肺恶性肿瘤具有明显的预防作用，上调p53和下调Bcl-2的表达是绿茶预防肺癌的重要机制。此外，肺自身具有较强的肿瘤防卫能力，绿茶很有可能通过另一种机制即通过调节肺“防卫细胞”的功能预防肺癌的发生。
金武龙,郭伟,叶为民[9]（2006）在《颌面部恶性肿瘤实验动物模型的研究进展》文中指出
秦国华[10]（2006）在《二氧化硫对基因表达谱、细胞色素P450及癌变相关基因表达影响的体内外研究》文中研究说明二氧化硫（SO2）是一种普遍存在的大气污染物,以低浓度存在于普通大气中,高浓度存在于某些工作场所。虽然对SO2的研究已有一些报道,但主要集中在它所引起的生化指标的改变、遗传毒性、氧化应激及DNA损伤等方面,而对其分子机制鲜见报道。本课题利用Affymetrix的基因芯片（RAE230A）研究了SO2短期（56mg/m3,6h/d,共7d）及长期（14mg/m3,1h/d,共30d）吸入后大鼠肺组织基因表达谱的改变,其中长期吸入SO2对大鼠肺基因表达谱影响的研究工作是在导师的指导下,与同届博士研究生白巨利合作完成的。结果发现:与其相应的对照组相比,SO2短期吸入后表达上调的基因有31个,其中包括18个已知基因和13个新基因,而表达下调的基因有30个,其中包括19个已知基因和11个新基因;SO2长期吸入后表达上调的基因有173个,其中包括79个已知基因和94个新基因,而表达下调的基因有85个,其中包括46个已知基因和39个新基因。进一步分析发现:1)短期吸入SO2的大鼠肺基因表达谱与其对照组相比,氧化磷酸化相关的一些基因发生了变化,表明高剂量短期吸入SO2可能导致线粒体功能的恶化;2)长期吸入SO2的大鼠肺基因表达谱与其对照组相比,表达有差异的基因涉及到脂肪酸代谢、免疫、炎症、氧化应激、原癌基因、肿瘤抑制基因和细胞外基质等多个方面,表明低剂量长期吸入SO2在体内的毒作用机理更为复杂;3)SO2高剂量短期吸入与低剂量长期吸入后,大鼠肺组织基因表达谱的改变很不一致,表明二者在体内的作用机理不同。因为人群接触SO2的途径主要是长期低剂量吸入,本研究提示SO2有可能通过调节人群一系列基因表达的改变,进而发挥其在人体中的毒效应。 为探讨SO2对肝、肺微粒体细胞色素P450的影响,本研究采用SO2
二、反式-BPDE诱发人胎气管上皮细胞H-ras癌基因点突变的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、反式-BPDE诱发人胎气管上皮细胞H-ras癌基因点突变的研究（论文提纲范文）
（1）PPP1R13L基因可变剪接在多环芳烃类所致肺癌变过程中的特征分析及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 PPP1R13L可变剪接异构体在肺癌组织中的表达及其特征分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 研究对象的确定 |
| 2.2.2 Affymetrix基因芯片和UCSC数据库筛选PPP1R13L可变剪接异构体 |
| 2.2.3 组织样本DNA提取 |
| 2.2.4 DNA及RNA扩增引物信息 |
| 2.2.5 DNA扩增 |
| 2.2.6 组织总RNA提取 |
| 2.2.7 实时定量PCR检测 |
| 2.2.8 组织蛋白提取及Western blot |
| 2.2.9 5'-RACE-Ready cDNA末端扩增检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因芯片及生物信息学筛选PPP1R13L可变剪接异构体 |
| 3.2 肺癌、癌旁及远端(非癌)组织中PPP1R13L-L和PPP1R13L-SVmRNA及蛋白表达水平 |
| 3.3 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53在肺癌组织与癌旁组织中mRNA表达水平 |
| 3.4 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53基因mRNA表达水平与肺癌临床病理特征关联性的分层分析 |
| 3.5 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53蛋白在肺癌组织与癌旁组织中的表达 |
| 3.6 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53表达水平与肺鳞癌临床病理特征的关联性 |
| 3.7 PPP1R13L可变剪接异构体在肺鳞癌中的表达与P53之间的相关性 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 PPP1R13L可变剪接异构体在BPDE所致人正常支气管上皮永生化细胞恶性转化过程中的特征分析 |
| 5 前言 |
| 6 材料与方法 |
| 6.1 主要试剂和仪器 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 细胞来源 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞的复苏与传代培养 |
| 6.2.2 CCK8试验筛选BPDE对16HBE细胞恶性转化的诱导剂量 |
| 6.2.3 16HBE细胞恶性转化模型的构建 |
| 6.2.4 划痕实验 |
| 6.2.5 Transwell小室体外侵袭实验 |
| 6.2.6 软琼脂克隆实验 |
| 6.2.7 裸鼠成瘤实验 |
| 6.2.8 成瘤组织HE染色 |
| 6.2.9 成瘤组织免疫组化 |
| 6.2.10 实时定量PCR检测不同代数恶性转化细胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53 mRNA表达 |
| 6.2.11 蛋白免疫印迹法检测不同代数恶性转化细胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53蛋白表达 |
| 6.2.12 统计学方法 |
| 7 结果 |
| 7.1 不同代数恶性转化细胞的迁移能力 |
| 7.2 不同代数恶性转化细胞的侵袭能力 |
| 7.3 恶性转化不同代数细胞的恶性增殖能力 |
| 7.4 恶性转化细胞皮下致瘤 |
| 7.5 恶性转化细胞的病理学鉴定 |
| 7.5.1 成瘤组织病理分析 |
| 7.5.2 成瘤组织免疫组化鉴定 |
| 7.6 恶性转化细胞P53基因型分析 |
| 7.7 不同代数恶性转化细胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53mRNA表达水平 |
| 7.8 不同代数恶性转化细胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53蛋白表达 |
| 8 讨论 |
| 第三部分 构建体外细胞转染模型分析PPP1R13L两种不同可变剪接模式在肺癌变中的作用及机制 |
| 9 前言 |
| 10 材料与方法 |
| 10.1 主要试剂和仪器 |
| 10.1.1 主要试剂 |
| 10.1.2 主要仪器 |
| 10.1.3 细胞来源 |
| 10.2 实验方法 |
| 10.2.1 构建PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV过表达质粒 |
| 10.2.2 设计并筛选PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV短片断干扰RNA(siRNA) |
| 10.2.3 利用CRISPR-Cas9体系构建PPP1R13L-L转录本敲除细胞模型 |
| 10.2.4 各质粒转染细胞效果的鉴定 |
| 10.2.5 BPDE染毒处理转染细胞的凋亡检测 |
| 10.2.6 BPDE染毒处理转染细胞的免疫荧光检测 |
| 10.2.7 统计学方法 |
| 11 结果 |
| 11.1 PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV在各转染细胞中mRNA及蛋白表达水平 |
| 11.2 PPP1R13L不同可变剪接模式与细胞凋亡的关系 |
| 11.3 siRNA干扰PPP1R13L可变剪接异构体对P53核内表达的影响 |
| 11.4 外源性质粒过表达PPP1R13L不同可变剪接异构体对P53核内表达的影响 |
| 11.5 CRISPR-Cas9体系内源性敲除PPP1R13L-L各转染细胞中PPP1R13L不同可变剪接异构体蛋白表达水平 |
| 11.6 CRISPR-Cas9细胞模型中PPP1R13L不同转录本表达模式与细胞凋亡的关系 |
| 11.7 CRISPR-Cas9细胞模型中PPP1R13L不同转录本表达模式对P53核内表达的影响 |
| 12 讨论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基因多态性与吸烟交互作用致肺癌易感性的研究进展（论文提纲范文）
| 1 CYP 基因多态性与吸烟交互作用致肺癌易感性 |
| 1.1 CYP1A1 基因 Exon7 位点与吸烟交互作用致肺癌易感性 |
| 1.2 CYP1A1 基因 Msp1 位点与吸烟交互作用致肺癌易感性 |
| 1.3 CYP1A1 基因 Ile462Val 位点与吸烟交互作用致肺癌易感性 |
| 1.4 CYP2E1基因Rsa I /Pst I位点与吸烟交互作用致肺癌易感性 |
| 2 p53 基因与吸烟交互作用致肺癌易感性 |
| 3 Ras 基因家族 |
| 4 结论 |
（3）淋巴瘤患者PAH-DNA加合物及CYP1A1、GSTM1基因多态性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 对象方法 |
| 1.1 对象 |
| 1.1.1 病例组选择 |
| 1.1.2 对照组选择 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 标本处理 |
| 1.2.2 PAH-DNA加合物含量测定(竞争性酶联免疫吸附法) |
| 1.2.3 提取上述标本基因组DNA(柱式) |
| 1.2.4 CYP1A1基因多态性检测(限制性片段长度多态性聚合酶链式反应-PCR-RFLP) |
| 1.2.5 GSTM1基因多态性检测 |
| 1.2.6 统计学方法 |
| 1.3 实验仪器及试剂 |
| 1.3.1 仪器 |
| 1.3.2 试剂 |
| 第2章 结果 |
| 2.1 PAH-DNA加合物含量 |
| 2.2 CYP1A1、GSTM1基因扩增结果 |
| 2.3 GSTM1、CYP1A1基因多态性与淋巴瘤危险性关系 |
| 2.4. GSTM1、CYP1A1基因多态性和PAH-DNA加合物水平与淋巴瘤危险性关系 |
| 第3章 讨论 |
| 3.1 PAH-DNA加合物与淋巴瘤易感性的关系 |
| 3.2 CYP1A1基因Msp1多态性与淋巴瘤易感性关系 |
| 3.2.1 CYP1A1基因结构和功能 |
| 3.2.2 CYP1A1基因MSP1多态性与淋巴瘤易感性关系 |
| 3.3 GSTM1基因多态性与淋巴瘤易感性的关系 |
| 3.3.1 GSTM1基因的结构和功能 |
| 3.3.2 GSTM1基因多态性与淋巴瘤易感性的关系 |
| 3.4 GSTM1、CYP1A1基因多态性和PAH-DNA加和物水平与淋巴瘤危险性关系 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）肺癌发生相关基因的研究进展（论文提纲范文）
| 1 代谢酶基因与肺癌 |
| 1.1 细胞色素 |
| 1.2 GST酶基因编码谷胱甘肽S-转移酶 (GST) 同工酶 |
| 1.3 NAT酶基因编码氮-乙酰基转移酶 (NAT) |
| 2 DNA修复基因多态性与肺癌 |
| 3 癌基因及其产物与肺癌 |
| 3.1 ras基因家族 |
| 3.2 myc基因家族 |
| 3.3 erbB基因家族 |
| 3.4 其他的癌基因产物 |
| 4 肿瘤抑癌基因与肺癌 |
| 4.1 p53基因 |
| 4.2 Rb基因 |
| 4.3 p16基因 |
（5）慢病毒介导的亲环素A（CyPA）siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 慢病毒介导的亲环素A(CyPA)siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的实验研究 |
| 引言 |
| 1.研究背景及目的、意义 |
| 2.研究技术路线 |
| 第一部分 人CyPA在非小细胞肺癌中的表达水平研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 慢病毒介导的CyPA siRNA的构建及假包装病毒颗粒的制备 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 慢病毒介导的CyPA siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的体外研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 慢病毒介导的CyPA siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的体内研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 后记 |
| 本课题创新点 |
| 本课题的启示与下一步工作 |
| 英文缩写词索引 |
| 图表索引 |
| 博士研究生期间主要成绩 |
| 致谢 |
（6）反式二羟环氧苯并（a）芘相关原癌基因表达及HER2/neu生物特性研究（论文提纲范文）
| 全文缩写词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 反式二羟环氧苯并(A)芘主要相关原癌基因表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 抑制反式二羟环氧苯并(A)芘高表达癌基因HER2/NEU 的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 抑制 HER2/neu 表达对反式二羟环氧苯并(a)芘恶性转化细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一 彩图 |
| 附录二 博士在读期间工作小结 |
| 致谢 |
（7）卷烟烟气凝集物诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 CSC对永生化人支气管上皮细胞的慢性转化及转化细胞的增殖动力学特征 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 CSC对永生化人支气管上皮细胞的氧化损伤作用 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述部分 |
| 吸烟与肺癌 |
| 参考文献 |
（8）苯并芘肺内注射诱发大鼠肺肿瘤及绿茶的预防作用机制初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 3,4-苯并芘肺内注射构建大鼠肺肿瘤模型的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二章 绿茶对苯并芘诱发大鼠肺肿瘤及p53、Bcl-2基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 绿茶对苯并芘所致大鼠肺损伤的保护作用及其机制初探 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 主要研究成果目录 |
（10）二氧化硫对基因表达谱、细胞色素P450及癌变相关基因表达影响的体内外研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 二氧化硫及其体内代谢衍生物研究进展 |
| 1.1.1 二氧化硫污染现状 |
| 1.1.2 SO_2的环境流行病学研究进展 |
| 1.1.3 SO_2及其衍生物毒理学研究进展 |
| 1.2 基因芯片技术研究进展 |
| 1.2.1 基因芯片技术概述 |
| 1.2.2 基因芯片技术的分类 |
| 1.2.3 基因芯片技术原理 |
| 1.2.4 基因芯片技术的技术流程 |
| 1.2.5 基因芯片技术的应用 |
| 1.2.6 基因芯片技术未来的发展趋势 |
| 1.3 细胞色素 P450研究进展 |
| 1.3.1 细胞色素 P450概述 |
| 1.3.2 CYP450s的分布及其结构 |
| 1.3.3 CYP450s的功能 |
| 1.3.4 影响 CYP450s的一些因素 |
| 1.3.5 外源化学物对 CYP450s的诱导和抑制 |
| 1.3.6 外源物对细胞色素 P450基因表达的调控 |
| 1.4 原癌基因与抑癌基因研究进展 |
| 1.4.1 原癌基因 |
| 1.4.2 抑癌基因 |
| 1.4.3 癌基因及抑癌基因的表达调控机制 |
| 1.5 本课题的立题依据及研究内容 |
| 1.5.1 本课题的目的意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 二氧化硫对大鼠肺基因表达谱的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.2.2 SO_2动态吸入染毒处理 |
| 2.2.3 RNA的提取及检测 |
| 2.2.4 cRNA的制备 |
| 2.2.5 芯片的杂交、洗涤及扫描 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 探针检出分析 |
| 2.3.2 短期SO_2吸入对大鼠肺基因表达谱的影响 |
| 2.3.3 长期SO_2吸入对大鼠肺基因表达谱的影响 |
| 2.3.4 短期与长期SO_2吸入对基因表达的作用不同 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 二氧化硫对大鼠肝肺细胞色素 P450的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂与仪器 |
| 3.2.2 SO_2动态吸入染毒处理 |
| 3.2.3 肝、肺微粒体的提取 |
| 3.2.4 肝微粒体 P450含量的测定 |
| 3.2.5 微粒体 CYP1A1，1A2和2B1/2活性的测定 |
| 3.2.6 微粒体 CYP2EI活性的测定 |
| 3.2.7 RNA的提取及检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SO_2对大鼠肝微粒体 P450含量的影响 |
| 3.3.2 SO_2对大鼠肝和肺微粒体四种 P450同工酶活性的影响 |
| 3.3.3 SO_2对大鼠肝和肺四种 P450同工酶mRNA表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 二氧化硫与苯并(a)芘对大鼠 CYP1A的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂与仪器 |
| 4.2.2 动物染毒处理 |
| 4.2.3 肝、肺微粒体的提取 |
| 4.2.4 微粒体 CYP1A1和 1A2活性的测定 |
| 4.2.5 RNA的提取及检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 SO_2与 B(a)P对大鼠肝和肺微粒体CYP1A1活性的影响 |
| 4.3.2 SO_2与 B(a)P对大鼠肝和肺微粒体CYP1A2活性的影响 |
| 4.3.3 SO_2与 B(a)P对大鼠肝和肺 CYP1A1mRNA表达的影响 |
| 4.3.4 SO_2与 B(a)P对大鼠肝和肺 CYP1A2mRNA表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 二氧化硫与苯并(a)芘对大鼠原癌基因和抑癌基因表达的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要试剂与仪器 |
| 5.2.2 动物染毒处理 |
| 5.2.3 RNA的提取及检测 |
| 5.2.4 目的蛋白表达的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SO_2与 B(a)P对大鼠肝和肺c-fos表达的影响 |
| 5.3.2 SO_2与 B(a)P对大鼠肝和肺c-jun表达的影响 |
| 5.3.3 SO_2与 B(a)P对大鼠肝和肺c-myc表达的影响 |
| 5.3.4 SO_2与 B(a)P对大鼠肝和肺c-Ki-ras表达的影响 |
| 5.3.5 SO_2与 B(a)P对大鼠肝和肺p53表达的影响 |
| 5.3.6 SO_2与 B(a)P对大鼠肝和肺p16表达的影响 |
| 5.3.7 SO_2与 B(a)P对大鼠肝和肺 Rb表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 二氧化硫体内衍生物对人支气管上皮细胞(BEP2D)原癌基因和抑癌基因表达的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要试剂与仪器 |
| 6.2.2 细胞培养 |
| 6.2.3 细胞染毒处理 |
| 6.2.4 四唑盐(MTT)比色实验 |
| 6.2.5 RNA的提取及检测 |
| 6.2.6 目的蛋白表达的检测 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 SO_2体内衍生物对 BEP2D细胞存活率的影响 |
| 6.3.2 SO_2体内衍生物对 BEP2D细胞c-fos表达的影响 |
| 6.3.3 SO_2体内衍生物对 BEP2D细胞c-jun表达的影响 |
| 6.3.4 SO_2体内衍生物对 BEP2D细胞c-myc表达的影响 |
| 6.3.5 SO_2体内衍生物对 BEP2D细胞 K-ras表达的影响 |
| 6.3.6 SO_2体内衍生物对 BEP2D细胞p53表达的影响 |
| 6.3.7 SO_2体内衍生物对 BEP2D细胞p16表达的影响 |
| 6.3.8 SO_2体内衍生物对 BEP2D细胞 Rb表达的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 博士研究生期间发表的论文 |
| 承诺 |
| 个人简况 |
四、反式-BPDE诱发人胎气管上皮细胞H-ras癌基因点突变的研究（论文参考文献）
- [1]PPP1R13L基因可变剪接在多环芳烃类所致肺癌变过程中的特征分析及机制研究[D]. 于涛. 中国医科大学, 2019(01)
- [2]基因多态性与吸烟交互作用致肺癌易感性的研究进展[J]. 乌日汗,常福厚. 中南药学, 2015(03)
- [3]淋巴瘤患者PAH-DNA加合物及CYP1A1、GSTM1基因多态性的研究[D]. 李艳勃. 青岛大学, 2014(01)
- [4]肺癌发生相关基因的研究进展[J]. 朱佳杰. 医药论坛杂志, 2011(07)
- [5]慢病毒介导的亲环素A（CyPA）siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的实验研究[D]. 冯艳铭. 郑州大学, 2008(10)
- [6]反式二羟环氧苯并（a）芘相关原癌基因表达及HER2/neu生物特性研究[D]. 傅娟. 华中科技大学, 2008(12)
- [7]卷烟烟气凝集物诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化的实验研究[D]. 徐国蕊. 安徽医科大学, 2007(08)
- [8]苯并芘肺内注射诱发大鼠肺肿瘤及绿茶的预防作用机制初步研究[D]. 顾其华. 中南大学, 2007(01)
- [9]颌面部恶性肿瘤实验动物模型的研究进展[J]. 金武龙,郭伟,叶为民. 口腔颌面外科杂志, 2006(02)
- [10]二氧化硫对基因表达谱、细胞色素P450及癌变相关基因表达影响的体内外研究[D]. 秦国华. 山西大学, 2006(10)