一、人γ干扰素/β肿瘤坏死因子重组杂合蛋白对γ干扰素抗性细胞株的杀伤效应（论文文献综述）
王佳林[1]（2021）在《不同培养体系及不同时间制备的γδT细胞对肺癌A549细胞的杀伤作用》文中研究指明
冯科[2]（2021）在《D-Nap-GFFY水凝胶增强LXR配体抗肿瘤作用的研究》文中进行了进一步梳理背景和目标:肺癌是在全球范围内发病率和死亡率最高的癌症,肺腺癌是肺癌最常见的类型。尽管近年在研究和治疗中取得了巨大进步,但是治疗效果仍有待提高。研究表明,肝X受体（liver X receptor,LXR）被其配体T0901317（T317）激活后,能促进干扰素γ（interferonγ,IFNγ）表达,发挥抗肿瘤作用。然而,LXR同时激活脂质合成基因表达,导致肝脏脂质过度合成和积累,造成脂肪肝及高甘油三酯血症,这些严重副作用限制了LXR激动剂的临床应用。D-Nap-GFFY水凝胶是萘乙酸修饰的D构型氨基酸组成的多肽,能被树突细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞（antigen presenting cell,APC）特异性吞噬,增强免疫反应,具有作为药物载体的优势和潜力。在此项研究中,我们采用D-Nap-GFFY包裹法构建T317的载药系统（D-Nap-GFFY-T317）,通过小鼠皮下注射方式给药,探究D-Nap-GFFY-T317抑制肺腺癌的作用和机制,以及该载药系统能否避免肝脏脂质积累等副作用。方法:用PBS配制D-Nap-GFFY形成水凝胶后,探究D-Nap-GFFY的物理性质,评估D-Nap-GFFY-T317在体内和体外条件下降解和T317释放水平;选用C57BL/6J背景的野生型和IFNγ敲除小鼠,分别以皮下注射小鼠肺腺癌肿瘤细胞LLC1的方式构建移植瘤模型,或者腹腔注射乌拉坦的诱导方式构建原位肺癌模型;分别给予各模型小鼠口服给药T317、皮下注射D-Nap-GFFY-T317的治疗,探究皮下注射D-Nap-GFFY-T317的治疗方式对肿瘤生长以及肝脏脂质合成的影响。结果:D-Nap-GFFY-T317能形成稳定胶体,T317均匀地分散在胶体中。T317的释放依赖于细胞内蛋白酶对D-Nap-GFFY的降解。皮下注射D-Nap-GFFY-T317后,小鼠血液中T317维持较低水平。在肺癌模型小鼠中,与口服T317相比,皮下注射D-Nap-GFFY-T317具有更好的抗癌效果。机制上,D-Nap-GFFY-T317能够激活APC、表达IFNγ,并且以IFNγ依赖的方式增加肿瘤中M1型巨噬细胞数量,减少M2型巨噬细胞数量。此外,D-Nap-GFFY-T317促进树突细胞的成熟和浸润;增加肿瘤中CD3+CD8+T细胞的数量;以依赖IFNγ的方式抑制肿瘤中血管的生成。与口服T317相比,皮下注射D-Nap-GFFY-T317抑制肝脏中脂质合成基因的过度表达,从而消除了T317引起的脂肪肝、高甘油三酯血症等副作用。机制上确认D-Nap-GFFY-T317可被巨噬细胞通过SR-A受体特异性吞噬,从而避免激活肝细胞内LXR。结论:皮下注射D-Nap-GFFY-T317能够特异性地被DC和巨噬细胞吞噬,激活IFNγ表达,抑制肺腺癌发生发展,同时对肝脏没有副作用。这表明水凝胶D-Nap-GFFY包裹T317的新型载药系统有望成为治疗肿瘤的新策略。
靳毅[3]（2021）在《肾透明细胞癌自噬相关多组学预后模型的构建研究》文中研究说明第一部分肾透明细胞癌患者自噬相关基因预后模型的构建目的:通过Cox回归模型构建与总生存相关的肾透明细胞癌（cc RCC）中心基因预后指数,获得自噬相关的临床生物标记物及预后判断模型。方法:从TCGA数据库下载cc RCC数据集,以识别cc RCC患者自噬相关基因（ARGs）的表达。功能富集分析GO和京都基因与基因组百科全书KEGG分析由Metacape数据库构建。中心基因由Cytoscape软件提供。然后,使用Cox比例危险回归模型来识别在cc RCC中与整体生存（OS）显着相关的中心基因cc RCC。然后构建了基于中心基因的预后指数（PI）,并应用单因素、多因素COX及KM生存曲线、多指标ROC等进行验证。结果:PI基于与OS相关的基因构建,并将cc RCC患者依据中位值分为高风险和低风险组,二者具有统计学差异,高风险组生存期明显下降。PI是多变量分析中一个独立的预测因子。小结:1.我们构建的预后指数对于肾透明细胞癌患者的预后具有一定的预测价值。2.在我们构建的预后模型中,风险基因为BECN1、ULK1,保护基因为PINK1、BNIP3、ZFYVE1。3.多因素COX分析显示,基于5种自噬相关m RNA（BECN1、PINK1、ULK1、BNIP3和ZFYVE1）开发的预后模型可以独立于经典TNM分期之外,可能成为临床患者预后预测方法的有力补充。第二部分肾透明细胞癌患者自噬相关lnc RNA预后模型的构建目的:通过联合应用Lasso与Random Forest算法,获得肾透明细胞自噬相关lnc RNA,应用多因素COX构建预后回归模型,并分别在训练集、测试集中进行验证,绘制预后判断列线图及进行GSEA相关通路分析。方法:从TCGA数据库下载cc RCC数据集,分离lnc RNA数据并进行差异分析。识别cc RCC患者自噬相关基因（ARGs）的表达。计算与ARGs共表达的lnc RNA作为自噬相关lnc RNA,联合应用Lasso与Random Forest算法,获得预后相关肾透明细胞自噬lnc RNA,应用多因素COX方法构建预后模型并绘制桑基图。然后在训练集中构建基于lnc RNA的预后指数（PI）,在测试集中进行验证,最后绘制预后判断列线图及GSEA相关通路分析。结果:PI基于与OS相关的lnc RNA构建,并将cc RCC患者依据中位值分为高风险和低风险组,高风险组的生存期明显降低。PI是多变量分析中一个独立的预测因子。获得了8个预后相关lnc NRA（CTD-2023M8.1、LINC00460、PROX1-AS1、RP11-19E11、RP11-191N8.2、AP000439.3、RP11-297L17.2、RP11-133F8.2）。构建了预后相关列线图。GSEA分析结果显示预后模型与PPAR,ERBB,TGF-β,RENAL CELL CARCINOMA通路相关。小结:1.我们利用TCGA-KIRC数据构建了肾透明细胞癌自噬相关lnc RNA预后模型。2.该模型具有可靠的预测效果,在训练集及测试集中均可得到较为满意的结果,可能成为TNM分期的有力补充,指导临床预后的判断。3.利用该模型,我们获得了2类8种lnc RNA,其中风险性lnc RNA 5种,分别为:CTD-2023M8.1、LINC00460、PROX1-AS1、RP11-19E11、RP11-191N8.2保护性lnc RNA3种,分别为:AP000439.3、RP11-297L17.2、RP11-133F8.2。4.我们开发了肾癌自噬相关lnc RNA预后的列线图,该图可以便捷的对患者预后进行预测,并且校准图显示,预测的生存率与实际生存率基本重合。第三部分肾透明细胞癌自噬相关lnc RNA验证目的:在构建了的肾透明细胞癌自噬相关lnc RNA预后模型后,我们最终获得了8种lnc RNA（AP000439.3、RP11-133F8.2、RP11-297L17.2,RP11-19E11.1,RP11-191N8.2,CTD-2023M8.1,PROX1.AS1,LINC00460）。为了结果的可靠性,进行了TCGA-KIRC TNM数据及实验室验证。方法:1.绘制8种lnc RNA在TCGA-KIRC数据中癌旁以及癌症不同TNM分期之间的表达情况图,分析在早期（Ⅰ、Ⅱ期）以及晚期（Ⅲ、Ⅳ期）中,以及肿瘤与正常对照组织中,8种lnc RNA是否存在差异表达;2.应用q RT-PCR检测8种lnc RNA在肾透明细胞癌细胞组织及癌旁组织中的表达情况,研究在组织中是否存在差异表达;3.应用q RT-PCR检测8种lnc RNA在肾透明细胞癌细胞系786-O、Caki-1、ACHN与永生化人肾近曲小管细胞HK-2中的表达情况,研究在细胞系中是否存在差异表达。结果:TCGA-KIRC TNM数据分析显示8种lnc RNA与预后相关,有5种风险性lnc RNA;RP11-19E11.1,RP11-191N8.2,CTD-2023M8.1,PROX1.AS1,LINC00460。3种保护性lnc RNA:AP000439.3、RP11-133F8.2、RP11-297L17.2。除RP11-297L17.2表达在组织及细胞系中均低,其余lnc RNA分析结果与TCGA-KIRC TNM分析数据一致。小结:1.通过TCGA-KIRC TNM分期及组织、细胞系q RT-PCR验证联合分析,7个lnc RNA与肾透明细胞癌预后密切相关,分别为:Linc00460、CTD-2023M8.1、PROX1-AS1、RP11-19E11.1、RP11-191N8.2和AP000439.3、RP11-133F8.2。2.其中Linc00460、CTD-2023M8.1、PROX1-AS1、RP11-19E11.1、RP11-191N8.2为疾病的风险因子,AP000439.3、RP11-133F8.2为疾病的保护因子。3.我们的预后模型筛选出来的lnc RNA在TCGA-KIRC独立的TNM数据中得到了很好的验证。4.新筛选出来的2种lnc NRA CTD-2023M8.1、RP11-19E11.1之前未见报道,可能成为新的肾透明细胞癌预后标志物。
余世龙[4]（2020）在《锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理背景肺癌目前仍然是位居全球肿瘤发病率和死亡率首位的恶性肿瘤。组织类型上肺癌分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）,其中,NSCLC占肺癌总类型的80-85%,肺腺癌是NSCLC的主要病理类型。近年来尽管以EGFR-TKIs为代表的靶向治疗和以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫治疗将具有相应驱动基因的晚期NSCLC患者生存期提高到了25-30月,远远超越了传统化疗的8-10月,但因获益人群的局限性,以铂类抗癌药物为主的联合化疗仍然是大部分NSCLC患者首选的一线治疗方案,特别是不适合分子靶向治疗或免疫治疗的NSCLC患者、分子靶向治疗或免疫治疗失败的NSCLC患者以及术后需要辅助化疗的I-IIIa期NSCLC患者。顺铂（DDP）是铂类药物中最常用的化疗药物。顺铂对早期肺癌的抑制作用显着,但在短期缓解之后,几乎对顺铂治疗有效的患者都会相继出现多药耐药、复发和进一步转移等恶性进展,导致化疗失败,成为提高临床肺癌治疗效果的一大瓶颈。三十多年来,研究者对肺癌的顺铂耐药进行了大量研究并获得了重要成果,但顺铂诱导的肿瘤耐药表现出极其复杂的多因素性,其中一个严峻的现实是,针对目前已知的顺铂耐药机制研发的小分子药物并没有达到预期的临床抑癌效果。因此,进一步深入挖掘顺铂诱发的肺癌耐药机制是当前亟待解决的重要课题。为了进一步探讨NSCLC获得性耐药机制,本研究在前期成功建立人NSCLC耐药细胞A549/DDP的基础上开展相关研究,具体研究内容如下:1)NSCLC获得性多药耐药细胞A549/DDP鉴定;2)耐药相关基因的筛选和鉴定;3)ZNF300与NSCLC恶性进展;4)ZNF300促进NSCLC耐药和恶性进展的分子机制;5)淫羊藿苷和全反式维甲酸增强顺铂对肿瘤耐药细胞杀伤作用的机制。本研究将为寻找肿瘤耐药新靶点,逆转NSCLC耐药提供理论和实验依据。方法1)DDP处理A549和A549/DDP细胞后,采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位（MMP）,ATP试剂盒测定细胞内ATP含量以及DCFH-DA探针标记法检测细胞内氧自由基（ROS）,以比较DDP对两种细胞线粒体功能的影响,并用流式细胞术检测DDP诱导的细胞凋亡。采用CCK8药敏实验检测五种化疗药物对两组细胞的IC50值,鉴定NSCLC耐药细胞的多药耐药性。2)以差异倍数|FC|≥3为标准筛选基因表达谱芯片（A549/DDP vs.A549）中差异表达基因,并把该数据和DNA甲基化芯片数据进行整合,筛选候选基因,尔后采用RT-PCR验证潜在侯选基因表达情况。RT-PCR和WB进一步验证候选基因在五种肺癌细胞株及其耐药株中的表达水平。BSP法检测三株NSCLC细胞及其耐药株中ZNF300启动子甲基化水平,WB检测5-Azacitidine和Belinostat处理后各细胞中ZNF300水平。3)重组慢病毒过表达或沉默相应细胞中靶基因表达后,CCK-8试剂检测五种化疗药物对各种细胞IC50。流式细胞术检测不同浓度DDP诱导下各组细胞的凋亡情况。建立免疫缺陷鼠移植瘤模型,体内验证靶基因对NSCLC肿瘤细胞耐药性的影响。4)Transwell小室实验检测各组细胞侵袭能力,划痕愈合试验检测各组细胞迁移能力,失巢凋亡实验评估各组细胞集落形成能力和抗失巢凋亡能力,Ed U染色检测各组细胞增殖率,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期,鬼笔环肽染色激光共聚焦观察细胞骨架形态。从Oncomine、Betastasis和Biogps等生物信息数据平台下载靶基因表达数据,分析靶基因与NSCLC临床特征之间的相关性。免疫组化法检测靶基因在肺癌标本中的表达水平,并分析其临床特点相关性。5)GO、KEGG和GSEA确定表达谱芯片中与耐药细胞表型改变相关的信号通路（A549-ZNF300 vs.A549-ZNF300-NC）,WB验证相关通路核心蛋白表达。使用通路抑制剂和激动剂体外验证靶基因调控NSCLC耐药和恶性进展的分子机制。6)ICA、ATRA和DDP处理时,高内涵系统动态观察共培养细胞。WB检测药物处理后各组细胞的CD235a和CD61表达水平,SA-β-GAL染色检测药物处理后各组细胞衰老情况。RT-PCR检测DDP对衰老基因和SASP相关基因表达影响。结果1)DDP处理后,A549/DDP细胞MMP改变、ROS水平显着低于A549细胞（p<0.05）,而ATP含量显着高于A549细胞（p<0.05）。DDP诱导A549/DDP细胞的凋亡显着低于A549细胞（p<0.05）。顺铂、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、培美曲塞对A549/DDP细胞的IC50显着高于A549细胞（p<0.05）。2)A549/DDP和A549细胞的表达谱芯片数据和甲基化数据整合后,初步筛选出140个候选基因,其中包括77个启动子低甲基化上调表达基因和63个启动子高甲基化下调表达基因。RT-PCR结果显示,15个启动子低甲基化基因的表达上调,25个启动子高甲基化基因的表达下调。候选基因ZNF300在A549/DDP、H520/DDP和H1650/DDP细胞中的水平显着高于相应亲代细胞。5-Azacitidine处理后ZNF300在上述三种耐药细胞的亲代细胞中表达显着性升高。3)成功建立ZNF300过表达细胞（A549-ZNF300）和低表达细胞（A549/DDP-sh ZNF300）。五种化疗药物对ZNF300高表达细胞的IC50显着高于ZNF300低表达细胞（p<0.05）。顺铂诱导ZNF300高表达细胞的凋亡显着性低于ZNF300低表达细胞（p<0.01）。DDP处理后,ZNF300低表达细胞形成的皮下移植瘤比ZNF300高表达细胞的重量和体积显着缩小,证明ZNF300促进NSCLC肿瘤细胞耐药形成。4)体外实验表明,耐药细胞的侵袭、迁移、集落形成和抗失巢凋亡能力均显着强于药敏细胞（p<0.05）,耐药细胞的细胞增殖率显着低于药敏细胞（p<0.05）。相比药敏细胞,耐药细胞出现细胞周期阻滞（p<0.05）,且具有更明显的细胞伪足。生物学信息分析结果表明,ZNF300与NSCLC恶性进展有关。免疫组化结果提示,ZNF300高表达与NSCLC患者病理分级、临床分期、术前淋巴结转移、区域性转移和复发呈正相关,与患者OS呈负相关。5)与A549-ZNF300-NC细胞相比,A549-ZNF300细胞中大部分与生长分化因子和MAPK/ERK通路相关的基因（CD61,CD235a,p-ERK1/2,p-p38 MAPK）表达下调,而大部分与细胞周期和癌症干性相关的基因（PCNA,p15,Nanog,Oct-4）表达上调。AZD6244处理ZNF300低表达细胞后,p-ERK1/2、p-p38 MAPK和CD61下降,而p15和Nanog增加,细胞迁移、侵袭、抗凋亡和顺铂耐受性显着增强,细胞增殖减弱。而Hesperetin对ZNF300高表达细胞的作用相反。6)与药敏细胞相比,ICA和ATRA能上调耐药细胞中CD235a和CD61水平。细胞共培养发现,耐药细胞对顺铂联合ATRA或ICA的反应比药敏细胞更明显。ICA和ATRA作用下,耐药细胞被药敏细胞吞噬的比例显着高于药敏细胞被耐药细胞吞噬的比例。DDP、ICA和ATRA药物处理后,耐药细胞中SA-β-GAL阳染率明显高于药敏细胞,并且,耐药细胞中衰老相关基因和SASP相关基因的表达显着性高于药敏细胞。结论1)ZNF300是NSCLC耐药相关基因。2)ZNF300可促进肿瘤细胞恶性生长,其高表达预示NSCLC患者预后不良。3)ZNF300通过抑制MAPK/ERK信号通路调控耐药细胞缓慢周期表型和细胞分化。4)ZNF300通过抑制WEE1/MYT1和调控MYC/AURKA/BORA/PLK1信号轴激活CDK1从而调节耐药细胞的细胞周期。5)ICA和ATRA通过诱导细胞分化提高DDP对耐药细胞抑癌作用。
柳颖[5]（2020）在《杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制》文中认为目前,农药残留问题仍然是食品安全领域的焦点问题,迫切需要建立快速、可靠的残留分析方法。免疫分析方法以其灵敏度高、检测迅速、易操作等特点,在快速诊断领域占有巨大市场。杂交瘤细胞作为制备免疫分析法的核心元件单抗的主要工程细胞,具有制备技术成熟、抗体表达量多、抗体特异性高等优势。本研究对体外培养条件下,杂交瘤细胞表达农药特异性抗体及其调控机制进行探究,为提高杂交瘤细胞的稳定性以及抗体表达量提供理论基础。研究内容与结果:（1）以百菌清（BJQ）特异性杂交瘤细胞为研究对象,表征了培养过程中出现不分泌特异性抗体的转阴现象,表现为增殖加快、不表达抗体轻链和/或重链蛋白,并对抗体基因及其转录表达进行比对分析,发现阴性细胞特异性抗体基因序列丢失或未丢失但表达量显着下调。（2）选择BJQ抗体基因表达量显着下调的对数生长期的D4细胞株与阳性细胞株E2进行转录组比较分析,发现D4癌基因Pet2上调,抑癌基因Lrig1下调;RNAi验证发现与囊泡转运相关基因Vapa、浆细胞分化关键因子Prdm1以及转录因子Foxb1与抗体表达显着相关。（3）利用CRISPR library对百菌清杂交瘤细胞进行全基因组基因编辑,利用农药压力筛选和流式分选方式对CRISPR敲除细胞文库进行抗体表达升高和降低的全生长周期细胞筛选,对富集的功能基因进行分析和归纳:调控杂交瘤细胞抗体表达的主要“油门”基因为抑癌基因Hivep3、Lrig1,MAPK通路基因Grap、Kras,转录调控因子Cebpb、Foxb1、Prdm1、Prdm2、Pax5,囊泡转运相关蛋白Rab12、Vapa、Vapb;主要“刹车”基因为促癌基因Pet2、Rad51、Rad50、Wnt2、Relb,抑制凋亡的基因Ucp2、Perp,促进周期进程的基因cdc25b、Id1、Plk2、Cdkl2,细胞周期进程中的周期蛋白和激酶,胞间信号传导相关的基因Rabgef1,MAPK及上游受体通路基因Rgs4、Gapt、Ralb、Rasef,PI3k/Akt通路中的基因Akt3。其中Foxb1、Prdm1、Vapa为si RNA干扰验证基因,与抗体表达成显着正向关,Pet2、Ccnd2为sh RNA干扰验证基因,与抗体表达呈显着负相关;并通过Erk/MAPK信号通路调控细胞周期和抗体基因表达。（4）对百菌清免疫各阶段的小鼠脾脏细胞进行转录组分析,发现百菌清刺激后,B细胞激活、增殖和分化为浆细胞的过程主要通过BCR级联的Ras-Erk/MAPK信号通路,启动细胞生长及抗体基因表达,与杂交瘤细胞主要通路一致。（5）对杂交瘤细胞抗体表达及调控机制进行归纳:杂交瘤细胞融合了B细胞表达特异性抗体的基因功能及SP2/0细胞不断增殖分裂的功能,在体外培养阶段两者同步进行并互相制约,通过Erk/MAPK通路及上下游相关调控因子进行细胞生长及抗体表达的调控;平台生长期细胞增殖的抑制可以促进抗体的表达,而因基因突变导致的细胞增殖异常加快会抑制抗体的表达。本研究表征了杂交瘤细胞抗体基因及其表达的多样性,探讨了百菌清特异性杂交瘤细胞抗体的表达及调控机制,明确了主要关键调控因子和信号通路,该研究为进一步提高杂交瘤细胞特异性抗体表达的稳定性及产量提供一定的理论基础。
魏家玮[6]（2020）在《结核分枝杆菌Cas1和RNA结合蛋白在结核致病及免疫逃逸中的作用》文中进行了进一步梳理研究背景:结核是由结核分枝杆菌引起的一种严重的传染性疾病,至今为止它仍然是全球十大致死原因之一,同样也是单一传染源导致的感染性疾病中最主要的死因。目前结核治疗中面临的两大最主要困难是治疗过程中的结核耐药和结核免疫逃逸,正是这两大因素导致结核治疗困难、化疗程长且容易复发。我们通过研究结核分枝杆菌CRISPR-Cas系统中一个关键蛋白Cas1和结核感染过程中诱导机体产生的RNA结合蛋白,探讨结核治疗中耐药发生的机制及逃避机体初级免疫的机制。研究方法:1.我们通过收集来自重庆医科大学附属第一医院初次确诊肺结核,且痰培养阳性的临床分类结核样本,通过PCR检测其Cas1基因及其侧翼序列的缺失情况。2.利用分枝杆菌噬菌体D29感染BCG构建共感染模型,利用高通量测序技术检测BCG受到分枝杆菌噬菌体D29感染后的CRISPR插入序列的变化情况,研究CRISPR-Cas在分枝杆菌噬菌体抵抗中的作用。3.构建分枝杆菌穿梭质粒在M.smegmatis中异源性表达结核分枝杆菌Cas1蛋白。4.通过H2O2,SDS和酸化培养基模拟环境压力条件,分别计算重组M.smegmatis在不同压力条件下生存率的变化情况,研究结核分枝杆菌Cas1蛋白对环境压力应激的影响。5.利用刃天青微量滴定法,研究Cas1蛋白对重组M.smegmatis抗生素敏感性的影响。6.利用体外表达纯化的结核分枝杆菌RpfE,通过计算复苏指数RI,研究Cas1蛋白对抗生素压力下的重组M.smegmatis滞留状态的影响。7.分别利用DNA损伤剂顺铂和丝裂霉素C诱导重组M.smegmatis产生DNA损伤,研究Cas1蛋白对重组M.smegmatis DNA损伤修复的影响。8.通过转录组测序,分析Cas1蛋白影响重组M.smegmatis DNA损伤修复可能的分子机制。9.利用体外表达纯化的结核分枝杆菌Cas1蛋白,与来源于结核分枝杆菌CRISPR插入序列的300bp双链DNA和CRISPR间隔序列来源62bp的双链DNA相互作用,研究其DNA结合活性和DNA酶切活性。10.通过Zfp36+/-和Zfp36 flox/flox转基因鼠杂交,得到髓系细胞选择性Zfp36基因敲除的转基因鼠。11.使用Mtb/BCG感染小鼠骨髓巨噬细胞,通过WB和qt-PCR研究结核感染如何诱导RNA结合蛋白TTP在巨噬细胞中表达。12.利用髓系细胞选择性Zfp36基因敲除的小鼠巨噬细胞,并以BCG为替代模型,感染小鼠巨噬细胞,通过qt-PCR研究TTP对感染巨噬细胞细胞因子谱产生的影响。13.分别利用氢-3标记的尿嘧啶掺入BCG生长抑制试验和BCG侵染巨噬细胞菌落形成单位测定,研究TTP对巨噬细胞抑菌作用和杀菌作用的影响。14.利用Zfp36基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞,利用血清剥夺和雷帕霉素诱导自噬,通过WB检测微管相关蛋白轻链3,免疫荧光染色探测细胞内自噬小体的形成,研究TTP对自噬过程的影响。15.分别使用MAPK抑制剂SB203580,mTOR通路阻断剂雷帕霉素、AZD8055和PP242研究mTOR通路对TTP转录和表达的影响。并进一步利用λ蛋白磷酸酶去除TTP的磷酸化修饰,研究mTOR通路对TTP磷酸化修饰的影响。16.通过利用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺阻断蛋白合成,研究mTOR通路对TTP蛋白稳定性的影响。17.通过利用蛋白酶体抑制剂MG132阻断泛素-蛋白酶通路介导的蛋白降解作用,研究mTOR-泛素-蛋白酶体通路在调节TTP蛋白稳定性中起到的作用。18.通过免疫共沉淀法研究TTP蛋白的泛素化修饰作用。研究结果:1.35株临床分离的结核分枝杆菌样本中,20例（57.14%）出现Cas1基因的缺失及其侧翼序列的改变。2.分枝杆菌噬菌体D29并不能完全杀灭体外培养的BCG,侵染30天后对BCG的CRISPR序列高通量测序,插入序列中检测不到与D29基因组相匹配的序列。3.通过转染分枝杆菌穿梭质粒,结核分枝杆菌的Cas1蛋白能够在重组M.smegmatis中异源性表达。4.表达Cas1的重组M.smegmatis的形态和生长情况发生变化,表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照菌落形态更加光滑及湿润,并且在液体培养基中也更容易聚集成团,电镜下表面皱劈更少。表达Cas1蛋白的重组M.smegmatis相对于空载体对照生长更缓慢,达平台期时间更长,但是达到平台期以后的OD600值更高,平台期的细菌密度更大。5.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照在H2O2,SDS和酸化培养基模拟的环境压力下生存率更低。6.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照对利福平、乙胺丁醇和左氧氟沙星的敏感性提高,但对链霉素敏感性影响不大。7.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照在半致死剂量的利福平、乙胺丁醇和左氧氟沙星抗生素压力下,进入滞留状态的细菌更少。8.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载对照对顺铂和丝裂霉素C诱导产生的DNA损伤更加敏感。9.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载对照其DNA损伤修复相关基因表达明显下调,其中包括主要RuvAB复合物、重组蛋白F、核酸内切酶IV、ATP依赖的DNA螺旋酶、尿嘧啶DNA糖苷酶、重组酶A、重组调节蛋白RecX、DNA修复ATP酶、DNA修复外切酶、烷基化DNA修复蛋白、DNA修复蛋白RadA、DNA完整性扫描蛋白DisA、核酸内切酶Ⅲ和DNA聚合酶IV。10.重组结核分枝杆菌Cas1蛋白体外表现出金属离子依赖的DNA酶活性。11.通过Zfp36+/-和Zfp36 flox/flox转基因鼠杂交,能使TTP在小鼠巨噬细胞中选择性敲除。12.Mtb和BCG感染均可诱导小鼠巨噬细胞产生TTP,选择性删除TTP蛋白的巨噬细胞受到感染后能产生更多促炎细胞因子,巨噬细胞杀菌作用增强,BCG在巨噬细胞内生长被抑制。13.TTP能够抑制小鼠胚胎纤维细胞在血清剥夺诱导下的自噬发生,但对雷帕霉素诱导的自噬效果不明显。14.BCG感染能够激活小鼠巨噬细胞mTOR通路,MAPK抑制剂SB203580和mTOR通路抑制剂雷帕霉素、AZD8055以及PP242能够抑制BCG感染引起的巨噬细胞TTP表达。15.mTOR通路抑制剂能加速TTP在巨噬细胞内降解。蛋白酶体抑制剂MG132能阻断mTOR抑制导致的TTP降解。16.mTOR通路是通过泛素化-蛋白酶体依赖途径来调节TTP的细胞内降解,mTOR通路抑制剂雷帕霉素能加速TTP的泛素化从而促进其蛋白酶体途径的降解。研究结论:1.分枝杆菌对其噬菌体的抗性可能并不主要依赖于CRISPR-Cas系统介导的插入序列而获得的。2.Cas1的丢失对结核分枝杆菌的环境压力抵抗、DNA修复以及抗生素耐药可能产生广泛的影响,这可能是不含Cas1基因的结核杆菌北京家系在特定地区高流行的原因。3.Mtb/BCG感染巨噬细胞后能诱导细胞产生RNA结合蛋白TTP,从而抑制感染巨噬细胞的杀菌作用,达到逃避初级免疫杀灭的目的。4.TTP的稳定性受到mTOR-泛素化-蛋白酶体通路的调节,mTOR抑制剂通过促进TTP泛素化从而加速其蛋白酶体途径的降解,增强巨噬细胞的杀菌作用。
陈聪[7]（2020）在《c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究》文中进行了进一步梳理目的:设计靶向c-Met的嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）,验证其在胃癌中的有效性及安全性,并对c-Met CAR进行PD1/CD28融合受体优化以改善免疫抑制,提高抗肿瘤效果。方法:使用生物信息学的方法分析TCGA中胃癌数据的c-Met表达情况及其与生存预后的关系。收集手术患者的胃癌肿瘤及癌旁组织标本,用免疫组化的方法检测c-Met的表达。并用PCR、WB、流式细胞计数等方法检测6种不同胃癌细胞系c-Met、PD-L1的基因和蛋白表达情况。构建c-Met CAR和cMet-PD1/CD28 CAR质粒,包装慢病毒、感染T细胞,制备对应的CAR-T。在体外细胞实验中,检测CAR-T细胞不同亚群和表型的变化,及靶细胞刺激对CAR-T激活和PD-1表达的影响。检测CAR-T的细胞因子分泌水平,并通过乳酸脱氢酶释放实验、7-AAD染色、CD107a脱颗粒反应等方法反映c-Met CAR-T、cMet-PD1/CD28 CAR-T对靶细胞的杀伤能力。在体内动物模型中,通过活体小动物成像等方法观测两种CAR-T对小鼠胃癌皮下移植肿瘤的作用,并通过HE染色的方法检测两种靶向c-Met的CAR-T对小鼠正常器官的脱靶毒性。结果:TCGA数据库和胃癌标本免疫组化结果均显示胃癌组织高表达c-Met,c-Met表达较高的胃癌患者的预后较差。通过PCR、WB、FCM等方法筛选出c-Met表达最高的胃癌细胞系MKN-45和最低的细胞系HGC-27,作为实验细胞,并使HGC-27过表达c-Met构建HGC27-OE作为阳性对照。相对于转染空载体质粒的Mock T,c-Met CAR-T细胞的CD3+CD8+亚群和CD62L+CCR7+中央记忆表型增多,PD1/CD28融合受体结构能够进一步增加CAR-T的CD62L+CCR7+中央记忆细胞的比例,但却未明显改变CD4+、CD8+T细胞亚群。靶细胞的刺激可以使c-Met CAR-T的PD-1表达升高,CD69+、CD71+激活表型增多。相对于Mock T,c-Met CAR-T与靶细胞共培养后能够分泌更多的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10等细胞因子,CD107a脱颗粒反应和对靶细胞的杀伤能力均明显提高,且其杀伤活性依赖于靶细胞c-Met的表达。PD1/CD28融合受体结构能够进一步增强c-Met CAR-T对c-Met阳性胃癌细胞的杀伤能力,此外,还可以降低炎性因子IL-6的释放水平。c-Met CAR-T对小鼠皮下移植胃癌模型肿瘤的生长具有明显的抑制作用,并且对小鼠正常的胃、小肠、心、肝、脾、肺、肾等重要器官没有明显的脱靶毒性。PD1/CD28融合受体结构还能进一步增强c-Met CAR-T的远期抗肿瘤效果。结论:c-Met CAR-T对高表达c-Met的胃癌细胞具有良好的杀伤活性,能够明显抑制c-Met阳性胃癌肿瘤的生长,且对正常器官没有严重的脱靶毒性。PD1/CD28融合受体结构能够通过逆转PD-1免疫抑制信号,进一步增强c-Met CAR-T的抗肿瘤能力,并且可以减少c-Met CAR-T炎性因子IL-6的分泌,降低细胞因子释放综合征的发生率,具有更高的安全性。
张垚[8]（2020）在《CHO-hIL21细胞株的构建及其持续性分泌对NK细胞体外扩增的影响》文中提出背景与目的噬血细胞综合征（hemophagocytic syndrome,HPS）,也称噬血细胞淋巴组织细胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH）,是一种复杂且罕见的高炎症反应性综合征。HLH的发病迅速,病情危重,预后差,急性发作时自然杀伤（NK）细胞的数量往往显着减少,活性降低,其发病机制与NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的穿孔素依赖的细胞毒作用缺陷导致T淋巴细胞和巨噬细胞的过度增殖和活化、细胞因子大量释放（俗称细胞因子风暴）有关,因此,NK细胞作为HLH疾病发生发展过程中的重要机制细胞,已然已经成为研究该疾病相关机制的重要载体细胞。同时,NK细胞是CD3-CD56+CD16+为特征的细胞群,是先天性免疫细胞,可以识别和杀伤不受主要组织相容性复合体（MHC）限制或未致敏的异常细胞,被认为是体内监测和清除病变细胞最有效的免疫细胞亚群。因此,目前NK细胞作为免疫治疗的关键性细胞已成为研究热点,备受关注。然而NK细胞仅占正常人外周血单个核细胞（PBMC）的5%-10%,其体外扩增培养难度较大。目前的研究表明,白介素（IL）-2、IL-4、IL-9、IL-15和IL-21等细胞因子在体外扩增NK细胞方面发挥一定的作用。IL-21属于IL-2家族,是一种常见的γ链细胞因子,由活化的CD4+T细胞表达,在NK细胞激活、成熟和增殖中起着重要作用。在人体内,IL-21对NK细胞有刺激增殖作用,通过增加穿孔蛋白和颗粒酶B的表达,刺激NK细胞的细胞毒活性。已有研究证明,IL-21联合IL-2和IL-15共同作用,可对NK细胞增殖、细胞毒活性和IFN-γ的产生均具有正向效应。鉴于NK细胞作为肿瘤免疫具有巨大应用潜力的免疫细胞,加之其在HLH发病机制中扮演重要的角色,对其体外扩增,增强其抗肿瘤活性及深入研究HLH发病机制等均是当前研究的课题。已有多种培养体系被用于体外扩增,大多采用间隙性添加NK生长因子如IL-2、IL-15、IL-21及某些靶抗原如与K562细胞共孵育等,但均存在一定的问题。一些研究提示,NK细胞虽能扩增,但杀伤活性降低了;或虽能保持或增加杀伤活性,但扩增效率降低了。咎其原因,可能与培养体系不完善,间隙性添加NK生长因子为脉冲式提供NK细胞生长刺激,与生理状态明显不同有关。我们假设:如采用能持续分泌IL-21的细胞株作为饲养细胞,用于体外扩增NK细胞有可能解决其体外扩增效率并保持其杀伤活性的问题。本研究拟构建CHO-hIL21细胞株,探讨其持续分泌的IL-21为主的培养体系对NK细胞的体外扩增及杀伤功能的影响。本研究内容包括以下两部分进行:（1）CHO-hIL-21细胞株的建立及表达;（2）CHO-hIL21对NK细胞的影响。方法1. CHO-hIL21细胞株的建立及表达1.1 pLenti-IL-21慢病毒过表达载体的构建。查阅资料,检索Pubmed Genebank,查找IL-21基因序列,阅读框总长为489 bps,根据质粒构建要求,阅读框两端设计酶切位点Bam H I,连同酶切位点及阅读框序列,总长为501 bps,送公司进行全基因合成,以pLenti质粒载体合成返回。返回的质粒经过涂菌、挑克隆、摇菌、测序验证基因序列。1.2 转染CHO确定IL-21的表达。抽提pLenti-IL-21转染级质粒,脂质体法（Roche试剂）转染CHO细胞,24h后加入杀稻瘟菌素（Blasticidin）进行筛选并维持至最佳浓度,48h后收集培养基上清,利用流式细胞微球阵列检测（CytometricBead Array,CBA）技术检测IL-21的表达。1.3慢病毒包装。大量抽提穿梭质粒pLenti、pLenti-IL-21及包装质粒PSPAX2、Pmd2g,脂质体法（Lipofectamine 3000试剂）转染至293T细胞,收集上清,离心过滤,浓缩,有限稀释法测病毒滴度。1.4慢病毒感染CHO细胞。上述包装完整的慢病毒感染CHO细胞,同时加入Polybrene（终浓度为5μg/ml）增强感染效率,感染72h加入杀稻瘟菌素进行筛选。通过有限稀释法多次克隆化观察荧光强度和CBA技术检测IL-21浓度筛选出CHO-hIL21细胞株。1.5 IL-21的基因表达和蛋白表达鉴定。抽提CHO-hIL21细胞的RNA,并逆转录为c DNA,RT-PCR法检测CHO-hIL21细胞中是否有IL-21基因表达;一抗rabbitanti-IL-21 antibody,二抗goat anti-rabbit FITC,免疫荧光法检测CHO-hIL21细胞中是否表达IL-21蛋白。2.CHO-hIL21对NK细胞的影响。流式细胞术检测正常NK细胞对K562细胞的靶向杀伤能力。CCK-8实验检测Mitomycin C抑制CHO-hIL21细胞增殖的最佳浓度,Mitomycin C处理CHO-hIL21细胞,抑制细胞增殖,和NK细胞共培养,细胞计数仪计数NK细胞增殖能力,流式细胞术检测IL-21对NK细胞杀伤功能的影响,流式CBA技术定量检测NK细胞在IL-21介导下,Th1/Th2细胞因子水平的变化。结果1.CHO-hIL21细胞株的建立及表达1.1 pLenti-IL-21慢病毒过表达载体的构建。通过查阅相关资料和文献,确定IL-21基因序列,委托公司合成,测序结果进行基因序列比对,显示与设计序列完全一致,表明pLenti-IL-21慢病毒过表达载体构建成功。1.2转染CHO确定IL-21的表达。瞬时转染CHO细胞并定量检测IL-21浓度,结果显示,IL-21的分泌量可达800 pg/ml以上,提示质粒构建正确。1.3 慢病毒包装。成功包装了含IL-21目的基因的慢病毒过表达载体,收集病毒上清并浓缩50倍,滴度测定结果显示pLenti-IL-21滴度为4×108/ml,pLenti滴度为4.5×108/ml。1.4 慢病毒感染CHO细胞。慢病毒成功感染CHO细胞,多次克隆化筛选及流式CBA法定量检测结果显示,每次克隆化后IL-21浓度均呈倍数增加,最高可达3721.13pg/ml,从而确定稳定表达IL-21的CHO-hIL21细胞株。1.5 IL-21的基因表达和蛋白表达鉴定。RT-PCR法结果显示IL-21的条带大小（接近300 bps）与预期结果（298 bps）相符,提示筛选后的CHO-hIL21细胞中成功转入了pLenti-IL-21质粒;免疫荧光法结果显示,实验组在488nm激发光激发下的GREEN荧光场中有绿色荧光蛋白表达,空载组则无,提示筛选后的CHO-hIL21细胞中IL-21蛋白成功表达;Western-blot检测结果显示IL-21蛋白条带在15-20KDa之间,与IL-21分子量18KDa相符,同样表明筛选后的CHO-hIL21细胞中IL-21蛋白成功表达。2. CHO-hIL21对NK细胞的影响CCK-8实验结果显示,Mitomycin C对CHO细胞的最佳抑制浓度为10μg/ml,CHO-hIL21经Mitomycin C抑制后,检测细胞因子IL-21的分泌持续升高,提示Mitomycin C抑制CHO-hIL21扩增后短期内IL-21的分泌逐步升高,可达4842±444.3 pg/ml;CHO-hIL21和NK细胞共培养结果显示,PBMC中NK细胞无扩增,纯化的NK细胞扩增效率较低,且低于重组人IL-21+IL-2组（P<0.01）。和单独IL-2培养相比,培养至第9天,NK细胞存活率较高（P<0.05）。细胞因子水平结果显示,PBMC中的IL-6水平明显增高（P<0.001）,纯化的NK细胞中仅IL-21+IL-2组IFN-γ水平轻微升高（P<0.05）。而在杀伤活性方面共培养前后无任何变化。结论1.成功构建人源IL-21的慢病毒过表达载体;2. 成功构建并筛选出高表达IL-21的CHO-hIL21细胞株;3. CHO-hIL21持续分泌可致PBMC中的NK细胞在培养过程中细胞因子IL-6水平显着增高;4. CHO-hIL21持续分泌对NK细胞的扩增能力较弱,但能提高NK细胞的存活率。
赵月涛[9]（2019）在《EZH2在非小细胞肺癌PD-L1表达调控中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景及目的肺癌是全世界发病率最高也是死亡率最高的癌症。肺癌大致可以分为小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）两大类,其中NSCLC约占80%85%。尽管得益于手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等方面的不断突破,NSCLC的早期诊断和治疗均取得一定成果,但总体的生存率、尤其是晚期NSCLC患者的生存率仍面临极大挑战。因此,进一步深入的阐明肺癌的发病机制,探索新的治疗靶点仍十分迫切。研究表明,免疫逃逸是肿瘤发生、发展的重要机制,并可大致分为两个方面,源于肿瘤细胞自身的逃逸机制和源于肿瘤微环境中免疫细胞的逃逸机制。PD-1/PD-L1信号通路的激活是肿瘤免疫逃逸的重要机制。T细胞表面的PD-1（程序性死亡受体-1,Programmed cell death-1）与肿瘤细胞表面的PD-L1（程序性死亡配体1,Programmed death-ligand 1）结合后可使下游TCR信号通路的多个关键分子发生去磷酸化,从而传递抑制性信号,阻碍T细胞的增殖和活化、促进肿瘤细胞的免疫逃逸。目前,基于阻断PD-1/PD-L1信号通路的免疫检查点疗法在癌症治疗中取得了一定的疗效。然而,大量临床试验结果显示,使用PD-1/PD-L1抑制剂单药治疗的客观应答率仍然较低。因此进一步深入探讨NSCLC细胞PD-L1的表达调控机制有利于进一步阻断PD-1/PD-L1信号通路的活化,改善免疫治疗效果。PD-L1的表达调控主要存在―内源性‖和―外源性‖两大通路。其中,原癌基因突变或缺失导致的PD-L1表达持续上调是―内源性‖调控的主要机理。另一方面,肿瘤细胞所处的特定微环境是PD-L1高表达的―外源性‖促进机制。比如在低氧环境中,上调的低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）可通过结合PD-L1启动子的低氧反应元件促进PD-L1的表达。但目前,NSCLC中PD-L1的表达增多的内在分子机制尚不完全清楚,因此深入阐明NSCLC细胞PD-L1基础表达水平过高的分子机制,有望从―源头‖上抑制PD-L1的表达。Zeste增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2,EZH2）是一种重要的表观遗传学调控分子,具有组蛋白甲基转移酶活性,可催化组蛋白H3第27位的赖氨酸三甲基化,从而介导基因沉默。EZH2在多种肿瘤组织中过度表达,且其抑制剂在早期临床试验中取得了较好的疗效,表明该蛋白是一种潜在的治疗靶点。目前,EZH2参与NSCLC发生发展的机制尚不完全清楚。EZH2的下游信号通路十分广泛,并可抑制T辅助因子1（Th1）型趋化因子CXCL9和CXCL10的产生,从而在人类卵巢癌中建立免疫抑制微环境。因此,有必要研究EZH2是否参与NSCLC的免疫抑制,且该过程是否与NSCLC细胞PD-L1的表达存在关联。综上所述,本课题拟通过下载TCGA数据库中肺癌的基因芯片数据并收集NSCLC患者组织样本,检测并分析EZH2在NSCLC组织中的表达情况及其与PD-L1表达和患者预后的相关性。结合体内和体外实验抑制EZH2以探究EZH2对非小细胞肺癌PD-L1表达的影响及其内在的分子调控机制。研究方法1.EZH2在非小细胞肺癌组织中表达及与PD-L1表达和患者预后的相关性分析。在线下载TCGA数据库中肺癌的基因芯片数据,分析EZH2在肺癌及正常肺组织中的表达情况;收集NSCLC患者组织样本,采用qPCR技术检测EZH2在癌组织及正常组织中的表达;通过ProgGene V2和Kaplan-Meier绘图仪分析EZH2与肺癌患者预后的关系;结合GEO DataSets中肺癌基因芯片结果及非小细胞肺癌组织的qPCR检测分析EZH2表达水平与PD-L1表达的相关性,以此揭示EZH2在NSCLC中的表达情况及其与PD-L1表达和患者预后的关系。2.体外分析EZH2对非小细胞肺癌PD-L1表达的影响。分别采用sh-EZH2慢病毒敲低和EZH2抑制剂GSK343抑制小鼠肺癌细胞株LLC中EZH2的表达后,流式细胞、qPCR等检测肺癌细胞PD-L1表达水平变化。通过上述体外实验验证EZH2对非小细胞肺癌细胞PD-L1表达的影响。3.体内验证EZH2的抑制对非小细胞肺癌PD-L1表达及肿瘤免疫反应的影响。EZH2稳定敲低的LLC细胞皮下注射C57小鼠,荷瘤后观察肿瘤的生长以及体积重量,并通过流式细胞分析等检测非小细胞肺癌PD-L1的表达及肿瘤免疫反应变化。4.EZH2调控非小细胞肺癌细胞PD-L1表达的机制研究。通过qPCR、流式分析EZH2敲低后LLC中HIF-1α表达水平的变化以明确EZH2对非小细胞肺癌HIF-1α的调控作用。进而通过缺氧刺激上调LCC中HIF-1α的表达观察HIF-1α是否是PD-L1的上游调控分子。最后结合缺氧诱导加EZH2敲低,观察LLC细胞PD-L1的表达水平,证实HIF-1α是否是EZH2调控非小细胞肺癌PD-L1表达的确切分子机制。研究结果1.EZH2在NSCLC组织中表达增多并与PD-L1表达和患者预后不良呈显着的正相关。TCGA数据库基因芯片数据分析表明EZH2在肺癌组织中异常过表达。类似的,在医院收集的20例NSCLC组织样本中,肺癌组织EZH2的mRNA水平显着高于正常肺组织,表明EZH2在NSCLC中表达显着增多,提示EZH2是一个潜在的NSCLC的标志物。PROGgene V2和Kaplan-Meier Plotter在线数据库生存分析结果显示,EZH2高表达组患者的总体生存期及无复发生存期较低表达组均明显降低,可见EZH2的表达水平与患者生存预后呈显着的负相关。进一步对GEO DataSets数据库中肺癌基因芯片的结果进行深入分析发现,肺癌组织中EZH2表达与PD-L1表达呈显着的正相关,与20例NSCLC临床组织样本的结果一致。上述结果表明EZH2在NSCLC组织中异常过表达,并与PD-L1表达和患者的不良预后呈显着的正相关。2.体外实验证实抑制EZH2可减少NSCLC细胞PD-L1的表达。shEZH2慢病毒敲低LLC细胞中EZH2的表达,转染效率检测显示shEZH2-2组最为显着。qPCR、WB和流式细胞技术观察EZH2敲低后LLC细胞中PD-L1的表达变化,发现PD-L1表达显着下降,且PD-L1的下降水平与EZH2的敲低效率密切相关。类似的,EZH2抑制剂GSK343干预LLC细胞24小时后,流式细胞结果显示,与对照组相比,GSK343治疗组PD-L1的平均荧光强度显着降低,并呈现出良好的剂量依赖效应。上述体外实验结果表明,EZH2可以调控LLC细胞中PD-L1的表达。3.体内实验证实敲低EZH2可抑制NSCLC细胞PD-L1的表达,从而增强抗肿瘤免疫反应,延缓肺癌进展。荷瘤实验结果显示,shEZH2组肿瘤的生长速度及体积重量均明显低于对照组。通过流式细胞分析发现,shEZH2敲低组与对照组相比,其PD-L1的平均荧光强度显着降低。进一步分离肿瘤组织,经流式细胞检测分析,shEZH2组的肿瘤内浸润性CD8+T细胞比例显着高于对照组,CD8+T细胞分泌的功能性IFN-γ的比例亦显着增加,表明EZH2敲低后,NSCLC中PD-L1的表达下降,CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫反应增强,从而延缓了肺癌的进展。4.EZH2可通过HIF-1α调控非小细胞肺癌中PD-L1的表达。shEZH2转染LLC细胞后,HIF-1α的表达水平显着下降,表明EZH2对非小细胞肺癌HIF-1α高表达的维持具有重要促进作用。进一步通过低氧诱导LLC细胞,qPCR和流式分析均提示低氧环境下高表达的HIF-1α可上调LLC细胞中PD-L1的表达,在此基础上配合HIF-1α抑制剂IOX2干预,LLC细胞的PD-L1表达下降。从正向刺激和负向干预的两个水平证明HIF-1α是非小细胞肺癌PD-L1高表达的重要维持因素。为了进一步探究EZH2、HIF-1α和PD-L1之间的相关性,LLC细胞在缺氧诱导的基础上给予shEZH2敲低发现,缺氧+EZH2敲低组LLC细胞的PD-L1的转录水平较单纯缺氧组亦显着下降,表明EZH2是HIF-1α诱导PD-L1表达的上游调控分子。综上所述,EZH2可以通过HIF-1α调节NSCLC细胞中PD-L1的表达。研究结论1.EZH2在NSCLC组织中表达增多,并与PD-L1水平和患者预后不良呈显着的正相关。2.EZH2敲低可抑制NSCLC中PD-L1的表达,从而通过增强体内抗肿瘤免疫反应,延缓NSCLC的进展。3.EZH2可通过HIF-1α调控非小细胞肺癌中PD-L1的表达。
陈同庆[10]（2018）在《胶质瘤患者HCMV感染、表达及其IE1基因对U251细胞株生物特性的影响》文中指出人神经胶质瘤是目前已知的恶性程度最高的中枢神经系统肿瘤,也是发病率较高的颅内恶性肿瘤。然而,由于神经胶质瘤恶性程度高,胶质瘤细胞有很强的增殖能力、迁移和侵袭能力、抗凋亡能力,且胶质瘤组织与周围组织分界不清,呈浸润性生长,手术治疗很难完整切除。尽管现在医疗技术非常发达,但神经胶质瘤的治疗效果仍没有显着提升,即使采用手术、化疗、放射疗法结合,其死亡率仍居高不下。因此,发现神经胶质瘤患者具有预防、诊断和治疗意义的分子靶点,对于监测和改善其恶性生物学行为具有重要的科学和临床意义。近年来,越来越多的研究显示,神经胶质瘤患者中存在人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染,及其病毒DNA和蛋白的表达,提示HCMV可能与神经胶质瘤的发生和发展存在某种联系。此外,HCMV基因产物激活多种细胞因子,可促进肿瘤的演进和血管生成,如感染早期病毒IE1基因过表达能促进肿瘤的侵袭和转移,促进胶质瘤的发展。还有研究结果显示,由于HCMV能刺激细胞生长因子的过度表达、激活原癌基因、抑制抑癌基因产物、感染细胞调控机制、增加细胞恶性特征的表达,因而在胶质瘤的发生和发展中起重要作用。基于此,本研究检测HCMV DNA、抗体,分析HCMV立刻早期基因1-72（IE1-72）蛋白和磷酸化糖蛋白65（pp65）在胶质瘤组织中表达水平,探讨IE1-72和pp65蛋白表达水平和神经胶质瘤临床病理学特征的关系,并进一步采用体外实验技术,构建IE1表达载体,成功转染入神经胶质瘤U251细胞株,观察细胞内IE1 mRNA的表达;再分别检测IE1过表达后,U251细胞的增殖、迁移、侵袭和抗凋亡能力的变化。目的分析神经胶质瘤患者、外伤颅脑出血患者脑组织中HCMV抗原和核酸及外周血标本HCMV IgG和IgM抗体阳性率,观察HCMV IE1对神经胶质瘤细胞生物学特性的影响,探讨HCMV与神经胶质瘤的相关性。方法随机收集39例脑胶质瘤患者瘤组织标本及血液标本为实验组（按照WTO病理学分级标准对瘤组织分类:I级星形细胞瘤3例,II级6例,III级16例,IV级14例）,收集9例外伤颅脑出血外伤颅脑出血患者的脑组织标本及血液标本为对照组。（1）取患者血液标本,密度梯度离心分离外周血淋巴细胞,检测淋巴细胞HCMV pp65抗原,ELISA方法检测血清中HCMV IgG和IgM抗体,分别计算实验组及对照组的抗原、抗体阳性率。（2）巢式PCR检测技术检测两组组织标本和外周血中HCMV DNA中HCMV UL55基因,荧光定量PCR检测其中HCMV DNA的拷贝数。（3）采用免疫组织化学实验方法分析HCMV IE1-72和pp65抗原在神经胶质瘤组织中的表达水平。（4）构建携带HCMV IE1基因的质粒pCDNA3.0-IE1,转染神经胶质瘤细胞株U125,筛选出成功转染细胞株,设为设HCMV IE1（U251-IE1）组,与细胞对照组和空质粒对照组作比较,观察转染HCMV IE1基因后神经胶质瘤U251-IE1生物学特性的变化;包括细胞增殖检测（CCK-8试剂盒法）实验,观察转染HCMV IE1对神经胶质瘤细胞增殖能力的影响,通过流式细胞术检测细胞凋亡情况,分析转染HCMV IE1基因后,是否影响神经胶质瘤细胞抗凋亡作用,细胞划痕实验和Transwell实验分析转染HCMV IE1对神经胶质瘤细胞迁移及侵袭能力的影响。结果（1）外周血HCMV-IgG、IgM抗体检测结果:39例神经胶质瘤患者外周血抗原血症检测结果均为阴性;36例患者（36/39,92.3%）HCMV IgG抗体阳性,显着高于对照组（χ2=33.2,P<0.01）;7例（7/39,17.9%）HCMV IgM抗体阳性,与对照组无显着差异（χ2=1.89,P>0.05）;对照组9例IgG抗体及IgM抗体均阴性。胶质瘤组织和外周血中抗人巨细胞病毒IgM阳性率与病毒DNA拷贝数呈显着正相关（r=0.76,P<0.01）。HCMV IgM阳性患者的神经胶质瘤组织HCMV IE1-72和pp65抗原蛋白均阳性;3例HCMV IgG阴性患者的血液及瘤组织HCMV DNA结果阴性。（2）实验组胶质瘤组织标本及外周血HCMV DNA实验结果:实验组25例（25/39,64.1%）患者瘤组织细胞检出HCMV UL55基因,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%（2/3）、50%（3/6）、68.8%（11/16）、64.3%（9/14）;25例基因阳性患者中23例神经胶质瘤组织的IE1-72和pp65蛋白抗原均为阳性,另2例HCMV DNA检测阳性的神经胶质瘤组织IE1-72和pp65阴性。同时,有5例IE1-72阳性的标本未检出HCMV DNA。对照组9例外伤颅脑出血患者的脑组织中均未检出HCMV DNA。巢式PCR技术检测胶质瘤20例（20/39,51.3%）患者外周血HCMV DNA阳性,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%（2/3）、33.3%（2/6）、50%（8/16）57.1%（8/14）。外周血HCMV DNA阳性率与脑胶质瘤组织中HCMV的检出无显着相关性;5例患者外周血HCMV DNA检测阴性,而神经胶质瘤组织HCMV DNA均检出为阳性。DNA测序证实所有PCR扩增产物的序列与HCMV UL55完全一致。在神经胶质瘤每500ng组织中及外周血液中平均log10 HCMV DNA拷贝数分别为（3.75±1.60）、（2.88±1.20）,对照组分别为（1.66±0.19）、（1.54±0.12）;实验组胶质瘤组织标本及血液标本HCMV DNA阳性率均显着高于对照组（P<0.01）,在神经胶质瘤组织和外周血中HCMV DNA拷贝数均低于典型的活动性感染时HCMV DNA拷贝数（平均log10 HCMV DNA拷贝数为9.507）。（3）组织标本免疫组化检测结果:实验组共有30例（30/39,76.9%）神经胶质瘤患者瘤组织HCMV IE1-72为阳性,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%（2/3）、83.3%（5/6）、75.0%（12/16）、78.6%（11/14）;26例（26/39,66.7%）神经胶质瘤患者瘤组织HCMV pp65阳性,其中I、II、III、IV级星形细胞瘤的阳性率分别为66.7%（2/3）、66.7%（4/6）、56.3%（9/16）、78.6%（11/14）。其中26例pp65阳性标本其IE1-72均为阳性,30例IE1-72阳性的标本中4例为pp65阴性;而对照组9例外伤颅脑出血患者脑组织HCMV IE72和pp65抗原均阴性;实验组HCMV IE1-72及PP65阳性率均显着高于对照组（P<0.01）。（4）HCMV IE1对神经胶质瘤细胞生物学特性的影响:向U251细胞内转染HCMV IE基因后筛选成功转染细胞株,CCk-8法实验结果显示转染HCMV IE1基因后U251细胞的增殖能力较空质粒对照组和细胞对照组显着增强（P<0.05）,而空质粒对照组和细胞对照组细胞的增殖能力无显着性差异,表明HCMV IE1基因具有促进神经胶质瘤细胞增殖的能力;流式细胞术分析转染HCMV IE1组、空质粒对照组和细胞对照组细胞的凋亡水平发现转染HCMV IE1基因后U251细胞的抗凋亡能力较空质粒对照组和细胞对照组显着增强,而空质粒对照组和细胞对照组细胞无显着性差异,表明HCMV IE1基因能显着抑制神经胶质瘤细胞凋亡;Transwell实验分析转染HCMV IE1组、空质粒对照组和细胞对照组细胞的迁移和侵袭能力发现转染HCMV IE1基因后U251细胞的迁移和侵袭能力较空质粒对照组和细胞对照组显着增强（P<0.01）,而空质粒对照组和细胞对照组细胞无显着性差异;划痕实验结果显示转染HCMV-IE1后U251细胞株迁移能力显着增强（P<0.01）。结论HCMV感染与神经胶质瘤存在相关性,HCMV可能通过IE1等多种分子信号途径参与神经胶质瘤的发生和发展。
二、人γ干扰素/β肿瘤坏死因子重组杂合蛋白对γ干扰素抗性细胞株的杀伤效应（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人γ干扰素/β肿瘤坏死因子重组杂合蛋白对γ干扰素抗性细胞株的杀伤效应（论文提纲范文）
（2）D-Nap-GFFY水凝胶增强LXR配体抗肿瘤作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 第一节 肺腺癌的研究进展 |
| 1.1.1 肺癌的分类 |
| 1.1.2 肺腺癌的发生因素 |
| 1.1.2.1 基因突变、融合导致的肺腺癌 |
| 1.1.2.2 病毒感染导致的肺腺癌 |
| 1.1.3 肺腺癌的检测方式 |
| 1.1.3.1 影像学检测 |
| 1.1.3.2 分子生物学检测 |
| 1.1.4 肺癌的治疗 |
| 1.1.5 小鼠肺癌模型 |
| 1.1.5.1 基因工程鼠肺癌模型 |
| 1.1.5.2 化学成分诱导模型 |
| 1.1.5.3 肺癌细胞系诱导模型 |
| 1.1.5.4 体外模型 |
| 第二节 LXR研究进展 |
| 1.2.1 LXR与脂质代谢 |
| 1.2.1.1 LXR与胆固醇代谢 |
| 1.2.1.2 LXR与脂肪酸代谢 |
| 1.2.2 LXR与免疫系统 |
| 1.2.2.1 LXR与巨噬细胞 |
| 1.2.2.2 LXR与淋巴细胞 |
| 1.2.2.3 LXR与树突细胞 |
| 1.2.3 LXR与肿瘤 |
| 1.2.3.1 LXR与肺癌治疗的研究进展 |
| 1.2.3.2 LXR与其他癌症治疗的研究进展 |
| 第三节 IFNγ研究进展 |
| 1.3.1 IFNs简介 |
| 1.3.2 IFNγ的功能 |
| 1.3.2.1 抗原处理和递呈 |
| 1.3.2.2 抗病毒 |
| 1.3.2.3 激活杀菌效应 |
| 1.3.2.4 抗肿瘤与免疫逃逸 |
| 第四节 免疫细胞与肿瘤的研究进展 |
| 1.4.1 巨噬细胞与肿瘤 |
| 1.4.1.1 巨噬细胞的极化 |
| 1.4.1.2 肿瘤相关巨噬细胞 |
| 1.4.1.3 靶向巨噬细胞的抗肿瘤治疗 |
| 1.4.2 树突细胞 |
| 1.4.2.1 树突细胞参与的抗肿瘤作用 |
| 1.4.2.2 树突细胞抗肿瘤的阻力 |
| 1.4.2.3 通过树突细胞抗肿瘤治疗的方式 |
| 第五节 水凝胶抗肿瘤研究进展 |
| 1.5.1 宏观水凝胶 |
| 1.5.1.1 在局部肿瘤化疗中的应用 |
| 1.5.1.2 在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 1.5.1.3 微针贴片 |
| 1.5.2 微凝胶 |
| 1.5.2.1 口服给药 |
| 1.5.2.2 肺部输送 |
| 1.5.2.3 经动脉栓塞化疗 |
| 1.5.3 纳米凝胶 |
| 第六节 选题依据 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 第一节 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 细胞株 |
| 2.1.1.2 实验动物 |
| 2.1.1.3 实验耗材 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.2.1 细胞培养相关 |
| 2.1.2.2 药物 |
| 2.1.2.3 抗体 |
| 2.1.2.4 试剂盒 |
| 2.1.2.5 其他试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.3.1 细胞培养相关 |
| 2.1.3.2 免疫印迹和基因克隆相关 |
| 2.1.3.3 其他仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 细胞实验相关 |
| 2.2.1.1 细胞传代 |
| 2.2.1.2 细胞冻存 |
| 2.2.1.3 细胞复苏 |
| 2.2.2 动物实验相关 |
| 2.2.2.1 小鼠喂养 |
| 2.2.2.2 小鼠造模 |
| 2.2.2.3 小鼠组织收集和处理 |
| 2.2.3 小鼠骨髓来源树突细胞的提取和诱导 |
| 2.2.4 夹心ELISA |
| 2.2.5 肝脏脂质提取 |
| 2.2.6 切片制备 |
| 2.2.6.1 石蜡切片 |
| 2.2.6.2 冰冻切片 |
| 2.2.7 免疫组织化学染色(immunohistochemical staining,IHC) |
| 2.2.8 免疫荧光染色(immunofluorescent staining,IF) |
| 2.2.8.1 冰冻切片免疫荧光 |
| 2.2.8.2 石蜡切片免疫荧光 |
| 2.2.9 苏木素伊红染色(hematoxylin and eosin staining,HE) |
| 2.2.10 油红O染色(Oil red O staining,ORO) |
| 2.2.11 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.11.1 蛋白提取 |
| 2.2.11.2 BCA法蛋白浓度定量 |
| 2.2.11.3 凝胶电泳 |
| 2.2.11.4 转膜 |
| 2.2.11.5 杂交 |
| 2.2.11.6 显色曝光 |
| 2.2.11.7 Strip |
| 2.2.12 实时定量荧光PCR |
| 2.2.12.1 细胞总RNA提取 |
| 2.2.12.2 cDNA文库构建 |
| 2.2.12.3 Real-time qPCR |
| 2.2.13 实验相关材料 |
| 2.2.13.1 水凝胶的制备 |
| 2.2.13.2 流变力学检测 |
| 2.2.13.3 核磁 |
| 2.2.13.4 透射电镜 |
| 2.2.13.5 水凝胶的体内外降解 |
| 2.2.13.6 T317 的体内外释放 |
| 2.2.14 流式 |
| 2.2.15 细胞毒性实验 |
| 2.2.16 siRNA |
| 2.2.17 数据统计和分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 第一节 D-Nap-GFFY和 D-Nap-GFFY-T317 的特征分析 |
| 3.1.1 D-Nap-GFFY的核磁分析 |
| 3.1.2 D-Nap-GFFY和 D-Nap-GFFY-T317 制备 |
| 3.1.3 D-Nap-GFFY和 D-Nap-GFFY-T317 的流变力学检测 |
| 3.1.4 D-Nap-GFFY的降解检测 |
| 3.1.5 从D-Nap-GFFY-T317 中释放的T317 检测 |
| 第二节 D-Nap-GFFY-T317对Lewis肺癌移植瘤生长的抑制作用 |
| 3.2.1 D-Nap-GFFY-T317 降低LLC1 细胞的活力 |
| 3.2.2 D-Nap-GFFY-T317 提高荷瘤小鼠生存率 |
| 3.2.3 皮下注射D-Nap-GFFY-T317 能抑制肿瘤生长 |
| 3.2.4 D-Nap-GFFY-T317 能够激活IFNγ的表达和免疫细胞的浸润 |
| 第三节 D-Nap-GFFY-T317 抑制LLC1 肿瘤生长的机制探究 |
| 3.3.1 D-Nap-GFFY-T317 激活抗原呈递细胞中IFNγ表达 |
| 3.3.2 D-Nap-GFFY-T317 调控巨噬细胞极化 |
| 3.3.3 D-Nap-GFFY-T317 调控树突细胞的成熟和浸润 |
| 3.3.4 D-Nap-GFFY-T317 促进T细胞的浸润 |
| 3.3.5 D-Nap-GFFY-T317 抑制肿瘤中血管的生成 |
| 第四节 D-Nap-GFFY-T317 避免诱导荷瘤小鼠的肝脏脂质积累 |
| 3.4.1 D-Nap-GFFY-T317 处理不影响小鼠肝脏功能 |
| 3.4.2 D-Nap-GFFY-T317 处理不影响小鼠肝脏中脂质合成基因的表达 |
| 第五节 D-Nap-GFFY-T317 对乌拉坦诱发肺癌的抑制作用 |
| 3.5.1 D-Nap-GFFY-T317 抑制乌拉坦诱导的肺腺癌的发生发展 |
| 3.5.2 D-Nap-GFFY-T317 抑制乌拉坦诱导的肺腺癌中的炎症 |
| 3.5.3 D-Nap-GFFY-T317 通过促进IFNγ表达抑制乌拉坦诱导的肺腺癌 |
| 第六节 长期施用D-Nap-GFFY-T317 不影响乌拉坦诱导小鼠的肝脏脂肪生成和血脂水平 |
| 第七节 巨噬细胞以清道夫受体SR-A依赖的方式吞噬D-Nap-GFFY-T317 |
| 第四章 讨论 |
| 第一节 避免LXR副作用的研究现状 |
| 4.1.1 使用组织特异性LXR激动剂 |
| 4.1.2 使用LXRβ特异性激动剂 |
| 4.1.3 使用纳米颗粒特异性输送LXR激动剂 |
| 第二节 IFNγ抗肿瘤的研究现状 |
| 第三节 给药方式的探究 |
| 第四节 水凝胶包裹T317 抗肿瘤的机制 |
| 第五章 结论 |
| 第一节 课题结果总结 |
| 第二节 论文创新 |
| 第三节 进一步需要做的工作 |
| 附录 复方丹参滴丸抑制阿霉素诱导的心脏毒性 |
| 研究背景 |
| 研究结果 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表论文及所获奖励 |
（3）肾透明细胞癌自噬相关多组学预后模型的构建研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 肾透明细胞癌患者自噬相关基因预后模型的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肾透明细胞癌自噬相关lncRNA预后模型的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肾透明细胞癌自噬相关lncRNA表达验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 自噬在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 NSCLC获得性多药耐药细胞A549/DDP鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 NSCLC耐药相关基因的筛选及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ZNF300与NSCLC恶性进展 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ZNF300促进NSCLC耐药和恶性进展的分子机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 淫羊藿苷和全反式维甲酸增强顺铂对NSCLC肿瘤耐药细胞杀伤作用的机制探讨 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料和方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 肿瘤化疗耐药机制的研究现况 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 锌指蛋白家族的结构与功能以及ZNF300的研究现况 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的成果 |
| 致谢 |
（5）杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语与缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 农药残留及免疫检测技术发展现状 |
| 1.2 农药小分子特异性单克隆抗体研究进展 |
| 1.3 杂交瘤细胞技术 |
| 1.4 杂交瘤细胞识别特异性基础——B淋巴细胞 |
| 1.5 CRISPR/Cas基因编辑在杂交瘤细胞生物学研究中的应用 |
| 1.5.1 基因编辑技术概况 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas系统结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas系统机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9基因编辑原理 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9基因编辑文库 |
| 1.5.6 CRISPR/Cas9系统及文库在抗体基因编辑上的应用 |
| 1.6 研究内容及预期目标 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 预期目标 |
| 1.6.3 研究技术路线 |
| 第2章 杂交瘤细胞株及抗百菌清单抗表型的多样性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与设备 |
| 2.2.1.1 试剂材料 |
| 2.2.1.2 试剂盒 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.1.4 培养液及缓冲液配方 |
| 2.2.1.5 试验动物 |
| 2.2.2 农药特异性杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备 |
| 2.2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2.2 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)及饲养细胞的准备 |
| 2.2.2.3 细胞融合 |
| 2.2.2.4 阳性杂交瘤单克隆细胞株筛选 |
| 2.2.3 腹水单抗制备与表征 |
| 2.2.3.1 小鼠腹水单抗制备 |
| 2.2.3.2 腹水单抗灵敏度测定 |
| 2.2.3.3 腹水单抗轻重链类型测定 |
| 2.2.4 不同农药特异性杂交瘤细胞株不同处理后阴性率统计 |
| 2.2.5 杂交瘤细胞株抗体分泌FACS分析 |
| 2.2.6 阴阳性单克隆杂交瘤细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.2.7 BJQ单克隆杂交瘤细胞株抗体产生情况表征 |
| 2.2.7.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.2.7.2 BJQ杂交瘤细胞不同生长阶段Ig G分泌表征 |
| 2.2.7.3 杂交瘤细胞胞内总蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.7.4 胞内蛋白抗体亲和特异性检测 |
| 2.2.7.5 胞内蛋白Ig G定量 |
| 2.2.7.6 胞内蛋白抗体轻重链类型鉴定 |
| 2.2.7.7 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 阳性单克隆杂交瘤细胞株筛选及腹水单抗表征 |
| 2.3.2 单克隆杂交瘤细胞株阴性率测定 |
| 2.3.3 抗体分泌情况FACS分析 |
| 2.3.4 各农药阴阳性细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.3.5 BJQ单克隆细胞周期及抗体表达表征 |
| 2.3.5.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.3.5.2 BJQ阳性细胞株E2生长阶段与Ig G分泌 |
| 2.3.5.3 胞内蛋白的抗体特异性鉴定 |
| 2.3.5.4 胞内蛋白IgG定量 |
| 2.3.5.5 胞内蛋白抗体轻重链类型表征 |
| 2.3.5.6 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与设备 |
| 3.2.1.1 试剂材料 |
| 3.2.1.2 仪器设备 |
| 3.2.1.3 主要缓冲液 |
| 3.2.1.4 实验材料 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞测序 |
| 3.2.2.1 杂交瘤细胞总RNA提取 |
| 3.2.2.2 5’RACE反转录及PCR扩增抗体轻重链可变区序列 |
| 3.2.2.3 抗体基因克隆及Sanger测序 |
| 3.2.3 HEK293(F)重组全抗体瞬时表达 |
| 3.2.3.1 质粒提取 |
| 3.2.3.2 瞬时表达质粒构建及验证 |
| 3.2.3.3 重组全抗体瞬时表达及纯化 |
| 3.2.3.4 瞬时表达重组抗体表征 |
| 3.2.4 HEK293重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.1 构建慢病毒表达载体 |
| 3.2.4.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.4.3 重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.4 稳定表达重组抗体表征 |
| 3.2.5 杂交瘤细胞株免疫组库测序及分析 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞转录组测序及生物信息分析 |
| 3.2.6.1 转录组测序 |
| 3.2.6.2 转录组数据生物信息分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞测序 |
| 3.3.1.1 总RNA的提取 |
| 3.3.1.2 特异性PCR产物分析 |
| 3.3.2 百菌清重组抗体瞬时表达 |
| 3.3.2.1 瞬时表达载体构建及验证 |
| 3.3.2.2 重组抗体瞬时表达及纯化表征 |
| 3.3.3 百菌清重组抗体稳定表达 |
| 3.3.3.1 不同表达质粒和表达体系稳定表达重组抗体效果表征 |
| 3.3.3.2 腹水抗体以及瞬时/稳定表达的重组抗体亲和性表征 |
| 3.3.4 BJQ杂交瘤细胞株免疫组库测序 |
| 3.3.5 BJQ阴阳性细胞转录组学测序及分析 |
| 3.3.5.1 RNA样品检测结果 |
| 3.3.5.2 测序数据过滤及测序质量分析 |
| 3.3.5.3 参考基因组比对 |
| 3.3.5.4 样品组间相关性 |
| 3.3.5.5 杂交瘤细胞株抗体基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 抗百菌清单抗表达差异的杂交瘤细胞株转录组分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.1.1 试剂材料 |
| 4.2.1.2 仪器设备 |
| 4.2.1.3 实验材料 |
| 4.2.2 转录组差异表达基因筛选及GO/KEGG富集 |
| 4.2.3 qPCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.2.3.1 RNA提取 |
| 4.2.3.2 cDNA合成 |
| 4.2.3.3 qPCR反应 |
| 4.2.4 RNA干扰 |
| 4.2.4.1 基因siRNA片段设计 |
| 4.2.4.2 siRNA转染条件优化 |
| 4.2.4.3 RNA基因干扰 |
| 4.2.4.4 qPCR验证RNAi效果 |
| 4.2.4.5 流式分析RNAi杂交瘤细胞抗体分泌情况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 差异表达基因分析 |
| 4.3.2 差异基因GO富集分析 |
| 4.3.3 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.3.4 显着差异表达基因分析 |
| 4.3.5 qPCR验证转录组数据 |
| 4.3.6 RNAi验证基因功能 |
| 4.3.6.1 siRNA转染效率优化 |
| 4.3.6.2 RNA干扰功能基因表达及抗体分泌 |
| 4.3.7 杂交瘤细胞抗体表达途径及转阴可能因素 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9文库筛选杂交瘤细胞抗体表达的功能基因 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 文库质粒扩增 |
| 5.2.4 慢病毒包装 |
| 5.2.4.1 去内毒素质粒中提 |
| 5.2.4.2 慢病毒包装 |
| 5.2.4.3 慢病毒滴度测定 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞慢病毒文库感染 |
| 5.2.5.1 细胞准备 |
| 5.2.5.2 嘌呤霉素筛选浓度优化 |
| 5.2.5.3 慢病毒感染效率测定 |
| 5.2.6 GeCKO慢病毒文库感染E2细胞株 |
| 5.2.7 农药压力筛选 |
| 5.2.7.1 筛选原理 |
| 5.2.7.2 百菌清农药对杂交瘤细胞致死效应及抗体“中和作用” |
| 5.2.7.3 百菌清农药筛选浓度优化 |
| 5.2.7.4 百菌清农药筛选GeCKOv2E2细胞文库 |
| 5.2.8 流式细胞分选 |
| 5.2.8.1 分选原理 |
| 5.2.8.2 流式细胞分选 |
| 5.2.9 NGS扩增子测序 |
| 5.2.9.1 基因组DNA提取 |
| 5.2.9.2 特异性PCR |
| 5.2.9.3 NGS扩增子测序及数据分析 |
| 5.2.10 sh RNA功能基因验证 |
| 5.2.10.1 shRNA慢病毒质粒构建及慢病毒包装 |
| 5.2.10.2 shRNA慢病毒感染 |
| 5.2.10.3 qPCR验证基因功能 |
| 5.2.10.4 FACS检测杂交瘤细胞抗体表达情况 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 GeCKOv2 library质粒扩增 |
| 5.3.2 GeCKO library慢病毒包装与检测 |
| 5.3.3 杂交瘤细胞慢病毒文库构建 |
| 5.3.3.1 puro筛选浓度优化 |
| 5.3.3.2 慢病毒感染效率测定 |
| 5.3.3.3 GeCKOv2 E2 library慢病毒敲除文库构建 |
| 5.3.4 百菌清农药压力筛选 |
| 5.3.4.1 百菌清农药对杂交瘤细胞的毒性作用 |
| 5.3.4.2 特异性单抗对百菌清农药的“中和作用” |
| 5.3.4.3 百菌清农药筛选时间及浓度优化 |
| 5.3.4.4 百菌清农药筛选GeCKO v2 E2细胞文库 |
| 5.3.5 流式细胞分选 |
| 5.3.6 农药压力筛选NGS扩增子测序分析 |
| 5.3.6.1 核酸样品质控 |
| 5.3.6.2 测序数据质控 |
| 5.3.6.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.6.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.6.5 样品间相似性分析 |
| 5.3.6.6 显着富集基因分析 |
| 5.3.6.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.6.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.6.9 药筛富集的功能基因、通路与转录组比对分析 |
| 5.3.7 流式细胞分选测序结果分析 |
| 5.3.7.1 核酸样品质控 |
| 5.3.7.2 测序数据质控 |
| 5.3.7.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.7.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.7.5 样本间相似性分析 |
| 5.3.7.6 显着差异基因分析 |
| 5.3.7.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.7.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.7.9 CRISPR library流式筛选及药物筛选功能基因通路与RNA-seq比对分析 |
| 5.3.8 shRNA干扰验证功能基因 |
| 5.3.8.1 shRNA慢病毒感染效率优化 |
| 5.3.8.2 qPCR验证干扰基因及抗体基因表达情况 |
| 5.3.8.3 FACS检测抗体表达情况 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 百菌清抗原免疫小鼠脾脏细胞转录组学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 转录组测序与生物信息分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 脾脏转录组RNA样品检测结果 |
| 6.3.2 脾脏转录组测序数据过滤及测序质量分析 |
| 6.3.3 脾脏转录组数据参考基因组比对 |
| 6.3.4 基因表达分析及显着性DEG筛选 |
| 6.3.5 差异基因GO富集分析 |
| 6.3.6 差异基因KEGG富集分析 |
| 6.3.7 显着差异基因分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第7章 抗百菌清杂交瘤细胞抗体表达的调控途径及分子机制探究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 BJQ特异性杂交瘤细胞株及其单抗的多样性分析 |
| 7.2.1 杂交瘤细胞株及其单抗表型的多样性分析 |
| 7.2.1.1 阴阳性单克隆杂交瘤细胞的定义 |
| 7.2.1.2 不同处理方式测定杂交瘤细胞株阴性率 |
| 7.2.1.3 杂交瘤细胞增殖及抗体分泌情况 |
| 7.2.1.4 流式分析杂交瘤细胞抗体分泌情况及抗体亚型检测 |
| 7.2.1.5 BJQ杂交瘤细胞株抗体产生情况分析 |
| 7.2.2 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 7.2.2.1 BJQ特异性杂交瘤细胞抗体序列测定及验证 |
| 7.2.2.2 BJQ阴阳性细胞及SP2/0 细胞免疫组库测序 |
| 7.2.2.3 BJQ五株阴阳性细胞及SP2/0 细胞抗体基因表达情况 |
| 7.3 BJQ特异性抗体表达差异的杂交瘤细胞株转录组学分析 |
| 7.3.1 DEG筛选及RNA-seq可靠性验证 |
| 7.3.2 GO功能及KEGG通路富集分析 |
| 7.3.3 差异表达基因分析 |
| 7.3.4 RNAi相关功能基因分析 |
| 7.4 CRISPR文库筛选杂交瘤细胞抗体表达相关基因及通路分析 |
| 7.4.1 GeCKO文库质粒扩增及慢病毒包装 |
| 7.4.2 慢病毒文库感染杂交瘤细胞 |
| 7.4.3 农药压力筛选与流式细胞分选 |
| 7.4.4 NGS扩增子测序数据分析 |
| 7.4.5 差异基因与功能通路富集分析 |
| 7.4.6 shRNA验证Pet2基因和Ccnd2基因功能 |
| 7.5 BJQ杂交瘤细胞转录组与CRISPR library筛选综合分析 |
| 7.5.1 转录组与CRISPR library筛选方法比较 |
| 7.5.2 两种筛选方式共同富集的基因功能及信号通路 |
| 7.5.3 两种筛选方式共同富集的差异基因分析 |
| 7.5.4 杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.6 骨髓瘤细胞SP2/0 与杂交瘤细胞功能基因表达差异分析 |
| 7.7 百菌清农药抗原免疫小鼠脾细胞各阶段转录组分析 |
| 7.7.1 研究对象的选择 |
| 7.7.2 转录组基因表达分析及差异基因筛选 |
| 7.7.3 脾脏转录组显着差异基因GO/KEGG富集分析 |
| 7.7.4 小鼠机体产生抗BJQ特异性抗体的过程 |
| 7.7.5 杂交瘤细胞与机体B细胞抗体合成途径异同 |
| 7.8 抗百菌清特异性单抗合成及分泌途径及调控机制 |
| 7.8.1 杂交瘤细胞的融合与体外培养 |
| 7.8.2 杂交瘤细胞抗体基因编码与表达 |
| 7.8.2.1 DNA编码水平 |
| 7.8.2.2 表观遗传学编码水平 |
| 7.8.2.3 杂交瘤细胞抗体基因表达调控 |
| 7.8.3 杂交瘤细胞周期进程调控 |
| 7.8.4 信号通路与转录因子调控杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.8.5 杂交瘤细胞抗体基因转录后调控 |
| 7.8.6 杂交瘤细胞抗体装配与修饰 |
| 7.8.7 杂交瘤细胞抗体运输及分泌 |
| 7.8.8 杂交瘤细胞调控抗体合成及分泌的相关机制 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 全文创新点 |
| 8.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
（6）结核分枝杆菌Cas1和RNA结合蛋白在结核致病及免疫逃逸中的作用（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 CAS1蛋白在结核致病中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 RNA结合蛋白在结核免疫逃逸中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:结核的免疫逃逸机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士研究生期间发表的学术论文 |
| 攻读博士研究生期间参加的学术会议 |
（7）c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 胃癌CAR-T及c-Met CAR-T的研究现状 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 CAR-T在胃癌中的研究现状 |
| 1.2.1 胃癌CAR-T的基础研究 |
| 1.2.2 胃癌CAR-T的临床实验注册 |
| 1.3 c-Met CAR-T的研究现状 |
| 1.3.1 c-Met CAR-T的基础研究现状 |
| 1.3.2 c-Met CAR-T临床实验注册 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 MET基因在胃癌中表达及功能的生物信息学分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 数据获取及分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 c-Met在胃癌组织及细胞系中表达的检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 胃癌组织c-Met免疫组化表达分析 |
| 3.1.2 胃癌细胞培养 |
| 3.1.3 提取细胞RNA |
| 3.1.4 PCR反应 |
| 3.1.5 提取细胞总蛋白 |
| 3.1.6 聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳 |
| 3.1.7 流式细胞计数检测胃癌细胞系c-Met、PD-L1 表达 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 c-Met在胃癌中的表达水平高于癌旁组织 |
| 3.2.2 qRT-PCR分析不同胃癌细胞系中MET、PD-L1 基因转录水平 |
| 3.2.3 WB分析不同胃癌细胞系中c-Met表达水平 |
| 3.2.4 FCM分析不同胃癌细胞系c-Met、PD-L1 的细胞膜表面表达水平 |
| 3.2.5 CCLE数据库中MET、PD-L1 表达验证 |
| 3.3 结论 |
| 第四章 MET过表达慢病毒及CAR慢病毒的制备 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒构建 |
| 4.1.2 载体酶切 |
| 4.1.3 目的基因片段扩增 |
| 4.1.4 酶连重组 |
| 4.1.5 转化 |
| 4.1.6 质粒抽提 |
| 4.1.7 重组质粒基因测序 |
| 4.1.8 质粒转染与慢病毒收获 |
| 4.1.9 慢病毒感染293T |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 CAR序列结构 |
| 4.2.2 载体酶切、目的片段扩增、酶连重组验证 |
| 4.2.3 慢病毒的验证 |
| 4.3 结论 |
| 第五章 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对胃癌效果的体外验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 MET-OE慢病毒感染HGC-27 细胞 |
| 5.1.2 CAR-T细胞制备 |
| 5.1.3 慢病毒CAR-T感染效率的检测 |
| 5.1.4 CAR-T细胞增殖检测 |
| 5.1.5 CAR-T细胞亚群及表型检测 |
| 5.1.6 靶细胞刺激对CAR-T激活的影响 |
| 5.1.7 靶细胞刺激对CAR-T中 PD-1 表达的影响 |
| 5.1.8 细胞因子分泌检测 |
| 5.1.9 LDH释放实验 |
| 5.1.10 7-AAD杀伤实验 |
| 5.1.11 CD107a脱颗粒反应 |
| 5.1.12 高内涵成像分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 MET-OE慢病毒感染可使HGC-27 细胞过表达c-Met |
| 5.2.2 c-Met CAR和 c Met-PD1/CD28 CAR慢病毒感染以成功构建对应的CAR-T |
| 5.2.3 CAR-T细胞中CD8~+T细胞、中央记忆T细胞的比例升高 |
| 5.2.4 靶细胞刺激后c-Met CAR-T中激活表型增多 |
| 5.2.5 靶细胞刺激后c-Met CAR-T中 PD-1 表达升高 |
| 5.2.6 PD1/CD28 融合受体能刺激CAR-T中 IFN-γ、TNF-α分泌,抑制IL-6分泌 |
| 5.2.7 PD1/CD28 融合受体能进一步增强c-Met CAR-T对靶细胞的杀伤 |
| 5.2.8 PD1/CD28 融合受体能进一步增强c-Met CAR-T的脱颗粒水平 |
| 5.2.9 高内涵成像显示CAR-T识别并杀伤肿瘤 |
| 5.3 结论 |
| 第六章 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对胃癌效果的体内验证 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 实验动物 |
| 6.1.4 实验细胞 |
| 6.1.5 皮下成瘤及活体小动物成像 |
| 6.1.6 HE染色 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 c-Met CAR-T及 c Met-PD1/CD28 CAR-T对 c-Met~+胃癌模型具有明显的抑制作用 |
| 6.2.2 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对正常器官没有明显的脱靶毒性 |
| 6.3 结论 |
| 第七章 讨论、结论与展望 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 嵌合抗原受体T细胞的新型设计方案 |
| 参考文献 |
| HGF/c-Met信号通路及其在胃和胃食管交界癌治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 附图 技术路线图 |
| 附表 |
| 附缩略词简表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）CHO-hIL21细胞株的构建及其持续性分泌对NK细胞体外扩增的影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 CHO-hIL21细胞株的构建及表达 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 第一部分小结 |
| 第二部分 CHO-hIL21对NK细胞的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 第二部分小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 儿童噬血细胞综合征的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得科研成果 |
（9）EZH2在非小细胞肺癌PD-L1表达调控中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 非小细胞肺癌组织中EZH2与PD-L1 表达的相关性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果及分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 体外实验验证EZH2 对非小细胞肺癌PD-L1 表达的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果及分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 体内实验验证EZH2 对非小细胞肺癌PD-L1 表达的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 EZH2 通过HIF-1α调控非小细胞肺癌PD-L1 表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果及分析 |
| 5.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 EZH2在肿瘤生物学及肿瘤免疫中的作用 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 PD-L1在非小细胞肺癌中的表达及重要性研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的论文及获奖情况 |
| 致谢 |
（10）胶质瘤患者HCMV感染、表达及其IE1基因对U251细胞株生物特性的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 胶质瘤患者人类巨细胞病毒感染、表达 |
| 第一章 胶质瘤血液人类巨细胞病毒抗原血症及IGG、IGM抗体表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 胶质瘤组织及外周血中HCMVDNA水平 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 胶质瘤组织中HCMV病毒蛋白PP65、IE1-72的表达水平 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第一部分 结论 |
| 第二部分 脂质体介导HCMV-IE1转染胶质瘤U251细胞株增殖、侵袭、凋亡的实验研究 |
| 第一章 稳定表达HCMV-IE1胶质瘤U251细胞株的构建及鉴定 |
| 1 材料方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 表达HCMV-IE1的神经胶质瘤U251细胞株的增殖、侵袭和凋亡水平的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、人γ干扰素/β肿瘤坏死因子重组杂合蛋白对γ干扰素抗性细胞株的杀伤效应（论文参考文献）
- [1]不同培养体系及不同时间制备的γδT细胞对肺癌A549细胞的杀伤作用[D]. 王佳林. 内蒙古医科大学, 2021
- [2]D-Nap-GFFY水凝胶增强LXR配体抗肿瘤作用的研究[D]. 冯科. 南开大学, 2021
- [3]肾透明细胞癌自噬相关多组学预后模型的构建研究[D]. 靳毅. 河北医科大学, 2021
- [4]锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究[D]. 余世龙. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [5]杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制[D]. 柳颖. 浙江大学, 2020(01)
- [6]结核分枝杆菌Cas1和RNA结合蛋白在结核致病及免疫逃逸中的作用[D]. 魏家玮. 重庆医科大学, 2020(01)
- [7]c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究[D]. 陈聪. 兰州大学, 2020(01)
- [8]CHO-hIL21细胞株的构建及其持续性分泌对NK细胞体外扩增的影响[D]. 张垚. 浙江大学, 2020(02)
- [9]EZH2在非小细胞肺癌PD-L1表达调控中的作用及机制研究[D]. 赵月涛. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [10]胶质瘤患者HCMV感染、表达及其IE1基因对U251细胞株生物特性的影响[D]. 陈同庆. 安徽医科大学, 2018(04)