一、E-1胶配制说明书（论文文献综述）
高嫦娥[1]（2021）在《PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究》文中研究说明研究背景与目的靶向T细胞抑制性检测点肿瘤免疫治疗是当今生物医学研究的最热点。研究表明,利用单抗药物直接作用于PD-1可以有效地阻断抑制性免疫检测点,激活T细胞,增强T细胞的功能,达到治疗肿瘤的目的。在机体的免疫系统中,肠道由于接触抗原的表面积最大并且免疫细胞数量较多,因而被认为是体内最大的免疫器官[1],发生于结直肠的恶性肿瘤与免疫逃逸有关。本研究利用CRISPR/Cas9技术对T细胞PD-1基因进行靶向敲除,采用小鼠结肠癌模型进行PD-1基因敲除的T细胞的体内抗肿瘤作用及其可能机制研究,采用非人灵长类动物食蟹猴作为实验动物,高度模拟PD-1基因敲除T细胞在体内的安全性评价,以期建立利用CRISPR/Cas9技术靶向T细胞PD-1基因进行肿瘤细胞免疫治疗的策略,进而为临床研究的实施奠定坚实的实验基础。第一章:小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其机制研究第一部分:小鼠PD-1基因敲除T细胞的建立及其体外抑制肿瘤的作用[方法]在GENEBANK数据库中查找获得小鼠PD-1基因序列,设计靶向小鼠PD-1基因的sgRNA,构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体,经扩增、酶切鉴定及测序验证,获得正确的CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体。分离获得小鼠外周血PBMC,富集细胞数量为1×107,加入敲除PD-1基因的PX458敲除载体5μg,采用Lonza-4D电转仪进行电转染,48h后检测转染效率,采用PCR技术和T7E1酶切验证PD-1基因的敲除。体外培养结直肠癌细胞株CT-26,分为:阴性对照组:CT-26细胞组、PD-1基因敲除T细胞组,实验组:CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除的T细胞及PD-1单抗共培养组。绘制各组细胞生长曲线,细胞杀伤检测试剂盒检测PD-1基因敲除的T细胞的杀伤能力,通过流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比例的变化及体外分泌细胞因子的水平变化。[结果]成功获得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表达载体,建立小鼠PD-1基因敲除T细胞,对其体外特性进行检测,结果显示:流式细胞仪检测PD-1基因敲除T细胞CD3、CD4、CD8比例无明显变化;PD-1基因敲除T细胞与结直肠癌细胞株CT-26在不同效靶比作用下体外抑制肿瘤效应结果显示:各组细胞生长曲线示:与其他两组相比,CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组,72小时细胞活率明显下降,与其他两组相比,CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组,与肿瘤细胞共培养后:IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平增加。[结论]建立了稳定的体外定向敲除T细胞抑制性免疫检测点PD-1的技术,获得了小鼠同种异体PD-1基因敲除T细胞,体外实验显示,可抑制肿瘤细胞的生长,为体内抗肿瘤的研究奠定了基础。第二部分:小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及可能机制[方法]培养结直肠癌细胞株CT-26,制备小鼠结直肠癌移植瘤模型;实验分组分别为模型对照组（经尾静脉注射PBS）、阴性对照组（经尾静脉注射未经基因敲除的T细胞）、PD-1基因敲除T细胞组（经尾静脉注射PD-1基因敲除的T细胞）、PD-1单抗组（经尾静脉注射PD-1单抗）,观察结直肠癌移植瘤模型中各组小鼠体重,活动度,生存期等,绘制小鼠生存率曲线;处死各组中小鼠,分别取肝,肺和肠等组织进行病理学分析;分离MLNs、脾脏淋巴细胞,采用流式细胞仪检测MLNs、脾脏CD4+,CD8+T细胞,Treg细胞比例,ELISA法检测MLNs、血清中肿瘤免疫相关细胞因子的分泌水平变化。[结果]与模型对照组相比较,同种异体PD-1基因敲除T细胞可抑制结直肠癌荷瘤小鼠原位移植瘤的生长及向肝脏和肺部的转移,延长了小鼠的存活时间。PD-1基因敲除T细胞回输结直肠荷瘤小鼠,ELISA结果显示,与同模型对照组、阴性对照组相比较,PD-1基因敲除T细胞回输组MLNs和血清中IFN-y,TNF-α和IL-12的水平增加,IL-6无明显变化,IL-17水平减少。在结直肠癌小鼠PD-1基因敲除T细胞回输后,PD-1敲除组小鼠的CD44+CD62L-记忆T细胞比例明显提升,CD4+FoxP3+调节性T细胞比例降低。[结论]同种异体PD-1基因敲除T细胞在结直肠癌中显示出体内抑制肿瘤转移的作用,且可能通过依赖CD8+T细胞在结直肠癌中发挥抗肿瘤作用。第二章:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性评价第一部分:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的建立及其生物学特性[方法]在GENEBANK数据库中搜索食蟹猴PD-1基因序列,设计靶向食蟹猴PD-1基因的sgRNA,构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体,经扩增、酶切鉴定及测序验证,获得正确的sgRNA表达载体;分离培养食蟹猴PBMC,采用Lonza-4D电转仪进行电转染,48h后检测转染效率,采用PCR技术及T7E1酶切鉴定PD-1基因的敲除。在细胞因子刺激下诱导食蟹猴T细胞增殖,定期观察细胞形态变化及集落形成并计数,绘制食蟹猴PD-1基因敲除T细胞生长曲线,FACS检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞周期、凋亡,CCK-8法检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞增殖,以及食蟹猴PD-1基因敲除T细胞表面特征分子的表达,通过ELISA法检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞分泌的IFN-γ、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2水平。[结果]成功获得了靶向食蟹猴PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向食蟹猴PD-1基因的敲除重组表达载体sgRNA/Cas9,成功培养了食蟹猴PD-1基因敲除的T细胞,细胞生长周期为28天,生长曲线呈S形,符合Logistic生长曲线。CCK-8法检测结果显示,与未经敲除PD-1基因的T细胞相比较,PD-1基因敲除的T细胞增殖未受到抑制,生长曲线基本与未经敲除PD-1基因的T细胞相同;流式细胞仪检测T细胞表型无改变,具有杀伤性作用的CD8+T细胞所占比例有所升高;细胞周期及凋亡检测结果显示:与未经敲除PD-1基因的T细胞相比较,PD-1基因敲除的T细胞G0/G1期,S期,G2/M期比例两者无统计学差异,早期凋亡、死亡细胞比例两者无统计学差异。ELISA法对细胞因子IFN-γ、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2进行检测,结果显示:PD-1基因敲除的T细胞释放细胞因子与相同培养条件下,未进行PD-1敲除的T细胞释放细胞因子量统计学无差异。[结论]抑制性检查点基因PD-1的破坏导致PD-1表达的降低,但在体外培养期间不影响PD-1基因敲除T细胞的活力、PD-1基因敲除T细胞特征标志物的表达、PD-1基因敲除T细胞凋亡和PD-1基因敲除T细胞周期,且扩增的PD-1基因敲除T细胞也不影响具有细胞因子表达的能力,为其体内安全性评价奠定基础。第二部分:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性评价[方法]多次富集PD-1基因敲除T细胞后,经静脉回输入食蟹猴体内,参照人细胞因子诱导的淋巴细胞回输有效剂量（2×107/kg）,溶解于100ml 0.9%氯化钠注射液中,对照组经静脉注射100ml/（kg·次）0.9%氯化钠注射液,每3d上午同一时间给药1次,共给药3次,分别在回输后4h,24h,48h,1w,2w,3w,4w直到100天抽取外周血,流式细胞仪检测CD3,PD-1的表达,观察各组食蟹猴体重,活动度等一般情况,监测血常规、血生化,ELISA法检测各组食蟹猴Th1:IL-2、IL-12、IFN-γ;Th2:IL-4、IL-10;炎症细胞因子:TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子水平的变化,并分别取肝、肺、骨髓、脾脏、胸腺、甲状腺、垂体、肾上腺、睾丸等组织进行病理学分析,观察其毒性反应。[结果]将PD-1基因敲除的T细胞回输到食蟹猴体内,PD-1基因敲除的T细胞未显示出对其体重、活动度等一般情况的影响,血液学检查指标:白细胞数、单核细胞数与对照组相比,均未出现明显变化;生化学检查指标:总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、谷草转移酶、谷丙转移酶、尿素氮、肌酐等与对照组相比,均未出现明显变化;组织病理学分析显示没有与输注的PD-1基因敲除T细胞相关的损伤;流式细胞术监测外周血中PD-1基因敲除的T细胞的体内持久性为两个月。[结论]我们的研究结果证明了食蟹猴用于评估PD-1基因敲除T细胞免疫治疗安全性的效用,并为基于T细胞的过继免疫治疗提供了新的策略。
李晓钰[2]（2021）在《α-亚麻酸植物甾醇酯基于AMPK调节线粒体功能及氧化应激改善非酒精性脂肪性肝病的作用和分子机制》文中认为目的:本研究旨在探讨α-亚麻酸植物甾醇酯（plant sterol ester ofα-linolenic acid,PS-ALA）对非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的改善作用,并从保护线粒体功能和抑制氧化应激角度探讨其可能的分子机制。方法:第一部分:将50只C57BL/6J小鼠随机分为5组（10只/组）,分别为:对照组（Control,普通饲料喂养）、高脂高胆固醇组（HFD,高脂高胆固醇饲料喂养）、植物甾醇组（PS,高脂高胆固醇饲料添加2%PS喂养）、α-亚麻酸组（ALA,高脂高胆固醇饲料添加1.3%ALA喂养）、α-亚麻酸植物甾醇酯组（PS-ALA,高脂高胆固醇饲料添加3.3%PS-ALA喂养）。16w后,分别用GPO-PAP法、COD-PAP法、TBA法、DTNB法检测小鼠血清和肝脏TG、TC、MDA及GSH水平;油红O染色检测肝脏脂滴沉积情况;透射电子显微镜观察肝细胞线粒体超微结构;流式细胞术及荧光染色检测小鼠肝脏ROS水平;免疫组织化学染色及Western blot检测AMPK、p-AMPK以及线粒体动力学（Mfn2,Opa1,Drp1）、线粒体生物合成（PGC-1α,Nrf1,Tfam）、线粒体脂肪酸β氧化（PPARα,CPT1A）、线粒体呼吸链（COXⅠ,COXⅢ）和氧化应激反应（Nrf2,HO-1）)关键信号分子蛋白表达水平。第二部分:培养HepG2细胞,先将其分为5组:（1）对照组（Control）（2）模型组（OA）（3）PS干预组（OA+PS）（4）ALA干预组（OA+ALA）（5）PS-ALA干预组（OA+PS-ALA）。油红O染色观察肝细胞脂滴沉积情况;DCFH-DA荧光探针检测ROS水平。然后培养HepG2细胞,并将其分为7组:（1）对照组（Control）（2）模型组（OA）（3）PS-ALA干预组（OA+PS-ALA）（4）OA+AMPK抑制剂组（OA+CC）（5）OA+AMPK抑制剂+PS-ALA组（OA+CC+PS-ALA）（6）OA+AMPK激活剂组（OA+AICAR）（7）OA+AMPK激活剂+PS-ALA组（OA+AICAR+PS-ALA）。尼罗红染色观察细胞脂滴沉积;DCFH-DA探针检测细胞ROS水平;Mito-Tracker Green荧光染色检测线粒体数量;JC-1探针检测线粒体膜电位;免疫荧光和Western blot检测AMPK,p-AMPK及线粒体生物合成（PGC-1α/Nrf1/Tfam）、脂肪酸β氧化（PPARα/CPT1A）及抗氧化反应（Nrf2/HO-1）关键信号分子蛋白表达水平。结果:第一部分:与Control组相比,HFD组小鼠肝脏组织出现大量脂质沉积;肝脏及血清TC、TG水平显着升高;肝细胞线粒体超微结构明显异常;肝脏ROS的产生显着增多;血清及肝脏MDA水平显着增加、GSH水平显着降低;肝脏p-AMPK、PGC-1α、Nrf1、Tfam、PPARα、CPT1A、Mfn2、Opa1、Drp1、COXⅠ、COXⅢ、Nrf2、HO-1蛋白表达水平显着下调,CYP2E1蛋白表达水平显着上调（P<0.05）。与HFD组相比,PS-ALA组小鼠肝脏脂肪变性程度显着减轻;血清及肝脏TC、TG水平下降;肝细胞线粒体超微结构明显恢复;肝脏ROS产生减少;血清及肝脏MDA水平降低、GSH水平增加;肝脏p-AMPK、PGC-1α、Nrf1、Tfam、PPARα、CPT1A、Mfn2、Opa1、Drp1、COXⅠ、COXⅢ、Nrf2、HO-1蛋白表达显着上调,CYP2E1蛋白表达水平显着下调（P<0.05）。第二部分:油红O染色和ROS检测结果显示:与Control组相比,OA组细胞有大量脂滴聚集,并有大量ROS产生。与OA组相比,PS、ALA及PS-ALA组细胞内脂滴显着减少,ROS水平降低,且PS-ALA组更为明显。AMPK表达水平检测结果显示:与Control组相比,OA组p-AMPK蛋白表达水平显着下调,同时细胞内脂滴沉积显着增加。与OA组相比,AICAR+PS-ALA组p-AMPK蛋白表达水平显着上调,细胞内脂滴沉积显着减少。在给予AMPK抑制剂CC后,PS-ALA增加p-AMPK表达水平和减少细胞脂滴沉积的作用显着减弱。Mito-Tracker Green和JC-1检测结果显示:与Control组相比,OA组细胞线粒体数量显着减少、线粒体膜电位显着降低。PS-ALA干预不仅显着增加细胞线粒体数量,而且显着升高细胞线粒体膜电位。但CC干预后,显着抑制PS-ALA的上述有益作用。免疫荧光及Western blot检测结果显示:与Control组相比,OA组细胞线粒体生物合成通路关键信号分子PGC-1α/Nrf1/Tfam、线粒体脂肪酸β氧化通路关键信号分子PPARα/CPT1A及抗氧化通路关键信号分子Nrf2/HO-1蛋白表达水平显着下调。与OA组相比,PS-ALA组细胞上述信号分子蛋白表达水平显着上调。但抑制AMPK活性后,PS-ALA对线粒体生物合成、线粒体脂肪酸β氧化及抗氧化相关蛋白的上调作用显着减弱。结论:PS-ALA通过激活AMPK,上调PGC-1α/Nrf1/Tfam、PPARα/CPT1A及Nrf2/HO-1信号通路,改善线粒体功能和抑制氧化应激,发挥NAFLD保护作用。
马琳沣[3]（2021）在《氧化压力在丙戊酸引起肝毒性中的作用研究》文中进行了进一步梳理癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病,目前药物治疗是控制癫痫的主要手段。丙戊酸（VPA）是一种广泛应用于临床的广谱抗癫痫药,对各类癫痫及痉挛的发作疗效显着,同时还可以用作双向情感障碍的治疗。虽然VPA的有效性和安全性已经得到了临床的广泛验证,但是仍存在一些不良反应,其中以肝毒性最为严重。在长期接受VPA治疗的患者中有61%会发展成为非酒精性脂肪肝（NAFLD）,如不及时干预,NAFLD将进一步发展为非酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化、甚至肝癌。因此,阐明VPA致肝毒性机制,寻找潜在治疗新靶点并进行干预治疗具有重要意义。目前普遍认为VPA引起的肝毒性与其活性代谢产物有关。VPA进入肝脏后,会在体内酶系的作用下进行生物转化,包括葡萄糖醛酸化反应、线粒体介导的β氧化、细胞色素P450酶系（CYP）介导的ω氧化。其中,由P450催化生成的4-ene-VPA及2,4-diene-VPA被认为可通过抑制线粒体β氧化代谢并生成一些毒性产物,如亲电子基,氧自由基等。它们可以通过直接破坏细胞内包括DNA、蛋白质、脂质等大分子物质导致细胞死亡,造成肝毒性。但与此同时,体外研究表明内源性产生的4-ene-VPA及2,4-diene-VPA的剂量并不足以诱导机体产生肝毒性。说明VPA代谢致毒并不能完全揭示VPA引起的肝毒性。而目前,大量的研究表明氧化压力（Oxidative stress）在VPA引起肝毒性中发挥了重要的作用。但是,氧化压力产生的来源及其作用机制尚不明确。本研究以癫痫患者、LO2细胞以及小鼠建立VPA肝毒性模型为基础,系统的研究了氧化压力在VPA肝毒性中的作用及机制。氧化压力是体内氧化压力与抗氧化作用失衡的一种状态,并会导致活性氧自由基（ROS）的过量积累。在清除氧化压力及有毒物质的代谢中,谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、过氧化氢酶（CAT）起到了关键作用。抗氧化酶的基因缺失及突变与药物性肝损伤的易感性密切相关。基于氧化压力在VPA肝损伤中的重要作用,本课题首先在长期服用VPA治疗的癫痫患者中研究了四种抗氧化酶基因多态性[GST mu1（GSTM1）,GST theta 1（GSTT1）,CAT C-262T,GPX Pro200Leu以及SOD2 Val16Ala]对VPA引起的肝功异常的影响。结果表明,CAT C-262T在肝功能正常的患者组跟肝功能异常的患者组中所呈现的基因多态性有着显着性的差异,同时线性回归分析也说明了CAT C-262T是VPA引起肝功能异常的一个风险因素。这表明CAT C-262T的基因多态性在VPA造成的肝功能异常中发挥了至关重要的作用,也间接证明氧化压力是VPA引起肝毒性的一个重要来源。CYP2E1是氧化压力产生的重要来源之一,与NAFLD的发生密切相关。有文献报道促进CYP2E1表达能增加VPA引起肝毒性。但是CYP2E1是否直接参与VPA引起的肝毒性仍未见报道。本研究着重探究了CYP2E1在VPA引起的氧化压力的产生及其诱导肝脂质化中的作用机制。通过体内外的研究,我们发现VPA在引起肝脂质化的同时会伴随着ROS的产生,抗氧化剂NAC抑制ROS的水平,同时显着减轻VPA引起的肝脂质化,证明氧化压力参与了VPA引起肝脂质化的过程。下一步,体内外的研究表明VPA显着提高了CYP2E1的m RNA、蛋白水平及酶活力水平。使用CYP2E1抑制剂DAS及特异性敲低CYP2E1的表达量均可降低ROS水平以及VPA引起的肝脂质化,说明由CYP2E1产生的ROS是VPA引起肝脂质化的重要来源。为分析氧化压力引起VPA肝脂质化的分子机制,我们研究了与脂转运、合成及外排相关基因的表达水平。结果表明VPA可提高CD36及DGAT2的m RNA及蛋白表达量,并且NAC、DAS都可逆转此过程。由此,我们推测VPA可通过诱导CYP2E1的表达,致使氧化压力积累及其CD36、DGAT2过表达、导致体内外肝脂质化。此结论通过体外的时间进行曲线进一步得到证实。此外,有研究表明铁死亡与氧化压力及NAFLD的发生密切相关,我们随后在动物水平初步的研究了铁死亡在VPA引起肝毒性中的作用。研究结果发现VPA在引起小鼠肝毒性的同时也会诱发铁死亡。在此过程中,一方面VPA可以通过减少GPX4的表达量、降低机体对过氧化脂质的还原能力造成脂质过氧化;另一方面,VPA通过对铁反应元件系统的调节,提高了体内二价铁的水平,造成铁过载并诱发铁死亡,加剧了丙戊酸引起的肝毒性。综上所述,我们的结果表明VPA引起的氧化压力是抗氧化酶活性降低、CYP2E1酶活力提高以及二价铁水平升高共同作用的结果。VPA可通过引起肝功能异常,促进CYP2E1表达并诱导ROS从而进一步促进脂转运蛋白CD36和甘油三酯合成蛋白DGAT2的表达肝脂质化、诱发铁死亡引起肝毒性。这些结果为将来为以CYP2E1和铁离子为靶点进行VPA肝毒性的干预性治疗提供了全新思路,也为其临床合理用药提供了理论及实验基础。
南博[4]（2021）在《大蒜素调控氧化应激及内质网应激改善膳食丙烯酰胺肝毒性机制研究》文中认为本研究受国家自然科学基金面上项目（31571939）资助。丙烯酰胺（Acrylamide,AA）作为食品热加工过程中美拉德反应的重要产物,具有生殖毒性、神经毒性、肝毒性和潜在的致癌性等,因此通过膳食摄入AA的安全性问题引起广泛关注。研究发现,AA毒性的发生与氧化应激（Oxidative stress,OS）和内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）密切相关,但其潜在机制仍处于探究阶段。OS和ERS可参与调控NLRP3（NOD-like receptor protein-3,NLRP3）炎性小体的激活,而MAPK（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）和NF-κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路在调节炎症反应的过程中也发挥了至关重要的作用。探究MAPK和NF-κB信号通路参与AA诱导OS和ERS的过程不仅可以对AA的毒性机制进行补充,也可以进一步完善OS和ERS诱导生命过程紊乱的潜在机制。生物活性成分在调节机体炎症反应上一直受到广泛关注,大蒜素（Allicin）作为大蒜的主要活性物质,具有抗氧化、抑菌及抗炎等生理功能,在AA毒性干预上表现了突出的作用。因此,本研究旨在探究AA诱导OS、ERS和MAPK信号通路激活与NLRP3炎性小体激活、炎症反应之间的相互关系,并在此基础上,通过Allicin干预处理,进一步阐明Allicin保护AA所致机体损伤的潜在机制。主要研究内容与结果如下:（1）利用大鼠肝脏巨噬细胞Kupffer细胞和人肝癌细胞HepG2细胞构建细胞模型,探讨AA对Kupffer和HepG2细胞NLRP3炎性小体激活的影响。将Kupffer和HepG2细胞进行1m M AA诱导处理,首先,通过对超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）酶活性和活性氧（Reactive oxygen species,ROS）释放水平检测,以及ERS标志性蛋白-葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulated protein 78 k D,GRP78）和C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）的检测,确定AA可以诱导细胞OS和ERS。其次,通过基因和蛋白水平的检测,发现AA可以激活MAPK和NF-κB信号通路以及NLRP3炎性小体。此外,以ELISA酶联免疫法检测细胞炎症因子白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和白细胞介素-18（Interleukin-18,IL-18）释放水平,也补充说明了AA促进Kupffer和HepG2细胞炎症因子的释放,诱发炎症反应。在此基础上,分别利用ROS清除剂、内质网应激抑制剂以及MAPK选择性抑制剂预处理Kupffer和HepG2细胞,进一步明确OS、ERS和MAPK信号通路三者在参与调节AA诱导Kupffer和HepG2细胞NLRP3炎性小体的激活过程中的主要作用。研究发现,AA通过OS/ERS-MAPK-NLRP3信号通路激活NLRP3炎性小体,诱导炎症反应。（2）利用Allicin对AA的毒性进行干预,研究Allicin对AA诱导的Kupffer和HepG2细胞NLRP3炎性小体激活及炎症反应的影响及调控机制。以3.75、7.5和15μM Allicin干预处理1 m M AA诱导的Kupffer和HepG2细胞,首先,对SOD、GSH-Px酶活性和ROS释放水平以及GRP78、CHOP的mRNA和蛋白表达的检测证明Allicin缓解AA诱导的Kupffer和HepG2细胞OS和ERS。其次,对未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）分支的需肌醇酶1（Inositol-requiring enzyme 1,IRE1）通路、MAPK和NF-κB信号通路节点蛋白进行检测,发现Allicin抑制IRE1α、凋亡信号调节激酶1（Apoptosis signal regulating kinase-1,ASK1）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、丝/苏氨酸蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases,ERK）、p38丝裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen activited protein kinase,p38 MAPK）和核转录因子p65（p65 NF-k B）蛋白磷酸化及肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receptor-associated factor 2,TRAF2）和X盒结合蛋白1（X-box binding protein1,XBP1）蛋白的表达水平,从而减少信号通路的激活,抑制AA诱导的NLRP3炎性小体的激活。研究发现,Allicin通过OS/ERS-MAPK-NLRP3信号通路抑制AA诱导的Kupffer和HepG2细胞NLRP3炎性小体激活,减轻AA诱发的毒性作用。（3）建立AA染毒和大蒜素干预的SD（Sprague Dawley,SD）大鼠模型,通过体内实验深入研究AA诱导NLRP3炎性小体激活的潜在机制及Allicin对AA诱导炎症反应的调控影响。体外实验初步明确了AA诱导NLRP3炎性小体激活及Allicin缓解AA诱导炎症反应的潜在机制。因此,Allicin缓解AA对SD大鼠肝脏和脾脏损伤的研究,可对其潜在机制进行进一步明确和完善。分别构建SD大鼠AA（30 mg/kg）染毒模型和Allicin（25 mg/kg和50 mg/kg）保护模型,肝脏与脾脏形态学观察证明SD大鼠AA染毒模型构建成功。对OS指标、ERS标志蛋白和炎症指标进行测定,发现SOD、ROS、GRP78、CHOP以及IL-1β和IL-18等水平与体外实验结果一致。此外,MAPK和NF-κB信号通路相关蛋白表达水平的检测结果表明,AA通过激活MAPK和NF-κB信号通路,诱导大鼠肝脏和脾脏NLRP3炎性小体的激活,进一步产生炎症反应,而Allicin对这一过程具有潜在的调节作用。综上所述,AA通过诱导OS和ERS激活MAPK信号通路,而MAPK信号通路的激活是NLRP3炎性小体激活的关键,NLRP3炎性小体的激活会进一步引发炎症反应,Allicin则可以通过调控OS和ERS调节MAPK信号通路的激活,抑制机体炎症的产生,从而抑制AA的毒性作用。因此,Allicin通过OS/ERS-MAPK-NLRP3信号通路抑制AA诱导的NLRP3炎性小体激活,缓解AA的毒性作用。
宋远[5]（2021）在《穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究》文中认为背景酒精性肝损伤是由于酒精所致肝细胞功能受损的动态病理过程,随着其病理变化过程的加重,酒精性肝损伤可逐渐形成酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化,甚至肝细胞癌等酒精性肝病,进而导致较为严重的临床结局。目前,酒精性肝损伤发生发展过程的分子机制尚不完全清楚,也无明确的治疗靶点。从流行病学角度看,由过量饮酒所致酒精性肝病的患病率存在明显的地域差异,目前尚无全国性统计数据,如有研究报道辽宁省部分城市酒精性肝病的患病率为6.10%,高于浙江省的4.34%。目前临床上治疗酒精性肝损伤的药物主要包括:糖皮质激素、抗氧化剂、营养补充剂、中药以及天然活性成分、抗体类药物等,药物治疗费用不一,且疗效报道也存在争议。目前明确酒精性肝损伤的病理进程和分子机制以及探索有效的治疗药物仍是需要解决的问题。穿心莲内酯是临床常用的具有抗炎、抗病毒、免疫调节等功效的中药成分,近年来的研究报道,穿心莲内酯还可能具有保肝利胆、保护心脑血管等作用,提示药物作用可能存在某些新功效值得开发,可以产生“老药新用”的生物学效应。作者通过前期课题研究基础以及临床观察发现,穿心莲内酯可能对肝脏酶学指标的改善具有较好的效果,但其具体的作用靶点尚未被明确阐述。因此,本研究首先利用文献计量学描述穿心莲内酯与肝损伤的研究现状,同时收集并分析了某三甲医院应用穿心莲内酯的病例现状,研究探讨穿心莲内酯在临床中的应用情况;其次,本研究构建了酒精性肝损伤细胞模型和动物模型,从体外和体内两个层面对酒精性肝损伤发生发展的过程和具体的发病机制进行了实验研究,利用穿心莲内酯进行干预,探讨其对酒精性肝损伤的保护作用,从而为阐明酒精性肝损伤的发病机制和探寻新的临床治疗药物提供理论依据和实验数据。目的:（1）通过文献计量学以及分析某三甲医院应用穿心莲内酯成品药物开展临床治疗的病例情况,明确穿心莲内酯的研究热点和临床适应症以及可能的药理作用机制,为深入探寻穿心莲内酯药物在酒精性肝损伤中的应用提供研究路径。（2）分别构建酒精性肝损伤细胞模型和动物模型,应用穿心莲内酯进行干预,探讨穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的可能机制。方法:（1）以CNKI、GNBR,Drugbank,Hetionet数据库为数据来源,检索主题词为“穿心莲内酯”和“肝损伤”或“Andrographolide”和“Liver Injury”,检索时间范围为2000年1月1日-2020年12月31日,文献类型为期刊文献,提取其中的发表年份、引证关系及关键词等信息,通过自行编制的计算机代码进行可视化分析。（2）回顾性分析吉林省某三甲医院2015年1月至2019年12月期间住院治疗,且在院期间应用穿心莲内酯注射液的患者,通过方差分析、卡方检验、秩和检验等方法比较分析患者入院和出院时的血常规、肝功、肾功、血糖、血脂和血离子水平的变化情况。（3）选择健康成年雄性C57BL/6J小鼠,麻醉后,用75%酒精全身消毒放入超净工作台中,解剖小鼠,取出肝脏,制备小鼠原代肝细胞悬液并进行培养。经酒精染毒,同时应用低、中、高剂量（0.05、0.1、0.2mmol/L）穿心莲内酯进行干预,采用ELISA法检测细胞培养液中炎症相关因子的含量,q RT-PCR和Western Blot方法检测细胞内炎症相关信号通路基因和蛋白的表达变化情况。（4）选择8周龄雄性C57BL/6J小鼠,体重16-20g,随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、穿心莲内酯低、中、高剂量组,共六组,每组15只。空白对照组小鼠给予生理盐水灌胃,模型组小鼠给予市售高度白酒灌胃12w,阳性对照组小鼠给予高度白酒灌胃,同时给予水飞蓟宾灌胃,剂量为0.1g/kg·BW·d-1,穿心莲内酯低、中、高剂量组除给予高度白酒灌胃,同时分别给予穿心莲内酯0.05、0.1、0.2g/kg·BW·d-1灌胃。成模后,检测各组小鼠血清转氨酶、肝脏组织脂质代谢、抗氧化等各项生化指标的变化情况,同时利用q RT-PCR、Western Blot等方法检测小鼠肝组织中炎症相关信号通路基因和蛋白的表达情况。结果:（1）本研究利用文献计量学方法,以“穿心莲内酯”和“肝损伤”或“Andrographolide”和“Liver Injury”为主题词,搜集2000年以来,发表在CNKI、GNBR、Drugbank和Hetionet数据库的全部期刊文献,结果表明,在CNKI数据库中穿心莲内酯与肝损伤相关的研究共34篇,年度发文数量逐渐上升,结合外文数据库研究结果发现,穿心莲内酯与肝损伤研究的作用机制与抗炎信号通路有关。（2）本研究纳入了2015年1月至2019年12月在某三甲医院住院治疗期间应用过穿心莲内酯注射液患者的病历资料,共207例,通过比较用药前后患者血常规、肝功能、肾功能、血糖、血脂及离子水平的变化情况发现,穿心莲内酯对患者血常规指标中白细胞、单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞以及肝功能指标中谷草转氨酶、前白蛋白等的改善具有明显效果,而用药前后患者的肾功能、血脂及离子水平无明显变化,提示穿心莲内酯具有一定的抗炎和保护肝脏的作用。（3）酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞具有一定的毒性作用,且呈现明显的剂量依赖性。酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞24h毒性作用的IC50值约为400 mmol/L,且酒精可导致小鼠原代肝细胞内的炎症反应相关因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平显着升高,而经不同浓度的穿心莲内酯干预表现对肝脏细胞的保护作用,尤以高剂量（0.2mmol/L）组作用效果最为显着。（4）本研究成功建立了小鼠酒精性肝损伤动物模型,给予8周龄雄性C57BL/6J小鼠4mg/d·kg·BW高度白酒一周后过渡至6mg/d·kg·BW灌胃共12w后,可诱导小鼠出现肝脏重量和肝脏指数增加,血清转氨酶相关指标AST、ALT和γ-GT的水平显着升高（P<0.05）;肝脏组织氧化应激指标MDA显着升高、SOD和GSH显着下降（P<0.05）;肝组织内总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及ROS蓄积,表明经高度白酒灌胃12w后,小鼠出现明显的肝组织损伤。（5）穿心莲内酯对小鼠酒精性肝损伤具有明显的保护作用。分别给予酒精模型组小鼠不同浓度（0.05、0.1、0.2g/kg·BW）的穿心莲内酯,结果发现,高剂量穿心莲内酯（0.2g/kg·BW）组可显着降低小鼠的肝脏重量和肝脏指数,差异具有统计学意义（P<0.05）;且高剂量穿心莲内酯组小鼠血清转氨酶AST、ALT和γ-GT水平显着低于酒精模型组,而与空白对照组和阳性对照组无明显统计学差异;穿心莲内酯中、高剂量组小鼠肝组织中脂质过氧化指标MDA水平显着低于酒精模型组,差异具有统计学意义（P<0.05）,抗氧化指标SOD和GSH水平在高剂量穿心莲内酯组显着高于模型组,与阳性对照组无明显差异;穿心莲内酯可在一定程度上有效降低酒精诱导的肝组织脂质紊乱,且以高剂量组,即0.2g/kg·BW穿心莲内酯的保护效果最为明显,高剂量组穿心莲内酯组小鼠肝组织中TC和TG水平与阳性对照组相比,无统计学差异（P>0.05）;与模型组相比,穿心莲内酯各剂量组小鼠肝脏ROS均明显下降,特别是中、高剂量组下降更加明显,差异具有统计学意义（P<0.05）,以高剂量组效果最为明显。且高剂量穿心莲内酯组小鼠肝组织ROS水平与阳性对照组无明显差异（P>0.05）。（6）从各组小鼠肝组织病理学（HE染色）结果可以看出,空白对照组和阳性对照组小鼠肝细胞大小一致,肝细胞索以小叶中央动脉为中心呈辐射状排列;胞核大呈圆形,胞浆均匀红染;胆小管细胞结构完整,未见病变。与空白对照组小鼠相比,模型组小鼠肝组织结构紊乱,肝小叶和肝索结构消失,其中有大量脂肪空泡和炎细胞浸润,肝细胞胞浆稀疏,呈纤维化状态。与模型组相比,穿心莲内酯各剂量组小鼠肝组织形态有所改善,尤以高剂量（0.2g/kg·BW）组小鼠表现最为明显,肝组织接近阳性对照组结构,其脂肪空泡、炎细胞浸润和纤维化状态均有明显改善。（7）穿心莲内酯对各组小鼠肝组织NF-κB、TNF-α和CYP2E1蛋白水平的表达均有明显影响,从免疫组化结果看,模型组小鼠肝组织中有大量NF-κB和TNF-α的原位表达。与模型组相比,随着干预剂量的增高,穿心莲内酯各剂量组NF-κB和TNF-α的蓄积逐渐减少,且呈现明显的剂量依赖性,穿心莲内酯高剂量组小鼠肝组织NF-κB和TNF-α的表达量已接近空白对照组和阳性对照组水平。从Western Blot结果看,模型组小鼠肝组织中NF-κB、TNF-α和CYP2E1表达水平均显着升高（P<0.05）,而经穿心莲内酯干预后,NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平均有所下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。穿心莲内酯各剂量组NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平与阳性对照组无明显差异（P>0.05）。结论:（1）通过文献计量学分析得出,穿心莲内酯与肝损伤相关研究可能的信号通路主要是炎症信号分子,如NF-κB p100、NF-κB p105、TNF-α等。（2）通过对穿心莲内酯的临床应用现状分析得出,穿心莲内酯是目前临床上常用的抗炎药物,对改善肝脏功能具有一定的作用。（3）酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞具有一定的毒性作用,呈现明显的剂量依赖性,穿心莲内酯高剂量组（0.2 mmol/L）对酒精所致原代肝细胞损伤具有明显的保护作用。（4）本研究成功建立了小鼠酒精性肝损伤动物模型,即给予4mg/d·kg·BW高度白酒一周后过渡至6mg/d·kg·BW灌胃共12w,可诱导小鼠出现血清转氨酶升高、肝脏脂质过氧化、ROS生成等肝脏功能受损及组织病理改变。（5）穿心莲内酯高剂量组（0.2g/kg·BW）可有效降低小鼠酒精性肝损伤时的血清转氨酶水平、氧化应激水平、肝脏脂质水平以及ROS生成。（6）穿心莲内酯对酒精性肝损伤的保护作用机制可能是通过抑制CYP2E1/ROS/NF-κB信号通路相关蛋白的表达实现的。
拜小强[6]（2021）在《牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立》文中研究表明牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起牛病毒性腹泻病,也是导致牛呼吸道疾病综合征（BRDC）主要病原之一。牛病毒性腹泻病临床表现复杂,以孕牛流产、胎牛木乃伊化、犊牛先天性缺陷,染疫牛只呈双向热、腹泻脱水、共济失调、免疫抑制和持续感染为主。该病在世界范围内广泛流行,目前我国20多个省、市、自治区的牛群中检测到病原,牛、羊﹑猪和鹿等偶蹄类动物也存在不同程度地感染,严重影响着畜牧业的健康发展。BVDV基因组中ORF编码结构蛋白和非结构蛋白,结构蛋白包括核心蛋白C和糖基化囊膜蛋白Erns、E1、E2,在病毒适应环境和维持自身稳定方面发挥着重要的作用。本实验利用MDBK细胞对BVDV毒株培养增殖和滴度测定,设计全序列引物对编码结构蛋白的基因进行克隆和鉴定,在此基础上应用生物信息学分析工具对基因组序列以及蛋白结构、性质和功能进行预测分析。结果显示MDBK细胞接毒培养至24h开始出现细胞病变,测定BVDV TCID50=10-5.112/0.1m L,PCR扩增出结构蛋白基因条带分别为306bp、681bp、585bp和1122bp,测序结果与NCBI数据库中BVDV-1、BVDV-2、CSFV和BDV共17株同源性比对显示,与BVDV-1 NADL株同源性最高,分别为100%、99.71%、97.78%和100%;构建系统进化树显示,与BVDV-1 NADL株进化关系密切,与同属的CSFV和BDV进化关系较为疏远。BVDV Npro和Erns蛋白较为保守且具有特征性功能,是与同科不同属病毒进行鉴别的差异化蛋白,Npro和ErnsRNase在阻断干扰素诱导和引起宿主持续感染中发挥重要的作用。本实验构建BVDV Npro和Erns重组表达载体,利用哺乳动物真核表达系统对Npro和Erns蛋白进行表达。成功构建了p CMV-Myc-Npro和p CMV-Myc-Erns真核表达质粒,并将重组质粒瞬时转染至HEK 293细胞中,经Western blot验证后,分别在21k D和27k D处出现目的条带。BVD常用的诊断方法包括临床诊断、病原学检验、免疫学检验和分子生物学检验技术。本实验建立了BVDV RT-PCR、q RT-PCR和RT-LAMP三种核酸检测方法,并对检测方法进行优化、验证和比较。实验证实建立的三种检测方法均有良好的特异性;对不同浓度标准质粒样品检测显示,q RT-PCR方法灵敏度最高（8.134×101copies/μL）,分别是RT-LAMP和RT-PCR的10和1000倍,RT-LAMP灵敏度次之（8.134×102copies/μL）,RT-PCR灵敏度最低（8.134×104copies/μL）;对67份临床样本检测结果进行Kappa和Mc Nemar校正检验分析,得出三种方法临床检出率高、检测结果一致性较好。诊断BVDV时建议在条件有限的情况下采用RT-LAMP检测方法,实验室条件允许时进一步采用q RT-PCR检测方法复检确诊。
王明华[7]（2021）在《迷迭香酸抑制丙烯酰胺诱导的氧化应激和内质网应激缓解BRL-3A细胞凋亡机制研究》文中进行了进一步梳理丙烯酰胺（Acrylamide,AA）是食品中常见的内源性污染物,且肝脏是AA毒性作用的首要靶器官。AA刺激机体产生活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,激活氧化应激（Oxidative stress,OS）和内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）反应导致细胞凋亡可能是AA产生毒性作用的机制之一。迷迭香酸（Rosmarinic acid,Ros A）是天然存在的水溶性多酚化合物,具有良好的抗氧化活性,可以缓解机体所受的氧化损伤。本研究旨在对AA诱导的大鼠BRL-3A细胞毒性损伤的机制进行深入研究。通过添加天然植物源抗氧化剂Ros A,研究其对AA诱导的OS和ERS介导BRL-3A细胞凋亡的保护作用,为Ros A保护机体免受AA肝毒性的作用机制提供理论依据。本论文主要研究结果如下:（1）研究了Ros A对自由基的清除能力及其对AA诱导BRL-3A细胞氧化应激水平的影响。Ros A对ABTS、DPPH、FRAP和ORAC自由基有着很好的清除作用,而且清除作用呈明显浓度依赖性,Ros A浓度越高,其自由基清除效率越高。Ros A预处理可以降低AA刺激BRL-3A细胞产生的大量ROS,提高BRL-3A细胞SOD和GSH活性,降低MDA生成量,从而增强细胞的抗氧化能力,减轻AA诱导的细胞BRL-3A氧化应激损伤和脂质过氧化。（2）研究了Ros A对AA诱导的BRL-3A细胞CYP2E1和MAPK信号通路的影响。Ros A通过疏水作用结合在CYP2E1的活性区域,与氨基酸残基Ile114、Trp122、Leu368、Phe430、Arg435、Cys437、Ala438和Gly439有较强的相互作用,并降低BRL-3A细胞中CYP2E1的蛋白表达,抑制CYP2E1蛋白活性。AA提高MAPK通路蛋白p-JNK、p-ERK和p-p38的表达水平,然而Ros A和NAC（ROS抑制剂）预处理显着降低p-JNK、p-ERK和p-p38蛋白表达水平。表明Ros A可以通过减少ROS的产生抑制AA激活的MAPK通路,从而保护细胞免受AA诱导的OS损伤。（3）研究了Ros A对AA诱导的BRL-3A细胞内质网应激和细胞凋亡的影响。Ros A预处理降低AA诱导产生的钙离子,维持细胞中钙离子动态平衡。Ros A降低IRE1α通路蛋白GRP78,p-IRE1α,TRAF2和XBP-1s的表达水平,并降低ERS介导凋亡相关蛋白P-ASK1,Caspase-12和CHOP的表达。NAC预处理后,ERS相关蛋白IRE1α,GRP78,TRAF2和CHOP的表达明显降低,表明Ros A可以通过减少ROS的产生抑制AA诱导的ERS反应,从而保护细胞免受AA诱导的ERS损伤。Ros A预处理显着降低AA提高的细胞凋亡率,并降低凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax/Bcl-2的表达。NAC和4-PBA（ERS抑制剂）预处理降低细胞凋亡蛋白Caspase-3和Bax/Bcl-2的表达水平,表明Ros A通过抑制OS和ERS抑制细胞凋亡,从而预防AA的肝毒性。综上所述,Ros A有着良好的自由基清除能力和抗氧化能力,有效降低AA诱导BRL-3A细胞产生的ROS和MDA含量,显着提高SOD和GSH活性,降低CYP2E1蛋白表达,从而改善细胞氧化损伤。Ros A通过降低p-JNK、p-ERK和p-p38蛋白表达抑制AA激活的MAPK通路,减轻AA诱导的细胞OS损伤。Ros A还通过维持钙离子动态平衡,抑制IRE1α通路蛋白减轻ERS损伤。此外,Ros A通过降低细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的表达抑制AA诱导的细胞凋亡。总之,Ros A通过抑制OS和ERS减缓细胞凋亡,从而预防AA的肝毒性。本研究为Ros A在食品领域防护AA危害发挥作用提供理论依据,同时为其他天然植物源抗氧化剂应用于AA防护领域提供可靠的理论基础。
何川[8]（2021）在《FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究》文中研究指明背景:胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发肿瘤,具有较高的侵袭性和复发性[2]。新诊断的恶性胶质瘤的治疗方案主要以手术切除肿瘤为主,结合放疗、化疗等综合治疗方法[3]。替莫唑胺是临床一线化疗药物,然而由于耐药机制的建立,替莫唑胺取得的效果仍然有限[4]。越来越多的证据表明自噬在降低胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性方面起着重要的作用[9]。自噬是一种进化上高度保守的分解代谢过程。细胞通过将非必须的细胞组分或功能障碍的细胞器通过溶酶体降解来提供营养或能量,以维持细胞的稳态[6]。抑制自噬是提高胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的有效手段[9-12]。但是自噬导致胶质瘤细胞对替莫唑胺抗性的具体机制尚不清楚。通过自噬清除受损线粒体的过程被称为线粒体自噬[13]。细胞通过线粒体自噬的方式清除受损的线粒体,可以抑制细胞内ROS的积累,阻断线粒体中促凋亡蛋白如AIF、细胞色素C的释放[14]。尽管自噬赋予了胶质瘤细胞对替莫唑胺的抗性[9,12],但尚不清楚自噬的保护作用是否与清除受损线粒体相关。Bcl-2/腺病毒E1B 19-k Da相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-ineracting protein 3,BNIP3）是一种自噬受体,负责介导受损线粒体通过自噬途径清除[13]。然而,替莫唑胺是否能引发线粒体自噬尚不明确。叉头盒转录因子3a（forkhead box transcription factor 3a,FOXO3a）是FOX蛋白家族成员。FOXO3a调控多种细胞功能如增殖、分化、侵袭转移和细胞死亡[15]。自噬的激活和BNIP3的上调均由FOXO3a调控[16-18],但是FOXO3a是否参与了BNIP3介导的线粒体自噬仍不清楚。因此,我们研究了FOXO3a在替莫唑胺引起胶质瘤细胞死亡中的作用,以及它与BNIP3介导的线粒体自噬之间的关系。目的:用人类及大鼠胶质瘤细胞系以及裸鼠移植瘤模型来研究FOXO3a和BNIP3在替莫唑胺诱导胶质瘤细胞死亡中的作用及机制。方法:1.MTT法检测胶质瘤细胞生存率。2.LDH释放法检测胶质瘤细胞死亡率。3.si RNA转染研究相关蛋白在替莫唑胺引起胶质瘤细胞死亡中的作用。4.免疫荧光技术检测相关蛋白在细胞内定位的变化。5.DCFH-DA荧光探针检测胶质瘤细胞内ROS水平变化。6.Mito SOX荧光探针检测胶质瘤细胞内线粒体超氧化物水平的变化。7.JC-1荧光探针检测胶质瘤细胞线粒体膜电位的变化。8.Mito Tracker荧光探针检测胶质瘤细胞线粒体形态和数量的变化。9.蛋白质印迹技术检测胶质瘤细胞和组织内蛋白表达的变化。、10.中性单细胞凝胶电泳检测胶质瘤细胞DNA双链断裂。11.构建Stub RFP-Sens GFP-LC3B慢病毒转染的U87细胞,研究替莫唑胺对胶质瘤细胞自噬的作用。12.C6裸鼠移植瘤模型研究替莫唑胺对体内胶质瘤细胞的作用。结果:1.替莫唑胺以浓度依赖的方式抑制胶质瘤细胞的体外增殖,并能抑制体内胶质瘤的生长。2.替莫唑胺引起胶质瘤细胞的DNA双链断裂,AIF核转位和线粒体膜电位降低。3.替莫唑胺引起胶质瘤细胞内ROS升高,通过GSH抑制ROS的升高能够抑制替莫唑胺引起的DNA双链断裂。替莫唑胺引起胶质瘤细胞线粒体超氧化物积累,通过Mn TBAP抑制线粒体超氧化物的积累可以抑制胶质瘤细胞内ROS升高,并抑制DNA双链断裂。4.替莫唑胺激活胶质瘤细胞自噬。通过3MA、bafilomycin A1或ATG5 si RNA抑制自噬能够增强替莫唑胺引起的AIF核转位、细胞内ROS升高,增强替莫唑胺的杀伤作用。5.替莫唑胺激活BNIP3介导的线粒体自噬。通过si RNA敲低BNIP3的表达能够增强替莫唑胺引起的AIF核转位、ROS升高,增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。6.通过si RNA敲低FOXO3a的表达,能够抑制BNIP3和LC3B的上调,从而抑制替莫唑胺引起的保护性线粒体自噬,增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。结论:1.替莫唑胺通过诱发氧化应激损伤线粒体,引起AIF释放和核转位、ROS升高,进而导致DNA双链断裂和胶质瘤细胞死亡。2.BNIP3介导的线粒体自噬通过清除受损的线粒体,抑制AIF的释放和ROS的升高,保护胶质瘤细胞免受替莫唑胺的杀伤。3.抑制FOXO3a调控的线粒体自噬,能够增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。
刘永强[9]（2021）在《梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼生长、抗氧化、免疫、脂肪酸代谢及相关基因表达的影响》文中研究指明本论文研究梯度脂质对吉富罗非鱼（Genetic improvement of farmed tilapia,GIFT,Oreochromis niloticus）幼鱼生长性能、抗氧化、免疫、脂肪酸代谢及相关基因表达的影响。分别用6种等氮不同脂质水平的配合饲料投喂40d龄吉富罗非鱼幼鱼:对照（基础）饲料（含脂质0.35%）,另添加鱼油配制含脂质3.35%、6.35%、9.35%、12.35%和15.35%的饲料。每组3个平行,每个养殖槽（容量为120L）共36尾。于试验开始和投喂90d后随机抽取鱼样品测定,主要结果如下:1.饲料中添加不同水平的脂质显着提高吉富罗非鱼幼鱼的生长性能。与对照组鱼（0.35%脂质）相比,脂质添加组鱼的特定生长率（SGR）、日增长指数（DGI）、增重率（WGR）、体长增长率（BLG）和蛋白质效率（PER）显着提高（P<0.05）,饲料系数（FCR）显着降低（P<0.05）,但对存活率（SR）没有显着影响（P>0.05）。根据二次多项式回归分析,当饲料脂质水平为10.52%时,SGR最高;当饲料脂质水平为10.58%时,DGI最高;当饲料脂质水平为10.67%时,WGR最高;当饲料脂质水平为11.56%时,BLG最高;当饲料脂质水平为10.55%时,PER最高;当饲料脂质水平为10.61%时,FCR最低。因此,当饲料脂质水平为10.52%-11.56%时,吉富罗非鱼幼鱼的生长性能较为理想。2.饲料中添加不同水平的脂质显着影响吉富罗非鱼幼鱼的形体指标,包括肥满度（CF）、肝体系数（HSI）和脏体系数（VSI）。根据二次多项式回归分析,当饲料脂质水平为10.54%时,CF最高;当饲料脂质水平为7.56%时,HSI最低;当饲料脂质水平为4.53%时,VSI最低。饲料中添加不同水平的脂质显着影响吉富罗非鱼幼鱼的全鱼体成分。与对照组鱼（0.35%脂质）相比,脂质添加组全鱼的粗脂肪含量显着升高（P<0.05）,全鱼的粗蛋白含量显着降低（P<0.05）,但对全鱼的水分和灰分含量无显着影响（P>0.05）。饲料中添加不同水平的脂质显着降低吉富罗非鱼幼鱼的脂肪酶（Lipase）和脂肪酸合成酶（FAS）活性。与对照组鱼（0.35%脂质）相比,脂质添加组鱼的肠中Lipase活性显着降低（P<0.05）,肝、肌肉和肠系膜脂肪组织中FAS活性显着降低（P<0.05）。在吉富罗非鱼幼鱼中,Lipase活性大小为:前肠>中肠>后肠;FAS活性大小为:肝>肠系膜脂肪组织>肌肉。3.饲料中添加不同水平的脂质显着提高吉富罗非鱼幼鱼的抗氧化性能、免疫功能以及炎症抑制能力。与对照组鱼（0.35%脂质）相比,脂质添加组鱼的肝和血清中超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）活性显着升高（P<0.05）,丙二醛（MDA）含量显着降低（P<0.05）,脾指数显着升高（P<0.05）,血清中溶菌酶（LZM）和碱性磷酸酶（ALP）活性、补体C3和免疫球蛋白M（IgM）含量显着升高（P<0.05）。与对照组鱼（0.35%脂质）相比,脂质添加组鱼的脾、头肾和肝中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和干扰素γ（INF-γ）基因的相对表达量显着降低（P<0.05）。4.饲料中添加不同水平的脂质显着影响吉富罗非鱼幼鱼的脂肪酸组成。与对照组鱼（0.35%脂质）相比,脂质添加组鱼的各组织/器官中n-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFAs）含量显着升高（P<0.05）,肝、肌肉、肾、肠系膜脂肪组织、血清和脑中饱和脂肪酸（SFAs）和单不饱和脂肪酸（MUFAs）含量显着降低（P<0.05）,肝、肌肉、肾、肠系膜脂肪组织、血清和脑中多不饱和脂肪酸（PUFAs）含量显着升高（P<0.05）。在试验组中,各组织/器官中n-6多不饱和脂肪酸（n-6PUFAs）含量随饲料脂质水平的增加而降低。在吉富罗非鱼幼鱼中,同一组织/器官PUFAs含量显着高于SFAs含量和MUFAs含量（P<0.05）。相对于鱼体其他组织/器官而言,肝和肌肉中脂肪酸组成更易受饲料脂肪酸组成的影响。5.饲料中添加不同水平的脂质显着影响吉富罗非鱼幼鱼的脂敏感基因的相对表达量。与对照组鱼（0.35%脂质）相比,脂质添加组鱼的血清中瘦素（LEP）浓度显着升高（P<0.05）,脂联素（ADPN）浓度显着降低（P<0.05）。各组织/器官中过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）基因、LEP基因以及脂联素受体1/2（AdipoRI/2）基因的相对表达量显着升高（P<0.05）,ADPN基因以及瘦素受体（LepR）基因的相对表达量显着降低（P<0.05）。在吉富罗非鱼幼鱼中,PPARα基因主要在肝、脑和心脏中表达,LEP基因主要在脑和肝中表达,LepR基因主要在脑、脾和心脏中表达,ADPN基因主要在肝和脑中表达,AdipoR1基因主要在脑、脾、心脏和肝中表达,AdipoR2基因主要在脑、肝和肌肉中表达。综上所述,饲料中添加不同水平的脂质可显着影响吉富罗非鱼幼鱼的生长性能、抗氧化、免疫、脂肪酸代谢以及相关基因的表达。当饲料脂质水平为10.52%-11.56%时,吉富罗非鱼幼鱼的生长性能较为理想。
步婷婷[10]（2021）在《低苯丙氨酸乳清蛋白水解物制备及其调控骨合成作用的研究》文中研究说明苯丙酮尿症（Phenylketonuria,PKU）是由于患者无法正常代谢苯丙氨酸所引发的氨基酸代谢障碍疾病。以氨基酸配方食品为主的低苯丙氨酸饮食疗法可以有效控制苯丙氨酸摄入量,但无法改善PKU患者中常见的骨代谢失衡和骨密度降低症状。乳清蛋白是婴幼儿配方产品中重要的原辅料,其中多种活性蛋白和活性肽被报道有益于骨骼健康。本研究以乳清蛋白为原料制备了具有促进骨合成、调节骨重建作用的低苯丙氨酸蛋白肽基料,并分离鉴定出具有促成骨活性的肽序列。主要研究内容和成果如下:（1）建立酶解吸附联用技术制备低苯丙氨酸乳清蛋白水解物（LPH）。筛选双酶组合方式（嗜热菌蛋白酶和Protease A2SD）释放了浓缩乳清蛋白（WPC）中94.13%的苯丙氨酸,制备乳清蛋白TA2H水解液（TA2H）;优化D101大孔吸附树脂动态吸附工艺,脱除了TA2H中98.38%的苯丙氨酸,制得苯丙氨酸含量为1.38 mg/g蛋白当量的LPH。（2）LPH富含小分子肽并且风味平和。LPH蛋白含量为60.41 g/100 g,支链氨基酸和必需氨基酸含量分别为18.49和29.81 g/100g;LPH中180～1500 Da肽段占比达96.52%,但小分子肽比例增加也使LPH的苦味有所升高;TA2H中具有油脂异味和酸腐味的挥发性风味化合物在LPH中含量显着下降,使LPH呈现较平和的风味特征。（3）TA2H和LPH可全面促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1的分化进程,并且呈剂量效应。100～1000μg/m L TA2H和LPH有效促进了细胞增殖;有效提高了细胞分化过程中核转录因子RUNX2蛋白的表达水平;有效促进了成骨分化标志物碱性磷酸酶（ALP）的活性以及I型胶原蛋白（COLI）和骨钙素（OCN）的分泌水平;提高了细胞矿化结节的沉积;并且有效上调了细胞表达骨保护素（OPG）/核因子κB受体活化因子配体（RANKL）水平。（4）p38/MAPK-Runx2是LPH促进成骨细胞分化的主要信号通路。LPH可刺激成骨细胞内p44/42/MAPK和Akt蛋白磷酸化被短期激活（1 h）,而p38蛋白磷酸化被持续激活（24 h）。利用通路抑制剂阻断p38通路后,LPH对RUNX2蛋白表达的激活作用和对ALP的促进作用均被显着抑制,表明p38/MAPKRUNX2通路的关键作用。（5）乳清蛋白水解物有效缓解去卵巢骨质疏松小鼠的骨流失和骨代谢失衡。雌性小鼠切除双侧卵巢后分别饲喂添加WPC、TA2H和LPH的饲料12周未显着影响小鼠体重和脏器重量。乳清蛋白及水解物有效提高了去卵巢小鼠的股骨远端骨密度,增强股骨骨干处最大载荷量,修复骨小梁结构缺损,缓解血清中骨合成指标ALP的异常升高,降低血清中骨吸收指标和炎症因子水平。（6）Val-Ile-Glu-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn-Thr（VIESPPEINT）和Ser-Lys-Val-LeuPro-Val-Pro-Gln-Lys（SKVLPVPQK）是LPH中具有较强促成骨分化活性的序列。利用高效液相色谱分离LPH获得16个组分,并筛选出组分F9增强成骨细胞ALP活性最强。通过液质联用鉴定出F9组分中的15条牛源（Bos taurus）多肽,依据峰面积丰度筛选其中7条多肽进行化学合成,利用成骨细胞评价出VIESPPEINT和SKVLPVPQK促进ALP活性和RUNX2蛋白表达能力最强。综上所述,本研究制备了一种具有促进骨合成、调控骨重建能力的低苯丙氨酸乳清蛋白肽基料,并分离鉴定出促成骨活性的肽序列,为特殊医学用途配方食品中新型功能性蛋白肽基料开发和应用提供了理论基础。
二、E-1胶配制说明书（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、E-1胶配制说明书（论文提纲范文）
（1）PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景及立题依据 |
| 一、转移性结直肠癌的治疗现状及研究进展 |
| 二、靶向PD-1肿瘤细胞免疫治疗的机制及发展现状 |
| 三、大肠癌发生与肿瘤免疫治疗的关系研究进展 |
| 四、本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第一章、小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其机制研究 |
| 第一部分、小鼠PD-1基因敲除T细胞的建立及其体外抑制肿瘤的作用 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 靶向PD1基因sgRNA的设计构建及鉴定 |
| 2. PCR扩增和T7E1酶切鉴定 |
| 3. PD-1基因敲除T细胞亚群比例检测 |
| 4. PD-1基因敲除T细胞体外抑制肿瘤细胞生长 |
| 5. PD-1基因敲除T细胞与CT-26细胞株共培养的体外抗肿瘤效应 |
| 6. PD-1基因敲除T细胞与CT-26细胞株共培养的体外细胞因子分泌 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及可能机制 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 结直肠癌小鼠模型中CD8~+细胞中PD-1表达显着升高 |
| 2. 小鼠结直肠癌移植瘤模型的建立 |
| 3. 小鼠CT-26结直肠癌移植瘤模型体内抗肿瘤效应 |
| 4. 小鼠CT-26结直肠癌模型体内抗肿瘤效应可能机制 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二章、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的体内安全性评价 |
| 第一部分、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的建立及其生物学特性 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 食蟹猴外周血T细胞的培养 |
| 2. 食蟹猴PD-1敲除T细胞载体的构建及敲除效率的检测 |
| 3. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞增殖的影响 |
| 4. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞亚群的影响 |
| 5. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞周期的影响 |
| 6. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞死亡殖的影响 |
| 7. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞细胞因子分泌的影响 |
| 8. 混合淋巴细胞反应 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的体内安全性评价 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 食蟹猴一般情况 |
| 2. 食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内持续时间的检测 |
| 3. 食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性的评价 |
| 4. PD-1基因敲除T细胞回输对食蟹猴各组织器官的影响 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 PDH/PD-L1信号通路及其相关抗肿痛免疫疗法在结直肠癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）α-亚麻酸植物甾醇酯基于AMPK调节线粒体功能及氧化应激改善非酒精性脂肪性肝病的作用和分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 PS-ALA通过线粒体及氧化应激保护机制对NAFLD的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 受试物 |
| 1.3 实验主要仪器与试剂 |
| 1.4 动物分组及干预 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 NAFLD模型的建立及PS-ALA对 NAFLD的保护作用 |
| 2.2 PS-ALA通过线粒体保护机制改善NAFLD |
| 2.3 PS-ALA通过减轻氧化应激改善NAFLD |
| 2.4 基于AMPK初步探讨PS-ALA保护线粒体和减轻氧化应激的分子机制 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 PS-ALA通过调控AMPK改善线粒体功能和氧化应激发挥NAFLD保护作用的分子机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PS-ALA对 OA诱导的HepG2 细胞脂肪变性的改善作用 |
| 2.2 PS-ALA对 OA诱导的HepG2 细胞AMPK的调控作用 |
| 2.3 PS-ALA通过调控AMPK信号分子改善OA诱导HepG2 细胞的线粒体功能 |
| 2.4 PS-ALA通过调控AMPK信号分子减轻OA诱导HepG2 细胞的氧化应激 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 非酒精性脂肪性肝病中线粒体损伤机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）氧化压力在丙戊酸引起肝毒性中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 丙戊酸的临床应用现状 |
| 1.2 丙戊酸与肝毒性 |
| 1.2.1 肝功能异常 |
| 1.2.2 特异质肝毒性 |
| 1.2.3 非酒精性脂肪肝 |
| 1.3 丙戊酸代谢与肝毒性 |
| 1.3.1 葡萄糖醛酸化 |
| 1.3.2 线粒体β氧化 |
| 1.3.3 细胞色素P450 氧化 |
| 1.4 氧化压力与肝毒性 |
| 1.4.1 氧化压力概述 |
| 1.4.2 氧化压力的来源 |
| 1.4.3 氧化压力引起肝毒性的机制 |
| 1.5 铁死亡与肝毒性 |
| 1.5.1 铁死亡概述 |
| 1.5.2 铁死亡的机制 |
| 1.5.3 铁死亡与非酒精性脂肪肝 |
| 1.6 本研究的内容及意义 |
| 第二章 在癫痫患者中抗氧化酶基因多态性对丙戊酸引起的肝毒性的研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 DNA样本 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 DNA提取 |
| 2.3.2 引物设计 |
| 2.3.3 PCR反应 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 癫痫患者的自然情况统计 |
| 2.4.2 PCR产物检测 |
| 2.4.3 抗氧化酶基因型分布频率的Hardy-Weinberg平衡 |
| 2.4.4 癫痫患者中抗氧化酶SNP分布频率 |
| 2.4.5 性别与癫痫患者中抗氧化酶SNP分布频率的关系 |
| 2.4.6 年龄与癫痫患者中抗氧化酶SNP分布频率的关系 |
| 2.4.7 抗氧化酶SNP对 VPA血药浓度的影响 |
| 2.4.8 VPA致肝毒性风险因素的回归分析 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 第三章 CYP2E1-ROS-CD36/DGAT2 轴在丙戊酸引起肝脂质化中的作用 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.2.4 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 MTT实验 |
| 3.3.3 Western blot |
| 3.3.4 实时定量PCR |
| 3.3.5 流式细胞术检测细胞内氧化压力 |
| 3.3.6 CYP2E1 酶活力检测 |
| 3.3.7 运用CRISPR/Cas9 技术敲除CYP2E1 |
| 3.3.8 生化指标检测 |
| 3.3.9 细胞的油红O染色 |
| 3.3.10 VPA引起肝脂质化的动物模型 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 VPA对肝脂质化的影响 |
| 3.4.2 ROS对 VPA诱导的肝脂质化的作用 |
| 3.4.3 CYP2E1对VPA诱导的肝脂质化的作用 |
| 3.4.4 VPA对脂代谢相关基因表达的影响 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 铁死亡在丙戊酸引起肝毒性中的作用 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 溶液配制 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Western blot |
| 4.3.2 实时定量PCR |
| 4.3.3 铁含量检测 |
| 4.3.4 生化指标检测 |
| 4.3.5 铁死亡与丙戊酸引起的肝毒性动物模型 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 VPA对小鼠肝脏的毒性作用 |
| 4.4.2 VPA诱发铁死亡 |
| 4.4.3 VPA对铁代谢的影响 |
| 4.4.4 铁代谢对VPA引起的肝毒性的影响 |
| 4.4.5 铁死亡对VPA引起的肝毒性的影响 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）大蒜素调控氧化应激及内质网应激改善膳食丙烯酰胺肝毒性机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 丙烯酰胺(Acrylamide)的研究进展 |
| 1.1.1 丙烯酰胺的基本性质及来源 |
| 1.1.2 丙烯酰胺日膳食暴露评估 |
| 1.1.3 丙烯酰胺的代谢与吸收 |
| 1.1.4 丙烯酰胺毒理学研究 |
| 1.2 大蒜素(Allicin)的研究进展 |
| 1.2.1 大蒜素的理化性质 |
| 1.2.2 大蒜素的主要生理功能 |
| 1.3 NLRP3炎性小体的研究进展 |
| 1.3.1 NLRP3炎性小体的结构 |
| 1.3.2 NLRP3炎性小体的活化机制研究 |
| 1.3.3 NLRP3炎性小体的分布情况 |
| 1.3.4 NLRP3炎性小体与疾病的相互关系 |
| 1.4 氧化应激相关通路研究 |
| 1.4.1 MAPK信号通路调控NLRP3 炎性小体 |
| 1.4.2 NF-κB信号通路调控NLRP3 炎性小体 |
| 1.5 内质网应激相关通路研究 |
| 1.5.1 内质网应激与未折叠蛋白反应 |
| 1.5.2 内质网应激调控NLRP3 炎性小体 |
| 1.6 论文研究目的、意义和内容 |
| 1.6.1 研究目的和意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第2章 丙烯酰胺对Kupffer和HepG2细胞NLRP3炎性小体激活的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 药物的配制及给药方法 |
| 2.3.3 Kupffer和 HepG2细胞活力的测定 |
| 2.3.4 SOD和GSH-Px酶活力的检测 |
| 2.3.5 ROS荧光强度的检测 |
| 2.3.6 RT-qPCR检测mRNA表达 |
| 2.3.7 Western Blot检测蛋白表达 |
| 2.3.8 ELISA检测细胞因子 |
| 2.3.9 数据处理与统计 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1AA对Kupffer和HepG2细胞活力的影响 |
| 2.4.2AA对Kupffer和HepG2细胞氧化应激反应的影响 |
| 2.4.3AA对Kupffer和HepG2细胞内质网应激反应的影响 |
| 2.4.4AA对Kupffer和HepG2细胞NLRP3炎性小体激活的影响 |
| 2.4.5AA对Kupffer和HepG2细胞MAPK信号通路的影响 |
| 2.4.6AA对Kupffer和HepG2细胞NF-κB信号通路的影响 |
| 2.4.7 ROS清除剂(NAC)对AA诱导的Kupffer和HepG2细胞MAPK信号通路及NLRP3 炎性小体激活的影响 |
| 2.4.8 内质网应激抑制剂(4-PBA)对AA诱导的Kupffer和HepG2细胞MAPK信号通路及NLRP3 炎性小体激活的影响 |
| 2.4.9 MAPK选择性抑制剂对AA诱导的Kupffer和HepG2细胞NLRP3炎性小体激活的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 大蒜素对丙烯酰胺诱导的Kupffer和HepG2细胞NLRP3炎性小体激活的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 大蒜素对丙烯酰胺诱导的SD大鼠肝脏损伤的保护作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 动物试验 |
| 4.3.2 生理生化指标检测 |
| 4.3.3 RT-qPCR检测mRNA表达 |
| 4.3.4 Western Blot检测蛋白表达 |
| 4.3.5 ELISA检测细胞因子 |
| 4.3.6 数据处理与统计 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Allicin对AA诱导的SD大鼠肝脏损伤的影响 |
| 4.4.2 Allicin对AA诱导的SD大鼠肝脏氧化应激反应的影响 |
| 4.4.3 Allicin对AA诱导的SD大鼠肝脏内质网应激反应的影响 |
| 4.4.4 Allicin对AA诱导的SD大鼠肝脏NLRP3炎性小体激活的影响 |
| 4.4.5 Allicin对AA诱导的SD大鼠肝脏MAPK信号通路的影响 |
| 4.4.6 Allicin对AA诱导的SD大鼠肝脏NF-κB信号通路的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 大蒜素对丙烯酰胺诱导的SD大鼠脾脏损伤的保护作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 动物试验设计 |
| 5.3.2 生理生化指标检测 |
| 5.3.3 RT-qPCR检测mRNA表达 |
| 5.3.4 Western Blot检测蛋白表达 |
| 5.3.5 ELISA检测细胞因子 |
| 5.3.6 数据处理与统计 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Allicin对AA诱导的SD大鼠脾脏表观状态的影响 |
| 5.4.2 Allicin对AA诱导的SD大鼠脾脏氧化应激反应的影响 |
| 5.4.3 Allicin对AA诱导的SD大鼠脾脏内质网应激反应的影响 |
| 5.4.4 Allicin对AA诱导的SD大鼠脾脏NLRP3炎性小体激活的影响 |
| 5.4.5 Allicin对AA诱导的SD大鼠脾脏MAPK信号通路的影响 |
| 5.4.6 Allicin对AA诱导的SD大鼠脾脏NF-κB信号通路的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6 章 结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝脏疾病 |
| 1.2 酒精性肝损伤 |
| 1.2.1 酒精消费的现状 |
| 1.2.2 长期饮酒的危害 |
| 1.2.3 酒精性肝病的临床诊断 |
| 1.2.4 酒精性肝病的流行病学特征 |
| 1.2.5 酒精性肝损伤的危险因素 |
| 1.2.6 酒精性肝损伤的发生机制 |
| 1.2.7 酒精性肝损伤的药物治疗 |
| 1.3 穿心莲内酯 |
| 1.3.1 穿心莲内酯的生物学活性 |
| 1.3.2 穿心莲内酯的临床应用研究 |
| 1.4 选题内容、目的及创新点 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 本论文的研究目标 |
| 1.4.3 本论文的特色及创新之处 |
| 第2章 穿心莲内酯的文献研究及临床应用现状分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 穿心莲内酯相关研究的文献计量分析 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.3 穿心莲内酯临床应用的病例分析 |
| 2.3.1 对象与方法 |
| 2.3.2 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 穿心莲内酯对酒精性肝损伤的保护作用及其机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 细胞学实验 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.3 动物实验 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 酒精性肝损伤的模型 |
| 3.4.2 酒精性肝损伤的判定指标 |
| 3.4.3 酒精性肝损伤的分子机制 |
| 3.4.4 酒精性肝损伤的保护药物 |
| 3.5 不足与展望 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 牛病毒性腹泻病概述 |
| 2 BVDV病原学特性 |
| 2.1 病毒培养及理化性质 |
| 2.2 病毒分型 |
| 3 BVDV分子生物学特性 |
| 3.1 病毒基因组 |
| 3.2 病毒的结构蛋白 |
| 3.3 病毒的非结构蛋白 |
| 3.4 病毒生物型NCP向CP转化 |
| 4 流行病学与临床表现 |
| 4.1 流行病学 |
| 4.2 流行特点 |
| 4.3 临床表现 |
| 4.4 BVDV感染对机体免疫系统的影响 |
| 5 BVDV检测技术 |
| 5.1 病原学检查 |
| 5.2 免疫学诊断技术 |
| 5.3 分子生物学检查技术 |
| 6 防控措施 |
| 6.1 预防与治疗 |
| 6.2 疫苗免疫 |
| 6.3 牛场BVD的净化 |
| 7 研究内容及意义 |
| 第二章 BVDV结构蛋白的基因克隆及生物信息学分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 细胞、质粒和病毒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液及培养基配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒的增殖及滴度测定 |
| 2.2 C、E~(rns)、E1和E2 基因扩增 |
| 2.3 目的基因克隆及序列测定 |
| 2.4 目的基因及蛋白的生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的增殖 |
| 3.2 病毒TCID_(50)测定 |
| 3.3 C、E~(rns)、E1和E2 基因全序列扩增 |
| 3.4 C、E~(rns)、E1和E2 生物学信息分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 BVDV N~(pro)、E~(rns)蛋白的真核表达 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 N~(pro)和E~(rns)基因扩增 |
| 2.2 真核表达载体的构建及双酶切鉴定 |
| 2.3 N~(pro)和E~(rns)蛋白真核表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 BVDV N~(pro)、E~(rns)基因PCR扩增 |
| 3.2 菌液PCR筛选 |
| 3.3 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.4 转染细胞目的基因检测 |
| 3.5 Western blot蛋白表达验证 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 BVDV三种核酸检测方法的建立、比较与应用 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计合成 |
| 2.2 临床样品处理 |
| 2.3 重组质粒标准品的构建 |
| 2.4 RT-PCR方法的建立及条件优化 |
| 2.5 qRT-PCR方法的建立及条件优化 |
| 2.6 RT-LAMP方法的建立及条件优化 |
| 2.7 BVDV三种核酸检测方法的比较 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2 qRT-PCR检测方法的建立 |
| 3.3 RT-LAMP检测方法的建立 |
| 3.4 BVDV三种核酸检测方法的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（7）迷迭香酸抑制丙烯酰胺诱导的氧化应激和内质网应激缓解BRL-3A细胞凋亡机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 丙烯酰胺的研究进展 |
| 1.1.1 食品中的丙烯酰胺 |
| 1.1.2 丙烯酰胺的日常暴露量 |
| 1.1.3 丙烯酰胺的毒性研究进展 |
| 1.2 迷迭香酸的研究进展 |
| 1.2.1 迷迭香酸的来源 |
| 1.2.2 迷迭香酸的生理功能 |
| 1.3 氧化应激、内质网应激和凋亡相关通路的研究 |
| 1.3.1 氧化应激 |
| 1.3.2 内质网应激 |
| 1.3.3 细胞凋亡 |
| 1.4 论文研究意义及研究内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.5 研究路线 |
| 第2章 迷迭香酸的抗氧化能力及其对丙烯酰胺诱导的BRL-3A细胞氧化损伤的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 药物溶液的配制 |
| 2.3.2 迷迭香酸对ABTS~+自由基清除活性的测定 |
| 2.3.3 RosA对DPPH自由基清除活性的测定 |
| 2.3.4 RosA对铁离子还原能力(FRAP)的测定 |
| 2.3.5 RosA对氧化自由基吸收能力(ORAC)的测定 |
| 2.3.6 BRL-3A细胞的培养 |
| 2.3.7 CCK-8 法检测细胞活力 |
| 2.3.8 化学荧光法(DCFH-DA探针)检测ROS水平 |
| 2.3.9 酶联免疫法检测SOD水平 |
| 2.3.10 酶联免疫法检测GSH水平 |
| 2.3.11 TBA法检测MDA水平 |
| 2.3.12 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 ABTS自由基清除活性测定结果 |
| 2.4.2 DPPH自由基清除活性测定结果 |
| 2.4.3 铁离子还原能力(FRAP)测定结果 |
| 2.4.4 氧化自由基吸收能力(ORAC)测定结果 |
| 2.4.5 AA和 RosA对 BRL-3A细胞活力的影响 |
| 2.4.6 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞中ROS活力的影响 |
| 2.4.7 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞中SOD和 GSH的影响 |
| 2.4.8 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞中MDA的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 RosA的抗氧化能力 |
| 2.5.2 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞氧化应激水平的影响 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 迷迭香酸对丙烯酰胺诱导的BRL-3A细胞CYP2E1和MAPK信号通路的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 药物溶液的配制 |
| 3.3.2 Western blot方法测定CYP2E1蛋白表达水平 |
| 3.3.3 分子动力学模拟分析迷迭香酸和丙烯酰胺的结合位点 |
| 3.3.4 Western blot方法测定MAPK通路关键蛋白表达水平 |
| 3.3.5 Western blot方法测定NAC对MAPK通路关键蛋白表达水平 |
| 3.3.6 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞中CYP2E1 蛋白表达的影响 |
| 3.4.2 RosA和 CYP2E1 蛋白结合作用机制分析 |
| 3.4.3 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞MAPK通路关键蛋白的影响 |
| 3.4.4 NAC对MAPK通路关键蛋白表达水平的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞CYP2E1 表达的影响 |
| 3.5.2 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞MAPK通路关键蛋白的影响 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 迷迭香酸对丙烯酰胺诱导的BRL-3A细胞内质网应激和细胞凋亡的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 药物溶液的配制 |
| 4.3.2 化学荧光法(Fluo4-AM探针)检测钙离子水平 |
| 4.3.3 Western blot测定内质网应激通路相关蛋白表达水平 |
| 4.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 4.3.5 Western blot测定凋亡关键蛋白表达水平 |
| 4.3.6 Western blot测定NAC和4-PBA对凋亡关键蛋白表达水平 |
| 4.3.7 数据分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞钙离子的影响 |
| 4.4.2 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞内质网应激通路蛋白的影响 |
| 4.4.3 NAC对内质网应激相关蛋白表达水平的影响 |
| 4.4.4 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞凋亡率的影响 |
| 4.4.5 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞凋亡关键蛋白的影响 |
| 4.4.6 NAC和4-PBA对AA诱导的BRL-3A细胞凋亡关键蛋白的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞内质网应激的影响 |
| 4.5.2 RosA对AA诱导的BRL-3A细胞凋亡的影响 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者介绍及攻读硕士学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（8）FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 胶质瘤的治疗概述 |
| 2.2 程序性细胞死亡 |
| 2.2.1 凋亡 |
| 2.2.2 自噬依赖性细胞死亡 |
| 2.2.3 程序性坏死 |
| 2.2.4 铁死亡 |
| 2.3 自噬 |
| 2.3.1 自噬的分类 |
| 2.3.2 自噬的机制 |
| 2.3.3 自噬的调控 |
| 2.3.4 自噬在胶质瘤及其治疗中的作用 |
| 2.3.5 替莫唑胺与自噬 |
| 2.4 线粒体的质量控制 |
| 2.4.1 线粒体的结构和功能 |
| 2.4.2 线粒体动力学 |
| 2.4.3 线粒体自噬 |
| 2.4.4 BNIP3与线粒体自噬 |
| 2.5 ROS与细胞抗氧化机制 |
| 2.5.1 ROS的产生和作用 |
| 2.5.2 ROS的调控 |
| 2.5.3 ROS与肿瘤 |
| 2.6 内质网应激和未折叠蛋白质反应 |
| 2.7 替莫唑胺的作用及耐药机制 |
| 2.7.1 替莫唑胺的作用机制 |
| 2.7.2 染色质溶解 |
| 2.7.3 MGMT |
| 2.8 替莫唑胺的其他相关耐药机制 |
| 2.8.1 ABC转运蛋白 |
| 2.8.2 NF-κB信号通路 |
| 2.8.3 JAK-STAT信号通路 |
| 2.9 总结 |
| 第3章 资料与方法 |
| 3.1 主要器材与试剂 |
| 3.1.1 主要实验器材 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.2 细胞系及细胞培养、裸鼠饲养 |
| 3.3 实验液体及配制方法 |
| 3.4 细胞复苏、传代及冻存 |
| 3.5 实验技术 |
| 3.5.1 MTT法检测细胞生存率 |
| 3.5.2 RNA干扰技术 |
| 3.5.3 乳酸脱氢酶释放法(LDH法)检测细胞的死亡率 |
| 3.5.4 中性单细胞凝胶电泳电泳检测DNA双链断裂 |
| 3.5.5 JC-1 探针检测细胞内线粒体膜电位的变化 |
| 3.5.6 Mito SOX检测线粒体内超氧化物的变化 |
| 3.5.7 DCFH-DA探针检测细胞内ROS的变化 |
| 3.5.8 构建荧光蛋白标记的LC3B的U87细胞系 |
| 3.5.9 线粒体荧光探针检测细胞内线粒体的形态和数量变化 |
| 3.5.10 裸鼠皮下移植胶质瘤模型 |
| 3.5.11 蛋白质印迹技术检测细胞胞浆、胞核、线粒体蛋白的变化 |
| 3.5.11.1 蛋白样品准备 |
| 3.5.11.2 蛋白质印迹 |
| 3.5.11.3 实验分组 |
| 3.5.12 免疫共沉淀法检测胶质瘤细胞及肿瘤组织中LC3BⅡ、BNIP与相关蛋白的相互作用 |
| 3.5.13 激光共聚焦扫描显微镜观察细胞内目标蛋白的表达和定位变化 |
| 3.5.14 裸鼠肿瘤组织内过氧化氢含量的测定 |
| 3.5.15 透射电镜观察线粒体自噬 |
| 3.5.16 统计学分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 替莫唑胺在体外抑制胶质瘤细胞增殖 |
| 4.2 替莫唑胺引起胶质瘤细胞DNA双链断裂和线粒体损伤 |
| 4.2.1 替莫唑胺引起胶质瘤细胞DNA双链断裂 |
| 4.2.2 替莫唑胺引起胶质瘤细胞AIF核转位 |
| 4.2.3 替莫唑胺引起胶质瘤细胞线粒体损伤 |
| 4.3 损伤的线粒体通过上调ROS增强替莫唑胺引起的DNA双链断裂 |
| 4.3.1 替莫唑胺通过升高胶质瘤细胞内ROS引发DNA双链断裂 |
| 4.3.2 替莫唑胺通过损伤线粒体引起细胞内ROS升高 |
| 4.4 自噬抑制替莫唑胺引起的氧化应激 |
| 4.4.1 替莫唑胺引起胶质瘤细胞自噬 |
| 4.4.2 自噬抑制替莫唑胺引起的胶质瘤细胞死亡 |
| 4.4.3 自噬抑制替莫唑胺引起的AIF核转位和ROS升高 |
| 4.5 替莫唑胺激活胶质瘤细胞线粒体自噬 |
| 4.6 BNIP3 介导替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
| 4.6.1 替莫唑胺上调BNIP3的表达,并促进BNIP3向线粒体转位 |
| 4.6.2 BNIP3介导替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
| 4.6.3 BNIP3介导保护性线粒体自噬 |
| 4.7 FOXO3a调控替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
| 4.7.1 替莫唑胺引起FOXO3a表达升高和核转位 |
| 4.7.2 FOXO3a调控BNIP3介导的线粒体自噬 |
| 4.8 动物实验 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼生长、抗氧化、免疫、脂肪酸代谢及相关基因表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脂质对鱼类的营养调控作用的研究进展 |
| 1.1.1 脂质的营养作用及其生物学功能 |
| 1.1.2 脂质的代谢途径 |
| 1.1.3 脂肪酸的生物学功能及其代谢途径 |
| 1.2 鱼类对饲料中脂质需求量的研究进展 |
| 1.2.1 鱼类饲料的最佳脂质水平的研究 |
| 1.2.2 鱼类对必需脂肪酸需求量的研究 |
| 1.3 鱼类脂质代谢及其关键酶的研究进展 |
| 1.3.1 饲料脂质对鱼类脂肪含量的影响 |
| 1.3.2 饲料脂质对鱼类脂肪酸组成的影响 |
| 1.3.3 饲料脂质对鱼类脂质代谢关键酶的影响 |
| 1.4 鱼类脂质代谢相关基因的研究进展 |
| 1.4.1 鱼类PPARα基因的研究进展 |
| 1.4.2 鱼类瘦素及其受体基因的研究进展 |
| 1.4.3 鱼类脂联素及其受体基因的研究进展 |
| 1.5 脂质对鱼类抗氧化性能影响的研究进展 |
| 1.6 脂质对鱼类非特异性免疫功能影响的研究进展 |
| 1.7 本研究的目的及其意义 |
| 1.8 本研究的技术路线 |
| 第二章 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼生长性能的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 饲料的主要原料 |
| 2.2.3 饲料配方 |
| 2.2.4 饲养和管理 |
| 2.2.5 样品的采集 |
| 2.2.6 样品的测定及计算方法 |
| 2.2.7 数据处理及分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼存活率的影响 |
| 2.3.2 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼生长性能的影响 |
| 2.3.3 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼蛋白质效率和饲料系数的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼脂肪含量及其代谢酶活性的影响. |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 饲料的主要原料 |
| 3.2.3 饲料配方 |
| 3.2.4 饲养和管理 |
| 3.2.5 样品的采集 |
| 3.2.6 样品的测定及计算方法 |
| 3.2.7 数据处理及分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼形体指标的影响 |
| 3.3.2 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼全鱼成分的影响 |
| 3.3.3 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼脂肪酶和脂肪酸合成酶活性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼抗氧化、免疫及相关基因的影响. |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 饲料的主要原料 |
| 4.2.3 饲料配方 |
| 4.2.4 饲养和管理 |
| 4.2.5 样品的采集 |
| 4.2.6 样品的测定方法 |
| 4.2.7 数据处理及分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼脾指数的影响 |
| 4.3.2 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼抗氧化性能的影响 |
| 4.3.3 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼非特异性免疫的影响 |
| 4.3.4 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼肿瘤坏死因子α基因表达的影响 |
| 4.3.5 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼白细胞介素1β基因表达的影响 |
| 4.3.6 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼干扰素γ基因表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼脂肪酸组成的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 研究对象 |
| 5.2.2 饲料的主要原料 |
| 5.2.3 饲料配方 |
| 5.2.4 饲养和管理 |
| 5.2.5 样品的采集 |
| 5.2.6 样品的测定方法 |
| 5.2.7 数据处理及分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼各组织器官中脂肪酸组成的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼脂肪酸代谢相关因子及相关基因的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 研究对象 |
| 6.2.2 饲料的主要原料 |
| 6.2.3 饲料配方 |
| 6.2.4 饲养和管理 |
| 6.2.5 样品的采集 |
| 6.2.6 样品的测定方法 |
| 6.2.7 数据处理及分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼血清中瘦素浓度的影响 |
| 6.3.2 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼血清中脂联素浓度的影响 |
| 6.3.3 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼PPARα基因表达的影响 |
| 6.3.4 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼瘦素基因表达的影响 |
| 6.3.5 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼瘦素受体基因表达的影响 |
| 6.3.6 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼脂联素基因表达的影响 |
| 6.3.7 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼脂联素受体1 基因表达的影响 |
| 6.3.8 梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼脂联素受体2 基因表达的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 展望 |
| 7.3 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文的情况 |
（10）低苯丙氨酸乳清蛋白水解物制备及其调控骨合成作用的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 苯丙酮尿症与骨骼健康风险 |
| 1.1.1 苯丙酮尿症概述 |
| 1.1.2 治疗苯丙酮尿症的营养方法 |
| 1.1.3 苯丙酮尿症与骨密度降低 |
| 1.2 低苯丙氨酸特殊膳食食品概述 |
| 1.2.1 氨基酸代谢障碍配方产品 |
| 1.2.2 低苯丙氨酸蛋白水解物的制备 |
| 1.2.2.1 蛋白酶解技术释放苯丙氨酸 |
| 1.2.2.2 苯丙氨酸脱除技术 |
| 1.2.3 乳源糖巨肽 |
| 1.3 骨重建与成骨细胞生长 |
| 1.3.1 骨质疏松症概述 |
| 1.3.2 骨重建作用 |
| 1.3.3 成骨细胞分化作用 |
| 1.3.4 成骨细胞分化过程中分子信号机制 |
| 1.4 乳蛋白及其水解物促骨合成作用研究进展 |
| 1.4.1 碱性蛋白 |
| 1.4.2 乳铁蛋白 |
| 1.4.3 乳蛋白水解物及乳源活性肽 |
| 1.5 本文研究的背景、意义和主要内容 |
| 1.5.1 研究背景及意义 |
| 1.5.2 研究主要内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第二章 双酶法制备乳清蛋白水解液及苯丙氨酸的初步脱除 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料试剂与设备 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 双酶酶解乳清蛋白制备水解液 |
| 2.3.2 水解度测定 |
| 2.3.3 蛋白含量测定 |
| 2.3.4 总氨基酸和游离氨基酸含量测定 |
| 2.3.4.1 样品前处理方法 |
| 2.3.4.2 氨基酸衍生化方法 |
| 2.3.4.3 HPLC测定条件 |
| 2.3.5 苯丙氨酸释放率和吸附率 |
| 2.3.6 活性炭和大孔吸附树脂的筛选 |
| 2.3.6.1 活性炭静态吸附单体苯丙氨酸 |
| 2.3.6.2 大孔吸附树脂静态吸附单体苯丙氨酸 |
| 2.3.6.3 活性炭动态吸附单体苯丙氨酸 |
| 2.3.6.4 大孔吸附树脂动态吸附单体苯丙氨酸 |
| 2.3.7 不同吸附剂对水解液中苯丙氨酸吸附能力的测定的筛选 |
| 2.3.7.1 活性炭静态吸附水解液中苯丙氨酸 |
| 2.3.7.2 大孔吸附树脂动态吸附水解液中苯丙氨酸 |
| 2.3.8 统计学方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 双酶酶解乳清蛋白产物水解度变化 |
| 2.4.2 双酶酶解乳清蛋白产物苯丙氨酸释放率 |
| 2.4.3 活性炭和大孔吸附树脂静态吸附单体苯丙氨酸的能力 |
| 2.4.4 活性炭和大孔吸附树脂动态吸附单体苯丙氨酸的能力 |
| 2.4.5 活性炭脱除乳清蛋白水解液中苯丙氨酸的效果 |
| 2.4.6 大孔吸附树脂脱除乳清蛋白水解液中苯丙氨酸的效果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 低苯丙氨酸乳清蛋白水解物制备及其性质分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料试剂与设备 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 双酶酶解制备乳清蛋白TA2水解物(TA2H) |
| 3.3.2 D101大孔吸附树脂动态吸附最大装载量测定 |
| 3.3.3 大孔吸附树脂动态吸附水解液中苯丙氨酸 |
| 3.3.4 氨基酸含量测定 |
| 3.3.5 蛋白含量测定 |
| 3.3.6 干物质含量测定 |
| 3.3.7 低苯丙氨酸乳清蛋白水解物制备 |
| 3.3.8 分子量分布测定 |
| 3.3.9 电子舌测定 |
| 3.3.10 挥发性风味测定 |
| 3.3.11 统计学方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 D101大孔吸附树脂动态吸附最大装载量 |
| 3.4.2 大孔吸附树脂动态吸附制备低苯丙氨酸水解物(LPH) |
| 3.4.3 理化指标分析分析 |
| 3.4.4 氨基酸组成分析 |
| 3.4.5 分子量分布测定 |
| 3.4.6 电子舌评价味感特征 |
| 3.4.7 挥发性风味测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 低苯丙氨酸水解物对成骨细胞分化作用的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料试剂与设备 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.2.3 实验主要溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 双酶酶解制备乳清蛋白水解物(TA2H) |
| 4.3.2 大孔吸附树脂制备低苯丙氨酸乳清蛋白水解物(LPH) |
| 4.3.3 细胞实验样品制备 |
| 4.3.4 MC3T3-E1细胞的复苏、传代及冻存方法 |
| 4.3.5 MC3T3-E1前成骨细胞增殖实验 |
| 4.3.6 MC3T3-E1成骨细胞分化实验 |
| 4.3.7 碱性磷酸酶(ALP)活性测定 |
| 4.3.8 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 4.3.9 蛋白质免疫印迹实验(WB) |
| 4.3.10 MC3T3-E1成骨细胞矿化实验 |
| 4.3.11LPH对 MC3T3-E1成骨细胞内信号通路的激活作用 |
| 4.3.12 信号通路抑制剂对LPH促进MC3T3-E1成骨细胞分化作用的影响 |
| 4.3.13 统计学方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 TA2H和LPH对成骨细胞增殖作用的影响 |
| 4.4.2 TA2H和LPH对成骨细胞内分化标志物表达的影响 |
| 4.4.3 TA2H和LPH对成骨细胞内RUNX2表达的影响 |
| 4.4.4 TA2H和LPH对成骨细胞内OPG/RANKL表达的影响 |
| 4.4.5 TA2H和LPH对成骨细胞矿化作用的影响 |
| 4.4.6 LPH对成骨细胞内MAPK和 Akt信号通路的激活作用 |
| 4.4.7 LPH影响成骨细胞分化关键信号通路的确定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 低苯丙氨酸水解物对骨质疏松症小鼠的改善作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料试剂与设备 |
| 5.2.1 实验动物、材料与试剂 |
| 5.2.2 实验设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 双酶酶解制备乳清蛋白水解物(TA2H) |
| 5.3.2 大孔吸附树脂制备低苯丙氨酸水解物(LPH) |
| 5.3.3 动物饲料 |
| 5.3.4 动物实验设计 |
| 5.3.4.1 动物实验伦理审查 |
| 5.3.4.2 小鼠去卵巢手术 |
| 5.3.4.3 骨质疏松小鼠建模及分组 |
| 5.3.4.4 小鼠血清和器官收集 |
| 5.3.5 股骨微观结构扫描 |
| 5.3.6 股骨灰分含量测定 |
| 5.3.7 股骨生物力学测定 |
| 5.3.8 血清生化指标测定 |
| 5.3.9 股骨组织病理学观察 |
| 5.3.10 统计学方法 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 骨质疏松小鼠体重和子宫重量变化 |
| 5.4.2 骨质疏松小鼠股骨灰分含量变化 |
| 5.4.3 骨质疏松小鼠骨生物力学变化 |
| 5.4.4 骨质疏松小鼠股骨骨密度及微观结构变化 |
| 5.4.5 骨质疏松小鼠股骨切片HE染色观察 |
| 5.4.6 骨质疏松小鼠血钙和血磷含量变化 |
| 5.4.7 骨质疏松小鼠血清骨合成指标检测 |
| 5.4.8 骨质疏松小鼠血清骨吸收指标检测 |
| 5.4.9 骨质疏松小鼠血清炎症因子水平检测 |
| 5.4.10 骨质疏松小鼠血清OPG/RANKL水平检测 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 低苯丙氨酸水解物中促成骨分化活性肽的分离纯化与鉴定 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料试剂与设备 |
| 6.2.1 实验材料与试剂 |
| 6.2.2 实验设备 |
| 6.2.3 实验主要溶液的配制 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 大孔吸附树脂制备低苯丙氨酸乳清蛋白水解物(LPH) |
| 6.3.2 反相高效液相色谱分离LPH |
| 6.3.3 不同LPH组分对成骨细胞分化作用的影响 |
| 6.3.4 液质联用技术鉴定LPH组分中多肽氨基酸序列 |
| 6.3.5 Fmoc固相合成法合成LPH多肽 |
| 6.3.6 LPH多肽对MC3T3-E1细胞毒性测定 |
| 6.3.7 LPH多肽对MC3T3-E1细胞分化作用的影响 |
| 6.3.8 统计学方法 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 反相高效液相色谱分离LPH |
| 6.4.2 LPH组分对MC3T3-E1成骨细胞ALP活性的影响 |
| 6.4.3 液质联用技术鉴定LPH-F9组分中多肽序列 |
| 6.4.4 LPH多肽对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响 |
| 6.4.5 LPH多肽对MC3T3-E1成骨细胞ALP活性的影响 |
| 6.4.6 LPH多肽对MC3T3-E1成骨细胞RUNX2 蛋白表达的影响 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 全文结论 |
| 7.2 论文创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
四、E-1胶配制说明书（论文参考文献）
- [1]PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究[D]. 高嫦娥. 昆明医科大学, 2021(01)
- [2]α-亚麻酸植物甾醇酯基于AMPK调节线粒体功能及氧化应激改善非酒精性脂肪性肝病的作用和分子机制[D]. 李晓钰. 山西医科大学, 2021(01)
- [3]氧化压力在丙戊酸引起肝毒性中的作用研究[D]. 马琳沣. 吉林大学, 2021(01)
- [4]大蒜素调控氧化应激及内质网应激改善膳食丙烯酰胺肝毒性机制研究[D]. 南博. 吉林大学, 2021(01)
- [5]穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究[D]. 宋远. 吉林大学, 2021(01)
- [6]牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立[D]. 拜小强. 西北民族大学, 2021(08)
- [7]迷迭香酸抑制丙烯酰胺诱导的氧化应激和内质网应激缓解BRL-3A细胞凋亡机制研究[D]. 王明华. 吉林大学, 2021(01)
- [8]FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究[D]. 何川. 吉林大学, 2021(01)
- [9]梯度脂质对吉富罗非鱼幼鱼生长、抗氧化、免疫、脂肪酸代谢及相关基因表达的影响[D]. 刘永强. 广西大学, 2021(01)
- [10]低苯丙氨酸乳清蛋白水解物制备及其调控骨合成作用的研究[D]. 步婷婷. 浙江大学, 2021(01)