一、犬Ⅱ型腺病毒弱毒DNA的酶切分析及分子克隆（论文文献综述）
周亚花[1]（2020）在《嵌合犬冠状病毒N、S基因的重组狂犬病病毒的拯救与鉴定》文中认为狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种动物源性人兽共患病,一旦感染出现临床症状病死率为100%。犬冠状病毒病是由犬冠状病毒感染引起犬的一种接触性传染病,临床上以呕吐、腹泻、脱水和血便为主要特征,致死率较低,但与其他传染病如犬细小病毒、轮状病毒等混合感染时死亡率明显提高。本研究利用原核表达系统表达了犬冠状病毒N蛋白,免疫兔子后制备多克隆抗体,经过ELISA、Western blotting等试验鉴定,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体具有良好的反应特异性。本论文主要基于狂犬病病毒反向遗传操作系统研制狂犬病和犬冠状病毒病二联基因工程疫苗。以狂犬病病毒弱毒SAD毒株为骨架,分别在狂犬病毒的N、P基因之间插入犬冠状病毒N和S基因,构建狂犬病毒全长cDNA,然后与辅助质粒按一定的比例共转染BHK-21细胞拯救重组病毒,通过免疫荧光和qPCR试验筛选出含有目的基因的重组狂犬病病毒BNSP-CCV-N和BNSP-CCV-S,然后对重组病毒的生物学特性进行了鉴定,Western blotting试验和免疫荧光试验表明重组病毒BNSP-CCV-N可同时表达RV-G蛋白和CCV-N蛋白,重组病毒BNSP-CCV-S可同时表达RV-G蛋白和CCV-S蛋白。病毒生长曲线表明BNSP-CCV-N在72 h,BNSP-CCV-S在96 h后病毒滴度不再提高,由此可以确定重组病毒的最佳收毒时间。电镜观察表明插入外源基因的重组病毒可组装成有一定形态的完整病毒粒子。同时将重组病毒在BHK-21细胞中连续传10代,通过RT-PCR检测表明重组病毒携带外源基因具有遗传稳定性。进一步选用BALB/c小鼠模型对该重组病毒的致病性和疫苗的免疫效果进行评价,小鼠脑内注射两种重组病毒后观察14天,均未出现肉眼可见的临床症状,表明重组病毒对小鼠无致病性。将重组病毒进行浓缩、纯化,灭活后与GEL佐剂按一定的比例制备灭活疫苗和弱毒疫苗,分组免疫小鼠。试验结果表明制备的灭活疫苗和弱毒疫苗安全性良好,通过不同组别免疫小鼠抗体水平的比对,制备的重组病毒的弱毒疫苗产生较高的抗狂犬病毒的中和抗体,制备的灭活疫苗BNSP-CCV-N+S有较高的抗犬冠状病毒N蛋白和S蛋白的特异性抗体,结果表明重组病毒具有制备二联基因工程疫苗的潜力,在本动物的免疫保护试验有待于进一步研究。本研究利用反向遗传操作系统成功拯救出含有犬冠状病毒N和S基因的重组狂犬病毒,用其分别制备的灭活苗和弱毒苗免疫小鼠后诱导产生较高的抗狂犬病毒中和抗体和犬冠状病毒的特异性抗体,该研究为狂犬病和犬冠状病毒二联疫苗的研究提供了一定的参考价值。
宋增财[2]（2017）在《猪伪狂犬病毒变异株gE&TK基因缺失活疫苗的构建与鉴定》文中研究说明伪狂犬病（Pseudorabies,PR）也称 Aujesky 病,是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种能够感染牲畜和多种野生动物并引起漆痒、发热和脑脊髓炎等症状的急性传染病。猪的伪狂犬病在临床上的主要表现为发病猪只体温升高,新生仔猪有神经症状,育肥猪主要有呼吸道症状,母猪常发生流产,对养猪业危害极大。对该病的防控主要是疫苗免疫和加强生物安全等措施。在2011年底我国华东多地免疫过Bartha-K61疫苗的猪场出现猪伪狂犬病疫情,之后疫情逐步蔓延向全国各地的养猪场,从发病猪场的死亡仔猪中分离到了 PRV的变异毒株,说明Bartha-K61这种传统的弱毒疫苗面对伪狂犬变异毒株已不能提供完全保护力,因此研制出针对变异的伪狂犬病毒的疫苗对我国养猪业是极为迫切和必要的。本研究以PRV的变异毒株PRV AH02LA株构建的BACPRV-G为基础,用En Passant方法,通过同源重组的方式,构建了双基因缺失株PRV △TK&gE-AH02,并对该缺失株的体外生长特性和免疫保护力进行了初步的研究。1伪狂犬病毒TK&gE基因缺失株的构建首先将带有TK基因两侧同源臂的卡那霉素杭性基因电转到B ACPRV-G的感受态细胞中以取代TK基因,构建出BACPRV ATK/gE/gI/Kar+。然后经阿拉伯糖诱导敲除BAC基因组中的卡那霉素抗性基因,构建出BACPRV ATK/gE/gI。扩增转移载体,转移载体与BACPRV △TK/gE/gI基因组DNA 一起转染CEF细胞,在荧光显微镜下观察到未发出荧光的白斑,成功拯救了无mini-F并恢复了 gI基因的双基因缺失重组病毒株,命名为PRV ATK&gE-AH02。PCR产物序列分析显示PRV ATK&gE-AH02在gE基因内部缺失了第1位至第1418位共1418bp,TK基因内部缺失了第184位至530位共347bp。2 PRV △TK&gE-AH02的生长特性研究发现PRV △TK&gE-AH02和强毒株PRV AH02LA在ST细胞上增殖的最高病毒含量分别为106.29TCID50/0.1ml和107.19 TCID50/0.1ml,与亲本株相比,尽管TK和gE基因的双缺失对病毒的增殖有一定的影响,但双缺失株的病毒含量仍然能达到较高的水平。另外还测定了 PRV △TK&gE-AH02和强毒株PRVAH02LA在ST细胞上增殖的生长曲线,在规定时间收取感染细胞上清液和感染细胞中细胞结合性病毒并测定其病毒滴度,测定三次后统计所有时间点病毒液的TCID50,取平均值绘制生长曲线。从病毒生长曲线可以看出,PRV △TK&gE-AH02与强毒株PRV AH02LA的生长特性相似,但是前者的增殖速度比后者要慢,这说明TK和gE双基因的缺失对PRV的体外增殖是有影响的。3 PRV △TK&gE-AH02的安全性及免疫效力研究将PRV △TK&gE-AH02以肌肉注射的方法接种28日龄健康易感猪,接种剂量为106TCID50,同时设Bartha-K61免疫猪为对照,接种剂量相同,所有免疫猪没有出现PR的临床症状。免疫后7天对接种PRV △TK&gE-AH02和免疫Bartha-K61株的试验猪与空白对照猪一起,用强毒株PRV AH02LA攻毒,所有免疫PRV △TK&gE-AH02的猪无任何临床症状,没有检测出排毒,所有猪均得到了完全的保护。而Bartha-K61弱毒苗组在攻毒后体温升高明显并检出有排毒现象。这表明该基因缺失病毒PRV △TK&gE-AH02对猪安全,具有良好的免疫原性,能够保护猪抵御PRV变异强毒株的攻击。
崔国杰[3]（2015）在《番鸭呼肠孤病毒强弱毒株S基因分子特征分析及感染性克隆载体构建》文中研究说明番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）引起的番鸭以软脚,肝、脾出现大量灰白色坏死点为主要特征的病毒性传染病,对我国番鸭饲养业造成巨大经济损失。番鸭呼肠孤病毒病活疫苗（CA株）可有效预防本病,但MDRV致病和致弱的分子机理尚不清楚。本研究以MDRV强毒株（MW9710株）和疫苗株（CA株）为材料,分别构建了 MDRV强毒株和弱毒株S组基因的感染性克隆载体,结果如下:1、MDRV强弱毒株S组基因cDNA分子克隆构建:提取病毒核酸,设计针对S组基因的特异性引物进行RT-PCR,克隆测序获得了病毒S组基因序列。结果显示:MDRV两株对应基因长度相同,其中S1基因1324 bp,S2基因1201 bp,S3基因1191 bp,S4基因1124 bp;两株核苷酸序列与MDRV参考毒株同源性均大于98%,证实扩增获得了 MDRV强毒株和弱毒株的S组基因。2、MDRV S组基因编码的氨基酸差异及蛋白理化性质分析:利用MegAlign和Protean软件对强毒MW9710株和弱毒CA株S组基因编码氨基酸及蛋白进行比较。结果显示:σA蛋白为2个同极性疏水氨基酸替换:301aa（A→V）,409aa（A→V）;σB蛋白为12个氨基酸替换,多为亲水性氨基酸替换:5aa（V→A）,21aa（W→R）,40aa（S→P）,65aa（M→T）,85aa（P->S）,96aa（I→T）,113aa（Y→H）,120aa（S→F）,218aa（S→P）,244aa（D→G）,265aa（G→S）,347aa（A→T）;σNS 蛋白为1个同极性亲水性氨基酸替换:273aa（S→T）;p10蛋白为3个疏水性氨基酸替换,46aa（A→V）,70aa（H→Y）,73aa（H→Y）;σC蛋白为8个氨基酸替换,多为疏水性氨基酸替换:162aa（H→Y）,167aa（F→I）,168aa（T→I）,172aa（S→F）,197aa（P→S）,198aa（T→M）,206aa（P→F）,264aa（L→F）。在分子量和等电点两方面比较中均有明显差异的为σB蛋白和σC蛋白,其中σB蛋白分子量下降,等电点升高,而σC蛋白分子量升高,等电点下降。3、MDRV S组基因感染性克隆载体构建:根据MRV感染性克隆构建的思路,获取含,SapⅠ酶切位点的p-MDRV病毒载体,利用引物设计扩增获得同样含Sap1酶切位点的S组基因片段,扩增片段经SapI酶切后连接至病毒载体,获得感染性克隆质粒载体。鉴定结果显示插入p-MDRV病毒载体中的S组基因未发生突变,位置、方向正确,表明成功构建了 MDRVS组基因感染性克隆载体。结论:本研究明确了 MDRV强毒和弱毒S组基因及其编码蛋白的差异,并成功构建了 MDRV S组基因感染性克隆载体。研究结果为继续克隆构建MDRV L及M组基因、建立MDRV反向遗传系统提供了技术平台,也为深入开展MDRV致病和致弱的分子机理研究奠定良好基础。
关玮琨[4]（2012）在《犬细小病毒LAMP检测方法建立及其串联表位卵黄抗体中和效力评价》文中研究说明犬细小病毒感染是由犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）引发犬类的一种接触性传染病。该病毒可引起犬急性肠炎、白细胞减少、呕吐、以及幼犬心肌炎等病症。犬细小病毒为单股线状DNA病毒,其主要结构蛋白是VP1和VP2。VP2基因全长1755bP,决定CPV的抗原型和侵入宿主的特异性,并可编码CPV的主要抗原决定簇和诱导机体产生中和抗体。本研究从疑似CPV感染的病犬粪便及肠内容物中分离得到2株CPV,分别命名为DN7株和DN8株。并对两株分离株与疫苗株C154的VP2基因进行测序,比对其核苷酸序列和氨基酸序列的同源性。结果表明：两株CPV分离株相互间的核苷酸序列同源性为99.5%。两株分离株DN7和DN8与疫苗株C154之间的同源性分别为98.6%、99.1%。DN7、DN8与国内分离株BJ02007株核苷酸同源性最高分别为99.5%、100%,与国内分离株V154核苷酸同源性最低分别为99.0%、99.4%,与韩国分离株DH426核苷酸同源性最高分别为99.4%、99.8%,与日本分离株2c（b）核苷酸同源性最低,分别为99.0%、99.4%。通过进化树推测两株分离株属于CPV-2a型。本研究根据GenBank登录的CPV（登录号：GU569943.1）保守区域设计并合成2对LAMP引物,经反应条件优化,特异性、敏感性试验和对临床样品的检测验证,建立了CPV环介导等温扩增（LAMP）检测方法。结果显示：所建立的LAMP检测方法对阳性临床样品的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳呈现出特征性梯状条带,阴性临床样品的扩增产物电泳后则无扩增条带,对犬细小病毒的最低检出量为O.11×10-4μg/μL,其敏感性是PCR的100倍,是犬细小病毒抗原快速检测试纸的1000倍。LAMP和PCR对临床样品检测结果的符合率为100%。表明所建立的LAMP检测方法简便、快速,对提高CPV的检测速度和准确性有很大帮助。本研究采用表位串联方法,将犬细小病毒的一段线性B细胞表位经反复串联后转化大肠杆菌原核表达系统,获得CPV的VP2基因B细胞线性表位重组蛋白。将表位串联后的重组蛋白、DN7株、疫苗株C154共3种抗原作为免疫原分别对7月龄海兰蛋鸡进行3次免疫后收蛋,用氯仿抽提法提取卵黄抗体。通过间接ELISA法检测抗体效价,测得3种不同抗原的卵黄抗体ELISA检测效价最高值分别为1：1024、1：4096、1：2048。体外中和试验结果表明：卵黄抗体原液中和CPV的能力不强,但将卵黄抗体浓缩倍数增加,可以使卵黄抗体中和CPV的能力加强,对细胞保护作用增大,使接种CPV的F81细胞在36h内不产生任何病变,48h后细胞才慢慢开始显现病变。本研究分离得到了两株犬细小病毒,并建立了针对CPV VP2基因的LAMP快速检测方法。串联表位重组蛋白制备的高免卵黄抗体对犬细小病毒有一定的中和作用,可以延缓其对细胞的感染,并为临床应用提供实验参考依据。
蔡锦顺[5]（2010）在《PRRSV GP5与M蛋白重组犬2型腺病毒的构建及其免疫特性研究》文中研究指明为研制安全有效的PRRSV基因工程疫苗,本研究首先利用吉林地区一疑似PRRS的病猪肺脏,通过MARC-145细胞传代、血清学鉴定及病毒理化学特性等方法鉴定,获得了一株PRRSV, JL-0605。采用RT-PCR方法扩增了PRRSV JL-0605主要免疫原性蛋白GP5和M,将其克隆到犬2型腺病毒E3缺失性载体中,获得了携带GP5和M两个基因的重组感染性全基因组,转染细胞获得了重组病毒,通过对重组病毒酶切鉴定,确定GP5、M重组犬2型腺病毒构建成功。传代表明该病毒稳定,TCID50为105.25/0.1mL。感染细胞经IFA检测可观察到特异性荧光,表明PRRSV GP5、M蛋白获得了表达。以GP5、M蛋白重组犬2型腺病毒免疫小鼠,2周开始检出中和抗体,6周达到高峰,抗体效价达到1:16,同时产生了较明显的淋巴细胞增殖效应。该结果说明,GP5和M蛋白同时表达能显着增强体液免疫应答和细胞免疫应答。GP5、M蛋白重组犬2型腺病毒免疫3月龄仔猪,第10周中和抗体效价达到最高水平,说明该重组疫苗可有效诱导和维持PRRSV特异性抗体。以上研究为PRRS的特异性免疫研究奠定了基础,为有效抗原的筛选和预防制剂的研制提供了重要手段。
刘益新[6]（2010）在《表达虎源H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组犬2型腺病毒的构建与鉴定》文中研究表明[目的]目前,禽流感病毒（Avian Influenza virus,AIV）在世界范围内多种动物中广泛流行,每一次严重的暴发都会造成巨大的经济损失。尤其是高致病性禽流感可导致高达100%发病率和较高的死亡率,且其可直接感染人并致人以死亡。其在生态学和公共卫生学方面的意义已引起全世界人们的广泛关注。禽流感（Avian Influenza,AI）在我国很多地区普遍存在,并造成了严重的危害。为了减少损失,为我国在禽流感疫苗方面的进一步研究提供有力的基础,本研究构建能够表达虎源H5N1亚型流感病毒HA蛋白的重组犬2型腺病毒（canine type 2 adenovirus,CAV-2）,其可以作为常规免疫,降低禽流感疫情的发生,增强我国禽流感的防控能力。[方法]应用常规分子生物学方法,构建能够表达A/Tiger/Harbin/132/2007 HA基因的真核表达载体pCAGGS-HA;运用间接ELISA和间接免疫荧光的方法检测其在哺乳动物细胞BHK-21中的瞬时表达情况；将pCAGGS-HA中含有HA表达盒的片段定向克隆入犬2型腺病毒载体pPoly2-CAV2的E3缺失区,获得在E3区缺失处插入HA表达盒的重组质粒pCAV-2-HA。利用脂质体介导的转染方法,将重组质粒pCAV-2-HA导入DK细胞中；观察细胞的变化,待培养细胞出现典型的腺病毒样细胞病变时,对重组的病毒采用电镜进行形态学鉴定,利用血凝实验检测重组病毒的血凝性,应用RT-PCR的方法检测重组病毒在繁殖的过程中HA基因片段是否发生缺失以及能否正确转录HA基因的mRNA,采用间接免疫荧光和间接ELASA的方法检测HA基因在DK细胞中的表达情况和重组病毒体外遗传稳定性。[结果]成功构建了真核表达质粒pCAGGS-HA并且能在哺乳动物细胞BHK-21中表达具有生物活性的HA蛋白；CAV-2-HA重组病毒具有典型的CAV-2形态特征和血凝特性,并且能够转录HA基因的]mRNA,间接ELISA和间接免疫荧光检测表明所构建的重组病毒能够正确表达HA蛋白,且在体外具有良好的遗传稳定性。[结论]该实验成功构建了A/Tiger/Harbin/132/2007 HA基因重组犬2型腺病毒的载体pCAV-2-HA;转染出了能在哺乳动物细胞中表达具有生物活性的HA蛋白的重组病毒CAV-2-HA。
韩国全[7]（2009）在《含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用》文中研究说明为适应以减毒胞内寄生菌为运载体的兽用基因疫苗研究发展趋势,研究构建含有减毒胞内寄生菌自身内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗表达载体,以增强基因疫苗诱导有效保护性免疫。基于以上考虑,本课题研究旨在研制含猪霍乱沙门菌内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗通用表达载体,既能够在运载体原核细胞中可调控表达携带抗原基因,又能够在真核细胞中启动表达携带抗原基因,以期与S.C500合用开发适于粘膜免疫的猪群重组活菌疫苗。为此,本研究首先扩增出猪霍乱沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,然后分析其启动活性,进一步构建新型双功能表达载体pCB-neo、pCC-neo,系统研究表达载体的启动活性特点,检验S.C500运送以pCB-neo、pCC-neo基础构建的基因疫苗的可行性。本课题研主要研究内容包括:Ⅰ.猪霍乱沙门菌nirB、pagC基因启动子区域分子克隆及其生物信息学分析为获得沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,利用PCR技术从猪霍乱沙门菌疫苗株S.C500基因组DNA中扩增出启动子PnirB、PpagC基因区域片段,经TA克隆筛选及测序鉴定,成功构建克隆重组质粒pUCX-PnirB、pUCX-PpagC。序列分析结果显示启动子PnirB、PpagC与其它沙门菌相关序列核苷酸同源性较高,分别为96%～100%、93%～99%,其中与霍乱沙门菌SC-B67核苷酸同源性分别高达100%、99%,说明两启动子基因区域高度保守。生物信息学网络软件NNPP分析结果显示,PnirB启动子基因区域序列有3个较强的启动子Promotor序列,PpagC启动子基因序列有12个较强的启动子Promotor序列,说明试验所扩增的两个基因启动子区域片段具有启动基因表达的基本元件。Ⅱ.沙门菌nirB、pagC基因启动子启动活性研究为考察沙门菌启动子的启动表达能力及特点,运用基因工程技术构建携带有沙门菌内源性启动子PnirB、Ppagc的单一启动子表达载体pPB、pPC,进一步构建其报告基因载体pPB-EGFP、pPC-EGFP,并转化到S.C500中进行相应的诱导性表达。通过表达菌液荧光观察、菌细胞表达荧光检测、SDS-PAGE检测,确证EGFP的获得成功表达,证实克隆获得的启动子PnirB、PpagC区域基因片段在S.C500中具有启动活性。Ⅲ.新型双功能基因疫苗通用表达载体的构建及表达活性研究为研制含沙门菌内源启动子的新型双功能基因疫苗表达载体,利用PCR技术亚克隆启动子必需区域基因片段PnirB（CB）（190bp）、PpagC（CC）（490bp）,并设计添加SD-Kozak杂合序列,替换pCI-neo启动子Pcmv下游的Chimeric intron基因区域,构建双功能疫苗表达载体pCB-neo、pCC-neo。进一步构建报告基因载体pCB-EGFP、pCC-EGFP。实现EGFP在S.C500中表达,证实PnirB（CB）、PpagC（CC）可以在S.C500中驱动外源基因的表达;实现EGFP在Vero细胞中表达,证实原载体中启动子Pcmv可以在Vero中驱动外源基因的表达,说明下游新插入的启动子不影响其启动活性:实现EGFP在小鼠体外培养巨噬细胞中表达,进一步证实S.C500运送以pCB-neo、pCC-neo为表达载体构建的新型基因疫苗的可行性。Ⅳ.内江猪白细胞介素15基因的分子克隆、表达及免疫佐剂作用研究为获得内江猪白细胞介素15基因序列片段,利用RT-PCR技术从经由Con A刺激的内江猪PMBC扩增了pIL-15基因,经TA克隆筛选及测序鉴定,成功构建克隆重组克隆质粒pUCX-njpIL-15。构建原核表达载体pMAL-pmIL-15,实现pIL-15在大肠杆菌中高效表达。MTT法试验显示融合产物MBP-pmIL-15经初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞增殖。构建真核表达载体pCI-pIL-15,与pCI-gD（PRV）联合肌注免疫BALB/c雌性小鼠试验显示,pCI-pIL15能够促进小鼠脾脏CD4+T、CD8+T细胞数量增殖,加强基因疫苗pCI-gD（PRV）特异性中和抗体的产生:试验证实内江猪IL-15具有免疫佐剂作用。Ⅴ.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的分子克隆与原核表达研究为获CSFV-E2基因片段,利用RT-PCR技术从PK-15细胞增殖的CSFV四川分离株中成功分子克隆E2基因,含有编码E2蛋白完整基因序列,共1119 bp,编码373 aa。构建原核表达载体pET-mE2（pe）、pET-E2（pe）,转化到宿主菌E.coli Rosetta-gami-TM（DE3）plysS进行表达研究,SDS-PAGE电泳检测及Western blot分析结果显示,试验成功表达的mE2（pe）、E2（pe）均具有一定的生物学免疫反应活性。CSFV-E2主要抗原位点区域（mE2）的成功原核表达,为进一步研究新型猪瘟病毒基因疫苗奠定理论基础。Ⅵ.猪IL-15与CSFV-E2双基因融合表达载体的构建及表达研究运用分子生物学实验技术将内江猪IL-15成熟肽基因与CSFV-E2主要抗原位点区域基因有机连接,构建融合双基因的克隆重组质粒pUCX-ME2-IL-15。构建真核表达载体pEGFP-ME2-IL-15,转染到Vero细胞中,荧光检测证实表达出增强型绿色荧光蛋白融合蛋白,证实试验构建的目的融合双基因ME2-IL-15可以在真核Vero细胞中获得表达,为进一步研究融合双基因ME2-IL-15奠定理论基础。构建融合双功能重组表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15及对照真核重组表达载体pCI-ME2-IL-15,分别将pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15转化到S.C500,SDS-PAGE电泳及Western-blott检测显示融合双基因ME2-IL-15在S.C500中成功表达,证实PnirB（CB）、PpagC（CC）可以在S.C500中驱动融合双基因ME2-IL-15的表达:将pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15转染到哺乳动物Vero细胞中,mRNA转录、间接免疫荧光及夹心ELISA检测结果证实Pcmv可以在Vero中驱动外源基因ME2-IL-15的表达。为进一步研究S.C500运载双基因融合表达基因疫苗奠定试验基础。Ⅶ.融合双基因疫苗在S.C500中的稳定性及其对运载菌侵袭力影响的研究为了考察融合双基因疫苗表达载体在运载菌S.C500中的稳定性及其对运载菌侵袭力的影响,试验对构建的重组工程活菌苗进行系统研究。结果显示,双功能表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15及对照pCI-ME2-IL-15存在与否不影响运载菌S.C500的生物学特性,对其生化鉴定特性亦不影响,除Amp抗性外,重组菌与运载菌的药敏性一致;基因疫苗表达载体所插入的融合双基因ME2-IL-15增加其在运载菌S.C500体内的稳定性;基因疫苗的存在使运载菌S.C500对ST细胞的粘附能力、侵袭能力及其在ST细胞体内的增殖能力均有一定程度的下降,对运载菌本身的免疫效应有一定影响;口服免疫28日龄BALB/c雌性小鼠具有一定的稳定性和免疫安全性,可以有效的将基因疫苗运载至免疫小鼠机体细胞;为研究S.C500运载基因疫苗的免疫应答奠定前提。Ⅷ.融合双基因疫苗重组S.C500活菌苗口服接种家兔的免疫应答初步研究为检测家兔血清中S.C500抗体水平,建立猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法,确立抗原最佳包被浓度为0.305μg/mL,血清最适稀释度为1:40,试验测定血清样品的D492 nm值,判定标准通过标准阴性血清按照P/N比值公式进行判断,P/N≥2.1为阳性,1.5＜P/N≤2.1为可疑,1.5＜P/N为阴性;可以间接反应抗体水平的高低。家兔血清CSFV抗体检测结果显示对照A组（口服PBS缓冲液对照）无CSFV抗体,B组（口服S.C500/pCB-ME2-IL-15）、C组（口服S.C500/pCC-ME2-IL-15）、D组（口服S.C500/pCI-ME2-IL-15）、E组（口服S.C500/pCI-ME2）首免后14天即已产生CSFV抗体,第二、三次均呈上升趋势,B、C组免疫效果优于D、E组,B、C组之间相比C组免疫效果稍好,D、E组之间相比D组免疫效果稍好,试验研制的双功能疫苗通用表达载体pCB-neo、pCC-neo具有一定优势;S.C500抗体检测结果显示,试验构建的四个重组工程菌组经灌服均产生了较高的抗体水平,对照灌服PBS缓冲液组未能检测到抗S.C500特异性抗体的存在。免疫家兔T淋巴细胞增殖检测分析显示,对照A组家兔三次T淋巴细胞增殖率均低于15%,之间差异亦不大;B、C、D、E四个口服免疫组T淋巴细胞增殖率均高于18%以上,末次免疫后14d,B组增殖率有小幅度下降,C、D、E三组增殖率均有不同程度的增强提高。于末次免疫后14d,用4头份猪瘟兔化弱毒脾淋苗肌肉注射进行攻毒,以热反应为判定标准,保护率依次为0%、40%、60%、40%、25%,说明S.C500为运载体的猪瘟基因疫苗能够诱导家兔产生一定抗CSFV的保护性特异抗体,其中试验研制的基因疫苗通用表达pCC-neo携带的抗原基因保护率较高,具有一定优势。采用4×1010 CFU/只剂量的猪伤寒沙门菌野毒株口服接种攻毒试验,结果表明试验所构建的四个重组工程菌均能够诱导家兔产生一定水平的抗猪伤寒沙门菌野毒株的保护性特异抗体。
郑颖[8]（2008）在《CDV、CPV、CAV三联DNA疫苗的制备及实验免疫研究》文中研究表明当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的传染病主要有犬瘟热、犬细小病毒性肠炎及犬2型腺病毒喉气管炎和肝炎,本研究期望通过多联基因疫苗的研究达到对以上三种传染病产生有效预防保护的目的,同时可解决现有弱毒疫苗存在的可能返祖及母源抗体干扰问题。本研究针对犬瘟热病毒（CDV）H基因、犬细小病毒（CPV）VP1基因和犬2型腺病毒（CAV-2）F基因的核苷酸序列,设计并合成了三对引物,分别提取相应的DNA、RNA。CPV、CAV直接进行PCR扩增, CDV提取总RNA后,进行RT-PCR。得到的三种目的基因分别与真核表达载体pIRES进行连接,转化、测序;获得的三种免疫质粒经纯化后分别按200、400、800ug三种浓度混合,以市售9周龄且CDV、CPV、CAV中和抗体效价≤2的昆明犬作为实验用犬,混合质粒和200、400、800ug三种浓度的单种质粒磷酸盐溶液分别对实验犬进行免疫实验,以接种空质粒的犬作为对照;每隔8周接种一次,每次接种前采血,测定血清的抗体效价,在第三次接种4周后,对全部实验犬进行用CDV、CPV、CAV-1强毒株进行攻毒,攻毒后观察犬的发病情况,并在攻毒后第7天及14天时采血,测定血清的抗体效价。所有接种不同量pIRCDV-H、pIRESVP1、pIRES-F单种基因疫苗及混合基因疫苗的犬,两次免疫后与对照相比均可提高4-40倍不等的抗体水平,且混合基因疫苗相互之间不发生免疫干扰。攻毒后27只混合基因疫苗免疫的犬除有1只发病,但症状较轻,其余都能抵抗三种强毒的攻击;而接种空质粒的9只对照犬全部发病严重,证明所构建的核酸疫苗在一定程度上可抵抗这三种强毒的攻击。
袁子国[9]（2008）在《表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建及免疫试验研究》文中进行了进一步梳理为了研制一种新型的抗狂犬病疫苗,本研究通过同源重组的方法成功的构建了表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区的两株重组伪狂犬病病毒rPrV/eGFP/rgp、rPrV/rgp),并对获得的重组病毒进行了犬科动物的免疫试验。本研究首先对PrV疫苗株Bartha-K61在犬科动物体内的安全性和有效性进行了评价。结果显示:该疫苗株在犬科动物体内安全,且能有效的刺激机体产生免疫应答。通过在Bartha-K61的PK基因处分别插入eGFP/rgp和rgp两个表达盒,构建了表达RV糖蛋白的两株重组病毒。犬的免疫试验结果表明:肌肉注射和口服免疫5周时,均能刺激机体产生抗体滴度大于0.5 IU/mL具有保护水平的抗RV的中和抗体,针对PrV的中和抗体滴度在1:64～1:128之间,且均可维持在26周以上。表明,两个重组病毒均可有效的刺激机体产生抗RV的保护性免疫应答。
李鹏[10]（2008）在《日本乙型脑炎病毒E蛋白多表位基因串联表达及免疫效力研究》文中提出日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）,又称乙型脑炎病毒,简称乙脑病毒,属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属,主要引起人类或马的中枢神经系统感染以及猪的流产,能通过持续感染的蚊子传播给人,并且主要在脊椎动物宿主内存在,特别是具有较高病毒血症的猪和鸟类,在人类乙脑主要引起致死率较高的脑炎,致死率从20-50%,但是绝大多数的幸存者都具有中枢神经系统的后遗症；猪是主要中间宿主和扩散宿主,也是主要的传染源。许多研究表明,猪流行性乙型脑炎与人流行性乙型脑炎密切相关,因此预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。同时,乙脑也是猪的重大疫病之一,能引起怀孕母猪流产、死胎及弱仔,公猪睾丸炎,仔猪呈神经症状,其暴发常给养猪业带来巨大的经济损失。目前用于JEV预防的疫苗主要是传统的灭活苗和弱毒苗,乙脑弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性,在预防和控制乙脑的过程中发挥着重要作用,但是鼠脑来源的乙脑灭活疫苗在过敏问题上越来越突出,而且使用灭活疫苗的一个主要问题是缺乏长效免疫,由于需要多次重复免疫,使得免疫程序繁琐。弱毒疫苗则存在病毒毒力返强的不安全因素,因此寻求稳定、安全以及新型的JE疫苗已经成为近年JE感染防治的主要研究方向。近年来,随着分子生物学技术的飞速发展,JE基因工程疫苗等多种新型的疫苗都在不断的研究开发中。本研究首次构建了乙脑E蛋白多表位串联基因（TEP）,包括E蛋白上四个重要的B细胞表位327aa～333aa,337aa～345aa,373aa～399aa,397aa～403aa和两个T细胞表位60～68aa,436aa～445aa。为了提高免疫效力,在六个表位串联的基础上引入了组织酶原激活物信号肽序列（tissue plasminogen activator, TPA）、CpG基序和通用型辅助性T细胞表位。本研究分别以原核表达体系、真核表达体系及腺病毒表达系统表达了TEP基因,并比较了它们的免疫效力。论文的主要研究内容主要包括以下几个方面：1.乙脑E蛋白多表位基因串联真核质粒的构建人工合成含有JEV E基因的T,B细胞表位的多表位基因,插入真核表达质粒pCDNA3.0中构建重组真核质粒pCDNA-TEP。重组质粒转染293A细胞,利用间接免疫荧光证明pCDNA-TEP在真核细胞内能有效的转录和表达；Western-blot检测表明重组真核质粒的表达产物能与JEV阳性血清特异性结合,证明其具有一定的生物学活性和抗原性。2.乙脑E蛋白多表位基因在大肠杆菌中的融合表达以重组质粒pUC-TEP为模板,扩增不含TPA信号肽序列的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,命名为pET-rEP。将重组质粒转化大肠杆菌（E. coli）BL21（DE3）感受态细胞,酶切鉴定的阳性菌经1mM IPTG诱导表达4h后,将大肠杆菌以6000rpm离心10min,用PBS洗两次,收集细菌,将其悬浮在PBS中,进行超声波破碎,以10,000 rpm离心20min,将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析,结果表明这种蛋白以包涵体形式存在。将包涵体在8M的尿素中过夜溶解,然后将上清过His Bind树亲和层析柱对重组表达产物进行纯化。结果显示融合蛋白的分子量为37kDa,Western blot表明重组蛋白具有抗JEV的特异抗原性。3.多表位DNA疫苗和重组蛋白疫苗对Balb/c小鼠的特异性免疫影响为了评价所构建的DNA疫苗和重组蛋白质疫苗的免疫效力,将6周龄Balb/c小鼠随机分成4组,每组8只,设pcDNA-TEP （1）, pET-rEP （2）, pcDNA-TEP+pET-rEP （3）,灭活疫苗（4）共4个免疫组,同时设pcDNA3.0空载体对照组（5）。肌肉注射免疫,重组质粒的免疫剂量为50μg/只,重组蛋白的免疫剂量为200 pmol/只,灭活苗免疫组按照使用说明进行。利用微量中和试验检测免疫后的中和抗体,利用商品化的ELISA试剂盒检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2及IL-4的能力,并与灭活苗进行比较。结果表明,试验构建的DNA疫苗和重组蛋白质疫苗都能诱导产生针对JEV的特异性体液免疫和细胞免疫应答。灭活苗免疫组产生了最高的中和抗体,其次由高到低依次为,pcDNA-TEP+pET-rEP, pET-rEP, pcDNA-TEP。pcDNA3.0空载体对照组没有检测到特异性针对JEV的中和抗体。通过对抗体亚型及细胞因子的测定,pET- rEP和灭活苗免疫组主要是增强Th2免疫反应,pcDNA-TEP增强Thl免疫反应,而pcDNA-TEP+pET-rEP则产生Thl/Th2混合型的免疫反应。这为研究能够更好地防制JEV感染的新型疫苗提供新的思路。4.表达乙脑E蛋白多表位基因重组腺病毒的构建将人工合成多表位基因克隆到腺病毒的穿梭载体pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP中。得到的阳性穿梭质粒经Pme I酶线性化后,利用电转化技术将线性化的质粒与腺病毒骨架载体pAdeno Vator△E1/E3共转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞,使其在大肠杆菌中进行同源重组。将筛选到的重组病毒质粒经Pac I酶线性化后暴露出包装信号,通过脂质体LipofectamineTM2000转染293A细胞后得到重组病毒。利用报告基因GFP检测病毒滴度,通过PCR和wes tern-blot检测JEV多表位基因得到成功的表达并有很好的免疫原性,重组病毒rAd5-TEP的滴度为1010.59个TCID５0/mL。重组病毒经过连续五代传代后效价稳定。5.重组腺病毒对小鼠特异性免疫的影响6周龄小鼠随机分为4组,每组8只。将重组病毒rAd5-TEP、灭活疫苗分别以腹腔接种的方式给小鼠进行3次免疫,同时设对照组小鼠,免疫PBS。然后通过测定IgGl、IgG2a、中和抗体和IL-4、IFN-γ水平来衡量重组病毒的免疫效果。结果表明重组病毒rAd5-TEP既能诱导细胞免疫应答又能诱导体液免疫应答,抗体亚型测定结果显示,重组病毒rAd5-TEP既能诱导IgGl的分泌又能诱导IgG2a的分泌,但以IgG2a为主。同时细胞因子ELISA试验结果进一步表明重组病毒主要刺激Thl分化（IFN-y）,但与灭活苗相比,也能刺激Th2（IL-4）的分化。pcDNA-TEP+rAd5-TEP免疫组能产生最高水平的IFN-γ和IL-4,而诱导产生的中和抗体滴度略低于灭活苗免疫组。6.不同疫苗联合应用对猪的免疫效力研究为了比较pcDNA-TEP+pET-rEP和pcDNA-TEP+rAd5-TEP对猪的免疫效力,将4周龄的健康仔猪随机分4组,每组5头,设pcDNA-TEP+pET-rEP （I）、pcDNA-TEP+rAd5-TEP（Ⅱ、）与灭活疫苗（Ⅲ）3个免疫组,同时PBS空白对照组（Ⅳ）。肌肉注射免疫,重组质粒的免疫剂量为200μg/头,重组蛋白的免疫剂量为800 pmo1/头,重组病毒免疫组免疫剂量为1×1010TCID５0/头,灭活苗免疫组按照使用说明进行,空白对照组每头注射2mL高压灭菌的PBS,4周后进行加强免疫。初次免疫后每隔2周采血分离血清,利用空斑抑制中和试验（PRNT）检测JEV特异性中和抗体水平；同时,在初次免疫后30、45与60天,无菌采血,分离血血清,采用ELISA定量检测细胞因子的水平。结果表明,pcDNA-TEP+rAd5-TEP免疫组在加强免疫后2周产生了可检测到的中和抗体,pcDNA-TEP+pET-rEP和灭活疫苗免疫组在加强免疫后4周检测到中和抗体,在整个试验过程中,灭活疫苗免疫组产生的中和抗体平均滴度最高；就细胞免疫而言,初次免疫后30天,各实验组细胞因子的产量没有明显差异；在初次免疫后45天,3个试验组IFN-y与IL-2的产量明显增多,pcDNA-TEP+rAd5-TEP产生最高水平的IFN-γ、IL-2和IL-4,在免疫后70d,各组IFN-γ与IL-2的产量没有明显变化,说明加强免疫后Thl型细胞因子的分泌至少可以维持3周,灭活苗免疫后,IFN-γ、IL-2都不明显,主要是IL-4的产量增加。上述研究结果表明以pcDNA-TEP作基础免疫,以rAd5-TEP加强免疫的‘"prime-boost"疫苗是一个值得深入研究的JE新型疫苗。综上所述：构建的重组疫苗pcDNA-TEP.pET-rEP. rAd5-TEP者能诱导产生针对JEV的特异性体液免疫和细胞免疫应答,采用"prime-boost"的免疫策略能明显提高其诱导的中和抗体水平和细胞免疫应答,以pcDNA-TEP作基础免疫,以rAd5-TEP加强免疫试验组在小鼠和猪体内获得了较高的特异性针对JEV的中和抗体和细胞免疫应答,从而为研究安全有效的乙脑新型疫苗提供了新的思路和方法。
二、犬Ⅱ型腺病毒弱毒DNA的酶切分析及分子克隆（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、犬Ⅱ型腺病毒弱毒DNA的酶切分析及分子克隆（论文提纲范文）
（1）嵌合犬冠状病毒N、S基因的重组狂犬病病毒的拯救与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 狂犬病概述 |
| 1.1.1 狂犬病 |
| 1.1.2 狂犬病流行病学 |
| 1.1.3 狂犬病临床症状与致病机理 |
| 1.1.4 狂犬病毒基因组结构和编码蛋白 |
| 1.1.5 狂犬疫苗研究进展 |
| 1.2 犬冠状病毒病概述 |
| 1.2.1 冠状病毒概述 |
| 1.2.2 犬冠状病毒的临床症状与致病机理 |
| 1.2.3 犬冠状病毒基因组结构和编码蛋白 |
| 1.2.4 冠状病毒疫苗研究进展 |
| 1.3 RNA病毒的反向遗传操作和应用 |
| 1.3.1 正链RNA病毒的反向遗传操作技术 |
| 1.3.2 负链RNA病毒的反向遗传操作技术 |
| 第二章 犬冠状病毒N基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 N基因密码子优化及其重组表达质粒p ET-B2M-N的构建 |
| 2.1.3 CCVN蛋白的诱导表达 |
| 2.1.4 免疫动物 |
| 2.1.5 血清抗体效价的ELISA测定 |
| 2.1.6 抗体纯化 |
| 2.1.7 Western blotting检测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 重组质粒的成功构建 |
| 2.2.2 重组N蛋白的诱导表达 |
| 2.2.3 多克隆抗体ELISA效价 |
| 2.2.4 抗体纯化结果 |
| 2.2.5 Western blotting检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 重组狂犬病病毒BNSP-CCV-N的拯救及生物学特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 质粒、细胞、病毒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 引物设计与合成 |
| 3.1.4 PCR扩增犬冠状病毒N基因 |
| 3.1.5 含犬冠状病毒N基因的重组狂犬病病毒基因组全长cDNA克隆的构建 |
| 3.1.6 重组病毒的拯救 |
| 3.1.7 免疫荧光鉴定重组病毒 |
| 3.1.8 实时荧光定量qPCR试验 |
| 3.1.9 重组病毒的传代和外源基因稳定性检测 |
| 3.1.10 重组病毒毒价测定以及生长曲线的测定 |
| 3.1.11 重组病毒浓缩、纯化 |
| 3.1.12 Western blotting鉴定外源蛋白表达 |
| 3.1.13 激光共聚焦观察和电镜观察 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 犬冠状病毒N基因的扩增结果 |
| 3.2.2 全长cDNA构建结果 |
| 3.2.3 qPCR鉴定重组病毒结果 |
| 3.2.4 免疫荧光鉴定重组病毒结果 |
| 3.2.5 重组病毒生长曲线的测定结果 |
| 3.2.6 重组病毒的电镜观察结果 |
| 3.2.7 Western Blotting鉴定外源蛋白的表达结果 |
| 3.2.8 外源基因稳定性检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 重组狂犬病病毒BNSP-CCV-S的拯救及生物学特性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒、细胞、病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 引物设计与合成 |
| 4.1.4 PCR扩增犬冠状病毒S1、S2、S3 基因 |
| 4.1.5 含犬冠状病毒S1、S2、S3 基因的重组狂犬病病毒基因组全长c DNA克隆的构建 |
| 4.1.6 重组病毒的拯救 |
| 4.1.7 免疫荧光鉴定重组病毒 |
| 4.1.8 实时荧光定量qPCR试验 |
| 4.1.9 重组病毒的传代和外源基因稳定性检测 |
| 4.1.10 重组病毒毒价测定以及生长曲线的测定 |
| 4.1.11 Western blotting鉴定外源蛋白表达 |
| 4.1.12 重组病毒浓缩、纯化 |
| 4.1.13 激光共聚焦观察和电镜观察 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 犬冠状病毒S1、S2、S3基因的扩增结果 |
| 4.2.2 全长cDNA构建结果 |
| 4.2.3 qPCR鉴定重组病毒结果 |
| 4.2.4 免疫荧光鉴定重组病毒结果 |
| 4.2.5 重组病毒生长曲线的测定结果 |
| 4.2.6 BNSP-CCV-S重组病毒的电镜观察结果 |
| 4.2.7 Western Blotting鉴定外源蛋白的表达结果 |
| 4.2.8 外源基因稳定性检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 重组病毒对小鼠的致病性及免疫效果评价 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物、病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 重组病毒对小鼠的致病性研究 |
| 5.1.4 疫苗的制备与免疫试验 |
| 5.1.5 RFFIT检测狂犬病毒的中和抗体 |
| 5.1.6 间接ELISA方法检测N、S抗体 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 重组病毒对小鼠致病性结果 |
| 5.2.2 RFFIT检测狂犬病毒的中和抗体结果 |
| 5.2.3 间接ELISA检测犬冠状病毒特异性抗体结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）猪伪狂犬病毒变异株gE&TK基因缺失活疫苗的构建与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文中部分符号及缩略语说明 |
| 第一章 猪伪狂犬病的研究进展 |
| 1 伪狂犬病及病毒概况 |
| 1.1 病毒特征 |
| 1.2 病毒基因组特征 |
| 1.3 与PRV毒力相关的蛋白 |
| 1.4 流行病学 |
| 1.5 临床症状 |
| 1.6 病理变化 |
| 2 猪伪狂犬疫苗的研究进展 |
| 2.1 传统疫苗 |
| 2.2 亚单位疫苗 |
| 2.3 核酸疫苗 |
| 2.4 活载体疫苗 |
| 2.5 基因缺失苗 |
| 2.6 细菌人工染色体的研究进展 |
| 第二章 PRV gE&TK基因缺失株的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器及耗材 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 伪狂犬缺失株的构建策略 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 CEF细胞的制备 |
| 2.4 KAN抗性基因表达盒的扩增 |
| 2.5 左右同源臂的扩增 |
| 2.6 电击转化 |
| 2.7 BAC~(PRV △TK/gI/Kar+)的鉴定 |
| 2.8 KAN抗性基因的敲除及鉴定 |
| 2.9 中提BAC~(PRV△TK/gE/gI)质粒 |
| 2.10 转移载体的扩增 |
| 2.11 不含mini-F的缺失株PRV △TK/gE的获得与传代 |
| 2.12 PRV~(△TK&gE-AH02)的PCR鉴定 |
| 2.13 基因缺失株与强毒株体外增殖特性的比较 |
| 3 结果 |
| 3.1 BAC~(PRV △TK/gE/gI/Kar+)的验证 |
| 3.2 KAN抗性基因敲除验证 |
| 3.3 不含mini-F的缺失株PRV ATK/gE的获得 |
| 3.4 PRV~(△TK&gE-AH02)的PCR鉴定 |
| 3.5 病毒体外增殖特性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组毒体外增殖特性 |
| 4.2 绿色荧光蛋白(GFP)的优点和敲除 |
| 4.3 缺失TK基因的优点 |
| 4.4 重组毒基因组转染法 |
| 第三章 伪狂犬基因缺失株的安全性及免疫效力研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物、疫苗和病毒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器及耗材 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 免疫与攻毒 |
| 2.2 血清抗体的检测 |
| 2.3 免疫和攻毒后的排毒情况 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫和攻毒后猪的临床变现 |
| 3.2 免疫和攻毒后排毒情况 |
| 3.3 免疫保护效力 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）番鸭呼肠孤病毒强弱毒株S基因分子特征分析及感染性克隆载体构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 番鸭呼肠孤病毒病概况 |
| 1.1 病原分类地位 |
| 1.2 病毒理化生物学特性 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 病理变化 |
| 1.6 诊断 |
| 1.7 防治 |
| 2 MDRV分子生物学研究进展 |
| 2.1 基因组特征 |
| 2.2 蛋白质组成 |
| 2.3 禽源呼肠孤病毒的复制 |
| 3 RNA病毒感染性克隆操作研究进展 |
| 3.1 RNA病毒感染性克隆构建的发展历程 |
| 3.2 RNA病毒感染性克隆构建的基础 |
| 3.3 反向遗传学的应用 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第二章 MDRV强弱毒株S组基因cDNA分子克隆构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒(菌)株及载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒增殖与浓缩 |
| 2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.3 病毒S组基因引物设计及合成 |
| 2.4 病毒S组基因RT-PCR扩增 |
| 2.5 PCR产物的纯化 |
| 2.6 纯化产物与载体的连接、转化 |
| 2.7 重组质粒的抽提 |
| 2.8 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.9 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 2.10 目的基因的测序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RT-PCR结果 |
| 3.2 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒双酶切鉴定结果 |
| 3.4 重组质粒测序结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 MDRV强弱毒株S组基因分子特征分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 核苷酸序列同源性分析 |
| 3.1.1 5'非编码(5'UTR)分析 |
| 3.1.2 编码框(ORF)分析 |
| 3.1.3 3'非编码(3'UTR)分析 |
| 3.2 氨基酸序列同源性分析 |
| 3.2.1 σA蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.2 σB蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.3 σNS蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.4 p10蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.5 σC蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.3 蛋白理化性质分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 MDRV强弱毒株S组基因感染性克隆载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 质粒的提取 |
| 2.3 PCR扩增及产物纯化 |
| 2.4 感染性克隆载体的构建 |
| 2.5 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.6 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.7 目的基因的测序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.2 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒测序结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五部分 总结 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 基金项目 |
| 发表论文情况 |
（4）犬细小病毒LAMP检测方法建立及其串联表位卵黄抗体中和效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 犬细小病毒感染 |
| 1.1.1 犬细小病毒感染概述 |
| 1.1.2 犬细小病毒的研究进展 |
| 1.1.3 犬细小病毒的检测方法 |
| 1.1.4 犬细小病毒感染的防治 |
| 1.2 环介导等温扩增(LAMP) |
| 1.2.1 LAMP原理 |
| 1.2.2 LAMP特点 |
| 1.2.3 LAMP的应用 |
| 1.3 抗原表位 |
| 1.3.1 犬细小病毒抗原表位 |
| 1.3.2 抗原表位疫苗研究进展 |
| 1.4 卵黄抗体 |
| 1.4.1 卵黄抗体的形成 |
| 1.4.2 卵黄抗体的结构 |
| 1.4.3 卵黄抗体的特点 |
| 1.4.4 IgY的提取 |
| 1.4.5 卵黄抗体的应用 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细菌菌株、质粒载体、病毒株 |
| 2.1.2 病毒分离样品、实验动物及细胞系 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CPV分离鉴定 |
| 2.2.2 CPV VP2基因克隆及序列分析 |
| 2.2.3 CPV VP2基因LAMP检测方法的建立 |
| 2.2.4 串联表位卵黄抗体中和效力评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 CPV分离鉴定 |
| 3.1.1 细胞病变 |
| 3.1.2 血凝试验(HA) |
| 3.1.3 PCR鉴定 |
| 3.1.4 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.1.5 胶体金试纸条检测 |
| 3.2 CPV VP2基因克隆及序列分析 |
| 3.2.1 CPV VP2基因扩增 |
| 3.2.2 CPV VP2重组质粒的鉴定 |
| 3.2.3 VP2基因核苷酸、氨基酸序列分析及抗原表位差异性分析 |
| 3.3 CPV VP2基因LAMP检测方法的建立 |
| 3.3.1 LAMP扩增产物的检测 |
| 3.3.2 LAMP最佳反应温度 |
| 3.3.3 LAMP最佳反应时间 |
| 3.3.4 LAMP特异性试验 |
| 3.3.5 LAMP敏感性试验 |
| 3.3.6 临床样本检测 |
| 3.4 串联表位及卵黄抗体中和效力评价 |
| 3.4.1 合成质粒的鉴定 |
| 3.4.2 串联表位的鉴定 |
| 3.4.3 4VP2-3L-6His-TAA重组表达质粒的鉴定 |
| 3.4.4 串联表位蛋白的诱导表达 |
| 3.4.5 串联表位蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.4.6 卵黄抗体效价检测 |
| 3.4.7 卵黄抗体中和效力评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 犬细小病毒的分离鉴定 |
| 4.2 LAMP技术 |
| 4.3 犬细小病毒VP2抗原表位串联 |
| 4.4 卵黄抗体中和试验 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）PRRSV GP5与M蛋白重组犬2型腺病毒的构建及其免疫特性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 第一篇 引言 |
| 第一章 选题的理论和实际意义及研究背景 |
| 第二章 文献综述 |
| 1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 2 PRRSV 的研究进展 |
| 2.1 PRRSV 的形态及理化学特性 |
| 2.2 PRRSV 的主要生物学特性 |
| 2.3 PRRSV 的遗传和变异 |
| 2.4 PRRSV 基因组结构及编码的结构蛋白 |
| 3 PRRS 免疫学研究进展 |
| 4 PRRS 疫苗研究进展 |
| 4.1 弱毒疫苗和灭活疫苗 |
| 4.2 亚单位疫苗 |
| 4.3 基因疫苗 |
| 4.4 重组载体疫苗 |
| 5 腺病毒简介 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 PRRS 地方毒株的分离鉴定及结构基因的分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料 |
| 1.2 细胞株与菌株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞复苏、培养及传代 |
| 2.2 病料处理 |
| 2.3 病毒的分离 |
| 2.4 病毒 TCID50 的测定 |
| 2.5 核酸型鉴定 |
| 2.6 病毒理化特性的测定 |
| 2.7 感染谱的测定 |
| 2.8 血凝试验 |
| 2.9 中和试验 |
| 2.10 病毒细胞培养物总 RNA 的提取 |
| 2.11 RT-PCR 扩增 |
| 2.12 RT-PCR 产物的回收与纯化 |
| 2.13 回收产物的连接 |
| 2.14 连接产物的转化 |
| 2.15 碱裂解法提取重组质粒 |
| 2.16 阳性克隆质粒的限制性内切酶酶切鉴定 |
| 2.17 阳性克隆质粒的序列测定与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离病毒结果 |
| 3.2 TCID_(50) 的测定结果 |
| 3.3 核酸型鉴定结果 |
| 3.4 病毒理化特性的测定结果 |
| 3.5 感染谱的测定结果 |
| 3.6 病毒的红细胞血凝试验结果 |
| 3.7 中和试验的结果 |
| 3.8 病毒的 RT-PCR 检测 |
| 3.9 PRRSV JL-0605 株部分基因核苷酸序列测定及其分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 PRRSV GP5 与 M 蛋白重组犬2 型腺病毒的构建及表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、菌株、病毒与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRRSV JL-0605 株 GP5 基因和 M 基因的扩增 |
| 2.2 目的基因的回收与纯化 |
| 2.3 GP5 与M 基因的pIRESneo-GP5-M 表达盒的构建及鉴定 |
| 2.4 pPolyⅡ-CAV-2-△E3-GP5-M 的构建 |
| 2.5 重组病毒的包装 |
| 2.6 IFA 检测重组腺病毒 CAV2-△E3-GP5-M 的表达 |
| 2.7 重组腺病毒 CAV2-△E3-GP5-M 的病毒滴度测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRRSV JL-0605 株 GP5、M 蛋白的扩增与表达盒载体pIRESneo-GP5-M 的构建及鉴定 |
| 3.2 重组病毒的包装及基因组的酶切鉴定 |
| 3.3 IFA 鉴定重组腺病毒的表达 |
| 3.4 重组腺病毒的 TCID_(50) |
| 3.5 重组腺病毒致 MDCK 细胞病变 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 PRRSV GP5 与 M 蛋白重组腺病毒免疫效果的评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠分组与免疫试验 |
| 2.2 重组腺病毒 CAV2-△E3-GP5-M 在猪体的免疫试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠的体液免疫应答 |
| 3.2 细胞免疫应答（淋巴细胞增殖应答） |
| 3.3 重组腺病毒免疫猪体的体液免疫应答 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
（6）表达虎源H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组犬2型腺病毒的构建与鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 禽流感的病原及分子生物学 |
| 2 禽流感疫苗的研究进展 |
| 3 腺病毒载体的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 虎源H5N1亚型禽流感病毒HA基因的克隆、测序及其真核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 H5N1 HA基因的扩增、克隆及测序 |
| 2.2 H5N1 HA基因真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3 pCAGGS-HA在BHK-21细胞中的表达和检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 毒株的选择 |
| 3.2 目的基因的选择 |
| 3.3 酶切鉴定 |
| 3.4 真核表达载体的选择 |
| 4 小结 |
| 第二章 犬2型腺病毒E3区大缺失转移载体的构建与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 表达虎源H5N1禽流感病毒HA蛋白重组犬2型腺病毒的构建与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 H5N1 HA表达盒转移质粒的构建与鉴定结果 |
| 2.2 pCAV-2-HA重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.3 重组pCAV-2-HA基因组转染DK细胞 |
| 2.4 重组病毒CAV-2-HA的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA的连接 |
| 3.2 连接产物的转化 |
| 3.3 CAV-2载体的选择 |
| 3.4 CAV-2-HA重组病毒的鉴定 |
| 3.5 重组病毒基因组的转染 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 目录 |
| 前言 |
| 1 研究背景、基础和目的意义 |
| 2 拟解决的问题 |
| 3 主要研究内容 |
| 4 整体技术路线 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗运载体研究进展 |
| 1 沙门菌的特征 |
| 2 沙门菌的侵染机制 |
| 3 沙门菌的减毒 |
| 4 减毒沙门菌的胞内定位及对基因疫苗的运送 |
| 5 运送基因疫苗减毒沙门菌诱发机体免疫应答的机制 |
| 6 减毒猪霍乱沙门菌作为疫苗的应用 |
| 7 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗载体的应用 |
| 8 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗载体的优点及潜在的威胁 |
| 第二章 猪瘟病毒研究进展 |
| 1 猪瘟病毒概述 |
| 2 猪瘟病毒的病原学研究 |
| 3 猪瘟病毒分子生物学研究 |
| 4 猪瘟病毒致细胞病变型的研究 |
| 5 猪瘟病毒疫苗研究 |
| 6 猪瘟病毒与动物性食品安全 |
| 7 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 猪霍乱沙门菌nirB、pagC基因启动子区域分子克隆及其生物信息学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物的设计与合成 |
| 1.2.3 S.C500细菌活化培养 |
| 1.2.4 S.C500细菌基因DNA的提取制备 |
| 1.2.5 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR扩增 |
| 1.2.6 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域扩增产物的TA克隆 |
| 1.2.7 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR产物的TA克隆质粒初步鉴定 |
| 1.2.8 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域TA克隆质粒测序鉴定 |
| 1.2.9 S.C500 nirB、pagC基因启动子扩增区域的序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR扩增 |
| 2.2 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列TA克隆质粒鉴定 |
| 2.3 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列测定及结果分析 |
| 2.4 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列的序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第二章 沙门菌nirB、pagC基因启动子启动活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 报告基因EGFP的质粒PCR扩增及TA克隆 |
| 1.2.4 基因片段PnirB、PpagC的质粒PCR扩增及TA克隆 |
| 1.2.5 含启动子PnirB、PpagC表达载体的构建 |
| 1.2.6 含报告基因EGFP重组载体的构建 |
| 1.2.7 报告基因EGFP在S.C500中的表达研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 报告基因克隆质粒pUCX-EGFP构建 |
| 2.2 目的基因克隆质粒pUCX-PnirB(PB)、pUCX-PpagC(PC)构建 |
| 2.3 表达载体pPB、pPC构建 |
| 2.4 报告基因载体pPB-EGFP、pPC-EGFP构建 |
| 2.5 重组菌S.C500/pPB-EGFP、S.C500/pPC-EGFP的表达研究 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 新型双功能通用表达载体的构建及启动活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 启动子基因PnirB(CB)、PpagC(CC)的PCR扩增及TA克隆 |
| 1.2.4 新型基因疫苗表达载体的构建 |
| 1.2.5 新型基因疫苗报告载体的构建 |
| 1.2.6 新型基因疫苗报告载体在S.C500中表达研究 |
| 1.2.7 新型基因疫苗报告载体在Vero细胞中瞬时表达研究 |
| 1.2.8 重组菌S.C500/pCB-EGFP、S.C500/pCC-EGFP的稳定性分析 |
| 1.2.9 重组菌S.C500/pCB-EGFP、S.C500/pCC-EGFP在体外培养小鼠巨噬细胞中表达研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 克隆质粒pUCX-PnirB(CB)、pUCX-PpagC(CC)的构建 |
| 2.2 新型双功能基因疫苗通用表达载体的构建 |
| 2.3 新型基因疫苗报告载体的构建 |
| 2.4 新型基因疫苗报告载体在S.C500中表达研究 |
| 2.5 新型基因疫苗报告载体在Vero细胞中表达研究 |
| 2.6 重组菌体外培养稳定性 |
| 2.7 重组菌感染体外培养小鼠巨噬细胞的荧光观察 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 内江猪白细胞介素15基因的分子克隆、表达及免疫佐剂作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物的设计与合成 |
| 1.2.3 内江猪IL-15基因的克隆和序列分析 |
| 1.2.4 内江猪IL-15基因的原核表达研究 |
| 1.2.5 原核表达产物的活性检测 |
| 1.2.6 内江猪IL-15基因的免疫佐剂作用研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 内江猪IL-15基因的RT-PCR扩增及TA克隆 |
| 2.2 内江猪IL-15基因序列分析 |
| 2.3 原核表达载体DMAL-pmIL15的构建 |
| 2.4 原核表达条件优化及其产物Western blot分析 |
| 2.5 融合表达产物的生物活性检测 |
| 2.6 pIL-15基因的免疫增强作用 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 猪瘟病毒E2基因的分子克隆与原核表达研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 CSFV-E2基因的分子克隆与序列分析 |
| 1.2.4 CSFV-E2蛋白主要抗原区编码基因的TA克隆质粒构建 |
| 1.2.5 原核重组表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)的构建 |
| 1.2.6 pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)在大肠杆菌中的表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CSFV-E2基因的分子克隆 |
| 2.2 CSFV-E2基因的序列分析 |
| 2.3 克隆质粒pUCX-mE2(pe)、pUCX-E2(pe)的构建 |
| 2.4 原核表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)的构建 |
| 2.5 R/pET-mE2(pe)、R/pET-E2(pe)表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.6 R/pET-mE2(pe)、R/pET-E2(pe)表达产物的Western Blot分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 猪IL-15与CSFV-E2双基因融合表达载体的构建及表达研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 CSFV-E2与pIL-15双基因的融合 |
| 1.2.4 融合双基因重组表达载体的构建 |
| 1.2.5 pEGFP-dME2-IL-15在Vero细胞中的表达 |
| 1.2.6 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15在S.C500中表达 |
| 1.2.7 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15在Vero细胞中的瞬时表达研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CSFV-E2与pIL-15双基因的融合 |
| 2.2 融合双基因重组表达载体的构建 |
| 2.3 pEGFP-ME2-IL-15在Vero细胞中的表达 |
| 2.4 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15在S.C500中表达 |
| 2.5 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15在Vero细的瞬时表达 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第七章 融合双基因疫苗表达载体在运载菌S.C500中的稳定性及免疫安全性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 重组菌生长特性、生化特性、药敏特性及血清学特性鉴定 |
| 1.2.3 重组菌体外增殖中重组质粒的稳定性 |
| 1.2.4 携质粒SC500对ST细胞的粘附、侵袭力和增殖 |
| 1.2.5 携质粒S.C500口服免疫BALB/c小鼠 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组工程菌体外培养特性检测 |
| 2.2 S.C500体外培养中质粒的稳定性 |
| 2.3 携质粒S.C500对ST细胞的粘附、侵袭和增殖能力的影响 |
| 2.4 携质粒S.C500免疫BALB/c小鼠 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第八章 融合双基因表达载体重组S.C500活菌疫苗口服接种家兔的体内免疫应答初步研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 重组工程菌的S.C500/pCI-ME2制备 |
| 1.2.2 双基因融合表达载体重组工程菌的活化培养 |
| 1.2.3 猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 1.2.4 口服免疫重组工程菌菌液的制备 |
| 1.2.5 试验家兔的口服免疫接种 |
| 1.2.6 免疫家兔血清抗体水平检测 |
| 1.2.7 免疫家兔T淋巴细胞增殖检测 |
| 1.2.8 免疫后家兔猪瘟兔化弱毒株攻毒试验 |
| 1.2.9 免疫后家兔猪伤寒沙门菌野毒株攻毒研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组工程菌的S.C500/pCI-ME2制备 |
| 2.2 猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.3 免疫家兔抗CSFV特异性抗体的检测 |
| 2.4 免疫家兔抗S.C500特异性抗体的检测 |
| 2.5 免疫家兔T淋巴细胞增殖能力检测 |
| 2.6 免疫家兔猪瘟兔化弱毒株攻毒研究 |
| 2.7 免疫家兔猪伤寒沙门菌野毒株攻毒研究 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三部分 全文总结论 |
| 第四部分 本研究的创新点 |
| 第五部分 本研究的不足之处 |
| 第六部分 本研究的展望与建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）CDV、CPV、CAV三联DNA疫苗的制备及实验免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 犬瘟热研究进展 |
| 1.1.1 附着或血凝(H)蛋白及其基因 |
| 1.1.2 CD 的疫苗研制 |
| 1.2 犬细小病毒的研究进展 |
| 1.2.1 CPV 的起源及进化 |
| 1.2.2 CPV 流行情况 |
| 1.2.3 CPV 和 FPV 核酸序列、蛋白氨基酸序列的比较 |
| 1.2.4 CPV 疫苗的研究现状 |
| 1.3 犬腺病毒研究进展 |
| 1.3.1 CAV 免疫研究进展 |
| 1.3.2 纤突结构研究进展 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株和质粒 |
| 2.1.2 实验动物及细胞 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 工具酶 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.1.6 实验耗材 |
| 2.1.7 试剂配制 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 病毒扩增 |
| 2.3.2 引物设计 |
| 2.3.3 CPV DNA 的制备 |
| 2.3.4 CAV-2 病毒 DNA 的制备 |
| 2.3.5 CDV 总 RNA 的抽提 |
| 2.3.6 PCR 扩增 CPV VP1 基因 |
| 2.3.7 PCR 扩增 CAV-2 F 基因 |
| 2.3.8 RT-PCR 扩增 CDV H 基因 |
| 2.3.9 PCR 产物的回收 |
| 2.3.10 连接 |
| 2.3.11 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.12 连接产物的转化 |
| 2.3.13 转化菌落的快速鉴定 |
| 2.3.14 重组质粒DNA 的小量制备 |
| 2.3.15 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.3.16 插入片段的序列测定 |
| 2.3.17 免疫质粒的构建和序列测定 |
| 2.3.18 免疫质粒的纯化 |
| 2.3.19 免疫 |
| 2.3.20 抗体分析 |
| 2.3.21 攻毒 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫质粒的构建 |
| 3.1.1 CDV H 基因免疫质粒的构建 |
| 3.1.2 CPV VP1 片段的 PCR 扩增、克隆及重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.1.3 CAV 纤突基因的 PCR 扩增、克隆及重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.2 片段的序列测定及比较 |
| 3.2.1 CDV H 基因的序列及分析 |
| 3.2.2 CPV VP1 基因的序列及分析 |
| 3.2.3 CAV F 基因的序列及分析 |
| 3.3 抗体效价的测定 |
| 3.3.1 CDV 中和抗体效价的测定 |
| 3.3.2 CPV 血凝抑制效价测定 |
| 3.3.3 CAV 中和抗体效价的测定 |
| 3.4 攻毒实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫质粒的纯化 |
| 4.2 免疫佐剂的选择 |
| 4.3 接种方法及剂量的选择 |
| 4.4 载体选择 |
| 4.5 基因疫苗的优缺点 |
| 4.6 抗体效价 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在读期间发表的文章 |
| 致谢 |
（9）表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建及免疫试验研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 狂犬病病毒分子生物学及其疫苗的研究进展 |
| 第二章 伪狂犬病病毒及其活载体疫苗的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 伪狂犬病疫苗株 Bartha-K61 在犬体内的安全性评价及免疫实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Bartha-K61 在试验犬体内的组织病理学检测 |
| 2.2 Bartha-K61 在试验犬体内的免疫组化检测 |
| 2.3 Bartha-K61 在试验犬排泄物中是否存在及存留时间检测 |
| 2.4 Bartha-K61 免疫犬后的临床观察 |
| 2.5 T 淋巴细胞增殖试验 |
| 2.6 犬血清Bartha-K61 特异性抗体水平的测定 |
| 2.7 犬血清中Bartha-K61 中和抗体的检测 |
| 2.8 Bartha-K61 免疫犬后的生产性能检测 |
| 2.9 Bartha-K61 免疫犬后血液指标的检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 表达LacZ 基因的重组伪狂犬病病毒的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PrV 基因组的提取 |
| 2.2 p8AA-LacZ 中间转移载体的酶切鉴定 |
| 2.3 rPrV/LacZ 重组病毒的获得 |
| 2.4 LacZ 基因在重组病毒中的整合性及稳定性鉴定 |
| 2.5 重组病毒外源蛋白基因mRNA 转录的检测 |
| 2.6 目的基因的Western blot 检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 rPrV/eGFP/rgp 和 rPrV/rgp 重组病毒的构建及生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 p8AA-eGFP/rgp、p8AA-rgp 中间转移载体的酶切鉴定 |
| 2.2 重组病毒rPrV/eGFP/rgp 的获得及鉴定 |
| 2.3 重组病毒rPrV/rgp 的获得及鉴定 |
| 2.4 重组病毒连续传代的遗传稳定性鉴定 |
| 2.5 重组病毒的增殖特性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 狂犬病病毒糖蛋白重组伪狂犬病病毒的免疫试验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 血清中抗体的Western blot 检测 |
| 2.2 免疫犬血清中RV 特异性抗体的测定 |
| 2.3 免疫犬外周血淋巴细胞增殖试验 |
| 2.4 小鼠中和试验 |
| 2.5 血清中和抗体效价的测定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（10）日本乙型脑炎病毒E蛋白多表位基因串联表达及免疫效力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 日本乙型脑炎的研究背景 |
| 1 乙脑流行的危害 |
| 2 JEV的分类 |
| 3 乙脑的流行病学研究 |
| 3.1 乙脑流行的地理分布 |
| 3.2 乙脑的流行模式 |
| 4 乙脑的生物学研究进展 |
| 4.1 病毒的生物学特性 |
| 4.2 病毒的基因组结构 |
| 4.3 乙型脑炎病毒的侵染和复制 |
| 5 乙型脑炎病毒的毒力和致病机理 |
| 6 乙型脑炎诊断技术研究进展 |
| 6.1 血清学诊断 |
| 6.2 病原学检查 |
| 7 乙型脑炎病毒的疫苗研究进展 |
| 7.1 传统疫苗 |
| 7.2 新型疫苗 |
| 8 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 腺病毒载体概述 |
| 1 腺病毒的基本特征 |
| 2 腺病毒载体的构建策略 |
| 3 互补细胞系 |
| 4 腺病毒载体构造的改进策略 |
| 4.1 去除对非靶器官天然嗜性,提高对靶器官的嗜性 |
| 4.2 构建复制型腺病毒载体 |
| 4.3 建立腺病毒高效重组体系及子代病毒颗粒的大量产生 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 表位疫苗的研究进展 |
| 1 表位疫苗研制的理论基础 |
| 2 新表位的确定 |
| 2.1 随机肽库技术筛选新表位 |
| 2.2 借助各种预测手段确定新表位 |
| 3 表位肽疫苗设计的优化与修饰 |
| 3.1 "非选择性"辅助T细胞表位的应用 |
| 3.2 氨基酸间隔序列的应用和侧翼序列的优化 |
| 3.3 T细胞表位和B细胞表位的定位 |
| 4 表位的传递 |
| 4.1 脂肽 |
| 4.2 多价抗原肽 |
| 4.3 多表位线形肽 |
| 4.4 受体连接的多肽传递系统 |
| 4.5 靶向多肽类(targeting polypeptides) |
| 5 应用 |
| 5.1 疟疾 |
| 5.2 血吸虫病 |
| 5.3 肿瘤 |
| 6 展望 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 日本脑炎病毒E蛋白多表位基因串联真核质粒的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、细胞及载体 |
| 1.2 主要试剂、工具酶及仪器 |
| 1.3 重组真核表达载体的构建 |
| 1.4 质粒的大量提取 |
| 1.5 重组真核质粒的体外表达与鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2 Western-blot分析结果 |
| 2.3 IFA鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 日本脑炎病毒E蛋白多表位基因在大肠杆菌中的融合表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 表达载体pET-rEP的构建 |
| 2.2 重组载体的酶切鉴定 |
| 2.3 测序结果 |
| 2.4 pET-rEP在大肠杆菌中的表达 |
| 2.5 重组蛋白的纯化及Western blot分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 多表位DNA疫苗和重组蛋白疫苗对Balb/c小鼠的特异性免疫影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 抗体亚型分析 |
| 2.2 免疫动物中和抗体分析 |
| 2.3 免疫小鼠T细胞增殖反应检测结果 |
| 2.4. 细胞因子检测 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 表达日本乙型脑炎病毒E蛋白多表位基因重组腺病毒的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 转移载体pA5-TEP的构建 |
| 2.2 同源重组腺病毒质粒pAd5-TEP的线性化鉴定 |
| 2.3 重组腺病毒的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 重组腺病毒对小鼠特异性免疫的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 抗体亚型分析 |
| 2.2 免疫动物中和抗体分析 |
| 2.3 细胞因子检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 不同的疫苗联合应用对猪的免疫效力研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫动物中和抗体分析 |
| 2.2 细胞因子检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文发表情况 |
四、犬Ⅱ型腺病毒弱毒DNA的酶切分析及分子克隆（论文参考文献）
- [1]嵌合犬冠状病毒N、S基因的重组狂犬病病毒的拯救与鉴定[D]. 周亚花. 中国农业科学院, 2020
- [2]猪伪狂犬病毒变异株gE&TK基因缺失活疫苗的构建与鉴定[D]. 宋增财. 南京农业大学, 2017(05)
- [3]番鸭呼肠孤病毒强弱毒株S基因分子特征分析及感染性克隆载体构建[D]. 崔国杰. 福建农林大学, 2015(01)
- [4]犬细小病毒LAMP检测方法建立及其串联表位卵黄抗体中和效力评价[D]. 关玮琨. 东北农业大学, 2012(03)
- [5]PRRSV GP5与M蛋白重组犬2型腺病毒的构建及其免疫特性研究[D]. 蔡锦顺. 吉林大学, 2010(08)
- [6]表达虎源H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组犬2型腺病毒的构建与鉴定[D]. 刘益新. 四川农业大学, 2010(04)
- [7]含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用[D]. 韩国全. 四川农业大学, 2009(07)
- [8]CDV、CPV、CAV三联DNA疫苗的制备及实验免疫研究[D]. 郑颖. 云南农业大学, 2008(06)
- [9]表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建及免疫试验研究[D]. 袁子国. 吉林大学, 2008(11)
- [10]日本乙型脑炎病毒E蛋白多表位基因串联表达及免疫效力研究[D]. 李鹏. 南京农业大学, 2008(06)