一、用微量及平板HA、HI试验诊断鸡新城疫的研究（论文文献综述）
王正平[1]（1998）在《用微量及平板HA、HI试验诊断鸡新城疫的研究》文中研究说明用微量ＨＡ、ＨＩ试验及平板ＨＡ、ＨＩ试验检测病鸡肝、脾、脑组织中的新城疫（ＮＤ）病毒。肝脏的检出率为７３２％，脾脏为８８２％，脑的检出率为０。平板ＨＡ试验与微量ＨＡ试验的结果呈平行关系。血凝作用可被ＮＤ阳性血清所抑制。结果表明，直接用ＨＡ及ＨＩ试验检测组织中的病毒，具有较高的检出率和特异性，可望成为一种快速、简便、准确诊断ＮＤ的方法。
陈晓涵[2]（2020）在《重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗研究及应用》文中认为高致病性H5和H7亚型禽流感的暴发不仅给养禽业造成重大损失,也给人类的生命健康构成严重威胁,而疫苗免疫是预防禽流感的主动措施、关键环节和最后防线。因此,为了防止H5和H7亚型禽流感在中国的肆虐,重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9H7-Re1株）于2017年在养殖场中广泛应用。但是,2017年底以来的全国禽流感流行病学调查结果显示,我国H5亚型禽流感病毒以2.3.2.1和2.3.4.4分支为主,并且2.3.4.4d分支和2.3.2.1d分支病毒已成为当前威胁我国养禽业的主要流行株。进一步的抗原性分析和攻毒试验结果表明,Re-8株疫苗株与2018年分离到的2.3.4.4d和2.3.2.1d分支代表病毒株均存在较大抗原性差异,并且在临床上所使用的二价灭活疫苗不能对当时流行的H5亚型高致病性禽流感病毒提供完全保护作用,因此需要将H5N1 Re-8株疫苗种毒进行更新。此外,H7N9 H7-Re1株与分离到的部分H7N9病毒的抗原性差异较大,并且这种差异还在不断增加,因此将H7N9 H7-Re1株疫苗种毒一并进行更新。本研究将构建的H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re2株重组禽流感病毒进行系统鉴定（种毒病毒含量、HA和NA基因的序列分析、对鸡胚和雏鸡毒力、特异性、免疫原性以及纯净性）。此外,我们将3株病毒在鸡胚中传至13代,测定所有代次病毒的鸡胚半数致死量和HA效价。结果表明,H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re2株重组病毒生物安全度高、特异性强、免疫原性好、适合在鸡胚中稳定增殖,病毒液纯净,均符合作为禽流感灭活疫苗种毒要求。随后,我们用Re-11、Re-12和H7-Re2株疫苗种毒制备成重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+H5N1 Re-12株+H7N9 H7-Re2株）,对其安全性和免疫效果等进行实验室研究。结果表明,三价灭活疫苗对SPF鸡、SPF鸭和商品鹅均安全,免疫后无不良反应;3批灭活苗免疫家禽后21d,SPF鸡、SPF鸭和商品鹅的HI抗体效价平均值分别可达到7.7log2、7.7log2和4.2log2以上。三价灭活疫苗免疫鸡用亲本毒株和流行毒株攻击,无发病死亡及排毒现象。当SPF鸡的HI抗体效价达到3log2时,可获得抗死亡保护;达到4log2时,可获得完全保护;SPF鸭H5亚型Re-11株、Re-12株HI抗体≥2log2时可对H5亚型效检毒株攻击提供完全保护,H7亚型H7-Re2株HI抗体≥3log2时,对异源H7N2亚型毒株攻击提供完全保护。最后,进行了临床上蛋种鸡、白羽肉种鸡、北京油鸡、固始鸡、商品白羽肉鸡和种鸭免疫三价灭活疫苗的抗体检测,以评价该疫苗的临床应用效果。结果表明,该疫苗安全性良好,免疫后的家禽均无明显不良反应;该三价灭活疫苗可以诱导蛋种鸡、白羽肉种鸡、北京油鸡、固始鸡和种鸭产生良好的抗体;免疫后的商品白羽肉鸡,在出栏检测时具有较高的抗体效价;疫苗免疫家禽后,可有效预防当前我国流行的H5和H7亚型禽流感病毒引起的禽流感。本研究表明重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+H5N1 Re-12株+H7N9H7-Re2株）对SPF鸡和水禽均具有良好的安全性和免疫保护效果。并且该三价疫苗已于2019年在全国广泛应用,为控制高致病性禽流感发挥了重要作用。
贺奋义[3]（2012）在《鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究》文中研究说明鸽I型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus1，PPMV-Ⅰ）病又称鸽瘟或鸽新城疫，是一种由禽I型副粘病毒（Avian Paramyxovirus1， PMV-Ⅰ）引起的一种急性、热性、高度性传染病。PPMV-Ⅰ引起鸽群突然发病，迅速蔓延，临床症状上与鸡新城疫嗜神经速发株引起的十分类似，主要临床特点是肠炎、下痢和神经症状，尤以嗜神经速发型为多见，发病率和死亡率都很高。鸽新城疫病其传播迅速、发病率高，发病后死亡率较高，死亡率可达50-80%以上，严重的可高达95%以上，处于孵化期的种胚感染后可全部死亡。给养鸽业造成的影响和危害巨大，是养鸽业重点防控的传染病之一。鸽新城疫病毒编码两种囊膜糖蛋白，融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（HN），F蛋白位于囊膜外表面，形成纤突，对鸽新城疫的毒力及感染性起决定性作用，是鸽新城疫的主要免疫原性蛋白；F基因还具有较高的遗传稳定性，是新城疫基因分型的主要依据，也是决定鸽新城疫致病力强弱的关键因素；F基因的遗传变异与鸽新城疫的变异和流行密切相关，是鸽新城疫分子流行病学研究的首选基因，因此，F基因是研究鸽新城疫核酸疫苗的首选目的基因。本文通过鸽新城疫种毒PL株在非免疫健康鸡胚上增殖动态的试验研究和病毒的灭活时间、灭活温度以及甲醛浓度的试验研究，确定了鸽新城制苗用病毒最佳制备方法和最佳灭活条件，在此基础上，研制出鸽新城疫油乳剂灭活疫苗和蜂胶佐剂灭活疫苗，经物理性状检验、安全性检验、急性毒性试验、免疫持续期试验、最佳免疫剂量测定，效力试验以及田间应用试验表明，鸽新城疫蜂胶佐剂灭活疫苗不仅均匀度好，粘度低，通针性良好，注射后易被机体吸收，在接种部位不会形成硬结，而且免疫效果好，对鸽群免疫后能起到坚强的保护作用。此外，本文还用RT-PCR方法，从鸽新城疫病毒PL株基因组中克隆、鉴定了融合蛋白基因（F基因），并在大肠杆菌中进行了高效表达，以纯化的F表达产物为抗原，建立了鸽新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法；同时，把鸽新城疫F基因插入酵母表达载体pPic9k和真核表达载体PC-DNA3.1/V5-His中，构建了鸽新城疫F基因毕赤酵母表达系统和F基因真核表达体系，为鸽新城疫F基因生物活性的进一步研究及新型核酸疫苗的研制奠定基础。本项目研究的主要内容包括：1、鸽新城疫种毒增殖规律和灭活方法的研究：采用鸽新城疫PL株为种毒，在鸡胚上连续盲传5代，使其扩大增殖，收获尿囊液做为基础种子毒。通过种子毒在非免疫健康鸡胚上增殖动态的试验研究表明，病毒在羊水、尿囊膜（包含羊膜）、尿囊液中含量较高、增殖动态趋于一致，而在胚体及卵黄中含量较低，接种病毒后72h为最佳收毒时间。经病毒的最佳灭活时间、灭活温度以及甲醛浓度的试验研究，确定了0.05%甲醛在20℃条件下经过48h；70℃的温度条件下经过20min灭活病毒为最佳灭活方法，不仅能有效的完全灭活病毒，而且能使病毒的血凝活性保持在94%以上。2、鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶灭活疫苗的制备：用70℃，20min的灭活方法分别制备尿囊液蜂胶佐剂灭活苗和四元材料（鸡胚尿囊液、羊水、尿囊膜、羊膜）混合蜂胶佐剂灭活苗，用0.05%甲醛在20℃条件下经48h的灭活方法分别制备鸽新城疫尿囊液蜂胶佐剂灭活苗、尿囊液油乳剂灭活苗和四元材料（尿囊液、尿囊膜、羊膜、羊水）混合油乳剂灭活苗。制备的六种疫苗经物理性状检验、安全性检验、急性毒性试验、免疫持续期试验综合分析表明，均具有良好的抗原性和安全性。3.鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶佐剂灭活苗的性能比较试验：用制备的六种鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶佐剂灭活苗分别免疫注射乳鸽，结果表明四种蜂胶佐剂灭活苗免疫抗体消长水平和免疫期基本一致，二种油乳剂苗免疫抗体消长水平和免疫期基本一致，从而证明四元材料的疫苗与尿囊液毒疫苗的性能基本一致；但四元材料蜂胶佐剂灭活苗和油乳剂灭活苗在抗体产生时间及其达到峰值的时间和数值上有差异，蜂胶苗明显优于油苗。蜂胶佐剂灭活苗在免疫后5d抗体开始上升（平均为2.8log2～2.9log2），14d抗体可达到高峰（平均为11.2log2～11.4log2），而油乳剂灭活苗在免疫后9d抗体效价开始上升（平均为3.0log2～3.1log2），21d才达到峰值（平均为9.0log2～9.2log2）。蜂胶佐剂灭活苗180d仍可维持较高水平（平均为6.6log2～6.7log2）；在免疫后30d、90d、180d用200ELD50强毒株攻击，其保护指数均为100%；对1日龄乳鸽接种1个使用剂量进行急性毒性试验观察，15d生长曲线表明，不影响鸽的生长，甚至有提高的趋势；室温保存3个月，4℃-8℃保存6个月，疫苗的物理性状和免疫保护性没有明显变化。4、鸽新城疫F基因的克隆及序列分析：通过设计一对引物，利用RT-PCR扩增以及亚克隆方法，从鸽新城疫病毒PL株中扩增出F基因，将扩增产物克隆进pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定筛选出阳性菌落并进行序列测定。结果表明：F基因为1662bp，编码553个氨基酸，与国内外报道的其他NDV毒株的F基因氨基酸数量相同；通过BLAST法与GenBank中国内外17个鸽源和鸡源部分新城疫毒株进行相似性比较及对照系统进化树的结果分析，表明我们的分离株（PL株）与17个毒株之间的相似性介于76.3-98.6%；对分离的鸽新城疫F融合蛋白的氨基酸序列与国内外8株新城疫氨基酸序列进行对比分析，结果氨基酸同源性为93.6%-96.7%；F0蛋白裂解位点的氨基酸组成为112R-R-R-K-R-F117，符合强毒株的序列。5、鸽新城疫F基因的原核表达及其生物活性研究：用PCR方法获得了缺失F蛋白信号肽、胞质区和跨膜区的F基因片段，将其亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中，与GST蛋白融合表达，经IPTG诱导和SDS-APGE分析，表明目的蛋白在大肠杆菌BL21中得到高效表达，表达产物分子量约为60Kda；以表达的融合蛋白为抗原初步建立了间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，用方阵法确定其最佳反应条件：抗原1∶128稀释即抗原包被量为0.6μg/孔，血清1∶400稀释，与一抗的最佳作用时间为60min，与酶标二抗的最佳作用时间为60min，底物显色的最佳作用时间为15min。6、鸽新城疫F基因在毕赤酵母中表达：根据鸽新城疫F基因序列，设计引物，将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K，用SalI内切酶线性化后电击转化GS115毕赤酵母感受态细胞，用影印法在含G418的YPD平板上筛选高拷贝重组菌，用甲醇诱导表达并进行SDS-APGE分析。7、鸽新城疫F基因的真核表达及其生物活性研究：将鸽新城疫PL株F基因插入到真核表达载体pcDNA3.1V5-Hi中，构建出真核表达质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F；将构建的真核表达重组质粒免疫接种非免疫新城疫的乳鸽，并在免疫后第28d进行攻毒保护试验。结果表明，在免疫后第7d产生抗体，14d抗体水平达到最高，之后抗体水平开始下降；攻毒保护试验结果显示，对鸽新城疫强毒攻击保护率为33.33%（5/15），具有一定的免疫保护作用。
杜元钊[4]（2011）在《新城疫—禽流感H9二联灭活疫苗的研究》文中指出自1998年秋冬始于河北省石家庄地区的低致病性禽流感（LPAI）爆发,传播速度很快,短期内即成燎原之势,在近一年的时间里已波及到包括我国主要养禽地区的20多个省、市、自治区。经鉴定各地分离的毒株主要为H9N2亚型。这次全国范围的大流行,已历经数年,至今尚未平息。发病种鸡群和蛋鸡群损失严重,产蛋率下降10-60%不等,个别鸡群甚至绝产；育雏鸡、育成鸡及肉鸡也可感染发病,表现呼吸道症状,受害鸡群死淘率急剧上升,根据鸡群并发和继发感染及饲养管理状况的不同,死淘率在10-80%之间,一般在20%左右。近年来我国部分地区的禽流感血清学调查发现,H9亚型阳性群占禽流感阳性鸡群总数的93.89%,进一步说明这种禽流感的广泛性和严重危害性。基于上述情况,我国迫切需要针对H9亚型的禽流感疫苗,用于控制日益严重的H9亚型禽流感在我国的大范围流行。目前我国新城疫发病流行也非常严重,有时与H9亚型的禽流感病毒混感,给养鸡业造成更大损失。同时基层养鸡户防疫频繁,应激反应大,免疫程序难以制定,急需一针防两病的鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗。我们在成功研究出禽流感（H9亚型）灭活疫苗基础上,又研制出鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗。一、禽流感（H9亚型）灭活疫苗毒种的筛选培育和鉴定在1998-1999年期间,我国主要养禽地区5个省、市鸡群分离鉴定出8株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）,进行了系统的常规生物学和分子生物学特性鉴定,从中筛选、培育出对鸡胚的毒力稳定、产生的毒价高、免疫原性强、交叉保护性好的F株（A/Chicken/Shanghai/F/98）作为研制疫苗的候选毒株F株基因组全长序列测定和各基因的遗传分析表明,其HA、NA、M和NS4个基因均属于CkBj94分支,同源率分别为96.7%、96.4%、97.5%和98%。1、在1998-1999年期间从我国主要养禽地区5个省、市有产蛋下降的产蛋鸡群和有呼吸症状及超常死亡的鸡群分离8株AIV（F、S、A1、H1、D1、D2、J1、J2）,初次分离时鸡胚死亡时间36-60小时,HA滴度22-24不等,血清亚型鉴定均为H9N2亚型,4周龄SPF雏鸡致病性试验确定均为低致病性。2、测定了这8个毒株的主要保护性抗原HA基因的全长序列,由其推导的氨基酸序列同源性在95%以上,在HA基因遗传发生树上这些毒株与CkBJ94一道形成一个独特的分支,提示有共同来源；8株病毒的交叉HI试验、交叉鸡胚中和试验和雏鸡交叉保护试验均表明,它们之间能提供交叉保护。3、在8株病毒中,选择初次分离时毒价高、鸡胚死亡时间一致的F株在SPF鸡胚中连续继代培育,第5代（E5）时鸡胚液病毒滴度达HA210,至第10代（E10）时HA滴度大于210。经系统鉴定,它对鸡胚的毒力稳定,（90%以上鸡胚在接种后72-96小时内死亡）,产生病毒的滴度高（HA大于210）,免疫原性强（7日龄SPF鸡免疫后HI滴度>5log2）,交叉保护性好,具有优良的疫苗毒株特性。4、通过RT-PCR和51/31RACE法扩增、各片段克隆测序和序列拼接,得到了F株的基因组全长序列,8个基因长度分别为PB12341bp、PB22341bp、PA2233bp、HA1742bp、NP1565bp、NA1458bp、M1027bp、NS8906bp,并对各基因进行遗传分析,其HA、NA、M、NS4个基因均属于CkBJ94分支,同源率分别为96.7%、96.4%、CkBj94株。二、鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗的研制和生产用新城疫LASOTA株和H9N2亚型AIV F株为毒种,经实验室研究、田间试验、中间试制和区域试研制出对不同品种和年龄的鸡安全而免疫效力高的新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗,可以达到与各自单苗具有相同免疫效果。已取得了国家新兽药证书和农业部颁发的生产批准文号,累计生产应用2亿羽份以上,产生了巨大的经济效益和社会效益。1、使用Millipore超滤浓缩机的4#膜浓缩新城疫和禽流感抗原,各浓缩1/2-1/3,测定HA效价,NDHA>1024,AIHA>512,按1：1比例配苗。2、二联苗效力试验表明,三批疫苗每羽份新城疫分别含有127、131和127PD50,达到英国兽药典每羽份≥50PD50的要求。禽流感的免疫抗体水平及攻毒保护均达到单苗的要求。免疫鸡日龄太小（小于10日龄）,鸡体免疫应答反应较差,效力检验最好采用3-4周龄易感鸡。3、抗体产生时间试验表明,无论免疫剂量多大,疫苗免疫后前4天都测不出抗体,免疫后7天,抗体开始缓慢上升,11天后,抗体上升加快,至21天基本达到高峰。免疫剂量大的,抗体继续上升；免疫剂量小的,抗体滴度就不再上升。相同剂量免疫时,免疫鸡日龄越小,抗体上升越慢,上升幅度越小。攻毒试验表明,免疫后11天攻毒,只有部分免疫鸡被保护,14天攻毒时,大部分免疫鸡保护,21天后方能完全保护。免疫剂量与免疫期试验表明,在一定免疫剂量范围内,免疫保护期与免疫剂量成正相关。免疫剂量偏低时,免疫保护期短；免疫剂量大时,免疫保护期适当延长。二联苗的免疫剂量和免疫期分别定为：商品肉鸡5日龄免疫,0.2m1/羽,出栏前免疫一次；蛋雏鸡和种雏鸡开产前免疫2次,14日龄首免,0.2m1/羽,可保护至60日龄,50-60日龄二免,0.5m1/羽,可保护至开产；或于21-30日龄免疫一次,0.5m1/羽,也可保护至开产。产蛋鸡开产前免疫一次,0.5m1/羽,可保护整个产蛋期。4、中间试制：在易邦公司生物制品GMP车间共试制10批次总量为540万羽份,成品检验全部合格。5、区域试验在江苏、山东、天津、河北等省、市的数十个养禽企业进行区域试验,共免疫800余万羽,临床保护率接近100%,取得很满意的效果。三、H9亚型禽流感发病机理研究：与大肠杆菌联合感染的致病协同作用用H9N2亚型AIV和禽源性大肠杆菌进行联合感染实验研究,结果发现两者之间有强烈的致病协同作用：AIV（H9N2亚型）单独感染症状轻微,不死亡或死亡率很低,但是与禽源性大肠杆菌,甚至是低致病性的大肠杆菌联合感染均可发生严重死亡,病变出现早、恢复慢且更为严重。1、H9N2亚型AIV和禽源性大肠杆菌联合感染时能产生致病协同作用：AIV单独感染（105.17ELD）时死亡率为6.25%,大肠杆菌（037）单独感染（3x107CFU）时死亡率为62.5%,联合感染时死亡率为81.25%。这种致病协同作用在低致病性的禽源大肠杆菌和AIV之间更为显着,单独感染和联合感染的死亡率分别为20.0%、13.3%和100%。2、H9N2亚型AIV和禽源大肠杆菌联合感染SPF鸡的动态病理变化：单独接种的两组接种后1-96小时内无死亡,联合感染组死亡率为24%：联合感染组死亡率为24%；联合感染组大体病变和显微病变比单独接种的两组出现得早、恢复慢且更为严重。
于淼[5]（2009）在《山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究》文中进行了进一步梳理近年来,我国新城疫（Newcastle disease, ND）的流行日益复杂,免疫失败屡屡发生,给养禽业,特别是养鸡业造成了不可估量的经济损失。为更好地防制新城疫的发生,探索有效的防制措施,本研究对山东省鸡新城疫进行了流行病学调查,掌握了新城疫的流行状况,并分离获得了12个新城疫病毒流行株。在此基础上,对新城疫病毒LY1分离毒株的致病性及变异性状开展了检测分析,然后以此分离株制备灭活疫苗进行免疫保护试验,同时,构建了新城疫病毒HN基因C3dP29补体融合基因疫苗,探明了C3d P29基因的分子佐剂效果,为新城疫防制奠定了重要基础。主要研究包括以下4个部分：1.NDV的分离鉴定与生物学特性研究从山东省8个地区22个养禽场82份疑似新城疫病料中,分离和鉴定出12株NDV。将12株NDV进行了MDT、ICPI和IVPI检测,结果表明,6个分离株（WF10、WF13、LY1、LY7、ZB10和JN2株）MDT均小于60h、ICPI均大于1.6、IVPI均在2.00以上,表明为强毒株；DY2、LC3和BZ7株的MDT分别为63.6h、69.6h和62.4h, ICPI值为1.4、1.44和1.35,IVPI值为1.74、1.85和1.49,为中毒力毒株；WF3、LY14和TA6株为弱毒株。经动物回归试验,各毒株NDV均可导致鸡发生不同程度的发病和死亡,且发病和死亡的鸡均出现ND典型症状和剖检变化。2. NDV LY1株F和HN基因的克隆与序列分析利用RT-PCR技术,对山东省新城疫病毒LY1分离株的F基因主要功能区片断和HN基因全部的核苷酸序列进行了克隆和序列分析。结果显示：（1）LY1株F基因开放性阅读框架（ORF）为1662bp,编码489个氨基酸。与国内外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,该毒株F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间；F蛋白裂解位点区（112-117）氨基酸组成与强毒株一致。从分子水平证明NDV山东分离株（LY1）为新城疫强毒株。LY1株病毒在101位和121位分别为K（赖氨酸）、V（缬氨酸）两种特征氨基酸,具有Ⅶ型基因型NDV的典型特征。该毒株与我国标准毒株的同源性较低,与强毒株F48E9的同源性只有86.3%,与新城疫标准弱毒株C30的同源性只有84.2%,说明已发生一定的变异,这可能是高抗体水平压力下引起鸡群发病的原因。（2）HN基因ORF大小为1716bp,编码571个氨基酸。与国内外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在87.6%～90.9%之间,属于强毒的C群,这与该病毒生物学鉴定的结论是一致的。3.新城疫病毒不同基因型灭活油乳疫苗的研制及免疫效果测定将新城疫病毒基因Ⅶ型LY1分离株和传统的LaSota株（基因Ⅱ型）与油佐剂按1：3比例混合乳化,分别制成油包水型LY1分离株、LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗；无菌试验和物理性状检验合格；鸡体倍量注射试验结果证明疫苗安全性好；用LaSota株抗原进行HI试验,检测免疫接种鸡抗NDV-HI抗体,结果显示,LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗于接种后的14d、21d、28d所产生的平均HI抗体效价与商品化灭活疫苗（LaSota株）无明显差异（P>0.05）,至35d后两种疫苗的抗体效价均达到7.2Log2以上；而LY1分离株灭活疫苗组各个时期（接种后7天除外）所产生的平均HI抗体效价与LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组及商品化灭活疫苗（LaSota株）组的抗体效价差异显着（P<0.05）。LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组、LY1分离株灭活疫苗组和商品化灭活疫苗（LaSota株）组HI抗体效价上升规律相同,均与对照组各个时段所产生的平均HI抗体效价差异均极显着（P<0.01）。免疫后4周用LY1分离株进行了攻毒试验。结果证明,LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组免疫保护率可达100%,LY1分离株灭活疫苗组和商品化灭活疫苗（LaSota株）组的免疫保护率分别为90%和70%。表明单纯使用LaSota株商品化灭活疫苗产生的保护力较低,而用分离株配以LaSota株制备的不同基因型（基因Ⅱ型+基因Ⅶ型）灭活油乳疫苗则能产生较强的保护能力。4.鸡C3d分子佐剂-NDVHN基因疫苗的构建与免疫保护效果研究以RT-PCR扩增新城疫病毒LY1株的HN基因,定向克隆至真核表达载体pCDNA-P29n中P29n的上游,将鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂与新城疫病毒的HN基因连接,构建了NDVpCDNA-HN-P29.4和pCDNA-HN-P29.6分子佐剂基因疫苗,免疫接种3周龄SPF鸡,结果显示,免疫后3-4周pCDNA-HN-P29.4、pCDNA-HN-P29.6和pCDNA-HN免疫组均能诱导鸡体产生HI抗体,但pCDNA-HN-P29.4、pCDNA-HN-P29.6免疫组HI抗体水平明显高于pCDNA-HN免疫组（P<0.01）,但低于商品化灭活苗免疫组。攻毒试验结果表明,pCDNA-HN-P29.6和商品化灭活苗免疫组能够较好地抵抗致死量病毒的攻击,保护效率达90%,明显高于pCDNA-HN免疫组,表明鸡C3d分子对NDV-HN基因具有明显协同作用。该研究结果为进一步研究开发和利用鸡C3d奠定了基础。
王志涛,孟凡生,申红[6]（2016）在《临沂地区商品肉鸡新城疫病毒的分离鉴定及流行性调查》文中进行了进一步梳理对临沂地区商品肉鸡新城疫病毒（NDV）进行简便、准确、快速的检测,分析该地区新城疫（ND）的流行情况,从而为养殖业提供有效的防治措施。试验从临沂地区商品肉鸡场发病鸡群中采集病死鸡的病料进行鸡胚尿囊腔接种和病毒的分离鉴定,并做了血凝（HA）试验与血凝抑制（HI）试验。结果表明:临沂地区55%的鸡群中存在新城疫病毒,新城疫病毒潜在率超过半数。同时为了验证结果的准确度,应用RT-PCR技术进行了检验,以保证结果的可信度。试验结果说明,为有效预防新城疫的爆发、减小经济损失、控制发病率,临沂地区所有鸡场有必要立即进行新城疫疫苗接种。
包小芝[7]（2013）在《济南地区鸭源新城疫病毒的分离鉴定及F基因变异分析》文中研究说明鸭新城疫是由新城疫病毒引起的一类急性、高度接触性和致死性的传染病。该病以腹泻和神经症状，腺胃黏膜局灶性出血或溃疡，肠道黏膜枣核样出血及胰腺或脾脏有白色坏死点为主要特征。新城疫病毒对水禽的致病力在逐渐增强，水禽不仅是新城疫的宿主和储存库，而且成为新城疫病毒的易感禽类。新城疫病毒长期以来一直是危害我国养禽业的主要病原之一。新城疫病毒主要引起鸡的新城疫、鹅源新城疫、鸽源新城疫等，但近年来新城疫病毒感染并致病的宿主范围有扩大的趋势。且有报道显示，不同禽源的新城疫病毒分离株的毒力及其相关毒力基因、免疫原活性和致病性等生物学特性并非完全一致。所以进行对新城疫各种不同禽源分离毒株的主要生物学特性的研究，有利于探索该病毒在不同禽类之间感染与传播的机制、病毒的进化机制及其疾病的流行病学调查等方面的研究。近年来，鸭新城疫的感染呈上升趋势，将对我国的养鸭业产生巨大危害。加强对鸭新城疫病毒的研究，对预防和控制鸭新城疫的流行，保护和促进我国养鸭业的健康发展具有重要意义。本研究是从济南地区鸭病料中分离得到三株鸭新城疫病毒。通过RT-PCR技术对这三株鸭新城疫病毒的F基因进行扩增，并进行序列测定，分析测序结果。并与GeneBank上已发表的新城疫病毒序列和传统疫苗株基因进行核酸同源性比较、遗传进化树分析，从而在分子生物学水平上分析济南地区鸭源新城疫病毒分离株之间的亲缘关系以及与其它地区流行毒株之间的亲缘关系，为该病的防控提供理论依据。在济南地区从临床疑似新城疫症状的鸭中解剖收集病料，鸡胚盲传三代分离得到三株病毒，按常规方法进行血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI），结果显示该三株病毒均具有血凝特性，且血凝特性能被NDV阳性血清所抑制，而不被H9亚型和H5亚型AIV阳性血清所抑制，通过RT-PCR技术扩增出特异性目的条带，因此鉴定为鸭源新城疫病毒，并依次命名为SDJN01、SDJN02、SDJN03株。通过试验测得鸭胚半数致死量ELD50为10-7.8-10-8.2，ICPI为1.68-1.74，MDT为50.6h-54.6h。综合以上生物学毒力指标，表明3株分离毒株均为新城疫强毒株。采用RT-PCR对3株分离毒株的F基因进行扩增和序列测定分析，结果表明，3株分离毒株间同源性在98.5%-100%，氨基酸同源性在98.7%-100%之间，与GeneBank上已发表的与其他鸭源、鹅源NDV同源性为96.0%98.5%；但与LaSota株的核苷酸同源性为83.9%-84.8%，氨基酸同源性为88.6%-89.2%；遗传进化分析表明，3株鸭新城疫病毒与黑龙江、江苏、福建等地的鹅新城疫病毒毒株和鸭新城疫病毒毒株的亲缘性较近。分离的3株病毒与目前国内分离的鸭源、鹅源新城疫病毒的F基因亲缘性均较高，与LaSota株的F基因相比变异较大。
刘霞[8]（2011）在《鸭源新城疫油乳剂灭活疫苗制备的研究》文中认为鸭源新城疫（即鸭源新城疫病毒病）是由新城疫病毒（即鸭源新城疫病毒）引起的一类急性、高度接触性和致死性的传染病。近年来鸭源新城疫病毒的感染日渐增多,2001至2005年间,张训海（2001）、张存（2002）、陈少莺（2004）、何永强（2005）等学者分别从安徽、福建、浙江等地不同患病鸭群中都分离到了鸭源新城疫病毒,本病发病率和死亡率较高,对养鸭业危害严重。疫苗接种是控制该病的有效措施之一,但目前我国尚未有商品化的鸭源新城疫疫苗供应,故研制鸭源新城疫灭活疫苗对促进和保护养鸭业的健康发展具有重要意义。为此我们利用分离的鸭源新城疫病毒,研制了鸭源新城疫灭活油乳剂疫苗,并对该疫苗的安全性、稳定性、免疫效力等进行了研究。本研究分别对鸭源新城疫病毒SDFCH株及新城疫病毒LaSota株的毒力、增殖特性、免疫特性及特异性等生物学特性进行了研究。鸭源新城疫病毒SDFCH株静脉致病指数为2.59、对鸡胚的最小致死量的平均死亡时间为56.6h、对10日龄鸡胚的致死率为10/10、红细胞凝集价为1:128、病毒含量为107.67EID50/0.1mL、免疫原性良好、能够被鸭源新城疫病毒SDFCH株阳性血清中和。新城疫LaSota株对鸡脑内致病指数为0.41、对10日龄鸡胚的致死率为8/10、红细胞凝集价为1:256、病毒含量为108.0EID50/0.lmL、接种2-7日龄SPF雏鸡安全、能够特异性被新城疫阳性血清中和。采用鸭源新城疫病毒SDFCH株和新城疫病毒LaSota株分别接种9-12日龄SPF鸡胚,得到病毒含量分别是107.67EID50/0.1mL和108.0EID50/0.lmL的两种病毒液。两种病毒液均用最终浓度为0.1%的甲醛溶液灭活。制成2批油乳剂灭活疫苗。经过物理性状检验,疫苗均为乳白色油包水剂型;取疫苗样品10mL装于离心管中,以3000r/min离心15min,2批疫苗样品均不分层;用lmL吸管（上口内径2.7mm,下口内径1.2mm）,吸取25℃左右的疫苗样品lmL,让其垂直自然流出,记录流出0.4mL所需的时间,2批疫苗样品流出时间均在8秒以内。研制的鸭源新城疫病毒SDFCH株灭活疫苗通过颈部皮下或胸部肌肉分别注射4-5周龄SPF鸡10只及非免疫雏鸭10只,每只疫苗1.0mL,观察14日,全部存活,且未出现因疫苗引起的局部和全身不良反应。分别用病毒含量为101.0EID50/mL-108.5EID50/mL的鸭源新城疫病毒SDFCH株和新城疫F48E10株病毒液对26-90日龄的SPF雏鸡及26-51日龄的非免疫雏鸭攻毒,观察14日,结果显示SDFCH株及F48E10株对26-90日龄的SPF雏鸡的最小致死量为103.0EID50/mL;SDFCH株对26-51日龄的雏鸭的最小致死量为108.5EID50/mL。将研制的鸭源新城疫病毒SDFCH株灭活疫苗和新城疫LaSota灭活苗通过颈部皮下分别免疫4-5周龄SPF鸡、非免疫雏鸭各15只,接种21日后采血,分离血清。免疫鸡、鸭新城疫、鸭源新城疫病毒SDFCH株HI抗体效价均高于1:16,对照鸡、鸭血清HI抗体检测为阴性。当各免疫组HI效价达到24以上时,在SDFCH株攻毒下,鸡和鸭均能获得100%的保护。当HI效价在24以下时,鸭源新城疫灭活疫苗免疫的试验鸭组,对DPMV（SDFCH株）和NDV（F48E10）强毒株的保护率皆为80%;而用新城疫灭活疫苗免疫的试验鸭组,对DPMV（SDFCH株）保护力仅在67.7%,对NDV（F48E10株）保护力为83.3%。对照组在强毒的攻毒下则100%的死亡。研制疫苗的免疫持续期试验和疫苗保存期试验表明,疫苗免疫持续期在18周以上,疫苗保存期达到6个月以上。试验结果表明,该疫苗安全可靠,注射后鸭的精神状况良好,饮食、粪便无异常变化,注射部位未见明显变化,疫苗吸收良好。免疫7d雏鸭后第21d即可产生抗体（平均为41og2）,第60d可达到91og2。免疫后第25d攻毒保护率可达90%以上。各项指标均达到有关质量标准。
周云飞[9]（2014）在《抗鸡新城强毒HN09-68株单克隆抗体的制备与鉴定》文中认为鸡新城疫（Newcastle disease,ND）是由鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的，对养禽业危害非常严重的一种急性传染病，其主要特征是引起禽类消化系统的紊乱、中枢神经的损伤，临床表现主要为高热、呼吸困难、食欲减退、下痢以及运动失调等。在全球范围内，鸡新城疫是危害养禽业健康发展的禽类的A类传染病。我国自1948年报道鸡新城疫以来，它对我国养禽业已经造成了巨大的经济损失。因此，加强对鸡新城疫的诊断、检测、预防以及治疗技术的研发就愈发重要。HI试验作为鸡新城疫的传统血清学诊断的主要方法，使用抗鸡NDV血清来鉴定病毒，但是抗NDV血清只有一种血清型，不能区分NDV的不同致病型毒株；而且抗NDV血清还与有些禽副黏病毒存在交叉反应，不能准确的鉴定出NDV病毒。但是，鸡新城疫的单抗可以识别不同致病型的特定抗原位点，而且具有高度的特异性，使用单克隆抗体的检测技术克服了传统血清学检测中的这些问题，被广泛的应用到鸡新城疫诊断、检测、预防的各个方面。本研究中，为了获得产物更为丰富的抗鸡新城疫病毒的单克隆抗体，采用新城疫的全病毒（NDV HN09-68）作为免疫原来制备单克隆抗体。NDV HN09-68的平均死亡时间（MDT）和脑内致病性指数（ICPI）分别为53h和1.75，符合强毒特征，因此使用HN09-68作为免疫原。将病毒浓缩纯化后，免疫6周龄的BALB/c雌鼠，测定小鼠抗体水平超过1∶102400，取脾细胞和NS0细胞融合，使用全病毒包被的ELISA方法进行筛选，把阳性孔经过3次有限稀释亚克隆后，最终得到7株抗NDV的单克隆抗体，分别命名为2C9、3B6、3F6、12D4、13A2、13B11、15H7。ELISA试验和HI试验检测结果表明：这些单克隆抗体可与NDV09-68株病毒特异性结合，而不与新城疫的其他毒株：强毒F48E9株、弱毒LaSota株反应。亚型鉴定试验表明：13A2为IgG1亚型，其它6株为IgM亚型。为进一步分析所制备的7株单克隆抗体的特异性，利用原核表达系统表达HN09-68的蛋白用于单克隆抗体特异性的鉴定。考虑到新城疫病毒的血凝素神经氨酸酶（HN蛋白）构成了病毒囊膜表面的大纤突，是病毒非常重要的致病相关性蛋白，介导NDV对细胞受体的识别与洗脱，是免疫应答中重要的宿主保护性抗原，针对HN蛋白的单抗隆抗体有可能对宿主起到保护作用。因此，筛选针对HN蛋白的单克隆抗体将十分有意义。选取HN蛋白的主要抗原区域，对该基因进行扩增，并与pET-32a连接，构建pET-32a-HN表达载体，再转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达，表达出的融合蛋白大小约为37.1KDa，主要存在于包涵体中，纯化复性后包被ELISA反应板，与单抗2C9、3B6、12D4均呈阳性反应。表明这3株单抗特异性针对HN蛋白，也证明复性后的HN蛋白具有天然活性。由于2C9对NDV HN09-68株的HI效价较高，因此选择2C9进行鸡胚中和试验。结果表明，2C9具有中和病毒作用，2C9单抗可能具有重大的临床应用价值。
姜聪,颉煦泽,景强强,王希彩,关文怡[10]（2017）在《不同条件制配鸡红细胞悬液对血凝-血凝抑制试验影响初探》文中提出新城疫血凝-血凝抑制（HA-HI）试验是免疫检测最常用的方法之一,本试验旨在探究不同条件下制备1%鸡红细胞悬液对血凝-血凝抑制试验结果的影响。试验表明,母鸡红细胞悬液相对于同品种公鸡对新城疫抗原更敏感;在紧急大量检测新城疫样品时,可以采集鸡心脏血进行快速大量制备HA-HI试验所需的红细胞悬液;1%1.5%浓度范围的鸡红细胞悬液对HA试验是有效的,但要注意判读误差。
二、用微量及平板HA、HI试验诊断鸡新城疫的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用微量及平板HA、HI试验诊断鸡新城疫的研究（论文提纲范文）
（2）重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗研究及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 H7亚型禽流感的流行 |
| 1.3 H5亚型禽流感的流行 |
| 1.4 高致病禽流感疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 全病毒灭活疫苗 |
| 1.4.2 重组病毒活载体疫苗 |
| 1.4.3 DNA疫苗 |
| 1.4.4 通用流感疫苗 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 重组禽流感病毒H5N1 亚型Re-11 株、Re-12 株和H7N9 亚型H7-Re2 株生物特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒种 |
| 2.1.2 病毒株 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 血清 |
| 2.1.5 主要试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 种毒的系统鉴定 |
| 2.2.2 种毒的传代及病毒含量的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 种毒的系统鉴定 |
| 2.3.2 种毒的传代及病毒含量的测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗的实验室研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 制苗用种毒 |
| 3.1.2 攻毒用病毒株 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 检测用HI抗原 |
| 3.1.5 主要试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 抗原配比及有效成分相容性研究 |
| 3.2.2 3批三价疫苗物理性状检验 |
| 3.2.3 3批三价疫苗安全性试验 |
| 3.2.4 3批三价疫苗免疫效力试验 |
| 3.2.5 三价疫苗对流行毒株的免疫效力试验 |
| 3.2.6 HI抗体与攻毒保护关系研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗原配比及有效成分相容性研究 |
| 3.3.2 成品物理性状的检验 |
| 3.3.3 3批三价疫苗安全性试验 |
| 3.3.4 3批三价疫苗免疫效力试验 |
| 3.3.5 三价疫苗对流行毒株的免疫效力试验 |
| 3.3.6 HI抗体与攻毒保护关系研究 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗的临床应用评估 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 疫苗 |
| 4.1.2 抗原及标准阳性血清 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 主要试剂和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 蛋种鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.2 白羽肉种鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.3 北京油鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.4 固始鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.5 商品白羽肉鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.6 种鸭安全性和免疫效果评估 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 安全性评估结果 |
| 4.3.2 蛋种鸡免疫效果评估 |
| 4.3.3 白羽肉种鸡免疫效果评估 |
| 4.3.4 北京油鸡免疫效果评估 |
| 4.3.5 固始鸡免疫效果评估 |
| 4.3.6 商品白羽鸡免疫效果评估 |
| 4.3.7 种鸭免疫效果评估 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸽新城疫的研究概况 |
| 1.1.1 病原学特性 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 临床症状和剖检病变 |
| 1.1.4 诊断 |
| 1.1.5 防治 |
| 1.2 新城疫分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 新城疫病毒的形态和分子结构蛋白及功能 |
| 1.2.2 新城疫病毒致病力的分子基础 |
| 1.2.3 新城疫的分子流行病学研究 |
| 1.2.4 鸽新城疫基因工程疫苗研究 |
| 第二章 鸽新城疫疫苗的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 制苗用毒株 |
| 2.1.1.2 试验动物 |
| 2.1.1.3 试剂药品 |
| 2.1.1.4 仪器设备 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 种毒的制备 |
| 2.1.2.2 病毒的灭活 |
| 2.1.2.3 油乳剂灭活疫苗的制备 |
| 2.1.2.4 蜂胶苗的配制 |
| 2.1.2.5 油乳剂灭活苗物理性状检验 |
| 2.1.2.6 蜂胶佐剂灭活苗物理性状检验 |
| 2.1.2.7 疫苗免疫抗体产生时间的测定 |
| 2.1.2.8 疫苗最佳免疫剂量测定 |
| 2.1.2.9 疫苗免疫持续期的测定 |
| 2.1.2.10 疫苗保存期试验 |
| 2.1.2.11 对比试验 |
| 2.1.2.12 区域试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 制苗用毒在鸡胚上增殖 |
| 2.2.2 病毒的灭活 |
| 2.2.2.1 温度对病毒灭活 |
| 2.2.2.2 甲醛对病毒灭活 |
| 2.2.2.3 安全性检查 |
| 2.2.3 油乳剂灭活疫苗物理性状检验 |
| 2.2.3.1 外观检查 |
| 2.2.3.2 粘度检验 |
| 2.2.3.3 均匀度检验 |
| 2.2.3.4 剂型检验 |
| 2.2.3.5 稳定性检验 |
| 2.2.4 蜂胶佐剂灭活疫苗物理性状检验 |
| 2.2.4.1 外观检查 |
| 2.2.4.2 无菌检验 |
| 2.2.4.3 安全性检验 |
| 2.2.4.4 急性毒性试验 |
| 2.2.5 疫苗免疫效力对比试验 |
| 2.2.6 疫苗免疫持续期试验 |
| 2.2.7 疫苗保存期试验 |
| 2.2.8 鸽源和鸡源油乳剂灭活苗对比试验 |
| 2.2.9 区域试验 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 鸽新城疫 F 基因的克隆及序列分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 病毒 |
| 3.1.1.2 菌株、载体 |
| 3.1.1.3 主要试剂 |
| 3.1.1.4 主要仪器 |
| 3.1.1.5 培养基与溶液配制 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 引物设计与合成 |
| 3.1.2.2 病毒 RNA 的提取 |
| 3.1.2.3 RT-PCR 扩增 |
| 3.1.2.4 基因的克隆与鉴定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 F 基因的克隆鉴定 |
| 3.2.2 F 基因 DNA 序列测定结果 |
| 3.2.3 核苷酸相似性分析 |
| 3.2.4 氨基酸序列分析 |
| 3.2.5 裂解位点的氨基酸序列分析 |
| 3.2.6 系统发育树的建立 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 鸽新城疫 F 基因的原核表达分析及其生物活性研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种、载体 |
| 4.1.2 酶与试剂 |
| 4.1.3 培养基与溶液配制 |
| 4.1.4 仪器与设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸽新城疫 F 基因原核表达载体的构建 |
| 4.2.1.1 表达引物的设计 |
| 4.2.1.2 目的片段的 PCR 扩增 |
| 4.2.1.3 进行 PCR 产物凝胶回收与纯化 |
| 4.2.1.4 目的片段和载体的酶切与回收 |
| 4.2.1.5 目的片段与载体的连接 |
| 4.2.1.6 感受态细胞的制备 |
| 4.2.1.7 连接产物的转化 |
| 4.2.1.8 重组质粒的提取 |
| 4.2.1.9 重组质粒的鉴定 |
| 4.2.2 重组菌的诱导表达与表达条件的优化 |
| 4.2.2.1 重组菌的诱导表达 |
| 4.2.2.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 4.2.2.3 表达条件的优化 |
| 4.2.2.4 包涵体蛋白的提取 |
| 4.2.3 ELISA 方法的初步建立 |
| 4.2.3.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定 |
| 4.2.3.2 间接 ELISA 各工作条件的摸索 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.2 融合蛋白的可溶性鉴定 |
| 4.3.2.1 最佳诱导时间的确定 |
| 4.3.2.2 最佳诱导温度的确定 |
| 4.3.2.3 纯化蛋白的浓度 |
| 4.3.3 ELISA 筛选方法的建立 |
| 4.3.3.1 最佳抗原及抗体工作浓度的确定 |
| 4.3.3.2 一抗作用时间的确定 |
| 4.3.3.3 二抗作用时间的确定 |
| 4.3.3.4 底物显色液作用时间的确定 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 鸽新城疫 F 基因在毕赤酵母中的表达 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌种和载体 |
| 5.1.2 试剂和培养基 |
| 5.1.3 培养基 |
| 5.1.4 仪器与设备 |
| 5.2 重组表达载体 pPIC9K- PPMV-1-的构建 |
| 5.2.1 引物的设计与合成 |
| 5.2.1.1 目的基因的扩增 |
| 5.2.1.2 胶回收目的基因 |
| 5.2.1.3 目的基因与 pPIC9K 空载体的双酶切 |
| 5.2.1.4 双酶切目的片段与 pPIC9K 空载体的电泳回收 |
| 5.2.1.5 JM109 感受态细胞的制备 |
| 5.2.1.6 目的基因与 pPIC9K 空载体的连接 |
| 5.2.1.7 连接产物的转化 |
| 5.2.1.8 重组表达质粒的提取与鉴定 |
| 5.2.2 重组表达载体 pPIC9K- PPMV-1-F 电转化毕赤酵母 GS115 |
| 5.2.2.1 重组表达载体的线性化 |
| 5.2.2.2 毕赤酵母感受态细胞的制备 |
| 5.2.2.3 电激法转化 |
| 5.2.3 高拷贝重组酵母菌株的筛选鉴定 |
| 5.2.3.1 影印接种法筛选 G418 抗性菌株 |
| 5.2.3.2 PCR 法鉴定重组菌株 |
| 5.2.4 重组酵母菌株的诱导表达 |
| 5.2.5 表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组表达质粒 pPIC9K- PPMV-1-F 的 PCR 与双酶切鉴定 |
| 5.3.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 鸽新城疫 F 基因的真核表达分析及其生物活性研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌种和载体 |
| 6.1.2 试剂和培养基 |
| 6.1.3 培养基 |
| 6.1.4 仪器与设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 鸽新城疫真核表达载体的构建 |
| 6.2.1.1 表达引物的设计 |
| 6.2.1.2 目的片段的 PCR 扩增 |
| 6.2.1.3 进行 PCR 产物凝胶回收与纯化 |
| 6.2.1.4 目的片段和载体的酶切与回收 |
| 6.2.1.5 目的片段与载体的连接 |
| 6.2.1.6 感受态细胞的制备 |
| 6.2.1.7 连接产物的转化 |
| 6.2.1.8 重组质粒的提取 |
| 6.2.1.9 重组质粒的鉴定 |
| 6.2.2 鸽新城疫真核表达质粒免疫原性研究 |
| 6.2.2.1 免疫用重组质粒的制备与纯化 |
| 6.2.2.2 动物基因免疫 |
| 6.2.2.3 攻毒保护试验 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 6.3.2 动物基因免疫 |
| 6.3.3 攻毒保护试验 |
| 6.4 分析与讨论 |
| 6.5 结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（4）新城疫—禽流感H9二联灭活疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分：文献综述 |
| 第一章 鸡新城疫疫苗研究进展 |
| 1 NDV的生物学特性 |
| 2 NDV的分子生物学 |
| 3 ND的防制 |
| 参考文献 |
| 第二章 禽流感疫苗研究进展 |
| 1. 全病毒灭活苗 |
| 2. 亚单位疫苗 |
| 3. 重组活载体疫苗 |
| 4. 核酸疫苗 |
| 5. 基因缺失疫苗 |
| 参考文献 |
| 第二部分：实验室研究 |
| 第三章 新城疫病毒LA SOTA株毒种的鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 新城疫病毒LA SOTA株毒种的支原体及外源病毒检验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 A型禽流感低致病性H9亚型病毒F株分离与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 低致病性禽流感病毒与禽病原性大肠杆菌的联合感染试验 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 近年来从国内不同地区分离的8株H9N2亚型禽流感病毒HA基因全序列分析 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果和讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 A型禽流感低致病性H9亚型病毒F株毒种的支原体及外源病毒检验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第九章 禽流感(H9亚型)油乳剂疫苗两种效力检验方法的比较试验 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第十章 鸡新城疫—禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活疫苗安全性和免疫效力试验 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第十一章 鸡新城疫一禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活苗免疫抗体产生时间及免疫期试验 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第十二章 鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活疫苗保存期试验 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果和讨论 |
| 第十三章 雏鸡母源抗体对鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活苗免疫效果影响的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第十四章 鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活苗与鸡新城疫油乳剂灭活苗及禽流感(H9亚型)油乳剂灭活苗免疫效果对比试验 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 第十五章 鸡新城疫病毒和禽流感(H9亚型)病毒浓缩工艺的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分：区域试验和中间试制 |
| 第十六章 鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活疫苗田间免疫效力试验 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第十七章 鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活油乳剂灭活疫苗中间试制总结报告 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论 |
| 第十八章 鸡新城疫-禽流感二联油乳剂灭活苗区域试验总结 |
| 致谢 |
| 获奖情况及证书 |
（5）山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新城疫的流行概况及研究进展 |
| 1 新城疫的流行概况 |
| 2 病原学研究进展 |
| 2.1 病毒的分类与理化特性 |
| 2.2 生物学特性 |
| 2.3 抗原性 |
| 2.4 NDV的毒力和致病性 |
| 2.5 NDV的分子生物学特性 |
| 2.5.1 NDV基因组组成 |
| 2.5.2 NDV结构蛋白分布及特征 |
| 2.6 致病性的分子基础 |
| 3 ND诊断技术的研究进展 |
| 3.1 单克隆抗体技术 |
| 3.2 核酸探针技术 |
| 3.3 限制性核酸内切酶分析 |
| 3.4 RT-PCR技术 |
| 4 ND防制方法的研究进展 |
| 4.1 鸡新城疫灭活疫苗 |
| 4.2 鸡新城疫活疫苗 |
| 4.3 鸡新城疫基因工程苗 |
| 4.3.1 亚单位疫苗 |
| 4.3.2 DNA疫苗 |
| 4.3.3 重组活载体疫苗 |
| 参考文献 |
| 第二章 核酸疫苗及免疫佐剂的研究及应用 |
| 1 核酸疫苗的研究进展 |
| 1.1 核酸疫苗的结构 |
| 1.2 核酸疫苗的作用机理 |
| 1.3 核酸疫苗的优点及不足 |
| 1.3.1 核酸疫苗的优点 |
| 1.3.2 核酸疫苗的不足 |
| 1.4 影响核酸疫苗免疫效果的主要因素 |
| 1.4.1 目的基因的选择 |
| 1.4.2 质粒载体的选择 |
| 1.4.3 免疫剂量及次数 |
| 1.4.4 免疫方法与途径 |
| 1.4.5 免疫增强剂和免疫佐剂的应用 |
| 1.4.6 接种前组织预处理 |
| 1.5 增强DNA疫苗免疫效果的策略 |
| 2 DNA疫苗免疫佐剂的研究与应用 |
| 2.1 细胞因子佐剂 |
| 2.2 CpG DNA(ODN)佐剂 |
| 2.3 补体分子佐剂C3d |
| 2.3.1 C3d的分子生物学特性 |
| 2.3.2 C3d的分子佐剂作用 |
| 2.3.3 C3d可能的作用机制 |
| 3 本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第三章 NDV的分离鉴定与生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫标准毒株 |
| 1.1.2 标准血清 |
| 1.1.3 SPF鸡和鸡胚 |
| 1.1.4 病料 |
| 1.1.5 试剂 |
| 1.1.6 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病料的来源 |
| 1.2.2 病毒的分离与增殖 |
| 1.2.3 病毒分离株的鉴定 |
| 1.2.4 分离株毒力测定 |
| 1.2.5 动物回归试验 |
| 1.2.6 新城疫鸡群的平均抗体效价测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床症状与流行特点 |
| 2.2 病毒的分离 |
| 2.3 病毒分离株的鉴定 |
| 2.3.1 HA和HI试验 |
| 2.3.2 血凝谱测定 |
| 2.4 分离株毒力测定 |
| 2.5 动物回归试验 |
| 2.6 新城疫鸡群的平均抗体效价测定结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 山东省新城疫病毒LY1分离株F与HN基因序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 SPF鸡胚 |
| 1.1.2 菌株与质粒载体 |
| 1.1.3 病毒 |
| 1.1.4 试剂 |
| 1.1.5 溶液配制 |
| 1.1.6 主要仪器、设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 NDV LY1株增殖与浓缩 |
| 1.2.2 病毒RNA的提取 |
| 1.2.3 NDV F基因和HN基因的的RT-PCR扩增 |
| 1.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 1.2.5 PCR产物的回收 |
| 1.2.6 NDV F基因和HN基因的克隆与鉴定 |
| 1.2.7 重组质粒的提取与鉴定 |
| 1.2.8 阳性质粒测序与序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 F和HN基因的RT-PCR扩增结果 |
| 2.1.1 F基因的RT-PCR扩增结果 |
| 2.1.2 HN基因的RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 F基因、HN基因的克隆及阳性克隆的鉴定结果 |
| 2.2.1 F基因的克隆及阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.2 HN基因的克隆及阳性克隆的鉴定 |
| 2.3 F基因和HN基因的克隆测序及序列分析比较 |
| 2.3.1 F基因的克隆测序及序列分析比较 |
| 2.3.2 HN基因的克隆测序及序列分析比较 |
| 2.4 与国内外标准株同源性分析比较 |
| 2.5 对新城疫山东分离株(LY1)F蛋白裂解位点区(112～117)的研究 |
| 2.6 系统发育进化树 |
| 2.6.1 F基因发育进化树 |
| 2.6.2 HN基因发育进化树 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 新城疫不同基因型灭活油乳疫苗的研制及免疫效果测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 种毒 |
| 1.1.2 试验用鸡胚和鸡 |
| 1.1.3 1%红细胞悬液 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 LY1株半数致死量(LD_(50))测定 |
| 1.2.2 新城疫病毒油乳剂灭活疫苗的制备 |
| 1.2.3 疫苗质量的检验 |
| 1.2.4 免疫效果试验 |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 LY1株半数致死量(LD_(50))测定结果 |
| 2.2 疫苗质量检验结果 |
| 2.2.1 物理性状 |
| 2.2.2 无菌试验 |
| 2.2.3 安全性试验结果 |
| 2.3 免疫效果试验结果 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 鸡C3d分子佐剂NDV HN基因疫苗效果研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 RT-PCR扩增NDV-HN基因 |
| 1.2.2 C3d-P29-HN融合基因重组质粒的构建 |
| 1.2.3 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.4 NDV C3d-P29 HN基因疫苗免疫抗体效价检测 |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR扩增新城疫LY1株HN基因 |
| 2.2 抗原基因的插入 |
| 2.3 血凝抑制抗体变化 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）临沂地区商品肉鸡新城疫病毒的分离鉴定及流行性调查（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1. 1 标准阳性血清 |
| 1.2标准抗原 |
| 1. 3 SPF种蛋 |
| 1.4病料 |
| 2 方法 |
| 2. 1 病料处理及检测材料的制备 |
| 2.1.1病料的采集与处理 |
| 2.1.2 1%红细胞悬液制备 |
| 2.1.3被检血清制备 |
| 2. 2 鸡胚接种 |
| 2. 3 尿囊液的收集 |
| 2. 4 血凝( HA) 试验 |
| 2. 5 血凝抑制( HI) 试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3. 1 鸡胚接种结果 |
| 3.2 HA与HI试验结果 |
| 3. 3 病毒分离鉴定结果 |
| 3. 4 RT - PCR验证检测结果 |
| 4 讨论 |
（7）济南地区鸭源新城疫病毒的分离鉴定及F基因变异分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 鸭新城疫病毒的概述 |
| 1.1.1 病毒的分类、大小与形态特征 |
| 1.1.2 理化特性 |
| 1.1.3 培养特性 |
| 1.1.4 流行病学 |
| 1.1.5 临床症状及病理变化 |
| 1.1.6 病毒的致病机理 |
| 1.1.7 实验室诊断 |
| 1.1.7.1 血凝抑制（HI）试验 |
| 1.1.7.2 RT-PCR 技术 |
| 1.1.7.3 REAL-TIME PCR |
| 1.1.7.4 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 1.1.7.5 琼脂扩散试验（AGP） |
| 1.1.7.6 荧光抗体技术（IF） |
| 1.1.7.7 核酸探针检测技术 |
| 1.1.7.8 单克隆抗体技术 |
| 1.2 NDV 的基因组与 F 蛋白的结构和功能 |
| 1.2.1 NDV 的基因组 |
| 1.2.2 F 蛋白的结构和功能 |
| 1.3 NDV 的毒力与致病性 |
| 1.4 鸭 NDV 的防制 |
| 1.4.1 鸭新城疫的预防 |
| 1.4.1.1 加强饲养管理和卫生消毒工作 |
| 1.4.1.2 做好疫苗免疫 |
| 1.4.2 鸭新城疫的治疗 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料与试验动物 |
| 2.1.2 主要仪器与试剂 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离传代 |
| 2.2.2 血凝性试验（HA）和血凝抑制（HI）试验 |
| 2.2.2.1 红细胞悬液的制备 |
| 2.2.2.2 HA 试验 |
| 2.2.2.3 四单位病毒的制备 |
| 2.2.2.4 HI 试验 |
| 2.2.3 鸡胚半数感染量（EID50）的测定 |
| 2.2.4 鸡胚平均致死时间（MDT）的测定 |
| 2.2.5 1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）的测定 |
| 2.2.6 动物致病性试验 |
| 2.2.7 RT-PCR 扩增 F 基因及序列分析 |
| 2.2.7.1 病毒总 RNA 的提取 |
| 2.2.7.2 RT-PCR 反应 |
| 2.2.7.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.7.4 PCR 产物的纯化回收 |
| 2.2.7.5 PCR 纯化回收产物与 PMD 18-T 载体的连接反应 |
| 2.2.7.6 DH5Α感受态细胞的制备 |
| 2.2.7.7 转化反应 |
| 2.2.7.8 质粒 DNA 的制备 |
| 2.2.7.9 阳性重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.7.10 序列测定及分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒的分离与鉴定 |
| 3.2 ELD50、MDT 及 ICPI 的测定结果 |
| 3.3 致病性试验 |
| 3.4 F 基因 RT-PCR 扩增 |
| 3.5 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.6 测序结果及序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读专业学位期间发表的文章 |
（8）鸭源新城疫油乳剂灭活疫苗制备的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1.1 NDV 一般生物学特性 |
| 1.1.1 病毒的分类地位与形态、结构 |
| 1.1.2 NDV 的培养特性 |
| 1.1.3 NDV 的理化特性 |
| 1.1.4 NDV 的生物学活性 |
| 1.1.4.1 血凝性 |
| 1.1.4.2 神经氨酸酶活性 |
| 1.1.4.3 细胞融合与溶血活性 |
| 1.1.4.4 其他活性 |
| 1.1.5 NDV 的致病性 |
| 1.2 NDV 的基因组与结构蛋白特性 |
| 1.2.1 NDV 的基因组 |
| 1.2.2 NDV 的蛋白与功能 |
| 1.2.2.1 NP 蛋白、P 蛋白和L 蛋白及其分子生物学研究进展 |
| 1.2.2.2 F 蛋白分子生物学研究进展 |
| 1.2.2.3 HN 蛋白的分子生物学研究进展 |
| 1.2.2.4 M 蛋白及其分子生物学研究进展 |
| 1.2.2.5 V 和X 蛋白 |
| 1.3 NDV 的基因演化 |
| 1.4 水禽感染禽副粘病毒的研究进展 |
| 1.4.1 鸭感染禽副粘病毒 |
| 1.4.2 鹅感染禽副粘病毒 |
| 1.4.3 其他水禽感染禽副粘病毒 |
| 1.5 鸭源新城疫的预防与控制 |
| 1.5.1 免疫的理论基础 |
| 1.5.1.1 体液免疫 |
| 1.5.1.2 细胞免疫 |
| 1.5.1.3 局部免疫 |
| 1.5.2 鸡新城疫疫苗的种类和应用 |
| 1.5.2.1 活疫苗 |
| 1.5.2.2 灭活苗 |
| 1.5.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.5.2.4 核酸疫苗 |
| 1.5.2.5 重组活载体疫苗 |
| 1.5.3 新城疫疫苗的应用 |
| 1.5.3.1 在鸡上的应用 |
| 1.5.3.2 在鸽上的应用 |
| 1.5.3.3 在鹅上的应用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒毒株 |
| 2.1.2 鸡胚，SPF 鸡和樱桃谷鸭 |
| 2.1.3 缓冲液 |
| 2.1.4 主要试剂及培养基 |
| 2.1.5 检验抗原和阳性血清 |
| 2.1.6 试验仪器 |
| 2.1.7 其它试验材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸭源新城疫SDFCH 株的蚀斑纯化 |
| 2.2.1.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备 |
| 2.2.1.2 蚀斑纯化 |
| 2.2.1.3 挑斑 |
| 2.2.1.4 纯化代次 |
| 2.2.1.5 病毒组织培养半数感染量(TCID50)的滴定 |
| 2.2.2 鸭源新城疫SDFCH 株的部分生物学特性的研究 |
| 2.2.2.1 血凝性试验（HA）和血凝抑制（HI）试验 |
| 2.2.2.1.1 红细胞悬液的制备 |
| 2.2.2.1.2 血凝试验（HI） |
| 2.2.2.1.3 四单位抗原的制备 |
| 2.2.2.1.4 血凝抑制试验（HI） |
| 2.2.2.2 病毒血凝解脱及血凝素热稳定性试验 |
| 2.2.2.3 鸡胚半数感染量（EID50）的测定 |
| 2.2.2.4 鸡胚平均致死亡时间（MDT）的测定 |
| 2.2.2.5 1 日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）的测定 |
| 2.2.2.6 6 周龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)的测定 |
| 2.2.2.7 安全性测定 |
| 2.2.2.8 特异性测定 |
| 2.2.2.9 SDFCH 株对SPF 雏鸡的最小致死量测定 |
| 2.2.2.10 SDFCH 株对雏鸭的最小致死量测定 |
| 2.2.3 新城疫LaSota 株的部分生物学特性的研究 |
| 2.2.3.1 血凝性试验（HA）和血凝抑制（HI）试验 |
| 2.2.3.2 病毒血凝解脱及血凝素热稳定性试验 |
| 2.2.3.3 鸡胚半数感染量（EID50）的测定 |
| 2.2.3.4 鸡胚平均致死亡时间（MDT）的测定 |
| 2.2.3.5 1 日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）的测定 |
| 2.2.3.6 6 周龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)的测定 |
| 2.2.3.7 安全性测定 |
| 2.2.3.8 特异性测定 |
| 2.2.3.9 F48E10 株对SPF 雏鸡的最小致死量测定 |
| 2.2.3.10 F48E10 株对雏鸭的最小致死量测定 |
| 2.2.4 病毒的灭活 |
| 2.2.5 SDFCH 株和LaSota 株病毒液的制备 |
| 2.2.6 病毒液的检验 |
| 2.2.6.1 病毒液无菌检验的检验 |
| 2.2.6.2 病毒含量测定 |
| 2.2.6.3 HA 效价测定 |
| 2.2.7 疫苗制备 |
| 2.2.7.1 油相制备 |
| 2.2.7.2 水相制备 |
| 2.2.7.3 乳化 |
| 2.2.8 疫苗物理性状检验 |
| 2.2.8.1 外观检查 |
| 2.2.8.2 剂型检验 |
| 2.2.8.3 稳定性检验 |
| 2.2.8.4 粘度检验 |
| 2.2.9 无菌检验 |
| 2.2.10 疫苗安全检验 |
| 2.2.11 疫苗效力试验 |
| 2.2.12 免疫剂量试验 |
| 2.2.13 鸭源新城疫病毒及鸡新城疫病毒高免血清的制备 |
| 2.2.14 HI 交叉抑制试验 |
| 2.2.14.1 HA 效价测定 |
| 2.2.14.2 HI 交叉抑制试验 |
| 2.2.14.3 HI 抗原同源性 |
| 2.2.15 疫苗保存期试验 |
| 2.2.16 免疫效力比较试验 |
| 2.2.17 免疫持续期测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 纯化的结果 |
| 3.2 TCID50 的测定 |
| 3.3 鸭源新城疫SDFCH 株毒种的研究结果 |
| 3.3.1 血凝解脱及血凝素热稳定性试验 |
| 3.3.2 病毒EID_(50) |
| 3.3.3 鸡胚最小致死量平均死亡时间(MDT)测定结果 |
| 3.3.4 1 日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定结果 |
| 3.3.5 6 周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)测定结果 |
| 3.3.6 安全性测定结果 |
| 3.3.7 特异性测定结果 |
| 3.3.8 SDFCH 株对SPF 雏鸡的最小致死量测定结果 |
| 3.3.9 SDFCH 株对雏鸭的最小致死量测定结果 |
| 3.4 LaSota 株毒种的研究结果 |
| 3.4.1 血凝解脱及血凝素热稳定性试验 |
| 3.4.2 病毒EID_(50) |
| 3.4.3 鸡胚最小致死量平均死亡时间(MDT)测定结果 |
| 3.4.4 1 日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定结果 |
| 3.4.5 6 周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)测定结果 |
| 3.4.6 安全性测定结果 |
| 3.4.7 特异性测定结果 |
| 3.4.8 F48E10 株对SPF 雏鸡的最小致死量测定结果 |
| 3.4.9 F48E10 株对雏鸭的最小致死量测定结果 |
| 3.5 SDFCH 株病毒液的制备结果 |
| 3.6 最适灭活时间和灭活剂浓度 |
| 3.7 物理性状测定结果 |
| 3.8 安全性检验结果 |
| 3.9 效力检验结果 |
| 3.10 免疫剂量结果 |
| 3.11 交叉HI 结果 |
| 3.12 交叉 HI 结果 |
| 3.13 HI 抗原相关性 |
| 3.14 疫苗保存期试验 |
| 3.15 交叉免疫保护实验 |
| 3.16 免疫持续期的测定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于鸭源新城疫灭活疫苗生产用种毒毒株的选择问题 |
| 4.2 关于病毒灭活的问题 |
| 4.3 关于生产用种蛋的选择问题 |
| 4.4 关于疫苗抗原含量问题 |
| 4.5 关于疫苗物理性状的问题 |
| 4.6 关于疫苗安全性的问题 |
| 4.7 关于疫苗免疫效力的问题 |
| 4.8 本疫苗有待于进一步推广应用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 硕士学位论文内容简介及自评 |
（9）抗鸡新城强毒HN09-68株单克隆抗体的制备与鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 目录 |
| 摘要 |
| 常用英文缩略表 |
| 文献综述 |
| 1 新城疫的分类 |
| 2 新城疫的诊断和流行病学 |
| 3.从鸟类分离到的新城疫病毒 |
| 4.新城疫病毒的持续感染和传播 |
| 5 新城疫病毒的疫苗接种 |
| 6 新城疫病毒的宿主反应 |
| 7.新城疫病毒的研究的展望 |
| 8.新城疫诊断技术的研究进展 |
| 8.1 NDV 的常规分离与鉴定 |
| 8.2 电镜检测 |
| 8.3 血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI) |
| 8.4 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 8.5 琼脂扩散试验 |
| 8.6 免疫荧光技术 |
| 8.7 RT‐PCR 技术 |
| 8.8 单克隆抗体 |
| 第一部分 抗鸡新城疫强毒 HN09‐68 株单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 引言 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、实验动物、鸡胚与细胞 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 主要试剂的配制 |
| 1.1.3.1 细胞培养液的配制 |
| 1.1.3.2 ELISA 试剂: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒抗原制备 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 间接 ELISA 方法的初步建立 |
| 1.2.3.1 最佳抗原稀释倍数和血清稀释倍数的确定 |
| 1.2.3.2 阴阳性临界值的确定 |
| 1.2.3.3 ELISA 测小鼠的抗体水平 |
| 1.2.4 细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选与亚克隆 |
| 1.2.4.1 饲养细胞的制备 |
| 1.2.4.2 细胞的融合 |
| 1.2.4.3 杂交瘤细胞的培养与筛选 |
| 1.2.4.4 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 1.2.5 腹水的制备 |
| 1.2.6 杂交瘤分泌的单克隆抗体的初步鉴定 |
| 1.2.6.1 ELISA 和 HI 效价的测定 |
| 1.2.6.2 抗体亚型鉴定 |
| 1.2.6.3 单抗的特异性鉴定 |
| 1.2.6.4 间接免疫荧光试验（IFA） |
| 1.2.7 部分单克隆抗体的中和试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒抗原制备 |
| 2.2 间接 ELISA 方法的初步建立 |
| 2.2.1 最佳抗原稀释倍数和血清稀释倍数的确定 |
| 2.2.2 阴阳性临界值的确定 |
| 2.2.3 小鼠抗体水平的测定 |
| 2.3 杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.4 杂交瘤分泌的单克隆抗体的初步鉴定 |
| 2.4.1 腹水的 ELISA 和 HI 效价的测定 |
| 2.4.2 抗体亚型鉴定 |
| 2.4.3 单抗的特异性鉴定 |
| 2.4.4 间接免疫荧光试验（IFA） |
| 2.5 部分单克隆抗体的中和试验 |
| 3 小结与讨论 |
| 第二部分 新城疫病毒 HN 基因的克隆和截段 HN 蛋白的原核表达 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、质粒、菌株和鸡胚 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 溶液的配制 |
| 1.1.4.1 琼脂糖凝胶电泳相关试剂的配制 |
| 1.1.4.2 细菌培养基的配制 |
| 1.1.4.3 SDS‐PAGE 电泳所用试剂 |
| 1.1.4.4 Western blot 试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 截短 HN 基因 ORF 的扩增、克隆、测序 |
| 1.2.2.1 引物设计 |
| 1.2.2.2 NDV 病毒的增殖、RNA 提取与反转录 |
| 1.2.2.3 NDV 截短 HN 基因的扩增、优化和克隆 |
| 1.2.2.4 PCR 产物的胶回收 |
| 1.2.2.5 目的片段与克隆载体的连接 |
| 1.2.2.6 连接产物的转化 |
| 1.2.2.7 菌液 PCR 鉴定 |
| 1.2.2.8 提取重组质粒 |
| 1.2.2.9 重组质粒的双酶切 |
| 1.2.2.10 序列测定 |
| 1.2.3 新城疫病毒截短 HN 基因的原核表达系统的构建与鉴定 |
| 1.2.3.1 pMD18‐T‐HN 重组质粒和 pET‐32a(＋) 原核表达质粒的双酶切 |
| 1.2.3.2 截短 HN 基因与 pET‐32a(＋)表达载体的连接 |
| 1.2.3.3 重组的表达载体质粒转化 BL21(DE3) |
| 1.2.3.4 重组的表达载体的菌液 PCR 鉴定 |
| 1.2.3.5 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.2.3.6 测序 |
| 1.2.4 重组表达载体 pET‐32a‐HN 的诱导表达与鉴定 |
| 1.2.4.1 融合蛋白表达产物 SDS‐PAGE 电泳检测： |
| 1.2.4.2 融合蛋白的诱导表达、诱导时间的变化及融合蛋白可溶性分 析 |
| 1.2.4.3 融合蛋白的免疫印迹分析（Western blotting） |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因片段的扩增 |
| 2.2 PCR 反应的退火温度优化 |
| 2.3 重组质粒 pMD18‐T‐HN 的双酶切及测序 |
| 2.4 重组原核表达质粒 pET‐32a‐HN 的 PCR 鉴定以及双酶切鉴定 |
| 2.5 重组质粒 pET‐32a‐HN 表达蛋白的 SDS‐PAGE 分析 |
| 2.5.1 SDS‐PAGE 电泳结果及不同的诱导浓度的优化 |
| 2.5.2 SDS‐PAGE 电泳结果及不同的诱导时间的优化 |
| 2.5.3 融合蛋白的可溶性分析 |
| 2.6 融合蛋白的免疫印迹分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（10）不同条件制配鸡红细胞悬液对血凝-血凝抑制试验影响初探（论文提纲范文）
| 1 设备与材料 |
| 1.1 设备 |
| 1.2 试剂 |
| 2 方法与步骤 |
| 2.1 红细胞悬液的配制 |
| 2.1.1 1%鸡红细胞悬液配制 |
| 2.1.2 不同浓度鸡红细胞悬液配制 |
| 2.2 试验设计 |
| 2.2.1 以不同采血方式分组 |
| 2.2.2 配制不同浓度鸡红细胞悬液 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 HA试验判定抗原血凝价 |
| 2.3.2 HI试验测定被检血清的抗体效价 |
| 3 结果与分析 |
| 4 结论 |
四、用微量及平板HA、HI试验诊断鸡新城疫的研究（论文参考文献）
- [1]用微量及平板HA、HI试验诊断鸡新城疫的研究[J]. 王正平. 中国畜禽传染病, 1998(01)
- [2]重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗研究及应用[D]. 陈晓涵. 中国农业科学院, 2020
- [3]鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究[D]. 贺奋义. 甘肃农业大学, 2012(07)
- [4]新城疫—禽流感H9二联灭活疫苗的研究[D]. 杜元钊. 南京农业大学, 2011(12)
- [5]山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究[D]. 于淼. 南京农业大学, 2009(06)
- [6]临沂地区商品肉鸡新城疫病毒的分离鉴定及流行性调查[J]. 王志涛,孟凡生,申红. 黑龙江畜牧兽医, 2016(06)
- [7]济南地区鸭源新城疫病毒的分离鉴定及F基因变异分析[D]. 包小芝. 山东农业大学, 2013(05)
- [8]鸭源新城疫油乳剂灭活疫苗制备的研究[D]. 刘霞. 山东农业大学, 2011(08)
- [9]抗鸡新城强毒HN09-68株单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 周云飞. 河南农业大学, 2014(03)
- [10]不同条件制配鸡红细胞悬液对血凝-血凝抑制试验影响初探[J]. 姜聪,颉煦泽,景强强,王希彩,关文怡. 山东畜牧兽医, 2017(10)