一、丹参对体外培养鸡胚胎股骨生长的影响（论文文献综述）
王继雪[1]（2021）在《化裁血府逐瘀汤治疗下肢动脉硬化闭塞症的作用机制》文中研究说明目的:通过数据挖掘分析导师治疗下肢动脉硬化闭塞症的中药处方特点,提炼出治疗本病的基础核心主方化裁血府逐瘀汤;观察化裁血府逐瘀汤在临床治疗FontaineⅠ-Ⅲ期下肢动脉硬化闭塞症的疗效及安全性;并通过细胞实验初步探讨可能的作用机制,为临床的推广提供理论基础。方法:第一部分:纳入本课题组2010年9月～2020年9月,黑龙江中医药大学附属第一医院周围血管病科住院部及门诊收治的下肢动脉硬化闭塞症患者,共筛选出388例医案作为研究对象,建立数据库。利用中医传承计算平台（V3.0）对患者的基本信息、证型、处方药物等进行频数统计、关联规则分析及聚类分析等,对数据挖掘结果进行深入分析。第二部分:纳入2020年9月～2020年12月黑龙江中医药大学附属第一医院周围血管病科收治的下肢动脉硬化闭塞症患者共45例。治疗组23例,治疗方案为化裁血府逐瘀汤联合贝前列素钠片;对照组22例,口服贝前列素钠片。化裁血府逐瘀汤药物组成为桃仁20g、红花20g、赤芍15g、川芎15g、牛膝15g、当归20g、熟地黄20g、党参20g、黄芪20g、炙甘草15g,由黑龙江中医药大学附属第一医院统一煎制,早晚各口服200 mL,4周为1个疗程。比较治疗组与对照组治疗前后中医症状评分及临床疗效、踝肱指数、下肢红外热像、TG、TC、HDL-C、LDL-C、hs-CRP、FIB,采用SPSS 23.0软件进行统计学描述与分析。以P<0.05,差异具有统计学意义。第三部分:体外培养大鼠血管平滑肌细胞,使用ox-LDL诱导血管平滑肌细胞损伤模型,空白组、模型组、化裁血府逐瘀汤含药血清低、中、高剂量组及阳性药物含药血清（阿托伐他汀）组。观察细胞形态,BrdU染色,划痕实验及Transwell迁移实验分别检测血管平滑肌细胞增殖与迁移的能力,蛋白免疫印迹法检测α-SMA、CRBP1、PCNA、MMP-9、TGF-β1、TβRI、p-Smad3及t-Smad3蛋白表达水平,免疫荧光法检测α-SMA、CRBP1表达水平,激光共聚焦显微镜观察p-Smad3定位及表达水平,RT-PCR检测血管平滑肌细胞内MMP-9 mRNA、PCNA mRNA的表达水平。结果:第一部分:1.患者的各年龄段发病人数及性别频次统计:40～49岁下肢动脉硬化闭塞症的发病人数29人,50～59岁63人,60～69岁133人,70～79岁123人,≥80岁40人。388例下肢动脉硬化闭塞症患者中男性244人,女性144人。2.中医证型频次统计:按照频次升降顺序排列,血脉瘀阻证139例、寒凝血瘀证67例、气滞血瘀证47例、血虚血瘀证29例、阴虚瘀热证27例、寒湿阻络证22例、痰瘀阻络证16例、气血两虚证13例、湿热瘀滞证13例、阳虚血瘀证11例、阴虚血瘀证4例。3.用药频次统计:总计使用184种药物,所有药物的使用频次之和为6310次,药物频次≥30次的药物共53味;其中,频次≥100的药物为17种,使按照升降次序进行排名分别是当归、牛膝、熟地黄、赤芍、桃仁、黄芪、地龙、红花、炙甘草、川芎、生地黄、柴胡、炒白术、党参、茯苓、桂枝、积壳。4.药物四气、五味及归经统计:四气频次统计分析:温性药物使用2277次、寒性1678次、平性1607次、热性151次;药物五味频次统计:甘味药物3072次、苦味2721次、辛味1830次、酸味800次、咸味494次;药物归经频次统计:肝经3748次、脾经2435次、心经2323次、肾经1812次、肺经1709次。5.用药模式统计:将支持度个数设置在130,置信度0.9,结果显示出常用的中药组合,共计198条。常用2味药物组合,如“当归,牛膝”等;常用3味药组:如“当归,牛膝,熟地黄”等;常用4味药组合:如“当归,牛膝,桃仁,红花”等;常用5味药组合:如“当归,牛膝,熟地黄,桃仁,红花”等。6.规则分析统计:将支持度个数设置在130,置信度为0.9,进行药物规则分析。当“->”左侧药物时,右侧药物在388例处方中所出现的概率为99%以上,通过分析共得到134条规则。7.聚类分析结果:将聚类个数设置为5,提取核心中药组合共5条。核心组合1的频次统计104次;核心组合2的频次统计89次;核心组合3的频次统计77次;核心组合4的频次统计61次;核心组合5的频次统计57次。第二部分:1.所纳入的下肢动脉硬化闭塞症患者两组治疗前基线比较,差异无统计学意义,具有可比性（P>0.05）。2.主要结局指标:组内比较下肢动脉硬化闭塞症患者中医症状评分,治疗后优于治疗前（P<0.05）;组间结果表明,治疗组改善程度优于对照组（P<0.05）。3.次要结局指标:组内比较踝肱指数及下肢红外热像温度,治疗后优于治疗前（P<0.05）;组间比较的结果表明,治疗组优于对照组（P<0.05）。组内比较,治疗后实验室指标TG、TC、LDL-C、hs-CRP、FIB与疗前相比各项指标下降,HDL-C升高,治疗后明显优于治疗前（P<0.05）;组间比较,治疗组各项指标改善情况均优于对照组（P<0.05）。4.两组临床疗效评定:治疗组显效22例、有效1例,对照组临床治愈1例、显效6例、有效14例、病情恶化1例,两组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。第三部分:1.细胞形态学观察:空白组血管平滑肌细胞形态正常,呈典型“峰-谷”状结构。通过ox-LDL处理后,细胞数量减少,形态不规则,伪足回缩明显。随着化裁血府逐瘀汤含药血清浓度增加,血管平滑肌细胞出现峰谷状结构。2.细胞增殖实验检测结果显示:与空白组比较,模型组血管平滑肌细胞增殖效率显着增强;与模型组比较,化裁血府逐瘀汤含药血清呈浓度依赖性抑制增殖效率（P<0.05）。3.平滑肌细胞迁移实验结果表明:与空白组相比,模型组血管平滑肌细胞迁移能力逐渐增强;与模型组比较,随着化裁血府逐瘀汤含药血清浓度的增加,血管平滑肌细胞的迁移能力逐渐减弱（P<0.05）。4.蛋白免疫印迹法检测各组细胞中α-SMA、CRBP1、PCNA、MMP-9及TGF-β1/Smad3通路相关蛋白的表达水平。与空白组比较,模型组α-SMA表达水平显着降低,CRBP1、PCNA、MMP-9、TGF-β1、TβRI、p-Smad3的蛋白表达水平显着提高（P<0.05）;与模型组比较,化裁血府逐瘀汤含药血清能浓度依赖性提高α-SMA表达水平,抑制CRBP1、PCNA、MMP-9、TGF-β1、TβRI、p-Smad3 表达（P<0.05）;各组间t-Smad3水平未见统计学差异（P>0.05）。5.免疫荧光染色检测结果:与空白组比较,模型组显着降低α-SMA的平均免疫荧光强度,显着提高CRBP1的平均免疫荧光强度（P<0.05）;与模型组比较,化裁血府逐瘀汤含药血清能浓度依赖性增强α-SMA的平均免疫荧光强度及减弱CRBP1平均免疫荧光强度（P<0.05）。6.通过激光共聚焦定位观察发现:与空白组比较,模型组p-Smad3细胞核/细胞质的比值显着增高;与模型组比较,随着化裁血府逐瘀汤含药血清的浓度增加,p-Smad3细胞核/细胞质比值逐渐降低,逆转了核转位（P<0.05）。7.通过RT-PCR检测PCNA mRNA和MMP-9 mRNA的表达:与空白组比较,模型组PCNA mRNA和MMP-9 mRNA表达水平显着升高（P<0.05）;与模型组比较,化裁血府逐瘀汤含药血清呈浓度依赖性的抑制PCNA mRNA和MMP-9 mRNA的表达水平（P<0.05）。结论:1.运用中医传承计算平台,挖掘出导师治疗下肢动脉硬化闭塞症虚实夹杂的血脉病机,提出活血化瘀、疏补并重的治疗原则,提炼出治疗本病的基础核心主方化裁血府逐瘀汤。2.化裁血府逐瘀汤治疗下肢动脉硬化闭塞症4周后,评估患者中医症状评分、踝肱指数、红外热像,TG、TC、HDL-C等各结局指标均有改善。治疗中未见明显临床不良反应。3.化裁血府逐瘀汤含药血清通过调控TGF-β1/Smad3信号通路及相关蛋白的表达,抑制血管平滑肌细胞表型转化、增殖及迁移能力,从而达到治疗下肢动脉硬化闭塞症的作用。
黄杨[2]（2021）在《关节钙化软骨层通透性观测以及T型钙离子通道介导其发育的机制研究》文中指出研究背景骨关节炎（osteoarthritis,OA）作为一种退行性关节疾病在临床上十分常见,常导致患者关节疼痛、活动受限甚至肢体残疾。OA发病机制复杂,但是作为一种累及整个滑膜关节的炎性疾病已是共识,而炎症的起始及循环扩大的过程尚不清楚。近年研究表明,OA的病因有可能来自软骨下骨,始发于软骨下骨的轻微炎症,在没有干预的情况下继续引发了软骨的炎症,然后不断的形成了炎症的正反馈循环,最终导致OA的各种病理和临床表现。如果能够在其炎症早期阻断这种循环,即可能够大大延缓OA的进程。生理状态下,关节软骨和软骨下骨之间缺乏交流,处于截然不同的两种微环境中。关节软骨内无血供,乏氧;软骨下骨血供丰富,有氧。钙化软骨层（calcified cartilage zone,CCZ）是位于关节软骨与软骨下骨之间的一层致密的界层结构,与毗邻组织连接处形成标志型的线性结构,即软骨侧的潮线（tide mark,TM）和骨侧的粘合线（cement line,CL）。钙化软骨层拥有的特殊形貌结构、组成成分赋予了钙化层独一无二的力学特性,使得关节在运动过程中,来着软骨的巨大力学冲击在钙化层得以衰减,还能够将来自软骨的剪切力变为压应力往软骨下骨传递。除此之外,钙化层还具有重要的屏障作用,这种屏障作用的缺失将开启了骨—软骨之间非正常的对话机制,其结果是引发了OA。然而,我们对于这一领域知之甚少,既往研究结果充满争议。因此,我们首先运用了各种技术手段以及模型来探索钙化层的屏障功能。但是要彻底明白钙化层的各种功能,还需要从钙化层的发生、发育的着手,从而过渡到理解病理状态下其重塑的机制。在钙化层形成过程中,我们认为软骨组织也经历了一个类似的软骨内成骨的过程,但是这一过程和完整的软骨内成骨又有一定的区别。无论如何,在软骨—骨（钙化层）转换过程中,软骨细胞肥大化、凋亡与转分化是软骨内骨化进程中的重要一环。大量证据表明,电压依赖性钙通道（voltage-dependent calcium channel,VDCC）广泛表达在骨软骨发育的各个阶段,并且这种时空特异性的分布对于骨软骨发育具有决定性作用。据此,本课题首先设计了一系列新的实验方案及技术手段,用于探查钙化层的通透性,旨在揭开钙化层的通透性在软骨发育,以及发生OA时的变化特点。然后以电压依赖型钙离子通道为切入点,进一步探究钙化层发育、重塑的分子机制。实验方法第一部分:原位观测活体小鼠关节成熟/不成熟钙化层的通透性1.1-8月龄小鼠钙化层组织学观察24只Balb/c雌性小鼠（1-8月龄,3只/月龄）,二氧化碳处死后对膝关节样本常规组织学处理,然后进行苏木精-伊红（HE）染色、番红O/固绿染色,显微镜拍照观察。Image J软件测算小鼠软骨厚度（软骨表面至潮线的距离）,钙化层的厚度（潮线至粘合线的距离）2.小鼠固定装置设计制造采用L型不锈钢板,在合适的位置安装两个机械臂。一个固定小鼠大腿,另一个固定自制的穿孔塑料培养皿。小鼠膝关节股骨髁暴露后穿过培养皿小孔,周围用胶水封闭。3.活体小鼠钙化层通透性观察实验84只Balb/c雌性小鼠分为未成熟钙化层组（1月龄,42只）和成熟钙化层组（6月龄,42只）,用罗丹明B溶液和四甲基罗丹明异硫氰酸葡聚糖溶液（TRITC-葡聚糖）作为示踪剂进行通透性测试。然后将动物分为4个亚组:成熟CCZ+罗丹明B、成熟CCZ+TRITC-葡聚糖、未成熟CCZ+罗丹明B、未成熟CCZ+TRITC-葡聚糖。扩散时间为1min、15min、30min、1h和2h。直接处死小鼠取下膝关节股骨远端样本（0min）作为空白对照,而股骨远端浸泡在罗丹明B或TRITC-葡聚糖中72h作为阳性对照。4.硬组织不脱钙荧光观测技术以及图像处理收集小鼠膝关节样本以后依次进行如下处理:冻干脱水、塑料包埋、切割打磨、共聚焦显微镜扫描、DAPI和荧光素钠复染、共聚焦显微镜二次扫描、两次扫描图像拟合。最后进行荧光值定位定量分析以及统计检验。第二部分:基于Mirco-CT和菲克定律观测人膝骨关节炎软骨钙化层的通透性1.OA样本收集和预处理根据纳入、排除标准,入选重度膝骨关节炎患者3例,待全膝关节置换手术完成后,立即用冰盒转移样本,根据关节软骨表面情况,钻取直径8mm的骨软骨柱（0-1级或者4级）。软骨下骨为基底面置入放入离心管,UV树脂胶进行密封、紫外线照射凝固,测试防水性。2.Mirco-CT扫描和图像分析于离心管内滴加0.5ml碘海醇,立刻放入Mirco-CT内进行高精度扫描。第一次扫描完成后,放入4℃冰箱内。以第一次扫描时间点为0h,然后在6h、24h、48h、72h再次进行扫描。扫描获得各时间点图像数据用3D slicer以及AMIRA软件进行3D重建,测算样本的CT值。3.扩散系数计算与数学建模根据菲克定律建立数学模型,解方程组求得解析解,不断将每个时间点距离——CT值带入方程,与实验数据相拟合,求出关节软骨及钙化层的扩散系数k。第三部分:在小鼠钙化层发育过程中软骨细胞T-VDCC表达特异性1.1-8月龄小鼠膝关节组织样本切片1-8月龄小鼠膝关节取材、常规石蜡包埋切片。2.小鼠膝关节标本免疫组化染色观察对不同发育阶段的小鼠膝关节样本切片行各亚型T-VDCC和软骨细胞肥大化、骨化相关标志蛋白免疫组化染色,拍照观察,计算阳性细胞率和细胞数量。第四部分:抑制Cav3.3后软骨细胞肥大化/成骨分化的分子机制1.小鼠原代关节软骨细胞分离、提取、体外培养培养,ATDC5软骨细胞系培养选用出生7-10天的Balb/c小鼠,二氧化碳处死后分离、提取、体外培养关节软骨中的软骨细胞。P2代小鼠软骨细胞用于实验处理和相关检测。ATDC5细胞系采用同样培养条件,进行体外培养扩增。2.小鼠原代软骨细胞、ATDC5软骨细胞系T-VDCC表达鉴定两种细胞进行T-VDCC三种亚型（Cav3.1,Cav3.2,Cav3.3）免疫荧光染色和western blot检测,明确三种亚型在这两种细胞中的表达情况。3.不同浓度Mibefradil抑制T-VDCC后对ATDC5软骨的影响在正常贴壁培养的ATDC5软骨细胞培养基中加入浓度为1μm、5μm、10μm、15μm的Mibefradil,48h后采用流式细胞仪行凋亡检测,阿尔新蓝、茜素红、碱性磷酸酶细胞染色、免疫荧光染色和western blot检测,查看不同浓度的Mibefradil抑制T-VDCC后,ATDC5细胞的凋亡情况,Cav3.1,Cav3.2,Cav3.3表达情况,以及软骨表型和肥大化表型蛋白标志物表达情况。4.si RNA抑制ATDC5细胞Cav3.3表达后细胞受到的影响根据三种亚型在ATDC5细胞中的表达情况,采用Cav3.3-si RNA转染正常贴壁培养的ATDC5细胞,抑制Cav3.3的表达,48h后行RT-PCR检测,确认Cav3.3是否被敲低;转染72小时以后进行流式细胞仪凋亡检测,阿尔新蓝、茜素红、碱性磷酸酶细胞染色、免疫荧光染色和western blot检测,查看Cav3.3表达降低以后,ATDC5细胞凋亡情况以及软骨表型和肥大化表型,成骨标志蛋白标志物表达情况。实验结果:第一部分:原位观测活体小鼠关节成熟/不成熟钙化层的通透性1.6月龄小鼠膝关节钙化软骨层发育成熟1-5月龄小鼠膝关节发育欠成熟,潮线不明显,各结构（软骨层、钙化软骨层和软骨下骨）层次边界不清。6月龄小鼠膝关节基本发育成熟,各个组织层次分界明显,潮线、粘合线清晰可见。7月、8月龄小鼠发育进一步成熟,软骨下骨结构更加致密。2.成熟的钙化层对罗丹明B有阻滞作用,未成熟钙化层则没有罗丹明B（476 Da）在成熟钙化层组的软骨层扩散达到饱和浓度的时间是30 min;在未成熟钙化层组的软骨层扩散达到饱和浓度的时间是1h。在体扩散2h后,发育成熟钙化层组,潮线以下没有罗丹明B的荧光,而未成熟钙化层组则能检测到。3.成熟钙化层对TRITC-葡聚糖具有阻滞作用,未成熟钙化层则没有对于成熟钙化层组和未成熟钙化层组,TRITC-葡聚糖（20k Da）在软骨层达到饱和浓度的时间分别未30 min和1h。扩散2h后,未成熟钙化层组软骨下骨有低浓度TRITC-葡聚糖分布,提示TRITC-葡聚糖通过未成熟钙化层组织向软骨下骨渗透,而成熟钙化层组则难以检测到TRITC-葡聚糖。第二部分:基于Mirco-CT和菲克定律观测人体骨关节炎钙化层的通透性1.4级OA钙化层与正常钙化层相比结构改变,通透性增加Micro-CT扫描提示,4级OA钙化层于0-1级相比,孔隙率增加,厚度也增加。在72h渗透以后,4级OA软骨下骨出现CT值增强,提示造影剂到达软骨下骨,但是正常组织软骨下骨增强不明显。2.OA进程中钙化层扩散系数改变通过数据和数学模型推算,0-1级OA钙化层扩散系数为0.03±0.01μm2/s,而4级OA钙化层扩散系数为0.12±0.04μm2/s。意味着发生4级OA时,软骨和骨之间的物质交换更容易。第三部分:在小鼠钙化层发育过程中软骨细胞T-VDCC表达特异性1.T-VDCC在小鼠钙化层成熟过程中的表达逐步下降随着小鼠膝关节发育,深层软骨组织（钙化层形成区域）逐渐钙化,软骨细胞Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3的表达都逐渐下降,与之伴随的是COL 10和成骨标志蛋白osteocalcin在该区域的持续高表达。而表中层软骨细胞中Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3持续表达,不随月龄增加而改变;COL 10、osteocalcin、MMP 13只有1月2月龄有阳性表达,之后随着月龄增长,不再表达。第四部分:抑制Cav3.3后软骨细胞肥大化/成骨分化的分子机制1.原代小鼠关节软骨细胞和ATDC5细胞中主要表达Cav3.3亚型原代原代软骨细胞和ATDC5细胞Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3免疫荧光染色显示,两种细胞Cav3.3都出现很强的荧光,而Cav3.1、Cav3.2荧光则几乎不可见。三种离子通道western blot提示,Cav3.3条带清晰可见,而Cav3.1、Cav3.2几乎没有条带。2.Mibefradil抑制ATDC5细胞中Cav3.3的表达培养基中加入1μm、5μm、10μm、15μm的Mibefradil以后,PCR结果提示随着浓度增加,Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3表达都下降,Cav3.3趋势最明显。western blot提示同样的结果,但是Cav3.1、Cav3.2同样的没有条带,Cav3.3表达其中在10μm浓度时最为显着,同免疫荧光结果一致。3.Mibefradil促进ATDC5细胞凋亡,软骨表型丢失并出现肥大化、成骨倾向培养基中加入1μm、5μm、10μm、15μm梯度浓度的Mibefradil以后,随着抑制剂浓度增加,流式细胞仪检测提示ATDC5细胞早期凋亡比例增加,阿尔新蓝染色变浅,而茜素红和ALP成骨标志染色则上升。western blot提示随着抑制剂浓度升高,COL 2、SOX 9、ACAN表达下降,COL 10、MMP 13、RUNX 2表达升高,其中5μm、10μm最为显着。培养基中加入10μm Mibefradil以后,免疫荧光染色提示COL 2、SOX 9表达下降,而COL 10、MMP 13、RUNX2表达上升。提示VDCC被抑制以后,ATDC5软骨表型丢失,出现成骨倾向。4.si RNA转染ATDC5细胞以后Cav3.3表达下调,软骨细胞表型改变,出现肥大化以及成骨分化倾向。构建Cav3.3-si RNA进行成功转染后,PRC,western bolt,免疫荧光染色提示ATDC5细胞中的Cav3.3表达出现下调。转染后,流失细胞仪检测示早期凋亡比例增加,阿尔新蓝、茜素红、碱性磷酸酶染色提示软骨表型丢失,表现成骨分化倾向。免疫荧光染色和western blot提示,COL 2、SOX 9表达下降,COL 10、MMP 13、RUNX2表达升高。5.抑制Cav3.3后软骨细胞表现成骨分化倾向依赖osteocalcin/NFAT途径ATDC5细胞Cav3.3表达下调后,免疫荧光和western blot提示其COL 1、非磷酸化NFATc2表达显着升高,osteocalcin,磷酸化NFATc2表达稍微升高,提示这种成骨倾向是Calcineurin/NFAT依赖途径。结论:1.小鼠出生后6月龄关节钙化层发育成熟,成熟的钙化层具有屏障功能。2.重度OA钙化软骨层重塑过程中,孔隙率增加和扩散系数增高,易化了关节软骨和软骨下骨之间的物质交换。3.小鼠钙化层在逐渐钙化成熟过程中,该区域软骨细胞T型电压依赖型钙离子通道表达逐渐下降,而肥大化、骨化表型蛋白表达上升。4.Cav3.3能促进软骨表型维持,抑制其功能和表达以后,ATDC5细胞出现Calcineurin/NFAT信号通路依赖的肥大化和成骨分化倾向。
刘青武[3]（2021）在《回阳生肌汤和鸡血藤对慢性皮肤溃疡愈合过程中MSCs趋化和迁移功能的调节作用研究》文中研究表明背景:慢性皮肤溃疡是糖尿病、放化疗、周围血管病等常见的并发症,是外科常见病及多发病,迁延难愈,愈后常复发。尤其是长期不愈合,呈现疮面清冷,脓液稀薄,疮周紫黯不温的症状,在中医属于阴证疮疡的疮面,治疗难度最大。近年来,以间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）为主的细胞治疗在慢性创面修复中取得较大进展,但植入MSCs修复溃疡的治疗方法,存在细胞来源不稳定、操作复杂、不良反应及费用昂贵等不足,临床使用和推广困难。慢性皮肤溃疡属于中医“疮疡”的范畴,其中慢性皮肤溃疡阴证具有“肾精虚衰”的特点。北京中医医院皮外科奠基人赵炳南教授及其传人王玉章、吕培文教授以益肾填精、活血通络的回阳生肌汤治疗慢性皮肤溃疡阴证安全有效。鸡血藤作为回阳生肌汤活血通络的主要成分,其促进骨髓造血功能的作用受到广泛报道,但鸡血藤用于创面修复的研究较少。干细胞具有中医“肾精”的属性,因此提出回阳生肌汤通过益肾填精、活血通络促进内源性骨髓MSCs的增殖,提升其趋化和迁移能力,达到化生气血、生肌长肉,而促进慢性皮肤溃疡创面愈合的假说。研究将通过体内和体外实验加以验证,探索回阳生肌汤及其主要成分鸡血藤治疗慢性皮肤溃疡阴证的作用和靶点。目的:研究回阳生肌汤及其主要成分鸡血藤促进慢性皮肤溃疡愈合过程中,对MSCs增殖、趋化和迁移功能的调节作用及其机制,为临床中医血管外科防治慢性皮肤溃疡阴证提供实验基础和理论依据。方法:1.回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析:BALB/C小鼠灌胃给药,制备含药血清,采用高效液相色谱串联质谱技术（Ultra-performance liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）对回阳生肌汤和鸡血藤水提物的入血成分进行分析;2.体内实验:（1）db/db糖尿病小鼠伤口模型:采用db/db糖尿病小鼠背部正中部位全厚层皮肤打孔的方法制备糖尿病伤口模型,并使用回阳生肌汤干预;采用数码相机拍照记录创面大小,分析创面愈合率;采用苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）染色观察创面组织学形态;提取小鼠全骨髓细胞,采用显微镜下计数方法观察骨髓细胞数量;流式细胞术检测骨髓中干细胞标志物CD29、CD44、干细胞表面抗原（Stem cell antigen 1,Sca-1）、CD117阳性细胞比例;免疫荧光染色检测创面中MSCs标志物CD29、CD271阳性细胞数量;炎症因子芯片检测创面中白介素3（Interleukin 3,IL-3）、IL-6、IL-13等炎症因子表达;（2）骨髓抑制大鼠伤口模型:采用尾静脉注射（8mg/kg）的多柔比星联合背部正中部位全厚层皮肤打孔的方法,制备骨髓抑制大鼠伤口模型,并使用回阳生肌汤和鸡血藤水提物进行干预;采用数码相机拍照记录创面大小,分析创面愈合率;称量胸腺及脾脏重量,计算胸腺指数和脾指数;采用血常规检测观察外周血白细胞数量;酶联免疫吸附法（ELISA）检测了大鼠血清中基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1,SDF-1）和粒细胞集落刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor,G-CSF）的浓度;HE及Masson染色并观察创面组织学形态和胶原含量;免疫荧光染色检测创面中CD34、CD133阳性细胞数量;流式细胞术检测骨髓及外周血中CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例;采用骨髓细胞贴壁培养法提取和纯化各组药物干预后大鼠的BMSCs;EdU染色检测BMSCs的增殖能力;划痕和Transwell试验检测BMSCs的迁移和趋化能力;Western Blot法检测SDF-1和趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4,CXCR4）蛋白的相对表达量。3.体外实验:采用全骨髓细胞贴壁培养法纯化大鼠BMSCs;流式细胞术、成脂和成骨分化鉴定BMSCs;使用H2O2刺激BMSCs制作氧化应激BMSCs模型,并使用回阳生肌汤提取物和鸡血藤水提物干预;采用细胞增殖毒性检测试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测BMSCs的增殖活力;划痕试验检测BMSCs的迁移能力;Transwell趋化试验检测BMSCs的趋化能力;Western Blot法检测BMSCs中SDF-1和CXCR4蛋白表达水平。结果:1.回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析:（1）对回阳生肌汤的入血成分进行分析,共得到19个化合物,包括黄酮类,萜类,皂苷类及糖类,含量较高者分别为刺芒柄花苷、汉黄芩素、马钱素、（6αR,11αR）-10-羟基-3,9-二甲氧基紫檀烷、16-氧乙酰茯苓酸甲酯、莫诺苷、核黄素、β-谷甾醇、奥刀拉亭-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷,主要来自鸡血藤、牛膝、苍术、山茱萸、黄芪、茯苓;（2）对鸡血藤水提物的入血成分分析,共得到8个化合物,均为黄酮类化合物,含量由高到低分别为芒柄花黄素、阿夫罗摩辛、异甘草素、大豆素、3,7-二羟基-6-甲氧基二氢黄酮醇、密花豆素、樱黄素、卡亚宁。2.体内实验（1）db/db糖尿病小鼠伤口模型:整体药效观察显示,与模型组比较,回阳生肌汤组小鼠创面愈合率升高;在创面中,与模型组相比,创面肉芽组织新生增多,MSCs 标志物 CD29、CD271 阳性细胞数量增多,IL-3、IL-6、IL-15、Fas 配体（Fas ligand,Fas L）表达升高,IL-13、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）、细胞间黏附分子-1（Intercellular Cell Adhesion Molecule-1,ICAM-1）、嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）、趋化因子LIX/CXCL5表达降低;在骨髓中,与模型组比较,回阳生肌汤组小鼠骨髓细胞数量增加,骨髓中MSCs标志物CD29、CD44、Sca-1阳性细胞比例升高。（2）骨髓抑制大鼠伤口模型:整体药效观察显示,与模型组比较,回阳生肌汤组和鸡血藤水提物可提高模型大鼠的创面愈合率,升高胸腺指数和脾指数;在创面中,与模型组比较,可见回阳生肌汤组和鸡血藤水提物组大鼠中创面炎性细胞数量减少,胶原合成增加,干细胞标志物CD34、CD133阳性细胞数量增多;在骨髓中,CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例增加;在外周血中,与模型组比较,回阳生肌汤和鸡血藤水提物组血清中SDF-1和G-CSF的浓度升高,白细胞数量增加,CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例增多;分离提取药物干预后的原代大鼠BMSCs,与模型组比较,可见回阳生肌汤和鸡血藤水提物组BMSCs增殖细胞数量增加,迁移能力和趋化能力增强,SDF-1和CXCR4蛋白表达增多。3.体外实验:大鼠BMSCs细胞呈梭形,呈旋涡状、席纹状排列,折光性良好;第三代细胞MSCs标志物CD29、CD44阳性细胞比例分别99.9%和97.8%,造血干细胞表面标志物CD45表达率为0.47%。氧化应激状态下的原代大鼠BMSCs的增殖活力降低,趋化和迁移能力下降;与模型组比较,回阳生肌汤和鸡血藤水提物组BMSCs增殖活力升高,迁移和趋化能力增强,SDF-1和CXCR4蛋白表达升高。结论:1.回阳生肌汤和鸡血藤入血成分主要为黄酮类化合物,提示黄酮类化合物在回阳生肌汤和鸡血藤的药效中发挥了重要作用;2.回阳生肌汤干预db/db糖尿病小鼠伤口模型,能够加速创面愈合,并促进小鼠骨髓BMSCs的增殖,增加创面干细胞的数量,调控创面的炎症反应,促进肉芽组织新生;3.回阳生肌汤和鸡血藤水提物干预骨髓抑制大鼠伤口模型,能够促进大鼠血清SDF-1和G-CSF的分泌,且激活模型大鼠BMSCs SDF-1/CXCR4信号轴,促进骨髓干细胞的增殖、迁移和趋化能力,并动员干细胞进入外周血中,增加创面干细胞的数量,促进胶原合成,加速创面的修复;4.回阳生肌汤和鸡血藤水提物在体外作用于大鼠BMSCs,能够激活SDF-1/CXCR4信号轴,保护氧化损伤的BMSCs的活性,提升氧化损伤状态下BMSCs的迁移和趋化能力。
张志宏,邢娜,彭东辉,王秋红,匡海学[4]（2021）在《中药抗骨质疏松作用及机制的研究进展》文中认为目的:了解中药抗骨质疏松症（OP）作用及其机制的研究进展,为开发新型抗OP药物提供理论参考。方法:以"骨质疏松""中药复方""有效成分""骨细胞""作用机制""Osteoporosis""Compound Chinese medicine""Active ingredients""Bone cell""Mechanism of action"等为关键词,在中国知网、万方数据、维普网、PubMed、ScienceDirect等数据库中组合检索于1980年3月-2020年8月期间发表的有关中药抗OP的相关文献,并在查阅《中国药典》、相关法规和参考书的基础上,对中药（单味中药、中药复方、中药有效成分）抗OP作用及其机制的研究进展进行归纳总结。结果与结论:本文涉及的抗OP中药包括29种单味中药和7种中药复方,其中起药效作用的成分包括中药提取物（醇提物、水提物）、黄酮类、多糖类、皂苷类、挥发油等。中药治疗OP效果明显,能够有效改善患者的骨代谢、增加其骨密度,同时改善临床症状。其主要是通过促进成骨细胞增殖分化、抑制破骨细胞形成、调节信号通路3个方面的作用机制发挥抗OP功效。
艾亮[5]（2020）在《仙灵骨葆胶囊通过miR-100-5p/JMJD3/RUNX2促进成骨细胞分化的研究》文中认为目的:1.在临床样本中,明确骨组织中JMJD3的表达与骨质疏松以及成骨关键因子RUNX2表达的相关性。2.在细胞研究中,明确仙灵骨葆是否通过激活JMJD3/RUNX2促进成骨细胞的分化。3.进一步深入探讨仙灵骨葆调控JMJD3/RUNX2途径的分子机制。方法:1.临床研究（1）遵循严格的纳入标准和排除标准,选取50-70岁因髋关节骨性关节炎拟行全髋关节置换术的绝经后女性患者20例,其中骨质疏松组10例,骨量正常组10例。（2）分别提取骨组织样本RNA和蛋白,q RT-PCR检测骨组织中JMJD3和RUNX2的m RNA表达,WB检测骨组织中JMJD3、H3K27me3和RUNX2的蛋白表达。（3）统计分析骨组织中JMJD3表达水平与研究对象临床特征和RUNX2的表达水平的相关性。2.细胞研究（1）一定浓度的仙灵骨葆处理MC3T3-E1细胞14d,CCK-8检测细胞增值率,Elisa和ALP染色检测成骨标志物ALP的表达和活性,WB检测JMJD3和RUNX2表达水平的变化。（2）设计合成三条针对JMJD3的si RNA序列,转染（NC组,si-JMJD3-1组,si-JMJD3-2组,si-JMJD3-3组）48h后提取细胞RNA,q RT-PCR检测JMJD3的相对水平。（3）根据q RT-PCR结果挑选干扰效率最好的一条si RNA转染仙灵骨葆处理的MC3T3-E1细胞（Mock组,XLGB组,OM组,XLGB+si-NC组,XLGB+si-JMJD3组）,ELISA检测细胞中ALP水平的表达,q RT-PCR和WB分别检测细胞中RUNX2的m RNA和蛋白相对表达水平。3.机制研究（1）利用生物信息学预测mi R-100-5p与JMJD3的靶向结合作用。（2）通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-100-5p与JMJD3的靶向调控作用。（3）合成mi R-100-5p的拟似物转染仙灵骨葆处理的MC3T3-E1,检测成骨标志物ALP的表达以及JMJD3的表达改变。成果:1.临床研究（1）JMJD3在骨质疏松骨组织中的表达水平显着低于骨量正常的骨组织。通过q RT-PCR检测分析发现,骨质疏松组骨组织样本中JMJD3的m RNA表达水平显着低于对照组（P<0.05）,RUNX2的m RNA表达水平同样显着低于对照组骨组织样本中的水平（P<0.01）。通过Western Blot检测分析发现,骨质疏松组骨组织样本中JMJD3的蛋白表达水平显着低于对照组（P<0.05）,RUNX2的蛋白表达水平显着低于对照组骨组织样本中的水平（P<0.05）,而H3K27me3的表达水平显着高于对照组样本（P<0.05）。（2）JMJD3在骨组织中的表达水平与RUNX2表达水平正相关。JMJD3和RUNX2在骨组织中的m RNA表达水平显着正相关（Pearson r=0.8227,R2=0.0.6768,P<0.0001）。（3）JMJD3在骨组织中的表达水平与BMD正相关。JMJD3的m RNA相对表达水平与BMD水平显着正相关（Pearson r=0.7102,R2=0.5044,P<0.001）,RUNX2的m RNA相对表达水平与BMD水平显着正相关（Pearson r=0.7383,R2=0.5451,P<0.001）。2.细胞研究（1）仙灵骨葆在0.125mg/m L-1.0mg/m L浓度下对细胞没有毒性0.125 mg/m L,0.25 mg/m L,0.5 mg/m L,1.0 mg/m L仙灵骨葆胶囊处理从第1天到5天均能促进MC3T3-E1细胞的增殖,特别在浓度为1.0mg/m L时,促进效果最明显（P<0.001）。表明仙灵骨葆在0.125mg/m L-1.0mg/m L浓度下对细胞没有毒性,不会抑制MC3T3-E1细胞的增殖。（2）仙灵骨葆胶囊促进MC3T3-E1分化为成骨细胞。0.125mg/m L仙灵骨葆胶囊（XLGB）处理,能显着诱导成骨标志蛋白ALP的产生。仙灵骨葆胶囊（XLGB）浓度达到0.5mg/m L以后继续增加处理浓度到1mg/m L时增长不再显着增加。且在0.125mg/m L仙灵骨葆处理下对ALP的表达水平已经达到了成骨诱导液（OM）作用下ALP的表达水平。碱性磷酸酶染色结果显示细胞中ALP染色信号强度在仙灵骨葆（XLGB）浓度达到0.25mg/m L时,与对组处理组相比,ALP染色信号平均光密度值出现显着增加（P<0.05）。随着仙灵骨葆（XLGB）浓度的增加,ALP染色信号强度持续增加。（3）仙灵骨葆胶囊促进JMJD3/RUNX2通路激活。通过q RT-PCR和WB检测发现,仙灵骨葆处理组细胞对比对照组MC3T3-E1细胞JMJD3的m RNA表达水平显着增加（P<0.05）,RUNX2的m RNA表达水平显着增加（P<0.001）,JMJD3的蛋白表达水平显着增加（P<0.001）,RUNX2的蛋白表达水平显着增加（P<0.001）。（4）抑制JMJD3/RUNX2通路可以缓解仙灵骨葆胶囊对成骨细胞分化的促进作用。仙灵骨葆处理组（XLGB）和成骨诱导液处理组（OM）的细胞中ALP的表达水平比空白对照组有显着升高（P<0.001）,XLGB处理组和XLGB+si-NC处理组细胞中ALP的表达水平无显着差异,而XLGB+si-JMJD3处理组细胞中ALP的表达水平比XLGB组以及XLGB+si-NC组均有显着下调（P<0.01）。仙灵骨葆处理组（XLGB）和成骨诱导液处理组（OM）的细胞中RUNX2的m RNA表达水平和蛋白表达水平均比空白对照组细胞有显着升高（P<0.05）,XLGB处理组和XLGB+si-NC处理组细胞中RUNX2的m RNA表达水平和蛋白表达水平均无显着差异,而XLGB+si-JMJD3处理组细胞中RUNX2的m RNA表达水平和蛋白表达水平均比XLGB组以及XLGB+si-NC组有显着下调（P<0.05）。3.机制研究（1）仙灵骨葆胶囊抑制MC3T3-E1细胞中mi R-100-5p的表达。Target Scan预测发现,mi R-100-5p能与JMJD3的3’UTR区域结合。仙灵骨葆处理组（XLGB）MC3T3-E1细胞中mi R-100-5p的相对表达水平显着低于空白对照组（Mock）,降低到了大概五分之一（P<0.0001）。而仙灵骨葆处理组（XLGB）对比成骨诱导液处理组（OM）MC3T3-E1细胞中mi R-100-5p的表达水平要高（P<0.0001）。（2）荧光素酶报告基因系统检测mi R-100-5p与JMJD3的结合。与联合转染mi R-100-5p拟似物阴性序列与带野生型JMJD3m RNA 3’UTR（JMJD3-WT）的荧光素酶报告质粒相对比,联合转染mi R-100-5p拟似物与带JMJD3m RNA 3’UTR的荧光素酶报告质粒组检测到的荧光素酶活性显着降低（P<0.001）。而联合转染mi R-100-5p拟似物阴性序列与带突变型JMJD3m RNA3’UTR（JMJD3-mut）的荧光素酶报告质粒细胞中对比联合转染mi R-100-5p拟似物与带突变型JMJD3m RNA 3’UTR（JMJD3-mut）的荧光素酶报告质粒细胞,检测到的荧光素酶活性无显着差异。（3）转染mi R-100-5p拟似物可缓解仙灵骨葆胶囊对JMJD3表达的促进作用。仙灵骨葆组（XLGB）比空白对照组（Mock）细胞中JMJD3的相对水平有显着增加（P<0.01）。成骨诱导液组（OM）对比仙灵骨葆组（XLGB）细胞中JMJD3的相对表达水平无显着差异。仙灵骨葆组联合mi RNA阴性对照组（XLGB+mimic-NC）对比比仙灵骨葆组（XLGB）细胞中JMJD3的相对表达水平无显着差异。而XLGB处理基础上转染mi R-100-5p拟似物（XLGB+mi R-100-5p）的MC3T3-E1细胞中JMJD3的表达水平比转染mi RNA阴性对照拟似物的MC3T3-E1细胞（XLGB+mimic-NC组）有显着降低（P<0.001）。（4）转染mi R-100-5p拟似物可缓解仙灵骨葆胶囊对成骨细胞分化的促进作用。仙灵骨葆胶囊处理组（XLGB）比空白对照组（Mock）细胞中ALP的表达水平有显着增加（P<0.01）;成骨诱导液组（OM）对比仙灵骨葆组（XLGB）细胞中ALP的表达水平无显着差异;仙灵骨葆组联合mi RNA阴性对照组（XLGB+mimic-NC）对比比仙灵骨葆组（XLGB）细胞中ALP的表达水平无显着差异;XLGB处理基础上转染mi R-100-5p拟似物（XLGB+mi R-100-5p）的MC3T3-E1细胞中ALP的表达水平比转染mi RNA阴性对照拟似物的MC3T3-E1细胞（XLGB+mimic-NC组）有显着降低（P<0.01）。结论:（1）临床研究表明,骨质疏松患者骨组织中JMJD3的表达显着低于骨质正常人群,且JMJD3的表达水平与成骨分化关键因子RUNX2和BMD成正相关。说明JMJD3可能通过RUNX2调节了骨形成参与了骨质疏松的发生发展。（2）在体外细胞研究中,本研究首先明确了仙灵骨葆对成骨细胞分化的促进作用以及对JMJD3/RUNX2通路的激活作用,并且以成骨诱导培养基促进效果进行了对比,0.125mg/m L的仙灵骨葆即可达到成骨诱导培养基对成骨细胞分化的促进作用。同时,我们利用基因干扰技术在仙灵骨葆处理的前成骨细胞MC3T3-E1中转染JMJD3的有效si RNA序列,发现JMJD3-si RNA可以显着抑制仙灵骨葆对MC3T3-E1细胞成骨分化的促进作用。说明仙灵骨葆胶囊可能通过激活JMJD3/RUNX2途径促进成骨细胞分化。（3）机制研究中,本研究利用生物信息学软件预测发现,在骨质疏松患者外周血中高表达的mi R-100-5p与JMJD3m RNA的3’UTR具有靶向结合位点。通过细胞实验表明仙灵骨葆胶囊和成骨诱导液处理均可以显着抑制mi R-100-5p在MC3T3-E1中的表达。通过双荧光素酶报告基因系统发现mi R-100-5p过表达能抑制JMJD3的表达,当突变掉JMJD3 m RNA 3’UTR上与mi R-100-5p结合的位点后,mi R-100-5p不再抑制JMJD3表达。同时转染mi R-100-5p拟似物能抑制仙灵骨葆胶囊对MC3T3-E1成骨分化的促进作用。综上所述,仙灵骨葆胶囊可通过抑制mi R-100-5p的表达促进JMJD3/RUNX2通路的激活促进骨形成从而发挥治疗骨质疏松症的作用。
陈德胜,张学森,张晨,宋国瑞,刘子歌,郭凤英,李燕[6]（2020）在《MMP-9和VEGF在膝关节骨性关节炎软骨中的表达及意义》文中研究说明目的探讨MMP-9、VEGF在膝关节骨性关节炎软骨中的表达及意义。方法选取2018年10月—2020年1月宁夏医科大学总医院膝关节骨关节炎患者行人工全膝关节置换术35例,作为观察组;膝关节外伤患者行关节镜手术治疗13例,作为对照组。观察组取术中关节成形截除的股骨髁软骨,对照组取因损伤脱落需要清理的股骨髁软骨。采用苏木素-伊红染色、番红O-固绿特殊染色在光镜下观察软骨病理改变及免疫组化检测MMP-9、VEGF表达的变化。结果苏木素-伊红染色结果,观察组软骨表面不光整,有缺损,软骨细胞形态大小不等,潮线不完整;对照组软骨表面光整,软骨层排列均匀,潮线较连续。番红O-固绿染色结果显示,观察组软骨胶原显色较弱,软骨细胞排列不均匀,软骨细胞大小不等,成团状,潮线不连续;对照组软骨胶原显色较强,软骨细胞大小较均匀,排列较规整,潮线连续。免疫组化结果显示:免疫组化染色阳性细胞主要在软骨细胞胞浆和基质周围,在退变软骨组织中观察组的MMP-9阳性表达量为0.74±0.08,高于对照组（0.33±0.07）（P<0.01）;观察组的VEGF阳性表达量为0.59±0.03,高于对照组（0.39±0.05）（P<0.05）。结论膝关节骨性关节炎软骨中MMP-9、VEGF阳性表达明显增高,表明其与软骨退行性病变有关。
刘婉莹[7]（2020）在《芎归方协同BMSCs-exosomes调控缺血性脑卒中血管新生的实验研究》文中认为研究背景:中风是一种复杂且威胁生命的疾病,是全球死亡和残疾的主要原因之一。中风的恢复需要一系列神经干细胞和神经血管单元之间精密互动配合,因此在症状出现后尽快恢复缺血区血供成为缺血性中风治疗的首选,但现有治疗手段的效果都不理想,其中药物治疗是脑中风临床治疗的重要途径之一。中医学认为缺血性中风即为中风病的范涛,因经气升降失司、气血运行失常,致气血逆乱而发病,其病因病机虽然复杂,但无非气血二字;而由“气中之血药”川芎及“血中之气药”当归两味药组成的芎归方则为治疗缺血性脑血管病常用方药。本团队前期用芎归方开发的上市中成药舒脑欣滴丸进行了相关研究,表明舒脑欣滴丸有促进缺血性脑损伤大鼠血管新生、神经元再生和脑组织重建的作用。另外,现代医学研究发现干细胞具有治疗卒中的临床潜力,但也存在诸多风险;有研究表明在干细胞发挥主要治疗作用的旁分泌效应中,外泌体（exsomes）占主导地位,并且能避免干细胞治疗的诸多风险,但疗效仍有不足。此外相关研究发现,PI3K/Akt/mTOR信号通路对于促进细胞周期、细胞增殖、血管生成有着至关重要的作用。研究目的:探讨芎归方是否能对微环境进行调控,以提高骨髓间充质干细胞来源外泌体（BMSCs-exosomes）对缺血性脑卒中恢复期血管新生的作用;分析芎归方协同BMSCs-exosomes是否通过mTOR/p70S6K通路协同调控缺血性脑卒中恢复期血管新生。研究方法:1.原代大鼠BMSCs培养及鉴定。分离大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,用含1%双抗和10%胎牛血清的完全培养基培养,运用细胞流式术进行鉴定。2.BMSCs-exosomes的分离鉴定。以超速离心机100,000×g离心12小时的方法去除血清中的exosomes,配制含10%无exosomes血清的培基对BMSCs进行培养,取其上清液进行离心、超速离心以分离获得BMSCs-exosomes,并重悬于1×PBS中,-80°保存。并运用Westernblot检测法和透射电镜观察形态鉴定拍照。3.运用线栓法制作SD大鼠短暂性大脑中动脉闭塞缺血（tMCAO）模型。将实验动物随机分为六组,造模成功后的大鼠分为模型组（tMCAO组）、芎归方组（tMCAO+SNX组）、外泌体组（tMCAO+exos组）、协同组（tMCAO+SNX+exos组）、抑制剂组（tMCAO+SNX+exos+RAPA组）和假手术组（Sham组）,其中芎归方组给予舒脑欣滴丸配成液（溶于生理盐水,每只大鼠按45mg/kg/d灌胃,tMCAO后24h给药并持续七天）,外泌体组予以BMSCs-Exosomes400μg/kg尾静脉注射（tMCAO后24h、3d、5d、7d给药）,协同组按上述方法给予舒脑欣滴丸和BMSCs-exosomes共同干预,抑制剂组则是在给予舒脑欣滴丸和BMSCs-exosomes之前先给予RAPA（每只大鼠按照2mg/kg/d腹腔注射,tMCAO后24h给药并持续七天）,假手术组与模型组给予等体积1×PBS尾静脉注射。造模后第1、3和7天对大鼠进行神经功能缺损评分、足部故障测试、掉线试验。并用激光多普勒脑血流监测仪-DRT4监测大鼠tMCAO后21d脑血流量改变,于饲养21d后心脏灌注取脑,采用HE染色观察各组大鼠脑组织梗死体积。4.运用Westernblot免疫蛋白印迹法检测PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路中PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、VEGF等蛋白的表达情况。研究结果:1.各组大鼠神经功能缺损评分结果显示,缺血再灌后第3d,各组mNSS评分均有所降低,与模型组比较,协同组mNSS评分明显降低（P<0.05）;与协同组组相比,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。缺血再灌后第7d,各组mNSS评分显着降低,与模型组比较,协同组mNSS评分显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与协同组相比,外泌体组比较差异无统计学意义（P>0.05）,抑制剂组比较差异有统计学意义（P<0.05）。2.各组大鼠掉线试验显示,缺血再灌后第3d,与模型组比较,其余各组比较差异均无统计学意义（P>0.05）;与协同组比较,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。缺血再灌后第7d,与模型组比较,各组比较差异均无统计学意义（P>0.05）,与协同组比较,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。3.行足部障碍测试,缺血再灌后第3d,与模型组比较,其余各组评分比较差异无统计学意义（P>0.05）;与协同组相比,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。缺血再灌后第7d足部障碍测试显示,与模型组相比,协同组评分显着下降（P<0.01）;与协同组相比,外泌体组比较差异无统计学意义（P>0.05）,抑制剂组评分明显高于协同组（P<0.05）。4.脑缺血区域脑血流量监测结果显示,与模型组相比,芎归方组、外泌体组、协同组比较差异具有统计学意义（P<0.05）;与协同组相比,外泌体组比较差异无统计学意义（P>0.05）,抑制剂组脑血流量较低（P<0.05）。5.脑梗死体积比较结果显示,与模型组相比,芎归方组、外泌体组、协同组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）;与协同组比较,外泌体组比较差异无统计学意义（P>0.05）,抑制剂组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。6.Westernblot检测结果显示,各组间PI3K、AKT、p70S6K等蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）;与协同组相比,抑制剂组mTOR蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。与模型组相比,芎归方组p-PI3K、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平升高（P<0.05）;外泌体组p-PI3K、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平升高（P<0.05）;协同组p-PI3K、p-AKT、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平升高（P<0.05）,p-mTOR蛋白表达水平升高（P<0.01）。与协同组相比,抑制剂组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平显着降低（P<0.05,P<0.01）;外泌体组p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平显着降低（P<0.05）。研究结论:1.芎归方调控微环境,可能提高BMSCs-exosomes促进缺血性脑卒中恢复期血管新生的作用,改善tMCAO大鼠脑组织损伤和神经功能缺损;2.芎归方与BMSCs-exosomes可以通过PI3K/Akt/mTOR/p70S6通路协同调控tMCAO大鼠的血管新生,促进缺血性脑损伤后大鼠神经功能的修复。
范腾[8]（2020）在《复方青黄散调控HIF1A/GATA信号通路改善骨髓增生异常综合征红系造血》文中研究说明临床研究表明,复方青黄散治疗骨髓增生异常综合征安全、临床有效。为进一步完善复方青黄散临床疗效、复方青黄散的药效学及作用机制研究,本研究在课题组研究基础上,对复方青黄散的临床疗效进行分析,并利用MDS转基因模型小鼠进行药效学和作用机制探讨。研究一 复方青黄散治疗骨髓增生异常综合征的临床研究目的:分析复方青黄散治疗骨髓增生异常综合征的临床疗效。方法:对2015年1月到2016年10月在中国中医科学院西苑医院血液科接受复方青黄散治疗1年半的61例骨髓增生异常综合征患者的临床资料进行回顾性分析。主要分析患者使用复方青黄散的临床疗效及影响疗效相关因素。患者一般资料描述采用统计描述,计数资料的描述采用均数±标准差表示,两组间比较采用t检验,计量资料采用秩和检验。结果:（1）61例MDS患者接受复方青黄散治疗后:16例获得血液学改善（16/61,26.2%）,40例获得血液学稳定（40/61,65.6%）,5例治疗无效（5/61,8.2%）,血液学进步率为91.8%。（2）61例患者治疗后血红蛋白水平（85.59±26.6g/L）较治疗前（79.23±21.28g/L）显着升高（p=0.016）。（3）61例患者治疗后中性粒细胞计数（1.14±0.63×109/L）较治疗前（1.01±0.53×109/L）升高,无显着差异（p=0.12）。（4）61 例患者治疗后血小板计数（43.67±37.79 × 109/L）较治疗前（44.35±38.23×109/L）无显着改变（p=0.93）。（5）61 例患者在治疗后 3 月（260ml）、6月（180ml）以及1年半（80ml）的输血量较治疗前（350ml）显着减少（p=0.0004）。（6）年龄小于60岁,染色体核型预后好和中等及IPSS-R低危和中危患者复方青黄散治疗后疗效较好。（7）61例患者使用复方青黄散后未见肝肾功能异常。结论:复方青黄散治疗MDS患者的血液学进步率为91.8%,复方青黄散对红系改善较为明显。研究二 骨髓增生异常综合征小鼠模型的建立及复方青黄散的药效学研究目的:为了解复方青黄散药效学,本研究建立骨髓增生异常综合征转基因小鼠模型并进行复方青黄散的药效学研究。方法:本研究利用M11PTD/WT/Runx1Δ/Δ和TPM+移植小鼠的转基因MDS模型小鼠。M11PTD/WT/Runx1Δ/Δ和TPM+小鼠发病后,将其骨髓移植到受体鼠体内（B6J和B6J*129）,TPM+移植小鼠给予多西环素食物诱导发病,M11PTD/WT/Runx1Δ/Δ移植小鼠则等待发病。移植后监测小鼠移植物嵌合度。小鼠发病后将16只分为两组,分别给予复方青黄散或PBS灌胃治疗,每周5次,连续4周。复方青黄散给药小鼠药物剂量为4.2mg/kg/天,PBS组给予100ul/天。评价给药前、后小鼠血常规的变化,记录小鼠的生存时间。结果:（1）M11PTD/WT/Runx1Δ/Δ和TPM+移植小鼠移植1月后移植物嵌合度检测:M11PTD/WT/Runx1Δ/Δ移植小鼠CD45.2+细胞群所占百分比为76.19±3.21%,TPM+移植小鼠中,GFP+细胞群所占百分比为74.59±7.22%。（2）复方青黄散和PBS治疗组小鼠治疗前血常规基线。PBS组和复方青黄散组小鼠血红蛋白、红细胞、血小板的基线一致（p=0.32,0.19,0.55）。（3）复方青黄散和PBS组小鼠治疗后血常规变化。①治疗后第8,15,21天,复方青黄散组小鼠血红蛋白较PBS组小鼠血红蛋白显着升高（p=0.009,0.026,0.015）;②治疗后第8,15,21天,复方青黄散组小鼠红细胞较PBS组红细胞显着升高（p=0.005,0.012,0.004）;③治疗后第21天,复方青黄散组小鼠血小板较PBS组小鼠显着升高（p=0.029）。（4）复方青黄散组和PBS组小鼠生存时间:PBS对照组小鼠中位生存时间为47.5天;复方青黄散组小鼠记录至128天,仍未得到中位生存时间,复方青黄散治疗组小鼠的生存时间较PBS组显着延长（p=0.04）。结论:复方青黄散可改善MDS模型小鼠贫血、血小板减少,延长其生存时间。研究三 复方青黄散改善贫血的作用机制研究目的:为了解复方青黄散改善贫血的作用机制,本研究利用MDS小鼠和正常小鼠及MDS患者和正常人的细胞进行体内、外作用机制和分子作用机制研究。方法:（1）采用CCK-8法分析复方青黄散对正常小鼠和人的细胞以及MDS小鼠和人的细胞的细胞活力的作用;（2）采用流式细胞术分析MDS小鼠复方青黄散和PBS干预后骨髓造血干细胞和红细胞前体细胞分化;（3）采用克隆形成簇、红细胞爆发集落形成簇和红细胞集落形成簇分析,对MDS小鼠骨髓和正常小鼠骨髓进行体外培养,研究复方青黄散对红系分化的体外作用;（4）采用免疫蛋白电泳和定量PCR,探讨复方青黄散对MDS克隆和正常克隆的分子学作用机制。结果:（1）复方青黄散对MDS小鼠细胞、MDS患者细胞、正常小鼠和人脐带血细胞无细胞活力抑制作用,可促进MDS-L细胞分化。（2）MDS小鼠给予复方青黄散治疗后,红细胞前体细胞群Ⅰ、Ⅱ较PBS组显着增加（p=0.014,p=0.031）,成熟红细胞群Ⅳ较PBS组显着减少（p=0.039）;复方青黄散组正常造血干细胞群较PBS组显着增加（p=0.006）,复方青黄散组小鼠脾脏较PBS组显着减小（p=0.032）。（3）体外TPM+骨髓移植小鼠骨髓细胞、TPM+、TPM-小鼠骨髓细胞和正常小鼠骨髓的BFU-E和CFU-E培养结果显示:复方青黄散组BFU-E和CFU-E的克隆计数和细胞数均较PBS组增加（p<0.05）。（4）正常小鼠给予复方青黄散治疗后,小鼠的LSK,MPP2,MPP3,MPP4及Pre-CFU-E、Pro-E+CFU-E细胞群均较PBS组增加（p<0.05）,两组小鼠的脾脏重量和血常规改变无差异（p>0.05）。（5）复方青黄散可下调M11PTD/WT/Runx1Δ/Δ细胞HIF1A蛋白及下游Binp3,Binp31,Ldha,Hk2,Ddit4基因表达,上调M11PTD/WT/Runx1Δ/Δ细胞P53、MDM2、VHL蛋白的表达。（6）复方青黄散可上调正常细胞GATA1、GATA2、GATA3蛋白表达。结论:复方青黄散通过促进MDS克隆和正常细胞的红系分化而改善贫血。复方青黄散改善贫血的分子作用机制为:下调MDS克隆HIF1A表达,发挥抑制MDS克隆作用,使MDS克隆向正常红系分化;上调正常细胞的GATA1、GATA2、GATA3,促进正常细胞的红细胞系分化。
骆帝[9]（2020）在《补肾活血胶囊通过Hedgehog信号通路调控成骨、成血管防治激素性股骨头坏死的机制研究》文中提出目的:利用Western blotting方法检测不同病因造成ONFH患者的股骨头样本大致病理形态与其中成骨与成血管相关蛋白的表达情况,为后续SONFH相关基础实验与临床治疗提供一定的理论基础与参照;再通过观察补肾活血胶囊对GC相关的ONFH SD大鼠骨组织重建及血管新生的影响和对GC处理的BMSCs成骨-成血管分化的影响,进一步研究补肾活血胶囊对动物与细胞实验中的成骨、成血管及Hedgehog信号通路相关因子的影响机制。方法:1.收集本院在2017年12月至2019年12月期间接受THA手术后的ONFH与股骨颈骨折患者的股骨头样本,挑选符合标准的股骨头按病因分别归入对照组、特发组、酒精组、激素组以及创伤术后组,采用Western blotting检测不同病因坏死骨组织的成骨与成血管相关指标的蛋白表达情况。2.通过使用对SD大鼠臀肌注射MPS的方法建立GC相关的ONFH大鼠模型,随后给予不同剂量的补肾活血胶囊加以干预,8周后通过组织病理学观察、荧光定量PCR检测与Western blotting分析在不同层面综合评价补肾活血胶囊对GC相关的ONFH大鼠骨组织重建及血管新生的影响。3.运用贴壁法提纯与扩增SD大鼠的BMSCs,并使用不同剂量的补肾活血胶囊含药血清与Dex进行干预培养,观察BMSCs的生长状况、增殖能力以及分化潜能,并采用细胞划痕实验、q PCR检测与Western blotting分析细胞中成骨、成血管与Hedgehog信号通路相关因子的蛋白表达变化;同时,建立SD大鼠RAOECs与BMSCs共培养体系,并对共培养后的RAOECs进行血管生成实验和Transwell迁移实验,观察其在补肾活血胶囊含药血清与Dex干预培养下的成血管能力与细胞活性的变化。结果:1.通过观察各组股骨头样本的大致形态与冠状面,发现不同病因ONFH患者股骨头样本在大致形态与剖面具有较为相似的病理表现,同时有相似的坏死和修复的组织学特征;Western blotting结果:在成骨方面,ALP蛋白的表达除创伤术后组显着低于对照组外,其余各组间均无显着差异（P>0.05）;Collgen I蛋白只有特发组与对照组没有统计学差异（P>0.05）,其余各组表达量均显着低于对照组（P<0.05）;与对照组相比,激素组、创伤术后组的OPN蛋白表达量均显着降低（P<0.05）,而特发组、酒精组则无显着差异（P>0.05）;对照组中RUNX2的蛋白表达量分别显着高于其余各组（P<0.05）;在成血管方面,不同病因造成的ONFH股骨头样本中CD31、VEGFA与KDR血管生成相关标记物蛋白的表达较对照组均存在显着下降的情况（P<0.05）;而VWF的蛋白表达量在各组间均未有显着差异（P>0.05）;在Hedgehog信号通路方面,Shh的蛋白表达量在不同病因的ONFH患者股骨头样本内不存在显着差异（P>0.05）;与对照组相比,酒精组与创伤术后组样本中信号通路下游细胞内信号因子Gli1的蛋白表达量出现了显着下降（P<0.05）,而特发组、激素组则未见显着差异（P>0.05）;各组中细胞内信号因子Gli2的蛋白表达量较对照组均出现了显着减少（P<0.05）。2.SD大鼠干预8周后,各组大鼠股骨头样本大体观无明显差异;软件分析HE染色结果显示:CG组骨小梁面积比率显着高与MG组（P<0.05）,LDG、MDG、HDG三组数据则均显着高于MG组（P<0.05）;而大鼠空骨陷窝率情况与骨小梁面积比率趋势一致,同为CG组显着高于MG（P<0.05）且LDG、MDG、HDG剂量三组均显着高于MG组（P<0.05）;软件分析免疫组织化学染色结果显示:与CG组相比,MG组大鼠股骨头成骨相关指标ALP、Collgen I、OPN与RUNX2不同程度的表达减少（P<0.05）;而灌胃不同剂量补肾活血胶囊的三个组则显着高于MG组（P<0.05）;MG组成血管相关指标CD31、VEGFA、KDR与VWF在股骨头中的表达强度相比较CG组均有明显下降（P<0.05）,而不同剂量补肾活血胶囊灌胃组与MG组相比均有显着升高（P<0.05）;q PCR检测结果显示:在成骨方面,CG组中ALP、Collgen I和RUNX2的m RNA表达均显着高于MG组（P<0.05）;LDG组中Collgen I与RUNX2的表达显着高于MG组（P<0.05）;MDG组中ALP与Collgen I的表达显着高于MG组（P<0.05）;而HDG组Collgen I的表达显着高于MG组（P<0.05）;在成血管方面,CG中CD31、VEGFA和KDR的m RNA表达均显着高于MG组（P<0.05）;LDG组中只有VEGFA的m RNA表达量明显多于MG组（P<0.05）;MDG组中CD31与VEGFA的m RNA表达量均显着多于MG组（P<0.05）;而HDG组VEGFA的m RNA表达量明显少于MG组（P<0.05）;在Hedgehog信号通路方面,CG组中Shh、Gli1和Gli2的m RNA表达量均明显多于MG组（P<0.05）;LDG组中则有Gli1和Gli2的表达显着高于MG组（P<0.05）;MDG组与HDG组中Shh、Gli1和Gli2的m RNA表达情况均显着高于MG组（P<0.05）;Western blotting结果分析显示:CG组样本中成骨相关ALP、Collgen I、OPN和RUNX2蛋白表达均显着高于MG组,而经过补肾活血胶囊LDG组中Collgen I、OPN和RUNX2三种蛋白表达情况均显着高于MG组表达（P<0.05）;MDG组中ALP、Collgen I和OPN三种蛋白表达均显着高于MG组（P<0.05）;HDG组显中ALP与Collgen I着高于MG组（P<0.05）;CG样本中成血管相关CD31、VEGFA、KDR和VWF四种蛋白表达均显着高于MG组,而LDG组中VEGFA、KDR两种蛋白表达情况均显着高于MG组表达（P<0.05）;而MDG组中VEGFA与KDR两种蛋白表达均显着高于MG组（P<0.05）,而CD31与VWF的表达则显着低于MG组（P<0.05）;HDG组显中KDR和VWF着高于MG组（P<0.05）;CG组样本中Hedgehog信号通路相关Shh、Gli1和Gli2蛋白三种蛋白表达均显着高于MG组,而经过补肾活血胶囊干预的LDG组中仅有Gli2蛋白表达情况显着高于MG组表达（P<0.05）;而MDG组中Shh和Gli2两种蛋白表达均显着高于MG组（P<0.05）;HDG组显中也仅有Gli2蛋白的表达着高于MG组（P<0.05）。3.本研究采用贴壁法可以提纯高纯度的原代SD大鼠BMSCs;原代BMSCs可顺利进行成骨、成脂与成软骨诱导分化;不同浓度的补肾活血胶囊含药血清不进对原代BMSCs具有促进增殖的作用,并且还可显着提高经Dex处理过的原代BMSCs的增殖活性;成骨诱导3周后,茜素红染色显示不同浓度补肾活血胶囊含药血清低、中、高剂量组与对照组染色结果相似,较模型组显着升高;BMSCs划线实验24h时,CG组与LDG、MDG、HDG三组的划线平均宽度均显着低于DG组（P<0.05）,且48h时趋势与24h时保持一致;将与SD大鼠BMSCs在不同浓度补肾活血胶囊含药血清与Dex进行共培养后的RAOECs进行血管生成实验,对CG与LDG、MDG、HDG三组的血管分支数量指标均显着高于MG组（P<0.05）;而在血管分支总长度指标上,CG组总长度数值显着高于DG组（P<0.05）,而MDG与HDG组的血管分支总长度显着高于DG组（P<0.05）;Transwell迁移实验结果表明:DG组迁移的细胞数量显着少于CG组（P<0.05）;MDG组迁移细胞数则显着多与DG组（P<0.05）;而LDG、HDG组迁移细胞数与模型组不存在显着差异（P>0.05）;q PCR结果显示:在Hedgehog信号通路方面,相比较于CG组,DG组中Shh、Gli1和Gli2的m RNA表达量均出现显着减少（P<0.05）;在含药血清方面,LG、HG组中Shh、Gli1和Gli2指标的m RNA表达量均显着多于CG组（P<0.05）,而MG组中的Shh和Gli2的m RNA表达情况较CG组均出现显着提高（P<0.05）;在干预方面,与DG组相比,MDG与HDG组中Shh、Gli1和Gli2各指标的m RNA表达量均出现显着升高（P<0.05）,而LDG组中的Shh和Gli2表达均显着高于DG组（P<0.05）;成骨方面,DG组相较于CG组ALP、Collgen I和RUNX2的m RNA表达量均有显着降低（P<0.05）;在含药血清方面,LG组中ALP、Collgen I和RUNX2的m RNA表达均显着高于CG组（P<0.05）,而MG与HG组中的ALP和RUNX2表达均显着高于CG组（P<0.05）;在干预方面,MDG组中ALP、Collgen I和RUNX2的m RNA表达均显着高于DG组（P<0.05）,LDG组中Collgen I和RUNX2的表达显着高于DG组（P<0.05）,而HDG组中ALP和Collgen I的表达则显着高于DG组（P<0.05）;成血管方面:CG组的CD31、VEGFA和KDR的m RNA表达均显着高于DG组（P<0.05）;LG、MG与HG组中CD31、VEGFA和KDR的m RNA表达均显着高于CG组（P<0.05）;在干预方面,MDG与HDG组中CD31、VEGFA和KDR的m RNA表达均显着高于DG组（P<0.05）,LDG组中VEGFA和KDR的m RNA表达量皆显着多于DG组（P<0.05）;Western blotting结果分析显示:在Hedgehog信号通路方面,DG组BMSCs的Shh、Gli1和Gli2三种蛋白的表达量相较于CG组均有明显降低（P<0.05）;LG组中的Shh、Gli1和Gli2各指标蛋白表达程度较CG组有显着增加（P<0.05）;MG、HG组中Gli1的蛋白表达量与CG组相比也有显着提升（P<0.05）;干预方面,LDG与MDG组相较于DG组的Shh、Gli1和Gli2三种蛋白表达量均有显着提高（P<0.05）;而HDG组则只有Gli2蛋白表达显着高于DG组P<0.05);在成骨方面,DG组BMSCs的ALP、Collgen I、OPN和RUNX2蛋白表达水平相较于CG组均有明显降低（P<0.05）;HG组中的ALP、Collgen I、OPN和RUNX2蛋白表达量均显着均高于CG组（P<0.05）;MG组中Collgen I、OPN和RUNX2的蛋白表达量显着高于CG组（P<0.05）;LG组中Collgen I和OPN的蛋白表达量显着高于CG组（P<0.05）;干预方面,MDG与HDG组相较于DG组的ALP、Collgen I、OPN和RUNX2蛋白表达水平方面均有显着提高（P<0.05）;而LDG组则在ALP、Collgen I和RUNX2的蛋白表达量上显着高于DG组（P<0.05）;在成血管方面,CG组BMSCs的CD31、VEGFA、KDR和VWF蛋白表达水平均显着高于DG组（P<0.05）;在CD31和VEGFA蛋白表达水平方面,LG、MG与HG三组表达情况与CG组相比提升明显（P<0.05）,但KDR和VWF的蛋白表达量则没有显着差异（P>0.05）;干预方面,LDG与MDG组相较于DG组在CD31、VEGFA、KDR和VWF的蛋白表达水平上均有显着提高（P<0.05）;而HDG组则在CD31、KDR和VWF的蛋白表达量上显着高于DG组（P<0.05）。结论:1.本研究通过对临床坏死的股骨头样本进行分析,初步了探究了不同病因导致的ONFH的初步机制。2.补肾活血胶囊可以通过Hedgehog信号通路对GC相关ONFH的SD大鼠骨重建与血管新生具有一定的促进作用。3.不同浓度的补肾活血胶囊含药血清可以通过Hedgehog信号通路可以调控并促进SD大鼠BMSCs向成骨与成血管方向的分化。
李赛慧[10]（2020）在《维生素D对镉致鸡胚原代软骨细胞毒性损伤的保护作用》文中进行了进一步梳理镉（Cadmium,Cd）是环境中常见的重金属污染物,Cd对机体肾小管的毒性作用会继发维生素D的代谢紊乱,从而引发软骨症、自发性骨折、禽痛风等代谢性疾病。禽类软骨疾病较难治愈,而软骨细胞是软骨的唯一组成细胞,因此以软骨细胞为研究对象,研究其增殖分化和生理功能变化,对了解Cd引起的软骨类疾病的发生和防治机理具有重要意义。1α,25-二羟维生素 D3（1α,25-dihydroxyvitamin D3,1α,25-（OH）2D3）是维生素D在体内最强的生物活性形式,1α,25-（OH）2D3能直接作用于骨细胞,参与维持骨稳态的平衡,但其能否改善Cd对鸡胚原代软骨细胞的毒性作用仍需进一步研究。因此,本试验旨在建立一个稳定的鸡胚原代软骨细胞的体外培养体系,从细胞水平观察1α,25-（OH）2D3和Cd对软骨细胞表型、增殖分化、凋亡及其它生理功能的影响,并探究1α,25-（OH）2D3是否能改善Cd对鸡胚原代软骨细胞的毒性作用,为临床上1α,25-（OH）2D3防治Cd致家禽软骨类疾病的研究提供理论依据。1鸡胚原代软骨细胞的分离培养与表型鉴定本试验采用胰蛋白酶和Ⅳ型胶原酶分步消化法获取鸡胚长骨关节软骨细胞,阿利新蓝染色鉴定软骨细胞酸性粘多糖表达,倒置显微镜观察软骨细胞形态,CCK-8检测软骨细胞增殖率,qRT-PCR检测软骨细胞分化标志基因。结果显示,分离细胞酸性粘多糖表达强阳性,呈现典型“铺路石”状,符合软骨细胞特征;软骨细胞在体外培养到5d时增殖明显加快;随着体外培养时间的延长,软骨细胞早期分化相关标志性基因Sox9、COL2A1、ACAN mRNA表达量逐渐降低,晚期分化相关基因Mmp-9、RANKL mRNA表达量逐渐升高。表明,获取的鸡软骨细胞能够在体外培养过程中向终末期正常分化成熟。2 维生素D对鸡胚原代软骨细胞增殖分化及生理功能的影响为探究不同浓度1α,25-（OH）2D3（10-8,10-9,10-10 mol/L）对鸡胚原代软骨细胞的影响,采用CCK-8、qRT-PCR、Western blot和免疫荧光等技术检测相关指标。结果显示,不同浓度1α,25-（OH）2D3对软骨细胞的增殖有促进作用,能维持软骨细胞在体外培养过程中的正常分化表型,并促进软骨细胞早期分化相关基因Sox 9、ACAN mRNA的表达,10-8 mol/L 1α,25-（OH）2D3 效果最明显;10-8 mol/L 1α,25-（OH）2D3 还能显着促进软骨细胞外基质主要成分COL2A1的表达。表明,1α,25-（OH）2D3对鸡胚原代软骨细胞的增殖、分化及生理功能起到了积极的促进作用。3镉对鸡胚原代软骨细胞的毒性作用为探究Cd对鸡胚原代软骨细胞的毒性影响,采用不同浓度Cd（0,0.5,1,2,4,6,8,10μmol/L）处理细胞,通过 CCK-8、qRT-PCR、Western blot、流式细胞术、阿利新蓝染色等技术检测相关指标。结果显示,0.5 μmol/L以上Cd能显着促进软骨细胞凋亡;1μmol/L以上Cd明显抑制软骨细胞的增殖,并抑制软骨细胞早期分化基因Sox 9、Aggrecan mRNA的表达以及COL2Al的表达;2μmol/L以上Cd能明显抑制软骨细胞分泌酸性粘多糖,并促进基质金属蛋白酶Mmp-9的表达。表明,Cd能抑制鸡胚原代软骨细胞的增殖、早期分化,并促进软骨细胞的凋亡和细胞外基质降解。4维生素D对镉致鸡胚原代软骨细胞毒性损伤的保护作用为探究1α,25-（OH）2D3对Cd致鸡胚原代软骨细胞毒性损伤的保护作用,选取10-8 mol/L 1α,25-（OH）2D3 和 2μmol/L Cd 联合处理软骨细胞,采用 CCK-8、Western blot、流式细胞术、免疫荧光、阿利新蓝染色等技术检测相关指标。结果显示,1α,25-（OH）2D3能缓解Cd对软骨细胞COL2Al和酸性粘多糖表达的抑制作用,明显改善Cd对软骨细胞的增殖毒性,并抑制Cd的促凋亡作用。1α,25-（OH）2D3还能降低Cd作用下的Mmp-9的过度表达,来缓解软骨细胞外基质的降解。表明,1α,25-（OH）2D3在Cd致鸡胚原代软骨细胞毒性损伤中起到了保护作用。
二、丹参对体外培养鸡胚胎股骨生长的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丹参对体外培养鸡胚胎股骨生长的影响（论文提纲范文）
（1）化裁血府逐瘀汤治疗下肢动脉硬化闭塞症的作用机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 综述 |
| 1 中医对下肢动脉硬化闭塞症的认识 |
| 1.1 病名来源 |
| 1.2 脱疽的病因病机 |
| 1.3 中医治疗ASO的研究进展 |
| 2 西医对下肢动脉硬化闭塞症的认识 |
| 2.1 定义及发病机制 |
| 2.2 危险因素 |
| 2.3 西医对下肢动脉硬化闭塞症的治疗进展 |
| 第一部分 基于数据挖掘的导师诊治下肢动脉硬化闭塞症医案回顾性研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究对象 |
| 2.1 病案来源 |
| 2.2 诊断标准 |
| 2.3 纳入标准 |
| 2.4 排除标准 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 病案资料收集与录入信息 |
| 3.2 数据整理与挖掘 |
| 4 结果 |
| 4.1 患者基本信息统计 |
| 4.2 中医证型结果 |
| 4.3 用药频次统计 |
| 4.4 药物四气、五味、归经统计 |
| 4.5 方剂组方规律统计 |
| 5 讨论 |
| 第二部分 化裁血府逐瘀汤治疗下肢动脉硬化闭塞症的临床研究 |
| 1 临床资料 |
| 1.1 样本量的估算 |
| 1.2 研究对象 |
| 1.3 纳人及排除标准 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 干预方法 |
| 2.2 观察指标 |
| 2.3 疗效评价标准 |
| 2.4 安全指标检测 |
| 2.5 统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 人组情况 |
| 3.2 两组患者一般资料的比较 |
| 3.3 两组患者中医症状评分比较 |
| 3.4 两组患者ABI指数的比较 |
| 3.5 两组患者下肢皮肤温度变化 |
| 3.6 两组患者血脂的比较 |
| 3.7 两组患者hs-CRP的比较 |
| 3.8 两组患者FIB的比较 |
| 3.9 两组患者治疗后临床疗效比较 |
| 3.10 安全性评价及不良反应 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 化裁血府逐瘀汤含药血清对血管平滑肌细胞TGF-β1/Smad3信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验仪器和试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞形态 |
| 2.2 化裁血府逐瘀汤含药血清对ox-LDL诱导VSMCs增殖的影响 |
| 2.3 化裁血府逐瘀汤含药血清对ox-LDL诱导VSMCs迁移的影响 |
| 2.4 化裁血府逐瘀汤含药血清对ox-LDL诱导VSMCs内α-SMA、CRBP1蛋白表达水平的影响 |
| 2.5 化裁血府逐瘀汤含药血清对ox-LDL诱导VSMCs内α-SMA、CRBP1免疫荧光强度的影响 |
| 2.6 化裁血府逐瘀汤含药血清对ox-LDL诱导VSMCs中PCNA、MMP-9蛋白表达水平的影响 |
| 2.7 化裁血府逐瘀汤含药血清对ox-LDL诱导VSMCs中PCNA mRNA、MMP-9 mRNA表达水平的影响 |
| 2.8 化裁血府逐瘀汤含药血清对TGF-β1/Smad3相关蛋白表达水平的影响 |
| 2.9 激光共聚焦定位及检测VSMCs中p-Smad3的表达 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附表 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 个人简历 |
（2）关节钙化软骨层通透性观测以及T型钙离子通道介导其发育的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 原位观测活体小鼠关节成熟/不成熟钙化层的通透性 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 基于Mirco-CT和菲克定律观测人膝骨关节炎软骨钙化层的通透性 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 在小鼠钙化层发育过程中软骨细胞T-VDCC表达特异性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 抑制Cav3.3 后软骨细胞肥大化/成骨分化的分子机制 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述1 关节钙化软骨层研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述2 电压依赖性钙离子通道在骨软骨细胞中的作用 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表的论文以及成果 |
| 致谢 |
（3）回阳生肌汤和鸡血藤对慢性皮肤溃疡愈合过程中MSCs趋化和迁移功能的调节作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词(表) |
| 综述 |
| 综述一 干细胞在创面修复中的研究进展 |
| 1 表皮干细胞 |
| 2 间充质干细胞 |
| 3 毛囊干细胞 |
| 4 细胞外囊泡 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 回阳生肌法治疗慢性皮肤溃疡的研究进展 |
| 1 疮疡的阴阳辨证 |
| 2 回阳生肌法的现代理论体系 |
| 3 回阳生肌法促进慢性皮肤溃疡愈合的机制 |
| 4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 实验一 回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 回阳生肌汤对db/db糖尿病小鼠伤口愈合及BMSCs增殖能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 回阳生肌汤对骨髓抑制大鼠伤口愈合及BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 鸡血藤水提物对骨髓抑制大鼠伤口愈合及BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验五 回阳生肌汤和鸡血藤水提物体外对氧化损伤大鼠BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 存在的问题与不足 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（4）中药抗骨质疏松作用及机制的研究进展（论文提纲范文）
| 1 抗OP中药概述 |
| 2 中药抗OP机制 |
| 2.1 对成骨细胞的影响 |
| 2.2 对破骨细胞的影响 |
| 2.3 调节信号通路 |
| 2.3.1 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 2.3.2 OPG/RANKL/RANK信号通路 |
| 2.3.3 NF-κB信号通路 |
| 2.3.4 其他信号通路 |
| 3 结语 |
（5）仙灵骨葆胶囊通过miR-100-5p/JMJD3/RUNX2促进成骨细胞分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 中医中药对骨质疏松的治疗进展 |
| 一、中医中药对骨质疏松病因病机的认识 |
| 二、中医中药对骨质疏松的治法与方药 |
| 第二节 骨形成的分子机制研究进展 |
| 一、蛋白因子与蛋白信号通路 |
| 二、非编码RNA调控网络 |
| 第三节 抗骨质疏松中药促进骨形成的分子机制研究进展 |
| 第四节 仙灵骨葆胶囊抗骨质疏松机制 |
| 第五节 组蛋白修饰与骨质疏松 |
| 第二章 JMJD3和RUNX2 在骨质疏松患者骨组织中的表达水平分析 |
| 第一节 研究背景 |
| 第二节 材料和方法 |
| 一、临床研究对象 |
| 二、实验试剂和仪器 |
| 三、实验方法和步骤 |
| 第三节 研究结果 |
| 一、两组研究对象一般资料相关性分析 |
| 二、骨组织中JMJD3和RUNX2的m RNA表达水平检测 |
| 三、骨组织中JMJD3、H3K27me3和RUNX2 的蛋白表达水平检测 |
| 四、JMJD3、H3K27me3和RUNX2 在骨组织中的表达水平与研究对象临床信息的相关性分析 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 仙灵骨葆通过上调JMJD3/RUNX2 通路促进成骨细胞分化 |
| 第一节 研究背景 |
| 第二节 材料和方法 |
| 一、细胞材料 |
| 二、试剂和仪器 |
| 三、方法和步骤 |
| 第三节 研究结果 |
| 一、不同浓度仙灵骨葆胶囊对MC3T3-E1 细胞增殖的影响 |
| 二、不同仙灵骨葆胶囊浓度对MC3T3-E1 成骨分化的影响 |
| 三、仙灵骨葆胶囊促进JMJD3/RUNX2 通路激活 |
| 四、抑制JMJD3/RUNX2 通路可以缓解仙灵骨葆胶囊对成骨细胞分化的促进作用 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 成骨细胞中仙灵骨葆胶囊通过抑制miR-100-5p上调JMJD3 的表达 |
| 第一节 研究背景 |
| 第二节 材料和方法 |
| 一、细胞材料 |
| 二、试剂和仪器 |
| 三、方法和步骤 |
| 第三节 研究结果 |
| 一、仙灵骨葆胶囊抑制MC3T3-E1 细胞中miR-100-5p的表达 |
| 二、荧光素酶报告基因系统检测miR-100-5p与 JMJD3 的结合 |
| 三、转染miR-100-5p拟似物可缓解仙灵骨葆胶囊对JMJD3 表达的促进作用 |
| 四、转染miR-100-5p拟似物可缓解仙灵骨葆胶囊对成骨细胞分化的促进作用 |
| 第四节 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）MMP-9和VEGF在膝关节骨性关节炎软骨中的表达及意义（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象及分组 |
| 1.2 标本收集及处理 |
| 1.3 苏木素-伊红（HE）染色 |
| 1.4 番红O-固绿染色 |
| 1.5 免疫组织化学染色 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HE染色观察膝关节骨性关节炎患者股骨髁软骨病理改变情况 |
| 2.2 番红O-固绿染色观察膝关节骨性关节炎患者股骨髁软骨潮线变化 |
| 2.3 免疫组织化学检测膝关节骨性关节炎患者股骨髁软骨中MMP-9、VEGF表达 |
| 3 讨论 |
（7）芎归方协同BMSCs-exosomes调控缺血性脑卒中血管新生的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 缺血性中风中医演变认识及气血论治理论 |
| 1、缺血性中风中医概念演变史 |
| 1.1 《黄帝内经》时期—始于症状 |
| 1.2 汉代时期—始见《金贵要略》 |
| 1.3 唐宋时期—奠定基础 |
| 1.4 金元时期—重视内因 |
| 1.5 清末时期—中西汇通 |
| 2、缺血性中风中医病因病机演变史 |
| 2.1 金元以前—外风立论 |
| 2.2 金元时期—内风立论 |
| 2.3 明清时期至近现代—内虚邪中 |
| 3、从气血论治缺血性中风理论 |
| 3.1 “气”与“血”在缺血性中风中的地位 |
| 3.2 气血理论下的缺血性中风瘀毒病机 |
| 3.3 气血理论下的缺血性中风痰浊病机 |
| 3.4 气血理论下的缺血性中风风火之邪 |
| 4、气血理论指导下缺血性中风的辨治策略 |
| 4.1 急性期—首辨虚实,紧守病机急性期 |
| 4.2 恢复期及后遗症期—气血通调,防病传变恢复期及后遗症期 |
| 5、小结 |
| 第二部分 芎归方协同BMSCs-exosomes调控缺血性脑卒中大鼠血管新生的效应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第三部分 芎归方协同BMSCs-exosomes调控缺血性脑卒中大鼠血管新生的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 1 中医对缺血性中风的认识 |
| 2 芎归方运用于中风治疗 |
| 3 MSCs和 MSCs-exos运用于中风治疗 |
| 4 芎归方调控微环境以提高BMSCs-exosomes促进缺血性脑卒中大鼠脑血管新生作用 |
| 5 PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路与血管新生 |
| 6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 中医药对脑梗死后血管新生的作用 |
| 参考文献 |
| 综述二 脑卒中疾病中的生物标志物—外泌体 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）复方青黄散调控HIF1A/GATA信号通路改善骨髓增生异常综合征红系造血（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 复方青黄散治疗MDS的临床研究 |
| 1. 研究内容 |
| 1.1 研究目的 |
| 1.2 病例来源 |
| 1.3 研究方案 |
| 1.4 病例选择 |
| 1.5 纳入和排除标准 |
| 1.6 治疗方法 |
| 1.7 疗效评价标准 |
| 1.8 患者资料 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2. 研究结果 |
| 2.1 临床疗效 |
| 2.2 外周血细胞计数 |
| 2.3 输血量改变 |
| 2.4 不同年龄疗效比较 |
| 2.5 不同性别疗效比较 |
| 2.6 不同染色体核型疗效比较 |
| 2.7 不同IPSS-R危度疗效比较 |
| 2.8 安全性评价 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 复方青黄散的药效学和作用机制研究 |
| 第一节 MDS小鼠模型建立及复方青黄散的药效学研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 骨髓细胞提取 |
| 1.3 药物干预方案 |
| 1.4 外周血细胞计数 |
| 1.5 流式细胞术检测细胞表面标记物 |
| 1.6 动物实验伦理 |
| 1.7 仪器和设备 |
| 1.8 试剂 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2. 研究结果 |
| 2.1 MDS小鼠移植物嵌合度检测 |
| 2.2 复方青黄散干预前MDS小鼠外周血细胞计数 |
| 2.3 复方青黄散干预后MDS小鼠外周血细胞计数 |
| 2.4 复方青黄散干预后MDS小鼠生存时间 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 复方青黄散改善贫血的作用机制研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 CCK-8法检测细胞活力 |
| 1.4 流式细胞术检测细胞表面标记物 |
| 1.5 q-PCR检测目的基因表达 |
| 1.6 Western-bolt检测目的蛋白表达 |
| 1.7 克隆形成蔟分析 |
| 1.8 实验仪器及耗材 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2. 研究结果 |
| 2.1 复方青黄散对小鼠和人源细胞细胞活力的作用 |
| 2.2 复方青黄散对MDS小鼠骨髓造血的作用 |
| 2.3 复方青黄散对MDS小鼠骨髓红系分化的体外作用 |
| 2.4 复方青黄散对正常小鼠造血的作用 |
| 2.5 复方青黄散对正常小鼠骨髓红系分化的体外作用 |
| 2.6 复方青黄散对MDS克隆的分子作用机制 |
| 2.7 复方青黄散对正常细胞的分子作用机制 |
| 2.8 复方青黄散中雄黄、青黛对正常小鼠骨髓红系分化的体外作用 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 文献综述 |
| (一) 中医论治骨髓增生异常综合征的研究进展 |
| (二) 西医诊治骨髓增生异常综合征的研究进展 |
| (三) 红细胞分化成熟机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）补肾活血胶囊通过Hedgehog信号通路调控成骨、成血管防治激素性股骨头坏死的机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 缩写词表 |
| 引言 |
| 第一章 不同病因的ONFH患者股骨头样本相关指标蛋白表达情况的检测与比较 |
| 1 研究目的 |
| 2 临床资料 |
| 2.1 病例收集 |
| 2.2 诊断标准 |
| 2.3 纳入标准 |
| 2.4 排除标准 |
| 2.5 病因判断标准 |
| 2.5.1 激素性股骨头坏死 |
| 2.5.2 酒精性股骨头坏死 |
| 2.5.3 特发性股骨头坏死 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 实验样本 |
| 3.2 主要仪器 |
| 3.3 主要器械 |
| 3.4 主要试剂 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 手术方式 |
| 4.2 股骨头样本的收集 |
| 4.3 股骨头样本的分组 |
| 4.4 Western blotting分析 |
| 4.5 统计学分析 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 一般情况 |
| 5.1.1 患者一般情况 |
| 5.1.2 各组代表患者一般情况 |
| 5.2 各组股骨头样本一般情况 |
| 5.3 Western blotting分析 |
| 6 讨论 |
| 6.1 造成股骨头坏死的病因 |
| 6.2 股骨头坏死治疗方案 |
| 6.2.1 非手术治疗 |
| 6.2.2 手术治疗 |
| 6.3 不同病因ONFH发病机制的异同 |
| 7 结论 |
| 第二章 补肾活血胶囊基于Hedgehog信号通路对GC相关ONFH大鼠骨破坏的修复与血管再生的研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要器械 |
| 2.4 主要药物/试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 补肾活血胶囊灌胃剂的制备 |
| 3.1.1 补肾活血胶囊组成与制备条件 |
| 3.1.2 补肾活血胶囊质量控制 |
| 3.1.3 补肾活血胶囊灌胃药液制备 |
| 3.2 动物分组方法与干预措施 |
| 3.3 病理学检测 |
| 3.3.1 股骨头组织的获取 |
| 3.3.2 HE染色 |
| 3.3.3 免疫组织化学分析 |
| 3.4 荧光定量PCR检测 |
| 3.5 Western blotting分析 |
| 3.6 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 一般情况 |
| 4.2 补肾活血胶囊可有效促进GC相关ONFH大鼠骨破坏的修复 |
| 4.2.1 股骨头样本大体观 |
| 4.2.2 HE染色分析 |
| 4.2.3 免疫组化学分析 |
| 4.2.4 荧光定量PCR检测 |
| 4.2.5 Western blotting分析 |
| 4.3 补肾活血胶囊可有效促进GC相关ONFH大鼠血管的再生 |
| 4.3.1 免疫组化学分析 |
| 4.3.2 荧光定量PCR检测 |
| 4.3.3 Western blotting分析 |
| 4.4 补肾活血胶囊可显着活化GC相关ONFH大鼠的Hedgehog信号通路 |
| 4.4.1 荧光定量PCR检测 |
| 4.4.2 Western blotting分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 激素性股骨头坏死动物模型的建立 |
| 5.1.1 模型动物的选择 |
| 5.1.2 模型的建立方法 |
| 5.1.3 动物模型的评价 |
| 5.2 中医对股骨头坏死的认识 |
| 5.3 补肾活血胶囊防治股骨头坏死的中医药基础与现代药理学探究 |
| 5.4 补肾活血胶囊对GC相关ONFH大鼠股骨头内骨破坏与血管损伤修复的促进作用 |
| 5.5 补肾活血胶囊对GC相关ONFH大鼠股骨头内Hedgehog信号通路的影响 |
| 6 小结 |
| 第三章 补肾活血胶囊含药血清通过Hedgehog信号通路调控BMSCs成骨成血管研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要器械 |
| 2.4 主要药物/试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 补肾活血胶囊含药血清的制备 |
| 3.1.1 制备补肾活血胶囊含药血清的材料 |
| 3.1.2 不同组别SD大鼠含药血清灌胃方法 |
| 3.1.3 SD大鼠补肾活血胶囊含药血清的获取 |
| 3.2 试剂的配制 |
| 3.2.1 细胞胎牛血清培养液 |
| 3.2.2 地塞米松磷酸钠配制液 |
| 3.2.3 细胞处理培养液 |
| 3.2.4 成骨诱导分化培养基 |
| 3.2.5 成脂诱导分化培养基 |
| 3.2.6 成软骨诱导分化培养基 |
| 3.3 原代BMSCs的提取与培养 |
| 3.4 原代BMSCs的鉴定 |
| 3.5 不同组别的培养与药物干预 |
| 3.6 细胞计数 |
| 3.7 BMSCs增殖检测 |
| 3.8 BMSCs成骨诱导后茜素红染色 |
| 3.9 BMSCs成脂诱导后油红O染色 |
| 3.10 BMSCs成软骨诱导行阿利辛染色 |
| 3.11 BMSCs划痕实验 |
| 3.12 RAOECs血管生成实验 |
| 3.13 RAOECs Transwell迁移实验 |
| 3.14 荧光定量PCR检测 |
| 3.15 Western blotting分析 |
| 3.16 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 含药血清基本情况 |
| 4.2 SD大鼠BMSCs鉴定 |
| 4.2.1 原代细胞形态学观察情况 |
| 4.2.2 流式细胞术鉴定 |
| 4.2.3 三系诱导分化 |
| 4.3 BMSCs增殖检测 |
| 4.4 补肾活血胶囊含药血清对诱导BMSCs成骨分化的影响 |
| 4.5 BMSCs划痕实验 |
| 4.6 RAOECs血管生成实验 |
| 4.7 RAOECs Transwell迁移实验 |
| 4.8 荧光定量PCR检测 |
| 4.9 Western blotting分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 含药血清的制备 |
| 5.1.1 中药含药血清研究方法发展的基本情况 |
| 5.1.2 制作含药血清实验动物的选择 |
| 5.1.3 给药剂量与方案 |
| 5.1.4 血清的采集、灭活与保存 |
| 5.2 SD大鼠原代BMSCs的提取、培养与鉴定 |
| 5.3 补肾活血胶囊含药血清对BMSCs生长增殖与成骨-成血管方面的干预作用 |
| 5.4 补肾活血胶囊含药血清对BMSCs中 Hedgehog信号通路的影响 |
| 6 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 干细胞疗法在股骨头坏死治疗中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 科技查新 |
| 博士期间参与科研课题情况 |
（10）维生素D对镉致鸡胚原代软骨细胞毒性损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第1部分 综述 |
| 第1章 软骨与软骨细胞 |
| 1 软骨的生长发育 |
| 2 软骨细胞的分化成熟 |
| 3 软骨与软骨细胞的生理功能 |
| 4 软骨类疾病的研究进展 |
| 第2章 镉对骨细胞毒性研究进展 |
| 1 镉及镉污染 |
| 2 镉的毒性作用 |
| 3 镉对成骨细胞毒性的研究进展 |
| 4 镉对破骨细胞毒性的研究进展 |
| 第3章 维生素D对骨细胞调控的研究进展 |
| 1 维生素D的生理功能 |
| 2 维生素D对成骨细胞的调控 |
| 3 维生素D对破骨细胞的调控 |
| 4 维生素D对软骨细胞的调控 |
| 研究目的及意义 |
| 第2部分 试验研究 |
| 第1章 鸡胚原代软骨细胞的分离培养及表型鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 鸡胚骨架染色 |
| 1.5 鸡胚关节软骨细胞的分离培养 |
| 1.6 CCK-8检测细胞增殖 |
| 1.7 阿利新蓝染色 |
| 1.8 RNA的提取和qRT-PCR |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同日龄鸡胚腿骨软骨发育 |
| 2.2 体外培养鸡胚原代软骨细胞增殖情况 |
| 2.3 阿利新蓝染色鉴定鸡胚原代软骨细胞 |
| 2.4 体外培养鸡胚原代软骨细胞的形态变化 |
| 2.5 体外培养鸡胚原代软骨细胞分化相关基因的表达 |
| 3 讨论 |
| 第2章 维生素D对鸡胚原代软骨细胞增殖分化及生理功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 试剂的配制 |
| 1.4 1α,25-(OH)_2D_3对软骨细胞的处理 |
| 1.5 CCK-8检测软骨细胞增殖率 |
| 1.6 qRT-PCR检测基因的表达变化 |
| 1.7 总蛋白的提取和Western blot检测 |
| 1.8 免疫荧光染色 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 1α,25-(OH)_2D_3对软骨细胞增殖的影响 |
| 2.2 1α,25-(OH)_2D_3对软骨细胞分化形态的影响 |
| 2.3 1α,25-(OH)_2D_3对软骨细胞早期分化相关基因表达的影响 |
| 2.4 1α,25-(OH)_2D_3对软骨细胞COL2Al表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 第3章 镉对鸡胚原代软骨细胞的毒性作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 试剂的配制 |
| 1.4 Cd对软骨细胞的处理 |
| 1.5 流式细胞术检测凋亡 |
| 1.6 流式细胞术检测线粒体膜电位 |
| 1.7 CCK-8检测软骨细胞增殖率 |
| 1.8 qRT-PCR检测基因的表达变化 |
| 1.9 总蛋白的提取和Western blot检测 |
| 1.10 阿利新蓝染色 |
| 1.11 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同浓度Cd对软骨细胞分化形态的影响 |
| 2.2 Cd对软骨细胞增殖的影响 |
| 2.3 Cd对软骨细胞早期分化相关基因表达的影 |
| 2.4 Cd对软骨细胞凋亡的影响 |
| 2.5 Cd对软骨细胞线粒体膜电位的影响 |
| 2.6 Cd对软骨细胞凋亡相关蛋白及Mmp-9表达的影响 |
| 2.7 Cd对软骨细胞酸性粘多糖表达的影响 |
| 2.8 Cd对软骨细胞COL2Al表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 第4章 维生素D对镉致鸡胚原代软骨细胞毒性损伤的保护作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 试剂的配制 |
| 1.4 1α,25-(OH)_2D_3和Cd对软骨细胞的共处理 |
| 1.5 CCK-8检测软骨细胞增殖率 |
| 1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 1.7 流式细胞术检测线粒体膜电位 |
| 1.8 总蛋白的提取和Western blot检测 |
| 1.9 免疫荧光染色 |
| 1.10 阿利新蓝染色 |
| 1.11 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 1α,25-(OH)_2D_3缓解Cd对软骨细胞增殖的抑制 |
| 2.2 1α,25-(OH)_2D_3改善Cd对软骨细胞分化形态的影响 |
| 2.3 1α,25-(OH)_2D_3抑制Cd对软骨细胞的促凋亡作用 |
| 2.4 1α,25-(OH)_2D_3缓解Cd致软骨细胞线粒体膜电位的下降 |
| 2.5 1α,25-(OH)_2D_3改善Cd对软骨细胞凋亡相关蛋白及Mmp-9表达的影响 |
| 2.6 1α,25-(OH)_2D_3缓解Cd对软骨细胞酸性粘多糖表达的抑制 |
| 2.7 1α,25-(OH)_2D_3缓解Cd对软骨细胞COL2Al表达的抑制 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
四、丹参对体外培养鸡胚胎股骨生长的影响（论文参考文献）
- [1]化裁血府逐瘀汤治疗下肢动脉硬化闭塞症的作用机制[D]. 王继雪. 黑龙江中医药大学, 2021(01)
- [2]关节钙化软骨层通透性观测以及T型钙离子通道介导其发育的机制研究[D]. 黄杨. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]回阳生肌汤和鸡血藤对慢性皮肤溃疡愈合过程中MSCs趋化和迁移功能的调节作用研究[D]. 刘青武. 北京中医药大学, 2021(01)
- [4]中药抗骨质疏松作用及机制的研究进展[J]. 张志宏,邢娜,彭东辉,王秋红,匡海学. 中国药房, 2021(03)
- [5]仙灵骨葆胶囊通过miR-100-5p/JMJD3/RUNX2促进成骨细胞分化的研究[D]. 艾亮. 广州中医药大学, 2020(09)
- [6]MMP-9和VEGF在膝关节骨性关节炎软骨中的表达及意义[J]. 陈德胜,张学森,张晨,宋国瑞,刘子歌,郭凤英,李燕. 宁夏医科大学学报, 2020(07)
- [7]芎归方协同BMSCs-exosomes调控缺血性脑卒中血管新生的实验研究[D]. 刘婉莹. 天津中医药大学, 2020
- [8]复方青黄散调控HIF1A/GATA信号通路改善骨髓增生异常综合征红系造血[D]. 范腾. 中国中医科学院, 2020(01)
- [9]补肾活血胶囊通过Hedgehog信号通路调控成骨、成血管防治激素性股骨头坏死的机制研究[D]. 骆帝. 山东中医药大学, 2020(01)
- [10]维生素D对镉致鸡胚原代软骨细胞毒性损伤的保护作用[D]. 李赛慧. 扬州大学, 2020