一、旋毛虫形态学比较与新生幼虫繁殖能力比较（论文文献综述）
杨莹[1]（2021）在《旋毛虫雌虫生殖力的影响因素及新生幼虫免疫保护作用评价》文中提出
李健[2]（2021）在《应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究》文中指出旋毛虫（Trichinella spiralis,T.spiralis）是一种人兽共患食源性寄生虫,生食或半生食含有旋毛虫的猪肉及其产品是人类感染旋毛虫的主要方式,因感染旋毛虫而引起的疾病被称为旋毛虫病（Trichinellosis）,该病呈世界性分布且严重威胁人类健康和公共安全,因此,猪旋毛虫检测被列为屠宰必检项目。目前使用的旋毛虫检测方法存在技术短板,无法满足对日常养殖和现代化屠宰加工过程中,猪体内旋毛虫的监测。因此,针对现代化大型养殖和屠宰场研发一种快速、灵敏的旋毛虫现场检测方法,对于旋毛虫病防控具有重要意义。本研究基于表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS）和上转换发光免疫层析法（Upconversion phosphor immunochromatography assay,UCP-ICA）建立旋毛虫快速检测体系,为研发适用于现代化大型养殖和屠宰场的旋毛虫检测方法奠定基础,具体研究内容和结果如下:1.基于SERS建立旋毛虫检测方法。利用盐酸羟胺还原硝酸银,制备银纳米溶胶,测试其拉曼光谱增强性能及其对实验样品的影响。20只Wistar大鼠口服感染旋毛虫肌幼虫（Muscle larvae,ML）（3500条/只）,并设平行空白对照组（20只Wistar大鼠）。收集血清,采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪采集未感染的血清及感染后28天血清的SERS,对SERS进行去荧光背景及面积归一化处理。比较SERS变化以及通过多元统计分析,如主成分分析（Principal component analysis,PCA）和线性判别分析（Linear discriminant analysis,LDA）,分析SERS并建模。结果表明,所制备的银纳米溶胶颗粒直径约为25 nm,大小均匀,纯度高,且具有良好的拉曼光谱增强效果。感染组和对照组在未感染旋毛虫时的血清拉曼光谱无显着差异;第28天,两组的血清拉曼光谱出现显着差异。通过PCA结合LDA构建诊断算法,发现该方法灵敏度为87.5%,特异度为94.7%,正确度为91.4%。基于以上结果,将银纳米胶体的SERS与PCA和LDA相结合,有望实现大规模、现场、快速、无标记、高准确检测,在旋毛虫病防控方面具有巨大的应用潜力。2.基于UCP-ICA建立旋毛虫免疫层析检测法。将旋毛虫排泄分泌抗原（Excretorysecretory antigens,ES）、山羊抗兔Ig G与上转换发光纳米颗粒（Upconversion nanoparticles,UCNPs）共价偶联,以山羊抗猪Ig G（800 ng/条）与兔抗山羊Ig G（200 ng/条）喷于硝酸纤维素薄膜（Nitrate cellulose sheet,NC sheet）上,分别作为检查带（T线）与质控带（C线）,并且命名该方法为旋毛虫上转换发光免疫层析法（T.spiralis upconversion phosphor immunochromatography assay,Ts-UCP-ICA）。Ts-UCP-ICA优化后的最佳血清稀释倍数为1:150、最佳样品处理液为100 m M HEPES p H 7.5,270 m M Na Cl,0.5%v/v Tween-20,1%v/v BSA。通过检测169份阴性猪血清,确定Ts-UCP-ICA的低特异度cut-off值为0.1906（T/C ratio）,高特异度cut-off值为0.3233。检测猪囊尾蚴、亚洲带绦虫幼虫以及弓形虫感染后的猪血清样本,结果显示,Ts-UCP-ICA特异性良好,均未发生交叉反应。检测感染100、1000、10000 ML猪血清,发现三个剂量分别在第35、30、25天可检出阳性。Ts-UCP-ICA单盲测试（Single-blinded assay）55份猪血清,使用低特异度cut-off值时,检测特异度和灵敏度均100%,使用高特异度cut-off值时,检测特异度为100%和灵敏度为80%。该方法与人工消化法的检测总符合率为87.27%,一致性系数（Kappa值）为0.7454,稳定性为4℃保存6个月有效。本论文建立的两种旋毛虫检测方法,构成“旋毛虫快速检测体系”。基于SERS建立的旋毛虫检测法具有检测速度快,高通量的特点,适合大规模样本筛查;而基于UCP-ICA建立的旋毛虫检测方法可用于可疑血清进一步确定。该检测体系可提高检测效率和检测效果,进一步提升旋毛虫流行病学调查、畜牧养殖及屠宰即时检测水平,为旋毛虫病防控提供技术保障。
王国英,陈丹丹,郑学礼,李祥会,张浩,张军,滕铁山[3]（2020）在《旋毛虫成囊幼虫的感染性与其发育阶段的关系》文中指出观察旋毛虫成囊幼虫的感染性与其发育阶段的关系,18只雌性昆明小鼠经口感染旋毛虫囊包（20个/鼠）,感染后60、 100、 200、 300、 400、 500 d,分别安乐死3只小鼠,每组取10份肉样（20个囊包/肉样）,分别经口感染10只雌性昆明小鼠。感染后30 d取小鼠完整膈肌,称重后压片镜检,计数囊包。计算每克膈肌虫荷（囊包）。实验结果显示,60 d组囊壁完整,深染层边缘出现透明,幼虫可见;100 d组囊壁完整,深染层边缘外出现透明痕迹,幼虫可见,2个囊包无囊壁和囊内结构,幼虫隐约可见;200 d组囊壁完整,深染层边缘外出现浅色痕迹,幼虫可见,4个囊包无囊壁和囊内结构,幼虫隐约可见或看不到;300 d组囊壁完整,透明带和透明痕迹均可见,幼虫可见,4个囊包无囊壁和囊内结构,幼虫隐约可见或看不到;400 d组多数囊壁完整,透明带和透明痕迹均可见,幼虫可见或隐约可见,12个无囊壁和囊内结构的囊包,囊内幼虫状况分别:可见、隐约可见或看不到;500 d组囊壁不明显或者消失,深染层边缘有透明带,幼虫可见或隐约可见。60～500 d感染组,肌幼虫长度均值分别为:（1 026.6±64.8）、（1 041.1±62.8）、（1 031.5±75.6）、（1 047.9±56.0）、（1 030.5±72.2）、（1 011.2±95.0）μm。60～400 d感染组囊包长度均值分别为:（371.4±69.1）、（309.4±40.3）、（311.9±48.1）、（299.5±43.8）、（294.3±23.4）μm, 60 d与100 d组差异有统计学意义（P﹤0.01）。6个实验组小鼠膈肌镜检,均检出幼虫囊包。随着寄生时间的延长,幼虫囊包老化数量和程度加重,感染能力逐渐降低。
王洋[4]（2020）在《伪旋毛虫排泄—分泌（ES）产物蛋白质组学的初步分析》文中研究指明伪旋毛虫（Trichinella pseudospiralis）是可以感染哺乳类动物和鸟类的人兽共患寄生线虫。人类通常感染伪旋毛虫是因为食用生的或未煮熟的猪肉和其它含有伪旋毛虫感染性肌幼虫的动物。幼虫在宿主肌纤维中不能形成保护性胶原囊,由于可以感染鸟类,在自然界中呈全球性分布。伪旋毛虫无包囊这一形态上与旋毛虫的差异,导致它们在幼虫和成虫的大小、幼虫在肌纤维中运动模式、调节宿主免疫反应的能力、杆细胞颗粒的形态和分泌蛋白质含量均存在显着差异,特别是在免疫特异性的差异,值得进一步深入的研究。伪旋毛虫在入侵及寄生过程中,会排泄、分泌一些产物（ES）。由于ES产物直接暴露于宿主免疫系统,因此被认为是诱导宿主产生免疫反应的主要靶向抗原。目前研究发现ES产物在虫体穿透组织、幼虫的移行、参与免疫细胞调控、减缓凝血、消化、蜕皮、细胞外基质的降解等方面都发挥重要作用,在伪旋毛虫和宿主相互作用中扮演了重要角色。伪旋毛虫目前主要有三个代表性分离株（T4RUS、T4 AUS和T4 USA）,有研究表明对最适宿主（猪）的易感性存在很大差别,推测不同分离株ES产物对宿主免疫调控能力存在差异。因此,本实验首先利用流式细胞仪检测了猪感染伪旋毛虫不同分离株在不同感染时间点外周血中免疫细胞水平变化,以期观察伪旋毛虫不同发育时期对宿主免疫反应的调控作用。其次,利用差异蛋白质组学技术鉴定、对比分析伪旋毛虫肌幼虫和旋毛虫肌幼虫之间ES产物中显着差异表达蛋白,并对这些功能蛋白进行分析,阐述这些功能蛋白在参与寄生虫与宿主相互作用中可能扮演的角色,以期找到哪些ES蛋白参与调控宿主免疫反应,并导致伪旋毛虫抑制宿主炎症能力强于旋毛虫的可能原因。最后,采用免疫蛋白质组学技术筛选伪旋毛虫成虫和新生幼虫阶段期特异性蛋白,作为潜在的早期诊断抗原或疫苗的候选。为了观察伪旋毛虫对宿主免疫系统调控能力,我们采用了流式细胞术对感染伪旋毛虫（T4 RUS和T4 AUS）两个分离株猪外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞、Th17细胞、CD3+T细胞、CD21+B细胞和中性粒细胞在不同感染时间点变化及Th1和Th2型特异性细胞因子IL-2和IL-4进行检测,观察伪旋毛虫入侵对宿主体内免疫反应调控。结果显示,伪旋毛虫感染猪在早期（0-17天）主要诱导的Th2型免疫反应,特异性细胞因子IL-4显着升高。从感染第17天开始B细胞发挥了主要调节作用。Treg细胞从感染第11天开始增多,展现了对宿主免疫反应强的调节抑制作用。伪旋毛虫入侵宿主猪抑制了炎症细胞Th17水平,但在感染后期（45-60天）略有升高。T4 RUS和T4 AUS两个分离株相同剂量（10000条/头）感染猪,猪外周血中上述免疫细胞在不同感染时间水平变化趋势一致,引起相同的宿主免疫反应。T4 RUS不同感染剂量（1000条/头和10000条/头）,引起猪体内免疫细胞水平变化基本无差异。应用iTRAQ串联质谱技术,对伪旋毛虫三个分离株（T4 RUS、T4 AUS和T4 USA）以及旋毛虫（T1 ISS534）之间肌幼虫ES产物进行鉴定,共鉴定出2,591个蛋白,其中535个为可信蛋白。每两组对比分析（T4 RUS:T4 USA、T4 AUS:T4USA、T4 RUS:T4 AUS和T1:T4 USA）共有65（146）、72（98）、43（103）和28（147）显着上调（或下调）差异表达蛋白被鉴定出来,并对鉴定出来的差异表达蛋白进行生物信息学分析。在GO和KEGG Pathway富集分析中,我们发现差异蛋白参与主要的生物学过程富集在碳水化合物代谢过程、小分子代谢过程、前体代谢和能量生成和蛋白折叠。参与的主要KEGG通路富集在与糖代谢相关的糖酵解和糖异生、果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢和磷酸戊糖途径等通路;与氨基酸代谢相关包括色氨酸代谢、组氨酸代谢、缬氨酸、精氨酸和脯氨酸代谢和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢等通路;与脂肪代谢相关包括丙酸代谢、脂肪酸代谢和脂肪酸降解等通路。差异蛋白参与的这些生物学过程及通路都主要集中在能量的合成、代谢和蛋白质合成等,这些都为寄生虫的长期寄生提供支持。此外,我们发现T4 RUS:T4 USA和T4 AUS:T4 USA两组富集在溶酶体通路和过氧化物酶体通路的差异表达蛋白均下调。溶酶体在信号转导、细胞适应、质膜修复、免疫应答和许多其它基本细胞过程中发挥着重要作用。特别是溶酶体介导的降解作用有助于吞噬细胞快速清除凋亡细胞,调节宿主炎症反应。而过氧化物酶体与胞内活性氧自由基的清除相关。所有参与溶酶体和过氧化物酶体通路的差异蛋白在分离株T4 USA中表达明显高于其它两组。搜索STRING数据库我们绘制了差异蛋白互作网络图查找相互作用关系密切的蛋白,并发现F23B12.5、Hsp83、calr、T0111246、MDH1和Nom1等为互作网络图中重要节点与多个蛋白具有紧密的互作关系,协同行使功能。对鉴定出来的差异蛋白进行功能分类分析发现了一些参与抗氧化、抗压力、宿主免疫调节和信号传导相关的蛋白。如抗氧化的二硫键异构酶（PPI）和过氧化物酶、抗压力的热休克蛋白HSP70、HSP83、HSP beta-1和alpha-crystallin B chain（small HSP）、参与宿主免疫调节的DNaseⅡ和Ca2+信号传导、稳态的钙调蛋白、钙网蛋白和钙同线蛋白-1等。对比这些功能差异蛋白表达量,我们发现T4 USA分离株的蛋白表达量显着上调,高于其它三组。此外,我们发现伪旋毛虫分泌的RWD domain-containing protein 2B蛋白与能够参与宿主免疫调节激发宿主Th2型反应,抑制Th1型反应的53kDa糖蛋白（rTsP53）同源度较高（query cover为97%）,伪旋毛虫这个蛋白是否也行使相似的蛋白功能,在我们以后的研究中会进一步验证。最后,我们利用2DE-Western blot结合MALDI-TOF/TOF-MS/MS鉴定伪旋毛虫成虫和新生幼虫ES产物,通过肽指纹图谱PMF共识别出大约24个匹配的蛋白点,并确定为12种不同的蛋白。GO注释分析其主要的分子功能为DNase II活性和丝氨酸型肽链内切酶活性。对其蛋白功能分类分析发现与免疫调节相关的DNase II和丝氨酸蛋白酶、运输或储存金属离子的PCHTP蛋白、利于成虫对宿主免疫应答逃避的venom allergen 5蛋白和可以作为侵入宿主的毒力因子烯醇酶等。丝氨酸蛋白酶在马来丝虫微丝蚴ES产物中确认其具有抑制炎性细胞的聚集及炎性因子的释放,从而介导宿主的免疫抑制作用,本实验在成虫和新生幼虫ES产物中发现的多个丝氨酸蛋白酶推测可能也参与宿主免疫抑制作用,后续研究我们会继续验证。此外,筛选出的这些蛋白也可以作为潜在的早期诊断或疫苗的候选蛋白。综上所述,本研究鉴定了伪旋毛虫不同发育时期（ML、Ad和NBL）ES产物,并对其功能蛋白进行分析。对理解伪旋毛虫对宿主免疫抑制能力、寄生虫与宿主互作关系、早期潜在诊断蛋白筛选具有重要意义。
杨达奇[5]（2020）在《利用RNAi技术对旋毛虫丝氨酸蛋白酶和谷胱甘肽S转移酶基因功能的研究》文中进行了进一步梳理丝氨酸蛋白酶是多种寄生虫的消化酶,在寄生虫的发育和生存过程中,除了具有催化和蛋白加工的功能外,还在寄生虫成囊、组织侵袭、营养摄取、免疫逃避和致病性等方面起重要作用。旋毛虫丝氨酸蛋白酶（Trichinella spiralis serine protease,TsSP,Genbank:ABY60762）在旋毛虫侵入宿主小肠上皮细胞（IECs）,幼虫发育中亦可能发挥了重要作用。旋毛虫谷胱甘肽S-转移酶（T.spiralis glutathione-S-transferase,TsGST,Genbank:XM＿003373603.1）在旋毛虫生活史各期均有表达,主要定位在虫体的皮层、杆状体和生殖原基,抗r TsGST免疫血清对体外幼虫侵入IEC具有显着的抑制作用,表明TsGST参与了幼虫的侵入。该文应用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术对TsSP和TsGST基因的功能进行了研究,观察了RNAi对TsSP和TsGST酶活性的影响,进一步观察了RNAi对幼虫的侵袭、发育能力和生殖力的影响。根据这2种基因的mRNA序列设计小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）,利用电穿孔法将siRNA转染到幼虫体内,通过qPCR和Western blot分别在基因转录和蛋白表达调查RNAi对基因的沉默效果。应用明胶酶谱和降解底物试验观察RNAi对肌幼虫虫体可溶蛋白和排泄分泌（ES）蛋白中天然TsSP和TsGST的酶活性。体外实验观察RNAi对幼虫侵入IEC和小肠黏膜的影响。通过动物实验观察TsSP和TsGST基因沉默对幼虫的侵袭、发育能力及生殖力的抑制作用。材料与方法1.旋毛虫虫种、小鼠及细胞旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）在本实验室BALB/c小鼠中传代保种。BALB/c雌性小鼠购自河南省实验动物中心。小鼠肠上皮细胞由本实验室从正常小鼠小肠分离培养,并用于体外旋毛虫幼虫-细胞侵袭模型。2.TsSP和TsGST的诱导表达及其抗血清的制备将本实验室构建的TsSP和TsGST重组菌活化,诱导表达并纯化r TsSP和r TsGST蛋白,用于免疫小鼠,获得抗r TsSP和r TsGST的免疫血清。3.siRNA的设计与合成根据TsSP和TsGST的mRNA序列,用siDirect version2.0在线工具设计siRNA。依据筛选的每条siRNA,根据其siRNA靶向位点分别命名为TsSP特异性siRNA-156、siRNA-171和siRNA-436,以及TsGST特异性siRNA-366。同时,设计1条control siRNA并加FAM荧光标记,用作阴性对照和观察siRNA是否旋毛虫体内。4.电穿孔法将siRNA转染到旋毛虫体内电穿孔法将1.0μM siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内后,体外培养18h后荧光显微镜下观察siRNA是否进入幼虫体内。5.RNAi对基因在转录和表达水平的影响通过qPCR和Western blot技术确定TsSP-siRNA的最佳干扰效果,从1.5、2.0、2.5、3.0和3.5μM siRNA得到最好的干扰剂量,将siRNA转染幼虫1、3、5和7 d后,观察RNAi对TsSP基因在转录和蛋白表达的沉默效果。观察TsGST-siRNA在不同浓度（1.5、2.0、2.5和3.0μM siRNA）与转染不同时间（1、2、3、4和5 d）后,最佳对TsGST基因的沉默效果。6.RNA干扰基因的特异性分别将TsSP-siRNA和TsGST-siRNA利用电穿孔法导入到旋毛虫体内后,互为对照,分析RNAi对2种基因特异性沉默的特异性。7.TsSP和TsGST基因沉默对其酶活性的影响通过明胶酶谱法和降解丝氨酸特异性底物偶氮酪蛋白,观察TsSP-siRNA对TsSP酶活性的影响。应用谷胱甘肽S转移酶底物CDNB观察TsGST-siRNA对TsGST酶活性的影响。8.RNAi对幼虫存活率及侵入IEC的影响将siRNA转染到肌幼虫后,体外培养7d,观察肌幼虫形态的变化,并计算幼虫的存活率。将RNAi后体外培养1d的幼虫经5%胆汁激活为肠道感染性1期幼虫（IIL1）,然后再将100条IIL幼虫与半固体培养基混匀后接种到体外培养的IEC单层上,孵育2h后观察并计数侵入IECs的幼虫数。9.RNAi对幼虫侵入小肠黏膜的影响将RNAi后体外培养1d的100条幼虫,注射入离体的2cm长的小肠袋内,37℃、5%CO2孵育2h后,剪开小肠,观察并计数幼虫对肠粘膜的侵入率。10.RNAi对旋毛虫幼虫在小鼠体内的侵入、发育和生殖力的抑制将80只BALB/c小鼠等分为4组（20只/组）,分别为TsSP-siRNA干扰组,TsGST-siRNA干扰组,control siRNA组和PBS空白对照组。每组每只小鼠径口感染300条siRNA转染后的肌幼虫。感染6d后每组剖杀10只小鼠,回收肠道期成虫（AW）,计算成虫减虫率,分别选取10条雌成虫在37℃、5%CO2体外培养72h收集新生幼虫（NBL）,计数NBL并拍照,计算雌成虫生殖力。剩余小鼠在感染后35d,麻醉后处死小鼠,收集肌幼虫（ML）,计算每克肌肉组织的肌幼虫虫数和幼虫减虫率。同时观察各期虫体形态并测量长度。结果1.FAM荧光信号追踪siRNA导入到肌幼虫体内后,荧光显微镜下观察到虫体内有绿色荧光。2.RNAi对TsSP和TsGST基因转录和蛋白表达水平的下调2.1 RNAi对TsSP基因转录和蛋白表达的抑制作用:qPCR和Western blot结果表明,siRNA-156、siRNA-171和siRNA-436实验组的TsSP转录水平相对于PBS组分别降低了50.54%、36.36%（P<0.05）和13.41%。同PBS组相比TsSP蛋白表达量分别减少了54.55%、46.84%和30.06%（P<0.05）。siRNA-156在1.5、2.0、2.5、3.0和3.5μM时,TsSP在转录水平相对于PBS组分别减少了50.4 9%、51.49%、55.48%、50.14%和48.47%（P<0.05）,TsSP在蛋白表达水平相对于PBS组分别减少49.62%、44.38%、58.6%、51.91%和54.38%（P<0.05）。2.5μM siRNA-156在转染后1、3、5和7 d,TsSP基因在转录水平上相对于PBS组分别减少了59.98%、37.23%、36.22%和8.71%（P<0.05）。TsSP在蛋白表达水平上相对于PBS分别减少了48.35%、36.68%、35.01%和21.7 5%（P<0.05）。Control siRNA组相对于PBS组的差异无统计学意义（P>0.05）。2.2 siRNA-366对TsGST基因转录和蛋白表达水平的抑制作用:qPCR和Western blot结果表明,siRNA-366在1.5、2.0、2.5和3.0μM时,TsGST在转录水平相对于PBS组分别减少了19.53%、20.24%、21.39%和49.38%（P<0.05）。Control siRNA组相对于PBS组的差异无统计学意义（P<0.05）。TsGST在蛋白水平相对于PBS组分别减少了40.36%、41.59%、46.42%和59.18%（P<0.05）。Control siRNA与PBS组的差异无统计学意义（P>0.05）。应用3.0μM siRNA-366在转染1、2、3、4和5 d,TsGST基因在转录水平上相对于PBS组分别减少了49.09%、32.65%、15.46%、12.62%和12.14%（P<0.05）;TsGST在蛋白水平上相对于PBS组分别减少了65.22%、41.00%、19.11%、12.97%和1.97%（P<0.05）。Control siRNA组相对于PBS组的差异无统计学意义（P>0.05）。3.RNA干扰基因特异性分析利用电穿孔法将siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内培养1 d。TsSP-siRNA-156处理组TsSP表达水平降低了57.10%（P<0.05）而TsGST蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）,TsGST-siRNA-366处理组TsGST表达水平降低了56.09%（P<0.05）而TsSP蛋白表达水平无显着性变化（P>0.05）。4.RNAi对酶活性的抑制作用4.1 RNAi对TsSP酶活性的抑制作用:明胶酶谱分析显示,2.5μM siRNA-156处理后使肌幼虫的ES蛋白降解明胶的能力明显低于control siRNA和PBS组。通过降解偶氮酪蛋白来检测siRNA-156处理后的TsSP酶活性。在siRNA-156处理组、control siRNA和PBS对照组中,相对于PBS组,siRNA-156处理组的肌幼虫ES蛋白中TsSP降解偶氮酪蛋白的酶活性降低了61.38%（F=1570.157,P<0.05）。4.2 RNAi对TsGST酶活性的抑制作用:酶活性分析表明,在siRNA-366组,TsGST催化还原性谷胱甘肽结合CDNB的酶活性为0.55±0.35 U/mg蛋白,在control siRNA组为0.94±0.12 U/mg蛋白,PBS组为1.00±0.078 U/mg蛋白。siRNA-366组和PBS组之间,TsGST的酶活性的差异有统计学意义（F=18.063,P=0.003）。control siRNA组和PBS对照组酶活性的差异无统计学意义（P=0.445）。结果表明,siRNA-366干扰可降低幼虫的TsGST的酶活性。5.RNAi后虫体存活率RNAi后培养1 d,siRNA-156、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是4.67%、4.33%和3.33%（P>0.05）,培养7d后,siRNA-156、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是33.33%、32.00%和31.67%（P>0.05）。结果表明,应用siRNA-156后幼虫的存活率无明显变化。RNAi后培养1 d,siRNA-366、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是4.33%、4.00%和3.67%（P>0.05）,培养7d后,siRNA-366、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是35.67%、34.33%和32.33%（P>0.05）。结果表明,siRNA-366幼虫的存活率无明显变化。6.RNAi对幼虫侵入IEC的抑制6.1 siRNA-156对幼虫体外侵入IEC的抑制作用:将IIL1接种到IEC单层上并培养2 h,IIL1侵入并在细胞单层中迁移。siRNA-156组的幼虫侵入率（40.90%）显着低于control siRNA组（65.76%）和PBS组（64.47%）（χ2=20.999,P<0.0001）。结果表明,siRNA-156下调TsSP基因可明显抑制IIL1对IEC的侵入。6.2 siRNA-366对TsGST的沉默抑制幼虫侵入IEC:将IIL1幼虫添加到IEC单层并培养2 h后,IIL1侵入IECs并在IEC单层中迁移。siRNA-366组的幼虫侵入率（42.93%）显着低于control siRNA（64.33%）和PBS组（65.20%）（χ2=10.502,P<0.05）。与PBS组相比,siRNA-366对幼虫的侵袭具有明显的抑制作用,抑制率为34.16%。Control siRNA与PBS对照组侵入率的差异无统计学意义（χ2=0.10,P>0.05）。7.RNA干扰对幼虫侵袭小肠黏膜的抑制7.1 siRNA-156对幼虫侵袭离体小肠黏膜的抑制作用:将IIL1灌注到小肠腔中并与Tyrode溶液孵育2 h后,幼虫侵入肠粘膜。siRNA-156、control siRNA和PBS对照组的幼虫侵袭率分别为51.00%、68.00%和69.00%（χ2=8.748,P=0.013<0.05）。结果表明,与PBS相比,siRNA-156对幼虫侵入肠粘膜的抑制率为26.09%。7.2 siRNA-366对幼虫侵入离体小肠黏膜的抑制:注射经siRNA处理的IIL1并在小肠中孵育,培养2 h后,IILI侵入肠粘膜。结果表明,siRNA-366实验组的幼虫侵入率为36.00%,control siRNA对照组的幼虫侵入率为56.00%,PBS组的侵入率为58.00%。siRNA-366处理组的幼虫侵入率明显低于control siRNA组和PBS对照组（χ2=11.840,P<0.05）。8.RNAi对幼虫在小鼠体内的侵入、发育和生殖力的抑制8.1 TsSP基因沉默对幼虫的侵入、发育和生殖力的抑制:与PBS对照组相比,siRNA-156组的成虫和肌幼虫减虫率分别为是58.85%和60.48%。siRNA-156处理幼虫攻击感染6 d,siRNA-156组的成虫荷（49.91±6.47）明显低于control siRNA组（120.64±9.71）和PBS组（121.27±8.96）(Fadults=256.630,P<0.05),siRNA-156实验组雌成虫所产新生幼虫数量（60.78±6.01）条,明显低于control siRNA对照组的（87.94±5.88）条和PBS组的（87.47±4.85）条(FNBL=50.440,P<0.05)条。siRNA-156转染幼虫攻击感染小鼠后35 d,肌幼虫荷（1245.736±248.0253）明显低于control siRNA组（2942.374±245.7014）和PBS组（3152.836±565.38）的肌幼虫荷(F larvea=81.877,P<0.05)。测量旋毛虫各期虫体长度,siRNA-156组的雌成虫长度（2076.51±420.98）μm明显低于control siRNA对照组（2489.28±374.71）μm和PBS组（2437.34±270.93）μm(Ff AW=5.817,P<0.05);siRNA-156组的雄成虫长度（930.67±88.92）μm明显低于control siRNA组（1159.60±220.53）μm和PBS组（1191.67±138.93）μm(Fm AW=9.617,P<0.05)。siRNA-156组的新生幼虫长度（87.694±19.34）μm低于control siRNA对照组（103.5±12.05）μm和PBS组（110.52±10.72）μm(FNBL=9.753,P<0.05)。siRNA-156组的肌幼虫长度（923.54±115.61）μm低于control siRNA组（1144.54±114.14）μm和PBS组（1125.24±80.90）μm(FML=40.933,P<0.05)。8.2 TsGST基因沉默对幼虫的侵入、发育和生殖力的抑制:与PBS对照组相比,siRNA-366组的成虫和肌幼虫减虫率分别是62.82%和65.07%。siRNA-366处理幼虫攻击感染小鼠后6 d,siRNA-366组的成虫数（45.09±7.45）明显低于control siRNA组（120.64±9.71）和PBS组（121.27±8.96）(Fadults=15642.775,P<0.05)。siRNA-366实验组雌成虫的新生幼虫产量（58.31±5.60）条,明显低于control siRNA组的（87.94±5.88）条和PBS组的（87.47±4.85）条（F=89.133,P<0.05）。siRNA-366处理幼虫攻击感染小鼠后35 d,肌幼虫数（1101.268±144.5001）,低于control siRNA组（2942.374±245.7014）和PBS组（3152.836±565.38）虫数(Flarvea=105.050,P<0.05)。siRNA-366组的雌成虫长度（1949.96±326.75）μm明显低于control siRNA对照组（2489.28±374.71）μm和PBS（2437.34±270.93）μm(Ff AW=12.425,P<0.05);siRNA-366组的雄成虫长度（1019.82±74.222）μm明显低于control siRNA对照（1159.60±220.53）μm和PBS组（1191.67±138.93）μm(Fm AW=4.095,P<0.05)。siRNA-366组的新生幼虫长度（87.77±16.19）μm低于control siRNA组（103.5±12.05）μm和PBS组（110.592±10.72）μm(FNBL=11.751,P<0.05)。siRNA-366组的肌幼虫长度（910.01±119.80）μm低于control siRNA对照组（1144.54±114.14）μm和PBS组（1125.24±80.90）μm(FML=44.961,P<0.05)。结论1.应用电穿孔法成功将TsSP和TsGST的特异性siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内。2.siRNAs下调TsSP和TsGST的转录和蛋白表达水平,并抑制了其酶活性。3.TsSP和TsGST基因沉默显着性抑制了旋毛虫幼虫对小肠上皮细胞和肠黏膜的侵入以及虫体发育,并降低了雌虫生殖力。4.TsSP和TsGST在旋毛虫侵入、发育和生殖等方面发挥了重要作用,可作为抗旋毛虫疫苗潜在的分子靶标。
罗晓翠[6]（2020）在《旋毛虫感染激活肠道簇细胞中苦味受体介导的信号通路》文中指出旋毛虫呈世界性分布,能造成严重的人畜共患病。而簇细胞作为一种占比较小的肠上皮细胞,在识别和响应寄生虫感染的过程中起着重要作用。研究表明簇细胞能接收寄生虫感染信号,并释放细胞因子IL-25触发II型天然免疫反应,最终将寄生虫驱逐出体内。然而,对于簇细胞是如何接收寄生虫感染信号及其胞内的信号转导机制还知之甚少。在本研究中,我们揭示了肠道簇细胞表达的苦味受体及其信号通路在检测旋毛虫感染及引发的II型免疫反应中的重要作用。分子机制研究表明,旋毛虫抽提液和排泄分泌液能诱导肠细胞产生IL-25,且这种效应能被苦味受体抑制剂明显抑制。再者,这两种物质还能诱导肠类器官中的簇细胞产生明显的钙反应。部分在旋毛虫感染后的肠细胞中及IL-13处理的类器官中表达量上调的苦味受体在簇细胞亚型中表达,而旋毛虫抽提液、排泄分泌液及苦味物质均能激活体外异源表达的苦味受体。此外我们利用基因敲除小鼠及有关的生化抑制剂等确定了参与下游信号通路的蛋白。研究表明旋毛虫感染激活了簇细胞上的苦味受体,这些受体反过来又激活三聚体G蛋白。通过对旋毛虫感染前后基因的表达情况分析发现Gαo Gβ1γ13在簇细胞中表达,且G蛋白αo/i,Gβγ亚基和磷脂酶Cβ/γ2抑制剂的应用大大降低了肠细胞中IL-25的释放。另外基因敲除小鼠实验表明Gγ13敲除小鼠中旋毛虫感染诱发的簇细胞增生程度明显低于野生型。游离的Gβγ刺激细胞膜上的磷脂酶Plcβ/γ2产生第二信使三磷酸肌醇（IP3）。与味觉细胞不同,肠道中的簇细胞表达IP3的受体亚型Ip3r2,IP3与其受体Ip3r2使得胞内自由钙离子浓度升高,打开了细胞膜上的瞬时受体电位离子通道（Trpm5）。进一步研究发现Trpm5敲除小鼠在感染旋毛虫后肠道簇细胞的增生明显受阻。再者,Trpm5离子通道增强剂Stevioside能在野生型小鼠中诱导产生更多的簇细胞,而这一现象在Trpm5敲除小鼠中却未被观察到。我们还发现,与囊泡运输相关的蛋白转运抑制剂能明显抑制IL-25的释放,因此,Trpm5阳离子通道打开导致膜电位去极化,促使IL-25以囊泡的形式从簇细胞中释放出来,触发II型免疫反应。综上所述,我们鉴定发现簇细胞表达的苦味受体能够接收旋毛虫感染信号,并阐明了由其介导的下游参与信号转导的元件。此项研究不仅为防止和治疗线虫寄生虫感染提供了新思路,而且对理解苦味受体和簇细胞在其它组织中的功能有着重要的指导意义。
张雨璐[7]（2020）在《旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫期排泄分泌物蛋白质组学分析》文中指出旋毛形线虫（Trichinella spp.）,又称旋毛虫,截至目前已分离鉴定出13种不同的类群[1]。根据其生活史中肌幼虫期是否在宿主肌细胞重组过程中形成包囊主要被分为两个进化枝,即有包囊虫种和无包囊虫种。旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）和伪旋毛虫（Trichinella pseudospiralis,T4）作为两大进化枝的代表虫种,其区别除是否形成包囊外,还在于易感宿主和感染后炎症反应的差异。就目前的流行病学调查发现T4是旋毛虫种属中唯一一个可以感染鸟类的虫种,其余则仅寄生于脊椎哺乳动物宿主。造成以上差异的原因很可能是由于虫种间排泄分泌物（excretory-secretory products,ESP）不同所致。ESP成分复杂,又直接暴露于宿主免疫系统,参与机体细胞调控,与寄生虫的寄生生活和致病性密切相关。此外旋毛虫ESP对自身免疫性疾病具有显着的预防及治疗效果[2]。由于虫体直接寄生会对患者造成一定的心理、病理损害,加之旋毛虫衍生蛋白成分、浓度难以控制,导致相关研究及应用受限。那么鉴定筛选旋毛虫ESP中的功能性蛋白分子则既可避免旋毛虫感染带来的危害,又可代替旋毛虫寄生为治疗自身免疫疾病提供新思路和新方向。本实验预期从T1、T4排泄分泌物入手,从蛋白质水平初步筛选影响包囊形成和/或参与免疫调节的相关蛋白分子。首先进行T1、T4肌幼虫时期排泄分泌物的收集,SDS-PAGE鉴定ESP蛋白质量后利用iTRAQ技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation）对二者进行蛋白鉴定以及差异表达蛋白的筛选。该过程共鉴定到蛋白1027个,T1中表达上调蛋白163个,T4中表达上调蛋白31个。T1中表达丰度较高的有DNaseⅡ家族（包括具有DNaseⅡ活性的Plancitoxin-1）、丝氨酸蛋白酶及丝氨酸蛋白酶抑制剂、胱抑素样蛋白、烯醇酶、热休克蛋白、核苷酸酶等;T4上调表达的主要有钙粘蛋白、DNaseⅡ、Moesin/ezrin/radixin蛋白、β-己糖胺酶、组蛋白H2B/H4等。为验证iTRAQ鉴定结果的准确性,对选取的9个蛋白的编码基因采用实时荧光定量PCR进行转录水平的验证。结果与蛋白表达水平相符,证实了iTRAQ结果的可靠性。随后选取了旋毛虫胱抑素样蛋白进行后续的初步探索。根据pET22b质粒成功构建出重组旋毛虫胱抑素样蛋白-pET22b表达载体,利用大肠杆菌表达出重组旋毛虫胱抑素样蛋白。生物信息学分析显示旋毛虫胱抑素样蛋白共由237个氨基酸组成,蛋白质量27.6 kDa,理论等电点8.02,N端具有1-18位氨基酸的信号肽。蛋白细胞亚定位显示其位于细胞质。具有5个酪蛋白激酶II磷酸化位点;3个N-肉豆蔻酰化位点;3个蛋白激酶C磷酸化位点以及1个酪氨酸激酶磷酸化位点。无保守的半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域,与现存的几种寄生性线虫的cystatin同源性极低。该蛋白可能为一种新型旋毛虫分泌型胱抑素样蛋白。之后使用重组旋毛虫胱抑素样蛋白免疫家兔获得抗血清,利用抗血清对虫体的间接免疫荧光实验发现该蛋白定位于虫体表面及包囊上。最后,使用重组旋毛虫胱抑素样蛋白免疫小鼠,三次免疫后进行攻虫计算减虫率探究旋毛虫胱抑素样蛋白对小鼠的保护作用。减虫率显示旋毛虫胱抑素样蛋白免疫组平均每只小鼠检获肌幼虫与PBS和佐剂对照组在分别感染T1、T4后相比均有显着性差异（P<0.05）,T1肌幼虫减虫率达到60.54%,T4肌幼虫减虫率达到37.49%。旋毛虫重组胱抑素样蛋白对T1感染小鼠有较好的减虫效果。综上所述,本研究一方面对旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫期排泄分泌物的差异蛋白进行了总体分析,另一方面发现一种定位于旋毛虫虫体和包囊上的新型重组旋毛虫胱抑素样蛋白,它对旋毛虫和伪旋毛虫分别感染的小鼠有较好的减虫效果。
姜鹏[8]（2020）在《旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究》文中进行了进一步梳理旋毛虫（Trichinella spiralis）是重要的食源性寄生线虫,其成虫寄生于宿主小肠黏膜内。幼虫能否侵入宿主肠黏膜,是旋毛虫感染宿主与致病的关键;然而,幼虫侵入肠黏膜的机制仍不清楚。形态学研究发现,侵入期幼虫的口孔并无齿（矛）状结构,因而,幼虫侵入肠黏膜并非单纯机械力作用,极可能是幼虫的蛋白酶介导了侵入过程。烯醇酶（enolase）是糖酵解过程的关键酶,也是一个多功能蛋白,在纤溶系统激活、肌肉再生、细胞应激、癌细胞转移及感染等过程中发挥重要功能。研究表明,烯醇酶参与了病原生物感染宿主的过程并发挥了重要作用。我们的前期研究发现,幼虫在与宿主小肠上皮细胞（IECs）共孵育后,旋毛虫烯醇酶基因（Ts-eno）的相对转录水平显着升高,旋毛虫烯醇酶（Ts ENO）的表达量明显增加;此外,在旋毛虫肠道感染性幼虫（IIL）的表面蛋白中也鉴定出了高丰度的Ts ENO;提示,Ts ENO参与了幼虫侵入宿主肠黏膜的过程,但尚不清楚Ts ENO在幼虫侵入过程中发挥作用的具体方式和分子机制。截至目前,已在多种病原体（细菌、原虫、蠕虫和昆虫）侵入宿主的过程中观察到烯醇酶结合宿主纤溶酶原（PLG）,促进纤溶系统激活,加速病原体入侵的现象。纤溶系统不仅在血管内发挥作用,在组织液中也广泛分布。生理状态下,由于纤溶酶原激活物（PAs）与纤溶抑制物（PAI-1和α2-AP）相互制约,机体内纤溶系统维持凝血与纤溶之间的动态平衡,避免出现纤溶亢进（出血倾向）或血栓形成。研究提示,烯醇酶在感染过程中可作为PLG的受体,打破纤溶系统的动态平衡,促进纤溶系统激活,利用纤溶酶（PLM）靶向降解细胞外基质（ECM）的作用,协助幼虫侵入,但分子机制尚不明确。Ts ENO能否作为宿主PLG的受体?能否结合宿主组织液中的PLG并与之发生相互作用?Ts ENO打破平衡态纤溶系统、促进纤溶系统激活的分子机制是什么?Ts ENO是否具有促进幼虫侵入宿主的功能?是本研究关注的科学问题。本研究应用生物信息学技术,深入分析了Ts ENO的分子生物学特征,构建了Ts ENO的3D分子模型,并与已解析晶体结构的人PLG分子进行对接,明确了Ts ENO结合宿主PLG并发生相互作用的方式和分子机制;在对Ts ENO进行系统的生物信息学研究基础上,体外表达、纯化出重组的Ts ENO（r Ts ENO）和定点突变的重组Ts ENO（M-r Ts ENO）,分别制备对应的抗血清;分析了Ts-eno在旋毛虫不同发育期的转录表达水平及Ts ENO的虫体组织定位;对r Ts ENO与宿主肠黏膜、PLG的结合能力进行了鉴定;分析r Ts ENO的酶活性,通过竞争性结合实验和PLG激活试验,验证了Ts ENO与PLG相互作用的分子机制;通过旋毛虫体外侵入细胞模型、动物试验和RNA干扰技术（RNAi）,从多个层次和不同角度,正、反向反复验证了Ts ENO通过激活宿主纤溶系统协助幼虫入侵肠黏膜的科学假设。材料与方法1.旋毛虫种株、实验动物、表达质粒、菌株及细胞旋毛虫河南猪源分离株（T.spiralis,T1）,昆明小鼠保种传代。实验动物为SPF级、雌性6周龄BALB/c小鼠,购自河南省实验动物中心。表达载体p QE-80L及大肠杆菌BL21均为本实验室-80℃冷冻保存。细胞为本实验室分离、原代培养的胎鼠小肠上皮细胞（IECs）。2.Ts ENO的分子生物学特征及与PLG结合能力的分析和实验验证应用生物信息学技术,对Ts ENO（XP＿003371233）的分子生物学特征进行了系统分析;应用Signal P预测信号肽,使用I-TASSER构建Ts ENO的3D分子模型,采用SAVES及Super Pose评估和验证Ts ENO 3D分子模型质量,采用ZDOCK将Ts ENO与PLG（PDB ID:4DUR）进行分子对接,VMD、Lig Plot+（DIMPLOT）及PDBe PISA分析对接结果;明确结合关键位点后,使用I-TASSER构建定点突变的M-Ts ENO分子模型,对比分析关键位点突变产生的影响。将重组p QE-80L/Ts ENO、p QE-80L/M-Ts ENO转化入感受态大肠杆菌BL21（DE3）进行原核表达;Far-Western blot和ELISA检测r Ts ENO、M-r Ts ENO与PLG的结合情况;应用?-ACA,采用竞争性结合试验验证关键位点突变对结合的影响。3.Ts ENO促进纤溶系统激活的分子机制及实验验证应用VMD、Lig Plot+（DIMPLOT）及PDBe PISA分别分析Ts ENO、M-Ts ENO与决定PLG活性的关键色氨酸残基（Trp761）之间的相互作用;计算色氨酸残基（Trp761）在与Ts ENO、M-Ts ENO结合前后相互作用面积（2）、相互作用残基的溶液可及表面积(AASA)、溶剂化能（ΔiG）、氢键、二硫键及疏水相互作用的变化,测量并比较Trp761与其相互作用残基间的距离;测定纯化复性后r Ts ENO、M-r Ts ENO的酶比活力;应用PLG激活试验,观察r Ts ENO、M-r Ts ENO结合并激活PLG产生纤溶酶（PLM）的情况,观察PAs存在与否对r Ts ENO、M-r Ts ENO激活PLG产生PLM的影响,验证Ts ENO通过与PLG的活性决定残基（Trp761）发生相互作用促进纤溶系统激活的分子机制。4.Ts ENO在旋毛虫侵入宿主过程中的作用研究Real-time PCR分析Ts-eno在旋毛虫各期的转录水平,IFA检测Ts ENO在虫体的定位;Far-Western blot检测肌幼虫（ML）排泄分泌抗原（ES）与PLG的结合;IFA检测r Ts ENO与小鼠肠黏膜组织特异性结合;应用旋毛虫幼虫-IECs体外侵入模型,观察不同浓度r Ts ENO、不同稀释度的抗r Ts ENO血清对旋毛虫幼虫体外侵入IECs单层的促进及抑制作用;设计、合成特异性靶向Ts-eno的小干扰RNA（si RNA）,使用电穿孔法导入旋毛虫幼虫体内,应用Western blot检测si RNA对Ts ENO表达水平的抑制情况,通过RNAi反向验证Ts ENO在幼虫侵入过程中的功能;应用r Ts ENO免疫60只BABL/c小鼠后,将旋毛虫肌幼虫以300条/鼠的剂量感染BALB/c小鼠,分别于感染后第5 d和42 d,收集肠道成虫和肌幼虫,统计回收虫数、减虫率、肌肉虫荷（LPG）和生殖力指数（RCI）,分析r Ts ENO免疫小鼠后对幼虫侵入的影响,验证Ts ENO在幼虫侵入肠黏膜过程中的功能。5.统计学分析应用IBM SPSS 21.0统计分析软件包对结果数据进行统计学描述、假设检验及图表绘制,检验水准设定为α=0.05。结果1.Ts ENO的分子生物学特征及其与PLG结合的关键位点确定切除信号肽的Ts ENO长473 aa,约51.95 k Da;Ts ENO与常见寄生虫烯醇酶的序列一致性为62.09%～98.91%,具有烯醇酶家族特征性MOTIF,结构域、金属结合位点、激活位点和底物结合口袋呈现高度保守特征。Verify 3D发现Ts ENO分子模型82.24%残基的3D-1D评分≥0.2,ERRAT计算出Ts ENO的全局质量因子为90.753,拉氏图显示Ts ENO在允许区域内分布的残基占比为98.8%。Super Pose三维结构多重比对结果表明,Ts ENO的结构与5种已解析晶体结构的寄生虫相关烯醇酶（3QTP、1OEP、4G7F、3OTR和5WRO）高度一致;在碳骨架和全分子的均方根偏差（RMSD）最大仅分别为2.03和2.18。Ts ENO和PLG具有结构互补性,赖氨酸残基（Lys90、289、291和300）在结合时发挥关键作用,其中Lys90与PLG的Ser383形成氢键。Ts ENO与M-Ts ENO在碳骨架和全分子间的RMSD仅分别为2.63和3.30,但将M-Ts ENO与PLG对接时,M-Ts ENO出现在相互作用面上的赖氨酸残基仅有Lys116。Far-Western blot发现,r Ts ENO、M-r Ts ENO均能特异性结合PLG,但相同条件下M-r Ts ENO的识别条带明显弱于r Ts ENO。ELISA表明,与r Ts ENO相比,M-r Ts ENO的PLG结合能力明显下降,下降幅度最高达45.37%。不同浓度的ε-ACA均能与r Ts ENO或M-r Ts ENO竞争性结合PLG,ε-ACA的竞争性抑制作用具有随浓度升高而增强的线性趋势(Fr Ts ENO=3532.392,FM-r Ts ENO=3499.730,P均<0.01);不同浓度ε-ACA对r Ts ENO的竞争性抑制作用显着高于M-r Ts ENO（t=3.411,P<0.05）。浓度为25 mmol/L时,ε-ACA对r Ts ENO、M-r Ts ENO的竞争性抑制率分别为64.25%和33%。2.Ts ENO促进纤溶系统激活机制的分析与验证对Ts ENO-PLG蛋白复合物的分析发现,Ts ENO的Glu303与决定PLG活性的关键残基Trp761间的平均距离为7.28 1.60,二者可以通过疏水相互作用结合在一起,Glu303与Trp761在结合时的埋入面积(ABSA)分别为33.97 2和29.55 2,ΔiG依次为-0.24 kcal/mol和0.47 kcal/mol。Trp761与M-Ts ENO（Glu303Ala）的Lys90、Ser91,以及与M-Ts ENO（Lys90 Ala、Lys289Ala、Lys291Ala和Lys300Ala）的Phe48、Tyr93之间,均存在疏水相互作用;Trp761与Lys90、Ser91之间的距离分别为5.35 0.43和7.27 1.41,与Phe48、Tyr93之间的距离分别为5.57 0.51和6.76 0.84。单因素方差分析表明,Trp761与不同相互作用残基之间距离的差异具有统计学意义（F=10.546,P<0.01）;根据相互作用残基间的空间几何构型,Trp761（PLG）在与Glu303（Ts ENO）相互作用时产生的空间位移最大（7.28）;互作产生的位移在一定程度上减少了Trp761对PLG底物结合口袋（由催化残基His603、Asp646和Ser741组成）的物理阻挡,有利于PLG的激活。Ts ENO催化糖酵解途径中2-PGA PEP反应的活性位点（Glu246、Lys382）在突变前后均未出现在与PLG的相互作用面上。在37℃、p H=7.5的反应条件下,r Ts ENO和M-r Ts ENO催化正向反应（2-PGA?PEP）时的酶比活力分别为36.77 20.22 U/mg和34.63 16.86 U/mg,逆向反应时依次为16.73 10.70 U/mg和17.20 13.82 U/mg;r Ts ENO和M-r Ts ENO催化正向反应时（2-PGA?PEP）的Km值分别为0.78 mmol/L和0.80 mmol/L,最大反应速率Vmax分别为0.42μmol/min/mg和0.40μmol/min/mg。含有Mg2+的缓冲体系可使r Ts ENO和M-r Ts ENO达到最佳酶催化活力,Zn2+、Mn2+、Fe2+和Cu2+的促进作用不及Mg2+,K+、Ni2+、Al3+、Ca2+和Li+对该酶促反应仅有非常微弱的启动作用,而Cr3+则对r Ts ENO和M-r Ts ENO的酶活性具有完全的抑制作用。PLG或t-PA单独与r Ts ENO、M-r Ts ENO、肌幼虫可溶性抗原或ES抗原相互作用时,各组OD405值之间的差异不具有统计学意义(FPLG=1.355,Ft-PA=1.013,P均>0.05);当PLG与t-PA共同存在时,t-PA可以激活PLG并产生PLM,添加不同的蛋白后,各组OD405值之间的统计学差异具有显着性(FPLG+t-PA=344.875,P<0.05);r Ts ENO、M-r Ts ENO、肌幼虫可溶性抗原和ES抗原均明显地促进PLG的激活、增加PLM的产生量（P<0.05）;其中以肌幼虫可溶性抗原的促进作用最强,随后依次为r Ts ENO、M-r Ts ENO和ES。3.Ts ENO在旋毛虫侵入IECs单层及肠黏膜过程中的作用Real-time PCR结果表明,Ts-eno在旋毛虫肌幼虫（ML）、肠道感染性幼虫（IIL）、3 d成虫（3 d AW）、6 d成虫（6 d AW）和新生幼虫（NBL）均转录,以ML期相对转录水平最高（F=7.878,P<0.05）。IFA检测发现,Ts ENO在ML、6 h IIL、24 h IIL、3 d AW、6 d AW和NBL各发育期均表达,主要定位在杆状体、表皮及胚胎中。Far-Western blot证实,ES抗原中包括特异性结合PLG的52 k Da蛋白;IFA结果表明,r Ts ENO可以与小鼠肠黏膜组织特异性结合。体外侵入实验表明,不同浓度r Ts ENO组幼虫侵入数均高于PBS对照(t2=4.564,t4=7.920,t6=24.588,t8=19.100,t10=30.237,P均<0.05),幼虫侵入率具有随r Ts ENO浓度升高而增加的趋势（F=410.744,P<0.01）;抗r Ts ENO血清对幼虫侵入的抑制率最高达51.26%,抑制率具有随血清稀释倍数增加而降低的趋势（F=557.494,P<0.05）。使用si RNA-97干扰幼虫可使Ts ENO的表达量降低53.56%,对幼虫侵入IECs单层造成的抑制率为49.82%。以r Ts ENO免疫BALB/c鼠后,5 d成虫减虫率为31.79%,42 d肌幼虫减虫率为47.15%;r Ts ENO免疫组的LPG及RCI均低于佐剂组和PBS对照组(FLPG=39.375,FRCI=46.533;P均<0.01)。结论1.旋毛虫烯醇酶（Ts ENO）的4个赖氨酸残基（Lys90、289、291和300）在Ts ENO与宿主纤溶酶原（PLG）结合时发挥重要作用。2.Ts ENO 4个赖氨酸残基的定点突变,导致M-r Ts ENO与PLG的结合能力显着降低;在与t-PA共同存在时,r Ts ENO能明显地促进PLG激活。3.重组Ts ENO具有促进幼虫侵入的功能,可诱导产生特异性免疫保护;Ts ENO是旋毛虫侵入宿主肠黏膜时的重要蛋白,可能是研制新型抗旋毛虫疫苗/药物的候选靶标。
潘靖丹[9]（2020）在《旋毛虫ESPs及CPSF2对人非小细胞肺癌A549细胞作用的研究》文中指出肺癌（Lung Cancer,LC）的发病率和死亡率位居全球肿瘤首位,是一种严重危害人类身体健康的疾病。根据病理类型将肺癌分为小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）,分别占肺癌总数的20%和80%。非小细胞肺癌患者早期可进行手术治疗,中晚期患者多采用手术、化疗、放疗等手段联合治疗,不仅患者痛苦、易出现耐药性,且总体治愈率仍小于20%。因此,急需探讨和寻找新型治疗方法。旋毛形线虫（Trichinella spiralis,T.s）又称旋毛虫,可以引起人和动物的旋毛虫病,近年来研究发现,旋毛虫寄生能够抑制肿瘤生长,动物体内和体外实验均证实了旋毛虫的活性蛋白能够抑制肿瘤细胞的增殖。课题组前期研究表明旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白（Excertory-secretory proteins,ESPs）能够有效抑制肿瘤细胞增殖。转录组（Transcriptome）是某物种或者特定细胞类型产生的全部转录本的集合。能够从整体水平上研究基因功能以及结构,揭示特定生物学和疾病发生过程中的分子机制,已广泛应用于临床诊断、基础研究与药物研发等领域。目前尚未有文献报道关于旋毛虫肌幼虫ESPs作用于A549细胞后的基因表达水平和信号通路的相关研究,本研究内容之一是以A549细胞作为研究对象,通过转录组测序技术（RNA-sequencing,RNA-seq）,探究旋毛虫肌幼虫ESPs对人非小细胞肺癌A549细胞基因表达和信号通路的影响,为抗肿瘤药物的研发提供实验依据。另外课题组前期运用质谱法筛选出旋毛虫肌幼虫ESPs中的六种抗肿瘤成分,本实验筛选了其中一种即剪切聚腺苷酸化特异因子亚基2（Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor subunit 2,CPSF2）,构建了CPSF2重组蛋白及真核表达质粒,观察了CPSF2重组蛋白及质粒是否具有诱导A549细胞凋亡的作用以及作用的可能分子机制。第一部分旋毛虫肌幼虫ESPs作用于A549细胞转录组学研究目的:通过转录组测序技术探究旋毛虫肌幼虫ESPs作用于A549细胞后基因表达水平和信号通路变化情况。方法:1构建文库:按照NEB Next Poly（A）m RNA Magnetic Isolation Module试剂盒说明书对各组样本进行m RNA富集。使用KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit（Illumina）处理产物RNA后构建文库。2测序:使用Illumina Nova Seq 6000测序仪测序。3对实验组和对照组6个样本的转录组测序数据进行转录表达定量分析、差异表达基因筛选、GO功能显着性富集分析、Pathway通路分析。结果:1对照组3个样本和实验组3个样本分别得到31475828、28699647、33661971、33000876、25627123、27549020个Read Pairs。2经过差异分析后得到2860个差异表达基因,其中含有上调基因为1634个,下调基因为1226个。3在上调的表达基因中,富集基因最多的三个条目分别是生物过程分类中的发展过程条目、分子功能分类中的蛋白结合条目和细胞组分分类中的细胞条目。在下调基因中,富集基因最多的三个条目分别是生物过程分类中的代谢过程条目、分子功能分类中的酰胺结合条目和细胞组分分类中的胞内条目。4 2860个差异表达基因共参与了74个信号通路,其中71个信号通路被显着富集（P<0.05）。上调基因富集差异最多的通路为癌症通路,下调基因富集差异最多的通路为代谢途径。结论:1旋毛虫ESPs对A549细胞基因表达和信号通路均有影响,经过差异分析后得到2860个差异表达基因,其中上调基因为1634条,下调基因为1226条。2差异表达基因涵盖细胞组分、分子功能、生物过程三个方面。并主要富集在71个信号通路中。第二部分CPSF2真核表达质粒的构建及对A549细胞凋亡和周期的影响目的:通过构建CPSF2原核表达和真核表达载体,研究重组蛋白和真核表达质粒对非小细胞肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响,探讨CPSF2重组蛋白和真核表达质粒诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡的可能机制。方法:1 Annexin V-FITC/PI双染法检测A549细胞凋亡率:实验组将2μg、4μg的质粒分别转染A549细胞后培养24h,空质粒组加入100μL无血清培养基和10μL转染试剂,转染A549细胞后培养24h,阴性对照组不做任何处理,收集细胞后用PI染色液和FITC染色液染色,通过流式细胞仪检测A549细胞凋亡情况。2 PI染色法检测A549细胞周期阻滞:实验组将2μg、4μg的质粒分别转染A549细胞后培养24h,空质粒组加入100μL无血清培养基和10μL转染试剂,转染A549细胞后培养24h,阴性对照组不做任何处理,收集细胞后用PI染色液染色,通过流式细胞仪检测A549细胞周期阻滞情况。3 Real-time PCR方法检测A549细胞凋亡相关因子的m RNA转录水平:实验组将2μg、4μg的质粒分别转染A549细胞后培养24h,空质粒组加入100μL无血清培养基和10μL转染试剂,转染A549细胞共后培养24h,提取核酸检测Bip、Atf4、Chop、Perk、Elf2α、Bax、Caspase-3、Caspase-9基因的转录水平。4统计学分析:使用SPSS19.0统计学软件对数据进行分析。采用单因素方差分析处理数据。P<0.05代表差异具有统计学意义。结果:1 Annexin V-FITC/PI双染法检测A549细胞凋亡率:对照组、空质粒组、低浓度质粒转染组、高浓度质粒转染组的总凋亡率分别为35.89%、34.15%、38.76%、49.8%,和空质粒组总凋亡率相比,低浓度质粒转染组、高浓度质粒转染组的总凋亡率高于空质粒组并呈逐渐递增的趋势,且以晚期凋亡为主,差异具有统计学意义（P<0.05）。对照组、空质粒组、低浓度质粒转染组、高浓度质粒转染组的晚期凋亡率分别为29.46%、29.46%、34.15%和43.81%,和空质粒组晚期凋亡率相比,低浓度质粒转染组、高浓度质粒转染组的晚期凋亡率高于空质粒组并呈逐渐递增的趋势,差异具有统计学意义（P<0.05）。2 PI染色法检测A549细胞周期阻滞:G0/G1期细胞所占比例:对照组为（49.6±0.87）%;空质粒组为（48.64±0.13）%;低浓度质粒转染组为（42.0±0.35）;高浓度质粒转染组为（53.34±1.02）%。和空质粒组相比,高浓度质粒转染组G0/G1期细胞所占比例增高（P<0.05）表明高浓度质粒转染组细胞阻滞在G0/G1期。S期所占细胞比例:对照组为（35.2±6.5）%;空质粒组为（41.88±0.82）%,低浓度质粒转染组为（48.70±2.79）%;高浓度质粒转染组为（36.11±6.48）%。和空质粒组相比,低浓度质粒转染组S期所占比例增高（P<0.05）,表明低浓度质粒转染组细胞阻滞在S期。3 Real-time PCR方法检测A549细胞凋亡相关因子的m RNA转录水平:Real-time PCR结果显示,与空质粒组对比,低浓度质粒转染组的Bip、Perk、Elf2α的m RNA转录水平呈上调趋势（P<0.05）,差异具有统计学意义。与空质粒组对比,高浓度质粒转染组的Bip、Perk、Elf2α的m RNA转录水平无明显变化（P>0.05）。与空白对照组相比,低浓度质粒转染组和高浓度质粒转染组的Chop、Atf4的m RNA转录水平均无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组相比,低浓度质粒转染组及高浓度质粒转染组的Caspase-3、Caspase-9、Bax的m RNA转录水平均无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1 CPSF2真核表达质粒转染于人非小细胞肺癌A549细胞株,可以诱导A549细胞发生凋亡,以晚期凋亡为主。可能是通过上调Bip、Perk、Elf2α而发挥作用。2 CPSF2真核表达质粒转染于人非小细胞肺癌A549细胞株,低浓度质粒转染组和高浓度质粒转染组分别阻滞A549细胞于S期和G0/G1期。
李坤[10]（2019）在《牦牛和藏猪常见原虫调查及藏猪肺线虫线粒体基因组分析》文中研究指明牦牛是地理分布非常有限的偶蹄动物之一,也是高寒地区特有牛种,更是高原地区支柱产业,当地牧民的主要经济来源之一。高寒藏香猪是世界上高海拔地带比较少见的小型猪种,亦是我国珍贵的、独有的猪种。然而,寄生虫病严重威胁着牦牛、藏猪的健康,也制约着牦牛、藏猪产业的发展,某些人畜共患寄生虫,更潜在威胁着人类的健康。近年来,牦牛频发腹泻病,至今尚不清楚导致牦牛腹泻的具体病原。而寄生虫所致的动物腹泻病,占所有腹泻疾病的40%。故为摸清我国珍贵动物（牦牛、藏猪）的常见原虫流行状态;初步挖掘牦牛腹泻的寄生虫病原体;揭示牦牛、藏猪寄生虫的分子特征、挖掘潜在的药物靶基因。本研究开展了牦牛、藏猪常见原虫的血清学调查;基于高通量测序的腹泻牦牛寄生虫病原调查;牦牛、藏猪寄生虫的分子特征研究;藏猪肺线虫线粒体基因组测序和分析,研究结果如下:1.我国高原牦牛、藏猪常见原虫血清学调查通过IHA或ELISA的检测方法对在采自我国高海拔地区的四个省份（西藏、青海、四川、甘肃）的3582份牦牛血清（2011-2017）,开展了牦牛七种寄生虫（弓形虫、犬新孢子虫、泰勒虫、巴贝斯虫、棘球蚴、贝诺孢子虫、住肉孢子虫）的血清学检测。应用ELISA法对2016年采自西藏地区的454份藏猪血清进行了棘球蚴血清学检测。结果表明牦牛这七种寄生虫的总体阳性率分别为25.0%、6.3%、15.1%、21.5%、6.5%、1.1%、0.9%;藏猪棘球蚴阳性率为7.3%。2.我国牦牛、藏猪五种寄生虫线粒体基因扩增及序列分析本研究以在我国西藏地区某屠宰场收集的藏猪肺线虫、结节线虫、蛔虫、包虫的包囊及在四川红原地区采集的牦牛蛔虫为主要研究对象。通过对寄生虫虫体的线粒体分子标记进行基因克隆、序列纯化、基因测序。应用生物信息学软件DNAMAN、Mega等,分别对这五种寄生虫的9种线粒体基因进行了多序列比对和进化分析。结果发现感染我国藏猪的肺线虫为复阴后圆线虫,其中米林县、林芝县及工布江达县藏猪源复阴后圆线虫与澳大利亚野猪源复阴后圆线虫（NC013813.1）同源性为97.5%-97.7%。感染藏猪的结节线虫为三种混合感染（齿食道口线虫、长尾肠结节虫、猩猩管口线虫）。其中猩猩管口线虫为首次在猪上发现。将从藏香猪胃和结肠分离的猩猩管口线虫与NCBI数据库比对发现,其与猩猩管口线虫（AJ619979.1）同源性分别为89%和90%。基于nad1、cox3和ITS三种分子标记基因,发现藏猪胃、盲肠、结肠的线虫阳性率分别为81.13%、66.04%和77.36%。藏猪蛔虫与猪蛔虫（日本、我国湛江）分离株的同源性为98.4%-99.9%,与人蛔虫（日本、巴西、我国临沭）分离株的同源性为99.4%-99.7%。藏猪包虫线粒体cox1基因与包虫G4型（AF346403.11）高度同源,说明感染藏猪的包虫为G4型。藏猪包虫线粒体atp6基因与包虫G6型（AY056613.1）同源性较高,说明感染藏猪的包虫为包虫G6型。感染牦牛的蛔虫为牛弓首蛔虫,且与牛弓首蛔虫（AJ937266.1）同源性为99.7%。3.腹泻牦牛寄生虫病原调查本研究从我国甘南地区,采集了健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛的粪便样品,通过提取粪便微生物基因组DNA（g DNA）和进行18S SSU r DNA序列扩增,应用高通量测序法,全面分析了健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛的粪便寄生虫的多样性与差异性。结果表明,在门水平上,健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛的粪便均检测到线虫门和顶复亚门。其中三组牦牛在线虫门上,无显着差异性（p>0.05）;而在顶复亚门上,腹泻犊牦牛显着高于腹泻成年牦牛（p<0.05）。在纲水平上,健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛的粪便均检测到侧口纲、色矛纲和Gregarinasina（顶复亚门的一个纲）,而仅有腹泻犊牦牛检测到旋毛纲和纤毛虫纲,但健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛,在这5种纲水平上均未发现明显的差异（p>0.05）。在目水平上,健康成年牦牛、腹泻成年牦牛和腹泻犊牦牛的粪便均检测到前庭目、三毛滴虫目、杆线虫目和Eugregarinorida（顶复亚门的一个目）,而Neogregarinorida（顶复亚门的一个目）、毛滴目和Hypotrichomonadida（鞭毛虫刚的一类寄生虫）,仅在腹泻成年牦牛的粪便检测到。腹泻成年牦牛在毛滴目上,显着高于健康成年牦牛（p<0.05）和腹泻犊牦牛（p<0.05）,而健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛,在这其它目水平上均未发现显着的差异（p>0.05）。在科水平上,健康成年牦牛、腹泻成年牦牛和腹泻犊牦牛的粪便均检测到Simplicimonadidae（毛滴目下的一个科）和Haemonchidae（类毛样线虫上科）。而毛圆线虫科仅在健康成年牦牛和腹泻成年牦牛粪便检测到。毛滴虫科和网尾线虫科仅在腹泻成年牦牛粪便检测到。Plectidae（色矛纲下的一个科）、圆线虫科、Echinamoebidae（变形虫门下的一个科）、衣孢虫科、伪角毛虫科和Panagrolaimidae（线虫目下的一个科）,仅在腹泻成年牦牛粪便检测到,且在毛滴虫科上,腹泻成年牦牛显着高于健康成年牦牛（p<0.05）和腹泻犊牦牛（p<0.05）。在属水平上,健康成年牦牛、腹泻成年牦牛和腹泻犊牦牛的粪便均检测到内变形虫属、布克斯顿纤毛虫属和血矛线虫属。而绕线属和Echinamoeba（变形虫门下的一个属）,仅在腹泻成年牦牛的粪便中检测到。毛圆线虫属和锥滴虫属,在健康成年牦牛和腹泻成年牦牛的粪便均检测到,但腹泻犊牦牛的粪便未发现该虫属。簇虫属仅在腹泻犊牦牛的粪便检测出,健康成年牦牛和腹泻成年牦牛的粪便均未发现该虫属。在四毛滴虫属上,腹泻成年牦牛显着高于健康成年牦牛（p<0.05）和腹泻犊牦牛（p<0.05）。4.急性腹泻犊牦牛的寄生虫病原调查本研究从我国四川某牦牛牧区,采集了健康犊牦牛、急性腹泻犊牦牛的新鲜粪便样品。以粪便寄生虫为研究对象、以18S SSU r DNA为切入点、以高通量测序为载体,全面分析了健康犊牦牛、急性腹泻血便死亡犊牦牛的粪便寄生虫的多样性与差异性,以发掘潜在的寄生虫病原体。结果表明,在门水平上,健康犊牦牛、急性腹泻便血死亡犊牦牛的粪便均检测到顶复亚门、槽虫门、苔藓虫门,且健康犊牦牛在槽虫门上显着高于腹泻血便死亡犊牦牛（p<0.0001）,而在顶复亚门上,腹泻血便死亡犊牦牛明显高于健康犊牦牛（p<0.0001）。副基体门仅在健康犊牦牛发现,而Blastocysta、变形虫门仅在腹泻血便死亡犊牦牛检出。在纲水平上,健康犊牦牛、腹泻血便死亡犊牦牛均检出Trichomonadea、Conoidasida、Phylactolaemata,而健康犊牦牛的Trichomonadea（p<0.001）和Conoidasida（p<0.0001）均显着高于腹泻血便死亡犊牦牛。Archamoebae、Aconoidasida、Blastocystidea这三纲仅在腹泻血便死亡犊牦牛粪便检出,而Hypotrichomonadea仅在健康犊牦牛检出。在目水平上,健康犊牦牛、腹泻血便死亡犊牦牛的粪便均检测到Tritrichomonadida、Eugregarinorida和Plumatellida,且Tritrichomonadida、Eugregarinorida在统计学上,健康犊牦牛明显高于腹泻血便死亡犊牦牛（p<0.0001）。Pelobiontida、Piroplasmida、Blastocystida、Adeleorina这四目仅在腹泻血便死亡犊牦牛粪便均检测到,而Hypotrichomonadida仅在健康犊牦牛检出。在科水平上,健康犊牦牛、腹泻血便死亡犊牦牛的粪便均检测到Simplicimonadidae、Gregarinidae和Plumatellidae这3科,且在统计学上,健康犊牦牛的Simplicimonadidae（p<0.0001）和Gregarinidae（p<0.01）均显着高于腹泻血便死亡犊牦牛。Entamoebidae、Theileriidae、Trichomonadidae、Blastocystidae、Cryptosporidae这5科仅在腹泻血便死亡犊牦牛检测到,而Hypotrichomonadidae仅在健康犊牦牛检出。在属水平上,健康犊牦牛、腹泻血便死亡犊牦牛的粪便均检测到Simplicimonas、Gregarina,且健康犊牦牛在这两属上均明显高于腹泻血便死亡犊牦牛,p值分<0.0001和<0.01。Entamoeba、Theileria、Tetratrichomonas、Blastocystis、Cryptosporidium这五种属仅在腹泻血便死亡犊牦牛的粪便检出,而Hypotrichomonas仅在健康组犊牦牛的粪便检测到。5.高原藏猪肺线虫线粒体基因组分析本研究通过测序,将感染藏猪的肺线虫鉴定为萨氏肺线虫（Metastrongylus salmi）,并首次揭示了藏猪M.salmi线粒体基因组信息。藏香猪M.salmi的线粒体基因组大小为13722 bp,碱基AT总含量为73.54%,核酸组成为A（23.52%）、C（6.14%）、G（19.60%）、T（50.02%）、N（UCAG）（0.73%）。包含12种蛋白编码基因（cox1、cox2、cox3、nad1、nad2、nad3、nad4、nad5、nad6、nad4L、atp6、cytb）,22个t RNA和2个r RNA（rrn L、rrn S）,而缺少编码atp8蛋白的基因。藏香猪M.salmi线粒体基因组中的nad4L、atp6、nad2、cob、cox3、cox1、cox2、nad5基因的3‘端会紧挨着一个trn碱基序。藏香猪M.salmi线粒体基因组可翻译氨基酸4237个,其中以ATA为起始密码子的最多41.7%（5/12）;以TAA或TAG为终止密码子的有11个（91.7%）。藏猪M.salmi线粒体基因使用的密码子有63种,苯丙氨酸的密码子UUU的使用频率最高,而除密码子CGC外,脯氨酸的密码子CCC的使用次数最低。综上所述本研究阐明了我国珍贵动物（牦牛、藏猪）的七种寄生虫血清流行病学特点;初步探明了牦牛腹泻的潜在寄生虫病原;确定了5种寄生虫的线粒体基因的分子特征;揭示了藏猪肺线虫线粒体基因组信息、提供了分子标记和潜在的药物靶点信息。知己（不断提高疾病的预防和治疗水平等）和知彼（全面掌握寄生虫的流行状态、分子特征等）,方能有效的解决我国高原牦牛、藏猪的寄生虫疾病,为促进我国畜牧业的蓬勃发展助力,为减少人畜共患寄生虫病对牧民的危害提供理论支持。
二、旋毛虫形态学比较与新生幼虫繁殖能力比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、旋毛虫形态学比较与新生幼虫繁殖能力比较（论文提纲范文）
（2）应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1 章 旋毛虫及旋毛虫病研究进展 |
| 1.1 旋毛虫及其生活史 |
| 1.2 旋毛虫病 |
| 1.3 旋毛虫检测方法的研究进展 |
| 第2 章 SERS在生物检测中的概况及应用 |
| 2.1 SERS概况 |
| 2.2 SERS在生物检测中的应用 |
| 第3章 UCP-ICA在生物检测中的概况及应用 |
| 3.1 UCP概况 |
| 3.2 UCP-ICA在生物检测中的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1 章 基于SERS建立旋毛虫病快速筛查模型及评价 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物和旋毛虫 |
| 1.1.2 主要试剂、耗材 |
| 1.1.3 主要实验仪器 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 旋毛虫ML收集 |
| 1.2.2 旋毛虫感染模型构建和血清样本制备 |
| 1.2.3 银纳米颗粒制备和表征 |
| 1.2.4 血清SERS光谱测量和收集 |
| 1.2.5 光谱数据处理和多元统计分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 旋毛虫ML收集后鉴定 |
| 1.3.2 银纳米颗粒表征结果 |
| 1.3.3 SERS测试结果 |
| 1.3.4 血清SERS多元统计分析 |
| 1.3.5 血清SERS官能团发掘 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 SERS光谱 |
| 1.4.2 统计分析 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 旋毛虫UCP-ICA制备及其优化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 旋毛虫虫种和实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂、耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 旋毛虫ML收集及其ES抗原制备 |
| 2.2.2 旋毛虫ML-ES抗原鉴定 |
| 2.2.3 UCNPs-ES/山羊抗兔IgG制备与表征 |
| 2.2.4 旋毛虫UCP-ICA建立与优化 |
| 2.2.5 Ts-UCP-ICA的操作流程 |
| 2.2.6 阈值(cut-off)确立 |
| 2.2.7 Ts-UCP-ICA检测不同感染剂量阳性血清的效果评价 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 旋毛虫ML-ES抗原的鉴定结果 |
| 2.3.2 UCNPs-ES/山羊抗兔IgG偶联表征 |
| 2.3.3 Ts-UCP-ICA建立与优化 |
| 2.3.4 Ts-UCP-ICA-cut-off值确定 |
| 2.3.5 Ts-UCP-ICA检测不同感染剂量阳性血清的结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 Ts-UCP-ICA评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Ts-UCP-ICA制备 |
| 3.2.2 特异性分析 |
| 3.2.3 单盲测试分析 |
| 3.2.4 一致性评价 |
| 3.2.5 稳定性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 特异性分析结果 |
| 3.3.2 单盲测试结果 |
| 3.3.3 一致性评价 |
| 3.3.4 稳定性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）旋毛虫成囊幼虫的感染性与其发育阶段的关系（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 虫种和小鼠来源 |
| 1.2 实验分组及动物感染 |
| 1.3 肌幼虫及囊包形态学观察 |
| 1.4 不同发育阶段成囊幼虫的感染性 |
| 1.5 统计学方法 |
| 1.6 伦理批准和患者知情同意 |
| 2 结果 |
| 2.1 感染组肌幼虫和囊包形态 |
| 2.1.1 感染后60 d |
| 2.1.2 感染后100 d |
| 2.1.3 感染后200 d |
| 2.1.4 感染后300 d |
| 2.1.5 感染400后d |
| 2.1.6 感染后500 d |
| 2.2 感染组肌幼虫长度和宽度 |
| 2.3 感染组囊包长度和宽度 |
| 2.4 实验组膈肌虫荷 |
| 3 讨论 |
（4）伪旋毛虫排泄—分泌（ES）产物蛋白质组学的初步分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 伪旋毛虫及伪旋毛虫病研究进展 |
| 1.1 伪旋毛虫概述 |
| 1.2 伪旋毛虫的分类 |
| 1.3 伪旋毛虫和旋毛虫差异 |
| 1.4 伪旋毛虫的宿主和分布 |
| 1.5 伪旋毛虫病的流行病学 |
| 1.6 旋毛虫病的发生机制、临床表现、诊断与防治 |
| 第二章 寄生虫的蛋白质组学研究进展 |
| 2.1 蛋白质组学概论 |
| 2.2 蛋白质组学技术体系 |
| 2.3 蛋白质组学在寄生虫领域应用 |
| 第三章 寄生虫ES产物对宿主免疫反应调节研究进展 |
| 3.1 寄生虫排泄分泌抗原(ES)免疫调节作用 |
| 3.2 伪旋毛虫免疫调节特点 |
| 3.3 伪旋毛虫免疫诊断抗原研究 |
| 3.4 免疫细胞及其细胞因子参与免疫调节作用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 猪感染伪旋毛虫的免疫反应 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 伪旋毛虫肌幼虫ES产物的差异蛋白组学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 伪旋毛虫早期诊断抗原的免疫学筛选 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
（5）利用RNAi技术对旋毛虫丝氨酸蛋白酶和谷胱甘肽S转移酶基因功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫与旋毛虫病 |
| 1.2 RNA干扰技术 |
| 1.3 TsSP的研究 |
| 1.4 TsGST的研究 |
| 1.5 研究目的 |
| 2 材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验动物、旋毛虫及细胞系 |
| 2.4 主要试剂配方 |
| 3 方法 |
| 3.1 技术路线 |
| 3.2 TsSP和 TsGST的菌种活化及表达 |
| 3.3 蛋白的纯化 |
| 3.4 TsSP和 TsGST蛋白浓度的测定 |
| 3.5 TsSP和 TsGST免疫血清的制备 |
| 3.6 ELISA法鉴定蛋白的抗血清效价 |
| 3.7 siRNA的设计和合成 |
| 3.8 旋毛虫肌幼虫的收集 |
| 3.9 将siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内 |
| 3.10 虫体可溶蛋白的提取 |
| 3.11 Western blot |
| 3.12 提取旋毛虫肌幼虫的RNA |
| 3.13 RNA反转录成c DNA |
| 3.14 Real-time PCR验证RNAi对基因的转录的影响 |
| 3.15 RNA干扰的基因特异性 |
| 3.16 明胶酶谱法证明RNAi对 TsSP基因酶活性的影响 |
| 3.17 底物偶氮酪蛋白验证RNAi对 TsSP基因酶活性的影响 |
| 3.18 底物CDNB检测RNAi对TsGST的酶活性 |
| 3.19 RNAi对幼虫在体外存活的影响 |
| 3.20 RNAi对旋毛虫幼虫体外侵入IEC的影响 |
| 3.21 RNAi对旋毛虫幼虫体外侵入小肠黏膜的影响 |
| 3.22 RNAi对旋毛虫肌幼虫侵入肠黏膜及其发育的影响 |
| 3.23 数据处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 RNAi对 TsSP基因的研究 |
| 4.1.1 siRNA的设计与合成 |
| 4.1.2 将siRNA转染到旋毛虫肌幼虫体内 |
| 4.1.3 qPCR检测siRNA对 TsSP基因转录的抑制 |
| 4.1.4 Western blot检测RNAi对TsSP的蛋白表达抑制 |
| 4.1.5 明胶酶谱法检测RNAi对 TsSP酶活性的抑制 |
| 4.1.6 偶氮酪蛋白为底物检测RNAi对 TsSP酶活性的抑制 |
| 4.1.8 siRNA-156 对幼虫体外侵入IEC的抑制作用 |
| 4.1.9 RNAi对幼虫体外侵袭肠黏膜的抑制作用 |
| 4.1.10 TsSP基因沉默对幼虫在小鼠体内侵入、发育和生殖的抑制 |
| 4.1.11 siRNA-156处理后对虫体各期形态大小的影响 |
| 4.2 RNAi对 TsGST功能的研究 |
| 4.2.1 TsGST的 siRNA设计与和合成 |
| 4.2.2 将siRNA转染到旋毛虫肌幼虫体内 |
| 4.2.3 qPCR检测siRNA-366对TsGST基因转录的抑制 |
| 4.2.4 Western blotting检测RNAi对 TsGST的蛋白表达抑制 |
| 4.2.5 CDNB为底物检测RNAi对 TsSGT酶活性的抑制 |
| 4.2.6 siRNA-366 对幼虫体外侵入IEC的抑制作用 |
| 4.2.7 siRNA-366对幼虫体外侵袭小肠黏膜的抑制作用 |
| 4.2.8 TsGST基因沉默对幼虫在小鼠体内侵入、生长和生殖的抑制 |
| 4.2.9 siRNA-366处理后对旋毛虫各个期形态大小的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 RNA干扰在寄生蠕虫中的应用 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）旋毛虫感染激活肠道簇细胞中苦味受体介导的信号通路（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 小肠上皮结构特点及类器官的形成 |
| 1.1.1 小肠上皮结构 |
| 1.1.2 小肠上皮细胞类型 |
| 1.1.3 小肠类器官的形成 |
| 1.1.4 肠道上皮细胞与微生物间的互作 |
| 1.2 簇细胞的功能 |
| 1.2.1 簇细胞的起源与发育 |
| 1.2.2 簇细胞形态及胞内结构特点 |
| 1.2.3 簇细胞基因标记 |
| 1.2.4 簇细胞相关的疾病研究 |
| 1.2.5 簇细胞在响应寄生虫感染中的作用 |
| 1.3 旋毛虫生活史及肠道对寄生虫的清除作用 |
| 1.3.1 旋毛虫的生活史 |
| 1.3.2 肠道细胞对寄生虫的清除作用 |
| 1.4 味觉信号转导途径 |
| 1.4.1 味觉信号转导途径 |
| 1.4.2 味觉细胞中苦味受体介导的信号通路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器与材料 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 抗体信息 |
| 2.1.4 常用试剂盒 |
| 2.1.5 常用试剂配制 |
| 2.2 动物实验 |
| 2.2.1 实验小鼠获取与培养 |
| 2.2.2 小鼠处理 |
| 2.2.3 旋毛虫幼虫及成虫的提取 |
| 2.2.4 旋毛虫幼虫抽提液及成虫排泄分泌液的制备 |
| 2.3 形态学实验 |
| 2.3.1 冰冻切片 |
| 2.3.2 免疫荧光染色 |
| 2.3.3 阿尔新蓝-核固红染色 |
| 2.3.4 小鼠肠道及组织切片X-gal染色 |
| 2.4 分子生物学实验 |
| 2.4.1 小鼠基因型鉴定 |
| 2.4.2 鼠三毛滴虫检测 |
| 2.5 细胞实验 |
| 2.5.1 HEK293细胞的复苏和培养 |
| 2.5.2 转染细胞 |
| 2.5.3 小鼠小肠类器官的培养 |
| 2.6 生化实验 |
| 2.6.1 钙离子成像 |
| 2.6.2 酶联免疫吸附(ELISA) |
| 2.6.3 小鼠小肠切片原位杂交 |
| 2.7 生物信息学实验 |
| 2.7.1 构建苦味受体系统进化树 |
| 2.7.2 苦味受体蛋白结构预测 |
| 2.8 统计学分析 |
| 第三章 旋毛虫感染激活簇细胞表达的苦味受体 |
| 3.1 旋毛虫感染诱导肠道免疫反应 |
| 3.1.1 旋毛虫感染诱导肠道中簇细胞和杯状细胞数量增加 |
| 3.1.2 旋毛虫感染增强肠道中Ⅱ型天然免疫反应 |
| 3.2 旋毛虫感染激活簇细胞表达的苦味受体 |
| 3.2.1 旋毛虫抽提液及排泄分泌液能激活簇细胞分泌IL-25 |
| 3.2.2 旋毛虫感染前后苦味受体的表达 |
| 3.2.3 IL-13处理增加类器官中簇细胞的数量 |
| 3.2.4 IL-13处理类器官前后苦味受体的表达 |
| 3.2.5 肠道绒毛中苦味受体的转录本数量测定 |
| 3.2.6 苦味受体在部分簇细胞亚型中表达 |
| 3.2.7 进化分析及蛋白结构预测 |
| 3.2.8 抗人TAS2R16的抗体能标记部分簇细胞 |
| 3.2.9 旋毛虫抽提液及hT2R16的配体Salicin能激活mTas2r143 |
| 3.2.10 Salicin激活肠道中的簇细胞 |
| 本章小结 |
| 第四章 旋毛虫感染激活苦味受体介导的信号通路 |
| 4.1 旋毛虫感染后激活簇细胞中与苦味受体偶联的G蛋白 |
| 4.1.1 旋毛虫感染前后G蛋白的表达情况 |
| 4.1.2 IL-13处理前后G蛋白的表达情况 |
| 4.1.3 簇细胞中表达的G蛋白亚基 |
| 4.1.4 簇细胞利用Gα-gustducin/Gβ1γ13或Gαo/Gβ1γ13响应旋毛虫感染 |
| 4.1.5 Gng13敲除影响IL-25的释放 |
| 4.1.6 Gng13敲除降低旋毛虫感染诱导的簇细胞增生 |
| 4.2 PLCβ/γ2-IP_3R2是簇细胞胞内信号级联反应的一部分 |
| 4.2.1 Plcβ/γ2在簇细胞中表达 |
| 4.2.2 Plcβ/γ2参与控制簇细胞中IL-25 的释放 |
| 4.2.3 Ip3r1/2参与簇细胞内的信号转导 |
| 4.3 增强TRPM5可促进簇细胞-ILC2环路的激活 |
| 4.3.1 Trpm5,lacZ和Dclk1在Trpm5-LacZ小鼠肠道簇细胞中共表达 |
| 4.3.2 Trpm5敲除降低旋毛虫抽提液诱导的IL-25的释放量 |
| 4.3.3 Trpm5缺失破坏旋毛虫感染引发的小肠簇细胞增生 |
| 4.3.4 Stevioside诱导Dclk1表达量增加依赖Trpm5 |
| 4.3.5 限量摄入stevioside不影响肠道鼠三毛滴虫的丰度 |
| 4.4 IL-25通过囊泡的形式从簇细胞释放出来 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 讨论与展望 |
| 5.1 病原体与簇细胞 |
| 5.2 簇细胞借助苦味受体响应旋毛虫的感染 |
| 5.3 簇细胞中Gαo/Gβ1γ13或Gα-Gustducin/Gβ1γ13介导信号转导 |
| 5.4 簇细胞胞内信号传导 |
| 5.5 TRPM5是簇细胞-ILC2环路中地关键元件 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| Real Time-PCR引物序列 |
| 作者简历 |
（7）旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫期排泄分泌物蛋白质组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 旋毛虫种属研究进展 |
| 1 旋毛虫种属 |
| 2 旋毛虫属的进化分支及主要地理分布 |
| 3 旋毛虫种属流行病学 |
| 4 旋毛虫和伪旋毛虫ESP中功能性蛋白的研究进展 |
| 4.1 43-、45-、53-kDa糖蛋白 |
| 4.2 蛋白酶 |
| 4.3 蛋白酶抑制剂 |
| 4.4 热休克蛋白 |
| 4.6 糖苷酶 |
| 4.7 核酸内切酶 |
| 4.8 胸苷酸合成酶 |
| 4.9 核苷酸代谢酶 |
| 4.10 巨噬细胞迁移抑制因子 |
| 4.11 烯醇化酶 |
| 4.12 超氧化物歧化酶 |
| 5 小结 |
| 第二章 蛋白质组概述 |
| 1 新兴蛋白质组学研究技术 |
| 2 寄生虫领域的蛋白质组学研究 |
| 3 寄生虫源半胱氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 4 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期ESP蛋白质组学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要实验动物与虫株 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 T1和T4排泄分泌产物的收集 |
| 2.2 iTRAQ鉴定T1和T4肌幼虫时期ESP中差异蛋白 |
| 2.3 数据检索及分析 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.5 实时荧光定量PCR验证部分编码差异蛋白的基因转录水平 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 T1、T4肌幼虫期ESP SDS-PAGE结果 |
| 3.2 差异表达蛋白统计 |
| 3.3 生物信息学分析 |
| 3.4 荧光定量PCR验证部分编码差异蛋白基因表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 旋毛虫胱抑素样蛋白原核表达及生物信息学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验质粒及细胞 |
| 1.4 主要试剂的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2 重组蛋白的表达及纯化 |
| 2.3 目的蛋白检测 |
| 2.4 旋毛虫重组胱抑素样蛋白生信分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组质粒酶切 |
| 3.2 重组蛋白表达纯化后SDS-PAGE结果 |
| 3.3 WB检测 |
| 3.8 浓度测定 |
| 3.9 旋毛虫胱抑素样蛋白理化性质及结构预测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 旋毛虫胱抑素样蛋白荧光定位及对小鼠感染T1和T4减虫率的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验动物及虫株 |
| 1.4 主要试剂的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.5 抗血清的制备 |
| 2.6 间接ELISA进行抗血清效价的测定 |
| 2.7 旋毛虫胱抑素样蛋白虫体免疫荧光定位 |
| 2.8 旋毛虫重组胱抑素样蛋白对小鼠感染T1和T4减虫率的影响 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 旋毛虫胱抑素样蛋白在肌幼虫虫体中的定位 |
| 3.2 重组旋毛虫胱抑素样蛋白对小鼠感染T1和T4减虫率的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在学期间成果 |
| 致谢 |
（8）旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词(Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一部分 旋毛虫烯醇酶的分子生物学特征及其与纤溶酶原的相互作用机制研究 |
| 1 方法 |
| 1.1 TsENO序列信息的获取 |
| 1.2 TsENO的理化性质分析 |
| 1.3 TsENO的疏水性分析 |
| 1.4 TsENO的亚细胞定位分析 |
| 1.5 TsENO的跨膜区分析 |
| 1.6 TsENO的信号肽预测 |
| 1.7 Ts ENO的模体(MOTIF)分析 |
| 1.8 TsENO的结构域分析 |
| 1.9 TsENO的序列保守性分析及进化树构建 |
| 1.10 TsENO的抗原位点预测 |
| 1.11 TsENO的二级结构分析 |
| 1.12 TsENO蛋白结合位点的预测 |
| 1.13 Ts ENO3D分子模型的构建及模型质量评估 |
| 1.14 Ts ENO与 PDB库中已知寄生虫烯醇酶晶体的三维结构比对 |
| 1.15 小鼠PLG与人PLG分子结构的比对与相似性分析 |
| 1.16 Ts ENO与人PLG的分子对接 |
| 1.17 Ts ENO与 PLG的相互作用分析及关键氨基酸位点的确定 |
| 1.18 PLG活性决定位点(Trp761)与Ts ENO的相互作用分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsENO的序列信息 |
| 2.2 TsENO的理化性质 |
| 2.3 TsENO的疏水性分析结果 |
| 2.4 TsENO的亚细胞定位分析结果 |
| 2.5 跨膜区分析 |
| 2.6 信号肽预测 |
| 2.7 Ts ENO的模体(MOTIF)分析 |
| 2.8 TsENO的结构域分析 |
| 2.9 TsENO的序列保守性分析及进化树构建 |
| 2.10 TsENO抗原位点及空间结构预测 |
| 2.11 TsENO的二级结构分析: |
| 2.12 TsENO蛋白结合位点的预测 |
| 2.13 Ts ENO3D分子模型的构建及模型质量评估 |
| 2.14 Ts ENO与 PDB库中已知寄生虫烯醇酶晶体的三维结构比对 |
| 2.15 小鼠PLG与人PLG分子结构的比对与相似性分析 |
| 2.16 Ts ENO与人PLG的分子对接 |
| 2.17 Ts ENO与 PLG的相互作用分析及关键氨基酸位点的确定 |
| 2.18 PLG的关键氨基酸(Trp761)与Ts ENO的相互作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 TsENO与 PLG相互作用的验证及Ts ENO在旋毛虫侵入时的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 旋毛虫种株、实验动物、表达质粒、菌株及细胞 |
| 1.5 旋毛虫各期虫体的收集与抗原制备 |
| 1.6 TsENO与 M-TsENO的重组表达、纯化与复性 |
| 1.7 rTsENO的酶活性分析 |
| 1.8 Real-time PCR检测Ts-eno的转录水平 |
| 1.9 IFA检测Ts ENO在虫体表面的表达 |
| 1.10 石蜡切片IFA检测TsENO在虫体内部的组织定位 |
| 1.11 Far-Western blot检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 1.12 ELISA检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 1.13 IFA检测TsENO与小肠上皮组织的特异性结合 |
| 1.14 赖氨酸类似物(?-ACA)竞争性结合试验 |
| 1.15 纤溶酶原激活试验 |
| 1.16 rTsENO及其免疫血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞影响 |
| 1.17 干扰TsENO的表达对IIL侵入IECs的阻断作用 |
| 1.18 rTsENO的免疫保护作用 |
| 1.19 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsENO与 M-TsENO的重组表达、纯化与复性 |
| 2.2 rTsENO与 M-rTsENO的酶活性分析 |
| 2.3 Real-time PCR检测Ts-eno在旋毛虫不同发育期的转录水平 |
| 2.4 TsENO在旋毛虫不同发育阶段虫体表面的表达情况 |
| 2.5 TsENO在旋毛虫不同发育阶段虫体的表达与定位 |
| 2.6 Far-Western blot检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 2.7 ELISA检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 2.8 IFA检测rTsENO与小肠黏膜组织的特异性结合 |
| 2.9 赖氨酸类似物(?-ACA)竞争性结合试验 |
| 2.10 纤溶酶原激活试验 |
| 2.11 rTsENO及其免疫血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞影响 |
| 2.12 抑制TsENO的表达对IIL侵入IECs的阻断作用 |
| 2.13 rTsENO的免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 烯醇酶在寄生虫侵入宿主中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）旋毛虫ESPs及CPSF2对人非小细胞肺癌A549细胞作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 旋毛虫肌幼虫ESPs作用于A549细胞转录组学研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CPSF2真核表达质粒的构建及对A549细胞凋亡和周期的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 重组蛋白技术应用于旋毛虫抗肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）牦牛和藏猪常见原虫调查及藏猪肺线虫线粒体基因组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(abbreviation) |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 牦牛和藏猪概况 |
| 1.1 牦牛和藏猪的简介 |
| 1.2 牦牛和藏猪的分布 |
| 1.3 牦牛和藏猪的价值 |
| 1.4 牦牛和藏猪的养殖现状及面临的问题 |
| 2 牦牛的主要寄生虫病 |
| 2.1 牦牛球虫病 |
| 2.2 牦牛巴贝斯虫病和泰勒虫病 |
| 2.3 牦牛皮蝇蛆病 |
| 2.4 牦牛包虫病 |
| 2.5 牦牛弓形虫病 |
| 2.6 牦牛犬新孢子虫病 |
| 2.7 牦牛隐孢子虫病 |
| 2.8 牦牛贾第鞭毛虫病 |
| 2.9 牦牛微孢子虫病 |
| 2.10 牦牛弓首蛔虫病 |
| 2.11 牦牛肝片吸虫病 |
| 2.12 牦牛住肉孢子虫病 |
| 2.13 绵羊夏伯特线虫病 |
| 3 藏猪的主要寄生虫病 |
| 3.1 藏猪弓形虫病 |
| 3.2 藏猪肺线虫病 |
| 3.3 藏猪包虫病 |
| 3.4 藏猪蛔虫病 |
| 3.5 藏猪旋毛虫病 |
| 3.6 藏猪结节线虫病 |
| 3.7 藏猪疥螨病 |
| 3.8 藏猪鞭虫病 |
| 3.9 藏猪球虫病 |
| 3.10 藏猪棘头虫病 |
| 4 寄生虫病的危害 |
| 4.1 寄生虫病对家畜的危害 |
| 4.2 寄生虫病对人的危害 |
| 4.3 寄生虫病对畜牧产业的影响 |
| 5 寄生虫的主要检测方法 |
| 5.1 流行病学 |
| 5.1.1 剖检 |
| 5.1.2 虫卵检测 |
| 5.1.3 血清学检测 |
| 5.2 寄生虫分离鉴定 |
| 5.2.1 形态学鉴定 |
| 5.2.2 分子鉴定 |
| 5.3 线粒体基因组研究 |
| 5.4 高通量测序 |
| 5.5 组学研究 |
| 6 本研究的意义 |
| 第二部分 试验部分 |
| 第一章 牦牛、藏猪七种寄生虫疾病的血清学调查 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 待检血清 |
| 2.1.2 ELISA和 IHA检测试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法及结果判定 |
| 3 检测结果 |
| 3.1 牦牛弓形虫的检测结果 |
| 3.2 牦牛犬新孢子虫血清学检测结果 |
| 3.3 牦牛和藏猪棘球虫血清学检测结果 |
| 3.4 牦牛巴贝斯虫、泰勒虫血清学检测结果 |
| 3.5 牦牛贝诺孢子虫血清学检测结果 |
| 3.6 牦牛住肉孢子虫血清学检测结果 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 弓形虫在青藏高寒地区牦牛的流行情况 |
| 4.2 犬新孢子虫在青藏高原部分地区的流行情况 |
| 4.3 棘球蚴在青藏高原部分地区的流行情况 |
| 4.4 巴贝斯虫和泰勒虫在青藏高原部分地区的流行情况 |
| 4.5 贝诺孢子虫在青藏高原部分地区的流行情况 |
| 4.6 住肉孢子虫在青藏高原部分地区的流行情况 |
| 5 总结 |
| 第二章 腹泻牦牛寄生虫病原调查 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 样品采集 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 试验试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 牦牛粪便微生物基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 18S SSU rDNA V4片段扩增 |
| 2.2.3 PCR扩增产物电泳、回收纯化 |
| 2.2.4 PCR产物荧光定量、混样 |
| 2.2.5 高通量测序文库的构建 |
| 2.2.6 文库质检与测序 |
| 2.2.7 测序分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基因组DNA提取结果 |
| 3.2 微生物18S SSU rDNA V4 区的PCR扩增结果 |
| 3.3 测序量与序列长度统计 |
| 3.4 牦牛样本Alpha多样性分析 |
| 3.5 Alpha多样性指数计算与差异性分析 |
| 3.6 不同分类水平上腹泻牦牛与健康牦牛寄生虫差异性分析 |
| 3.6.1 门水平上比较不同组牦牛寄生虫差异性 |
| 3.6.2 纲水平上比较不同组牦牛寄生虫差异性 |
| 3.6.3 目水平上比较不同组牦牛寄生虫差异性 |
| 3.6.4 科水平上比较不同组牦牛寄生虫多样性 |
| 3.6.5 属水平上比较不同组牦牛寄生虫多样性 |
| 4 分析讨论 |
| 第三章 急性腹泻牦牛的寄生虫病原分析 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 样品采集 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 试验试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 牦牛粪便微生物基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 18 S SSU rDNA V4片段扩增 |
| 2.2.3 PCR扩增产物电泳、回收纯化 |
| 2.2.4 PCR产物荧光定量、混样 |
| 2.2.5 高通量测序文库的构建 |
| 2.2.6 文库质检与测序 |
| 2.2.7 测序分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基因组DNA(g DNA)提取结果 |
| 3.2 微生物18S SSU rDNA V4 区的PCR扩增结果 |
| 3.3 测序量与序列长度统计 |
| 3.4 Alpha多样性分析 |
| 3.5 Alpha多样性指数计算与差异性分析 |
| 3.6 不同分类水平上腹泻犊牦牛与健康犊牦牛寄生虫差异性分析 |
| 3.6.1 门水平上比较不同组牦牛寄生虫差异性 |
| 3.6.2 纲水平上比较不同组牦牛寄生虫差异性 |
| 3.6.3 目水平上比较不同组牦牛寄生虫差异性 |
| 3.6.4 科水平上比较不同组牦牛寄生虫差异性 |
| 3.6.5 属水平上比较不同组牦牛寄生虫差异性 |
| 4 分析讨论 |
| 第四章 牦牛、藏猪五种寄生虫线粒体基因扩增及序列分析 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 虫株的收集与保存 |
| 2.2.2 虫株的形态学鉴定 |
| 2.2.3 虫体基因组DNA(g DNA)的提取 |
| 2.2.4 目的基因片段的扩增、电泳和切胶回收 |
| 2.2.5 DNA定量、基因克隆、质粒提取及测序 |
| 2.2.6 序列比对及进化分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR扩增结果 |
| 3.2 DNA定量、基因克隆、质粒提取结果 |
| 3.3 序列比对与进化分析 |
| 4 讨论 |
| 5 总结 |
| 第五章 藏猪肺线虫线粒体基因组分析 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 藏猪肺线虫线粒体基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 藏猪肺线虫线粒体DNA检测 |
| 2.3.3 肺线虫线粒体文库构建 |
| 2.3.4 藏猪肺线虫测序文库质量检测 |
| 2.4 测序 |
| 2.5 测序结果处理与分析 |
| 2.5.1 藏猪肺线虫线粒体基因组组装 |
| 2.5.2 藏猪肺线虫线粒体基因组注释 |
| 2.5.3 进化分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 藏猪肺线虫线粒体DNA提取结果 |
| 3.2 藏猪肺线虫线粒体基因组测序数据结果 |
| 3.3 藏猪肺线虫线粒体基因组概况 |
| 3.3.1 藏猪肺线虫线粒体基因组大小估计 |
| 3.3.2 藏猪肺线虫线粒体基因组组装结果及评价 |
| 3.4 藏猪肺线虫线粒体基因组组分分析 |
| 3.4.1 藏猪肺线虫线粒体基因组编码/非编码基因分析 |
| 3.4.2 藏猪肺线虫线粒体基因组GC含量分析 |
| 3.4.3 藏猪肺线虫线粒体基因组密码子与氨基酸分布分析 |
| 3.5 藏猪肺线虫线粒体基因组功能分析 |
| 3.6 藏猪肺线虫线粒体基因组可视化分析 |
| 3.7 藏猪肺线虫线粒体基因组进化分析 |
| 4 分析与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
四、旋毛虫形态学比较与新生幼虫繁殖能力比较（论文参考文献）
- [1]旋毛虫雌虫生殖力的影响因素及新生幼虫免疫保护作用评价[D]. 杨莹. 东北农业大学, 2021
- [2]应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究[D]. 李健. 吉林大学, 2021
- [3]旋毛虫成囊幼虫的感染性与其发育阶段的关系[J]. 王国英,陈丹丹,郑学礼,李祥会,张浩,张军,滕铁山. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020(06)
- [4]伪旋毛虫排泄—分泌（ES）产物蛋白质组学的初步分析[D]. 王洋. 吉林大学, 2020(08)
- [5]利用RNAi技术对旋毛虫丝氨酸蛋白酶和谷胱甘肽S转移酶基因功能的研究[D]. 杨达奇. 郑州大学, 2020(02)
- [6]旋毛虫感染激活肠道簇细胞中苦味受体介导的信号通路[D]. 罗晓翠. 浙江大学, 2020(08)
- [7]旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫期排泄分泌物蛋白质组学分析[D]. 张雨璐. 吉林大学, 2020(08)
- [8]旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究[D]. 姜鹏. 郑州大学, 2020(02)
- [9]旋毛虫ESPs及CPSF2对人非小细胞肺癌A549细胞作用的研究[D]. 潘靖丹. 承德医学院, 2020(02)
- [10]牦牛和藏猪常见原虫调查及藏猪肺线虫线粒体基因组分析[D]. 李坤. 华中农业大学, 2019(01)